اثرات هیپوگلیسمی و هیپولیپیدمیک آنتوسیانین های زغال اخته با فعال سازی AMPK: مطالعات In Vitro و In Vivo قسمت 1

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:زغال اخته سرشار از آنتوسیانین های فعال زیستی، با سطح بالایی از مالویدین است که با مزایای آنتی اکسیدانی مرتبط است که به کاهش خطر ابتلا به دیابت کمک می کند. هدف از این مطالعه بررسی اثرات هیپوگلیسمی و کاهش چربی خون عصاره آنتوسیانین بلوبری (BAE) بود.مالویدین(Mv)، مالویدین-3-گلوکوزید (Mv-3-GLC)، و مالویدین-3-گالاکتوزید (Mv{{3}gal) هم در رده سلولی هپاتوکارسینوم انسانی HepG2 و هم در رده سلولی هپاتوکارسینومای انسانی رژیم غذایی چربی ترکیبی از موش های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین تیمار با گلوکز بالا به طور قابل توجهی استرس اکسیداتیو کبدی را تا {7} برابر افزایش داد و زنده ماندن سلول های HepG2 را کاهش داد. پیش تیمار با BAE، Mv، Mv-3-glc، و Mlv{10}}gal به طور قابل توجهی این آسیب ها را با کاهش گونه های اکسیژن فعال (ROS) به میزان 87،80،76 و 91 درصد، و افزایش زنده ماندن سلول کاهش داد. به ترتیب 88،79،73 و 98 درصد. این پیش تیمارها همچنین با کاهش سطح بیان آنزیم‌های شرکت‌کننده در گلوکونئوژنز و لیپوژنز و تقویت آنزیم‌های درگیر در گلیکوژنولیز و لیپولیز، از طریق سیگنال‌دهی مسیر پروتئین کیناز (AMPK) فعال‌شده با آدنوزین مونوفسفات در سلول‌های سیگنال‌دهنده G2، هیپرگلیسمی و هیپرلیپیدمی را نیز به طور موثر مهار کردند. برای تعیین نقش AMPK در واکنش متابولیسم گلوکز و لیپید ناشی از BAE در داخل بدن، دوزهای 100 میلی گرم بر کیلوگرم (عصاره آنتوسیانین زغال اخته - غلظت کم، BAE-L) و 400 میلی گرم بر کیلوگرم (عصاره آنتوسیانین زغال اخته - غلظت بالا). BAE-H) به مدت 5 هفته در روز به موش های دیابتی داده شد. تیمارهای BAE دارای (P<0.05) effect="" on="" body="" weight="" and="" increased="" the="" ampk="" activity,="" achieving="" the="" decrease="" of="" blood="" and="" urine-glucose,="" as="" well="" as="" triglyceride="" and="" total="" cholesterol.="" this="" research="" suggested="" that="">آنتوسیانین هاکمک به عصاره زغال اخته ناشی ازهیپوگلیسمیو اثرات هیپولیپیدمیک در دیابت و BAE می تواند یک غذای کاربردی یا دارویی امیدوارکننده برای درمان دیابت باشد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

دیابت ملیتوس (DM) یک بیماری شناخته شده است که معمولاً با ناتوانی در حفظ سطح طبیعی گلوکز خون مشخص می شود. این اختلال متابولیک مزمن آسیب جدی به سلامت انسان وارد می کند و بار مالی سنگینی را بر سیستم های مراقبت بهداشتی در سراسر جهان تحمیل می کند [1]. این بیماری بر اساس علت اختلال در تنظیم گلوکز خون به دو نوع اصلی طبقه بندی می شود. دیابت نوع 1 ناشی از تخریب خودایمنی سلول های بتا است که منجر به ناتوانی در تولید انسولین می شود، در حالی که دیابت نوع 2 با گیرنده های انسولین مقاومت به انسولین مشخص می شود، با کاهش عملکرد، به سلول ها اجازه نمی دهد به اندازه کافی به افزایش گلوکز خون پاسخ دهند.

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

علاوه بر هیپرگلیسمی، دیابتی ها تمایل دارندهیپرلیپیدمیکه هر دو شرایط می توانند از طریق افزایش استرس گلیکاکسیداتیو منجر به آسیب به اندام ها و بافت ها شوند [2]. تولید انسولین و آسیب گیرنده انسولین از جمله عواملی است که باعث افزایش قند خون در بیماران دیابتی می شود. در کبد، بیان بیش از حد گلوکونئوژنز و گلیکوژنولیز، گلوکز را دوباره به جریان خون آزاد می کند [3] در حالی که، در روده کوچک، بیان بیش از حد ناقل گلوکز 2 (GLUT2) باعث افزایش انتقال گلوکز می شود [4]. هیپرلیپیدمی ناشی از بیان بیش از حد لیپوژنز در بافت چربی [5] همچنین ممکن است باعث اختلال در جذب گلوکز تحریک شده توسط انسولین و سنتز گلیکوژن شود که منجر به مقاومت به انسولین می شود و در نتیجه به پیشرفت دیابت کمک می کند. عوارض طولانی مدت مرتبط با دیابت بر اندام های مختلف تأثیر می گذارد و شامل فشار خون بالا، تصلب شرایین، رتینوپاتی، نفروپاتی، زخم پا و نوروپاتی محیطی می شود [7].

در حال حاضر هیچ درمانی برای دیابت وجود ندارد، با این حال، می توان اثرات آن را کاهش داد [8]. برای افراد مبتلا به دیابت نوع 1، ترکیبی از تنظیم رژیم غذایی و دریافت مناسب انسولین با توجه به کربوهیدرات های مصرفی درمان رایج است. چالش های فعلی برای دیابت نوع 1 شامل ناتوانی یا مشکلات در تخمین کربوهیدرات کل و دوز مناسب انسولین است. با این حال، تقریبا ایده آلقند خونسطوح با توجه به پیشرفت فن آوری از جمله پمپ های انسولین امکان پذیر است [9]. برای بیماران مبتلا به دیابت نوع 2، درمان ممکن است پیچیده‌تر باشد، از جمله ترکیبی از تنظیم رژیم غذایی، ورزش، انسولین و سایر داروها با مکانیسم‌های مختلف اثر که برای کاهش گلوکز خون عمل می‌کنند[10]. رژیم غذایی با کربوهیدرات کم [11،12].

زغال اخته یکی از میوه هایی است که بیماران دیابتی می توانند مصرف کنند و می تواند خطر ابتلا به دیابت نوع 2 (T2DM) را کاهش دهد [13،14]. زغال اخته سرشار از طیف گسترده ای از ترکیبات مفید برای سلامت انسان از جمله مواد معدنی، اسیدهای آلی فیبر، اسیدهای فنولیک و فلاونوئیدها از جمله فلاونول ها و آنتوسیانین ها است [15،16]. با این حال، پروفایل های معمولی آنتوسیانین شامل گالاکتوزیدها، گلوکوزیدها و آرابینوزیدهای دلفینیدین، مالویدین، سیانیدین، پتونیدین و پئونیدین است [17] که معمولاً مالویدین و دلفینیدین ها سهم عمده ای در محتوای کل آنتوسیانین دارند [18،19]. در مطالعه قبلی ما [20]، مالویدین فراوان ترین آنتوسیانیدین موجود در عصاره میوه زغال اخته چشم خرگوش همراه با دلفینیدین، سیانیدین، پتونیدین و پئونیدین بود که با سایر نویسندگان همخوانی دارد که همچنین دریافتند مالویدین نقش مهمی در محتوای آنتوسیانین کل دارد. در انواع مختلف زغال اخته [17،21].

آنتوسیانین های زغال اخته ممکن است حساسیت انسولین را از طریق ظرفیت آنتی اکسیدانی و از طریق سایر فعل و انفعالات تنظیمی بهبود بخشند، زیرا اثرات آنها به طور کامل توسط اولی قابل توضیح نیست [13،22]. مطالعات همچنین فواید آنتوسیانین زغال اخته را برای سایر نگرانی های مرتبط با دیابت پیدا کرده اند. در یک مطالعه آزمایشگاهی، هوانگ و همکاران. [23] دریافتند که آنتوسیانین های زغال اخته دارای اثرات ضد التهابی و آنتی اکسیدانی بر روی سلول های شبکیه انسان در شرایط گلوکز بالا هستند. سلول هایی که در معرض گلوکز بالا قرار داشتند 64 درصد زنده ماندن داشتند، در حالی که وقتی در معرض عصاره آنتوسیانین زغال اخته، مالویدین، مالویدین-گلوکوزید یا مالویدین-گالاکتوزید قرار گرفتند، زنده ماندن آنها 7-9 درصد، 83 درصد، 91- درصد یا { بود. به ترتیب {11}} درصد. از سوی دیگر، سونگ و همکاران. [24] دریافتند که آنتوسیانین های زغال اخته استرس اکسیداتیو و التهاب را در شبکیه موش های دیابتی کاهش می دهد. به موش های دیابتی 20، 40 و 80 میلی گرم بر کیلوگرم آنتوسیانین بلوبری به مدت 12 هفته به صورت خوراکی داده شد. موش‌هایی که دوزهای بالایی از آنتوسیانین بلوبری داشتند، گلوکز خون پایین‌تر، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بالاتر و التهاب کمتر در شبکیه چشم، و گونه‌های اکسیژن فعال کمتری در مقایسه با آنتوسیانین‌های بلوبری داشتند.

اگرچه آنتوسیانین های زغال اخته برای بیماران دیابتی فواید سلامتی را برای کبد و سایر اندام ها به ارمغان می آورد، اثرات کاهش قند خون و کاهش چربی خون عصاره آنتوسیانین بلوبری (BAE) در سلول های کبدی انسان نامشخص است. در مطالعه حاضر، حدس زده شد که BAE، و همچنین Mv، Mv{0}}glc، و Mv-3-gal دارای فعالیت های هیپوگلیسمی و هیپولیپیدمیک در سلول های هپاتوکارسینومای انسانی (HepG2) و موش هستند و آنها می تواند هموستاز گلوکولیپید را حفظ کند و در نتیجه پیشرفت دیابت را کاهش دهد.

2. مواد و روش ها

2.1. مواد شیمیایی و معرف

زغال اخته چشم خرگوش Brightwell (Vaccinium ashei از باغ فوجیابیان (نانجینگ، چین) برداشت شد و سپس عصاره آنتوسیانین آنها به دست آمد و در تاریکی در درجه {{0}} نگهداری شد. عامل مجدد 3- (4،5 دی متیل تیازول-2-یل)-2، 5 دی فنیل-2H-تترازولیوم بروماید (MTT) و استانداردهای مالویدین (Mv)، مالویدین{10}}گلوکز (Mv{10} {11}}glc)، و مالویدین-3-گالاکتوز (Mv-3-gal) از سیگما آلدریچ (شانگهای، چین) تهیه شد. سلول‌های اولیه HepG2، کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA) و بهبود یافته واکنشگرهای تشخیص وسترن بلاتینگ chemiluminescence (ECL) از CW Biotechnology (پکن، چین) تهیه شد.سرم جنین گاوی (FBS)، محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و پنی سیلین-استرپتومایسین از Gibco (Auckland، نیوزلند Biroxoxo) تهیه شد. استرپتوزوتوسین (STZ) از Saiguo Biotech (گوانگژو، چین) خریداری شد. کیت تشخیص دی کلرو-دی هیدرو-فلورسین دی استات (DCFH-DA) از موسسه فناوری Beyo-time (شان) خریداری شد گای، چین). آلبومین سرم گاوی (BSA) از Shyuanye (شانگهای، چین) به دست آمد. خوراک پرچرب و قند بالا (چربی 35.5 درصد، پروتئین 20 درصد، کربوهیدرات 36.4 درصد، 0.1 درصد سلولز) و خوراک معمولی (چربی 4.5 درصد، پروتئین 23 درصد، کربوهیدرات 31.9 درصد، 3.7 درصد فروکتوز و 5.3 درصد سلولز) برای موش ها از شرکت Xietong Bioengineering Co., Ltd (نانجینگ، چین) به دست آمد. کیت های سنجش انسولین، تری گلیسیرید (TG)، کلسترول تام (TCHD، گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) از موسسه تحقیقات مهندسی زیستی Jiancheng (نانجینگ، چین) خریداری شد. AndyGene Human Forkhead Box O1 (FOXO1) گلوکز{41}فسفاتاز (G6Pase)، گلیکوژن سنتاز-فسفوریلاسیون (p-GS)، گلیکوژن سنتاز کیناز{45}} بتا فسفوریلاسیون (p-GSK3)، ناقل گلوکز 2 (GLUT2)، استیل کوآنزیم A کربوکسیلاز (ACC)، تری گلیسیرید لیپاز حساس به هورمون (HSL)،3-هیدروکسی{53}}متیل گلوتاریل کوآنزیم ردوکتاز (HMGCR) و کیت های سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم انسولین ناشتا (ELISA) موش، همگی از Bluegeneotech خریداری شدند. (شانگهای، چین) مواد شیمیایی و معرف های مورد استفاده در این مطالعه همگی از گریدهای تحلیلی خالص بودند.

2.2. آنتی بادی ها

آنتی بادی های اولیه علیه GS، p-GS (Ser641)، پروتئین تنظیم کننده استرول متصل شونده به عنصر-1c(SREBP-1c)، و فسفونول پیروات کربوکسی کیناز (PEPCK) از Abcam (کمبریج، انگلستان) به دست آمد. . آنتی بادی های اولیه علیه پروتئین کیناز آلفا فعال شده با آدنوزین مونوفسفات (AMPKa)، p-AMPK a (Thr172)، گیرنده-y-coactivator فعال شده با پراکسی زوم-پرولیفراتور{12}} (PGC{13}})، ACC، p- آنتی بادی های ثانویه کونژوگه ACC (Ser79) و پراکسیداز ترب کوهی (HRP) از Cell Signaling Technology (بورلی، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. آنتی بادی علیه گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) از Nanjing Beidi Biomed Technology (نانجینگ، چین) خریداری شد، در حالی که آنتی بادی علیه -اکتین از Sigma Aldrich (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. آنتی بادی های اولیه در رقت های 1:1000 در حالی که رقت های 1:4000 برای آنتی بادی های ثانویه استفاده شد.

2.3. تهیه عصاره آنتوسیانین بلوبری (BAE)

استخراج آنتوسیانین های بلوبری با استفاده از روش قبلی ما Huang و همکاران انجام شد. [25]. زغال اخته چشم خرگوش منجمد تا زمانی که یخ زدایی شود در دمای اتاق نگه داشته شد. سپس با استفاده از هموژنایزر پایه T18 ULTRA-TURRAX (IKA Works Guangzhou، چین) با سرعت 10 000 دور در دقیقه به مدت 30 ثانیه ضرب شدند. سپس مقدار 250 گرم زغال اخته در محلول 1000 میلی لیتری متانول حاوی 1 درصد هیدروکلراید به مدت 24 ساعت خیسانده شد. سپس عصاره پس از سانتریفیوژ در 5000×g به مدت 15 دقیقه جمع آوری شد. پس از تبخیر حلال در دمای 40 درجه در خلاء، باقیمانده با اتیل استات 1:1 (v/v) سه بار استخراج شد. فاز آبی حاوی آنتوسیانین جمع آوری و با استفاده از تبخیر خلاء برای به دست آوردن عصاره خام آنتوسیانین تغلیظ شد. عصاره بیشتر با رزین ماکرو متخلخل AB{14} (سیگما آلدریچ، شانگهای، چین) خالص شد. برای حذف فروکتوز و پروتئین، عصاره به مدت 24 ساعت تحت کروماتوگرافی ستونی بر روی 1000 گرم رزین ماکرو متخلخل AB{16}} به مدت 24 ساعت قرار گرفت و سپس با آب مقطر دوبل شستشو داده شد. بخش آنتوسیانین با 80 درصد اتانول حاوی 1 درصد محلول HCl شسته شد، در خلاء غلیظ شد و سپس با استفاده از خشک کن انجمادی Eyela FDU{20}} (Tokyo Rikakikai، ژاپن) خشک شد تا عصاره آنتوسیانین زغال اخته (BAE) بدست آید. پودر

2.4. کشت سلولی و درمان

رده های سلولی HepG2، مشتق شده از یک کارسینوم سلولی کبدی با مشخصه مشخص، دارای نسبت بالایی از پروتئین های ویژه کبد هستند. به همین دلیل، آنها معمولاً به عنوان مدل های آزمایشگاهی برای مطالعات سلول های کبدی انسان استفاده می شوند [26]. سلول های HepG2 در DMEM حاوی D-گلوکز نرمال (5.5 میلی مولار) همراه با 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین- استرپتومایسین رشد کردند و در دمای 37 درجه سانتیگراد و انکوباتور اتمسفر 5 درصد CO2 نگهداری شدند (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). پس از رسیدن به 70-80 درصد تلاقی، سلول‌های HepG2 زیر کشت شدند. چهار ساعت قبل از آزمایش، سلول‌های HepG2 در محیط سرمی کاهش‌یافته خاموش شدند. پس از پیش تیمار با 5 ug/mLof Mv، Mv{18}}glc، Mv{19}}gal یا BAE به مدت 24 ساعت، سلول ها در معرض غلظت طبیعی (5.5 میلی مولار) یا بالا (30 میلی مولار) گلوکز قرار گرفتند. شرایط عادی و دیابتی را تقلید کنید. سلول‌ها برای آنالیز وسترن بلات آماده شدند و مواد رویی برای آنالیز ELISA جمع‌آوری شدند.

2.5. حیوانات و طراحی تجربی

موش‌های نر سالم C57BL/6J (2±20 گرم) از GemPharmatech (نانجینگ، جیانگ سو، چین) در شرایط آزمایشگاهی استاندارد، از جمله دمای ثابت 25 درجه و 12- ساعت تناوب روز و شب نگهداری شدند. کمیته فرعی آکادمی علوم کشاورزی جیانگ سو در مورد کمیته تحقیقاتی مراقبت و استفاده از حیوانات، قبلاً همه روش‌های آزمایشی حیوانی را تأیید کرده بود. یک رژیم غذایی پرچرب و استرپتوزوتوسین (STZ) برای القای T2DM در مدل های حیوانی بر اساس روش مورد استفاده اسلام و لوتس استفاده شد [27]. همه موش‌ها با رژیم غذایی پرچرب و قند بالا تغذیه شدند به جز گروه کنترل که رژیم غذایی معمولی داشتند. پس از 4 هفته، موش ها به مدت 12 ساعت ناشتا بودند و 100 میلی گرم بر کیلوگرم STZ محلول در محلول بافر سیترات سدیم (pH 4.5.5) به صورت داخل صفاقی تزریق شد. یک هفته پس از القای STZ، نمونه خون از ورید دم موش هایی که یک شب ناشتا بودند گرفته شد. موش هایی که علائم دیابت از جمله پلی اوری، پلی دیپسی و هیپرگلیسمی (سطح گلوکز خون ناشتا > 11.1 میلی مول در لیتر) را نشان دادند، به عنوان T2DM شناخته شدند و برای مطالعات آینده مورد استفاده قرار گرفتند. برای بررسی پایداری مدل T2DM، همه موش ها به مدت یک هفته با یک رژیم غذایی معمولی تغذیه شدند. موش های سالم به عنوان گروه کنترل استفاده شدند. سپس موش های دیابتی به طور تصادفی به سه گروه مدل، BAE با دوز کم (100 میلی گرم بر کیلوگرم) و BAE با دوز بالا (400 میلی گرم بر کیلوگرم) تقسیم شدند. به مدت 6 روز متوالی، تزریق داخل معده ای از همان حجم حلال (100 میکرولیتر)، 100 میلی گرم بر کیلوگرم یا 400 میلی گرم بر کیلوگرم BAE به گروه کنترل، گروه مدل، BAE با دوز پایین و BAE با دوز بالا داده شد. به ترتیب. در روز هفتم وزن بدن و گلوکز خون ناشتا اندازه گیری شد. همان تجویز داخل معده به مدت 5 هفته ادامه یافت. سپس موش‌ها یک شبه ناشتا بودند و نمونه‌های خون برای تهیه سرم از ورید اجوف تحتانی جمع‌آوری و در درجه{31} نگهداری شد. پس از خونگیری، تمامی موش ها بیهوش و قربانی شدند. بافت‌های کبد، طحال، کلیه و تیموس موش‌ها برداشته شدند، وزن شدند و برای آزمایش‌های بیشتر در{32}} درجه نگهداری شدند.

2.6. تشخیص زنده ماندن سلول

بقای سلولی با روش MTT تعیین شد. پنج ug/mL از Mv، Mv{{0}}glc، Mv-3-gal یا BAE برای پیش تیمار سلول‌ها به مدت 24 ساعت استفاده شد. سپس سلول ها با 5 میلی مولار 30 میلی مولار گلوکز به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و 10 میکرولیتر 0.5 درصد (5 میلی گرم بر میلی لیتر) از MTT به سلول ها اضافه شد که سپس دوباره کشت شدند. پس از 4 ساعت، محلول MTT حذف شد و 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکسید (DMSO) قبل از اینکه مخلوط به آرامی به مدت 10 دقیقه تکان داده شود تا کریستال سلولی حل شود، اضافه شد. جذب در 490 نانومتر بر روی یک میکروپلیت خوان StatFax (Awareness Tech-nology Inc., Plam, FL, USA) اندازه گیری شد تا مقادیر چگالی نوری (OD) بدست آید. سلول های کشت شده با سطوح گلوکز نرمال (5.5 میلی مول در لیتر) به عنوان گروه کنترل استفاده شد، در حالی که چاه های بدون سلول به عنوان خالی استفاده شد. برای تعیین زنده ماندن سلول از فرمول زیر استفاده شد: زنده ماندن سلولی( درصد )=(مقدار OD گروه نمونه-مقدار OD گروه خالی)/(مقدار OD گروه شاهد-مقدار OD گروه خالی)x 100 درصد .

2.7. تجسم فلورسانس ROS

گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در سلول‌های HepG2 با استفاده از کیت تشخیص DCFH-DA ارزیابی شد. پس از درمان اولیه با 5 ug/mL Mv، Mv{3}}glc، Mv-3-gal، یا BAE به مدت 24 ساعت که بعداً با یک تیمار 5 میلی‌مولار یا 30 میلی‌مولار گلوکز به مدت 24 ساعت دنبال شد. سلول ها با PBS شسته شدند و سپس 10 میکرومولار DCFH-DA به هر چاهک اضافه شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه واکنش نشان داد. سلول ها مجدداً به طور کامل با PBS شسته شدند و سپس گروهی از این سلول ها بلافاصله در زیر میکروسکوپ فلورسنت معکوس IX53 (المپوس، توکیو، ژاپن) در گسیل 530 نانومتر و فیلترهای تحریک 485 نانومتر مشاهده شدند. تصاویر با بزرگنمایی 200× ارائه می شوند. پس از تفکیک، گروه دیگری از سلول ها جمع آوری شد و فلورسانس آنها توسط دستگاه میکروپلیت خوان چند حالته Synergy H4 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) ثبت شد. شدت فلورسانس کل سلول ها در هر چاه ذکر شد و تولید ROS به عنوان یک برابر کنترل اندازه گیری شد.

2.8. الایزا

کیت های ELISA برای تعیین کمیت پروتئین های دخیل در گلوکونئوژنز (FOXO1، G6Pase، p-GS)، گلیکوژنولیز (p-GSK3)، انتقال دهنده گلوکز (GLUT2)، لیپوژنز (ACC و HMGCR) و لیپولیز (HSL) در سوپرناتانت های HepG2 استفاده شد. سلول ها. مقدار GLUT2 در کبد موش نیز تعیین شد. کیت سنجش پروتئین BCA برای تعیین کمیت کل پروتئین سلولی مایع رویی استفاده شد. جذب در 450 نانومتر در 37 درجه روی میکروپلیت خوان StatFax (Awareness Technology Inc., Plam, FL, USA) برای تعیین سطح پروتئین اندازه‌گیری شد.

2.9. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

وسترن بلات بر روی لیزهای HepG2 به منظور اندازه گیری سطح پروتئین AMPK، p-AMPK، گلوکونئوژنز (PGCl، PEPCK، گلیکوژنولیز (GS، p-GS) و لیپولیز (ACC، p-ACC، SREBP) انجام شد. ج) در سلول‌ها، وسترن بلات نیز برای تعیین مقادیر AMPK,p-AMPK روی کبد موش‌های دیابتی انجام شد. از GAPDH یا -Actin به عنوان کنترل بارگیری استفاده شد. تصویربرداری LAS{8}} از سیستم (فوجی، توکیو، ژاپن) برای مشاهده باندهای پروتئینی استفاده شد و چگالی آنها با استفاده از نرم افزار Bio Profile 1D plus plus (Vilbert Lour-mat, Marne La Vallee, France) اندازه گیری شد. کنترل.

2.10. سنجش قند خون ناشتا و سنجش تحمل گلوکز

گلوکز خون ناشتا یک بار در هفته به مدت 5 هفته پس از یک دوره ناشتایی 12- ساعت اندازه گیری شد. برای سنجش تحمل گلوکز، موش ها به مدت 16 ساعت ناشتا بودند و با 2 گرم بر کیلوگرم 20 درصد گلوکز (2{8}}0 میکرولیتر) به صورت داخل معده (ig) تغذیه شدند تا گلوکز خون در 0 تعیین شود. 0.5،1،1.5 و 2h. خون از ورید دم جمع آوری شد و سطح گلوکز با استفاده از دستگاه گلوکومتر (Sinocare, Changsha, China) اندازه گیری شد. سطح گلوکز در ادرار موش هایی که ig دریافت کردند نیز به مدت پنج هفته اندازه گیری شد.

2.11. برآورد شاخص های بیوشیمیایی سرم و فعالیت آنزیمی در کبد موش

مقدار انسولین، تری گلیسیرید و کلسترول تام در سرم اندازه گیری شد، در حالی که فعالیت آنزیم SOD و GSH-PX با استفاده از کیت های تجاری طبق پروتکل سازنده تخمین زده شد. جذب در 500 نانومتر برای تری گلیسیرید (TG) و کلسترول تام (TCH) و 450 نانومتر برای سایرین (انسولین، SOD و GSH-PX) در 37 درجه روی میکروپلیت‌خوان StatFax (تکنولوژی آگاهی) اندازه‌گیری شد. InC., Plam, FL, USA).

2.12. تحلیل آماری

همه داده ها به عنوان میانگین مقدار ± انحراف استاندارد (SD) حداقل سه آزمایش مستقل ارائه شده است. ارقام با استفاده از GraphPad Prism نسخه 8 (GraphPad Software, Inc., CA, USA) به دست آمد. برای تعیین تفاوت‌های آماری بین گروه‌های مختلف، آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA)، آزمون t یا آزمون مقایسه‌های چندگانه سیداک انجام شد. تفاوت ها در P معنی دار در نظر گرفته شد<>

این مقاله از https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102100 استخراج شده است 21 جولای 2021; دریافت در فرم اصلاح شده 9 اوت 2021؛ پذیرش در 11 اوت 2021