تقویت پروتئومیکس بالا به پایین بافت مغز با FAIMS قسمت 1

چکیده

تحقیقات پروتئومی آلزایمر و بیماری پارکینسون بینش های ارزشمندی را در مورد اختلالات نورودژنراتیو ارائه کرده است. تا کنون، این تحقیقات تا حد زیادی با رویکردهای پایین به بالا محدود شده است، که مانع از درجه ای است که می توان وضعیت "دست نخورده" پروتئین را مشخص کرد.

بیماری آلزایمر یک بیماری تخریب‌کننده عصبی است که اثرات جبران‌ناپذیری بر حافظه و توانایی‌های شناختی فرد دارد. اگرچه افراد نمی توانند بیماری را به طور کامل درمان کنند، اما با درمان و پیشگیری دقیق می توان تا حد امکان از پیشرفت بیماری کاست و سلامت جسمی و روانی بیمار را حفظ کرد.

حافظه یکی از بارزترین جنبه هایی است که بیماران آلزایمر را تحت تاثیر قرار می دهد. اغلب ممکن است اطلاعات مهمی مانند نام خود، نام عزیزانشان، تاریخ های مهم و غیره را فراموش کنند. علاوه بر این، برخی از واژگان پیشرفته خودآموز، مانند مفاهیم انتزاعی و مترادف ها نیز ممکن است فراموش شوند. با این حال، با برخی آموزش ها و درمان های شناختی، بیماران آلزایمر همچنان می توانند حافظه خود را در برخی جنبه ها حفظ کنند.

اگرچه بیماری آلزایمر می تواند اثرات منفی به همراه داشته باشد، اما باید به آن مثبت نگاه کنیم. اول اینکه با افزایش آگاهی و درک بیماری، بهتر می توانیم از آن پیشگیری و درمان کنیم. ثانیاً، مراقبان و اعضای خانواده بیماران آلزایمر نیز می‌توانند نحوه برقراری ارتباط و تعامل مؤثر با آنها را بیاموزند تا به بیماران کمک کنند تا کرامت خود را حفظ کنند و تا حد امکان شاد زندگی کنند.

به طور کلی، اگرچه بیماری آلزایمر می تواند اثرات جبران ناپذیری بر حافظه و توانایی های شناختی ایجاد کند، اما باید نگرش خوش بینانه را حفظ کرد و با اقدامات درمانی و پیشگیرانه سعی در کاهش سرعت پیشرفت بیماری داشت. در عین حال، ما باید به کسانی که از بیماران مبتلا به آلزایمر مراقبت می کنند کمک و حمایت بیشتری کنیم و به طور مشترک یک جامعه گرم و تعاملی تر ایجاد کنیم. مشاهده می شود که باید حافظه را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد زیرا یک ماده دارویی سنتی چینی با اثرات منحصر به فرد بسیاری است که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثر سیستانچ از ترکیبات فعال مختلف موجود در آن ناشی می شود، از جمله اسید تانیک، پلی ساکاریدها، گلیکوزیدهای فلاونوئید و غیره.

روی 10 روش برای بهبود حافظه کلیک کنید

پروتئومیکس از بالا به پایین (TDP) بر این محدودیت غلبه می کند. با این حال، معمولاً محدود به مشاهده فراوان‌ترین پروتئوفرم‌ها با اندازه نسبتاً کوچک است.

بنابراین، تکنیک‌های تقسیم‌بندی معمولاً برای کاهش پیچیدگی نمونه استفاده می‌شوند. در اینجا، ما شکنش فاز گاز را از طریق طیف‌سنجی تحرک یونی شکل موج نامتقارن میدان بالا (FAIMS) در TDP بررسی می‌کنیم.

با استفاده از یک نمونه با پیچیدگی بالا که از بافت مغز بیماری آلزایمر (AD) به دست آمده است، توضیح می دهیم که چگونه افزودن FAIMS به TDP می تواند عمق پوشش پروتئوم را به شدت بهبود بخشد.

به عنوان مثال، اجرای FAIMS با ولتاژ جبران خارجی (CV) در 50-، 40- و 30- CV می‌تواند میانگین تعداد پروتئوفرم‌های غیر زائد، ژن‌ها و پوشش توالی پروتئوم را در مقایسه با بدونFAIMS دو برابر کند.

ما همچنین دریافتیم که FAIMS می‌تواند بر انتقال پروتئوفرم‌ها و پوشش‌های شارژ آن‌ها بر اساس اندازه آنها تأثیر بگذارد. نکته مهم، FAIMS شناسایی پروتئوفرم‌های آمیلوئید بتا (A) دست‌نخورده، از جمله نوع A 1-42 مستعد تجمع را که به شدت با AD مرتبط است، فعال کرد.

داده های خام و فایل های مرتبط از طریق مخزن داده MassIVE با شناسه مجموعه داده PXD023607 به کنسرسیوم ProteomeXchange سپرده شده است.

مقدمه

در طول 2 دهه گذشته، بروز بیماری‌های عصبی در سراسر جهان بیش از دو برابر شده است و بیماری آلزایمر (AD) شایع‌ترین شکل آن است. 2-5 به شدت با AD مرتبط است.

بنابراین، مشخصه دقیق پروتئومیک AD از اهمیت ویژه ای برخوردار است. 6،7 طیف سنجی جرمی نقش محوری را در این تحقیقات ایفا کرده است، 8 عمدتاً با رویکردهای پایین به بالا.

با این حال، هضم پروتئاز مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل از پایین به بالا مانع گرفتن حالت کامل پروتئین می شود، که می تواند به دلیل آلل های ژنتیکی، پیوند جایگزین، پردازش پروتئولیتیک، و تغییرات پس از ترجمه (که به آن "پروتئوفرم" گفته می شود، متفاوت باشد. 20

از آنجایی که رویکردهای پروتئومیک بالا به پایین (TDP) پروتئین‌ها را در حالت دست نخورده تجزیه و تحلیل می‌کنند، احتمال جذب پروتئوفرم‌های مرتبط با آسیب‌شناسی خاص بیشتر است و اجازه می‌دهد تا ارتباط قوی‌تر و مستقیم‌تری بین ژنوتیپ و فنوتیپ ایجاد شود.20-22

به عنوان مثال، TDP به ویژه برای گرفتن قطعات پروتئولیتیک درون زا مشتق از پروتئین هایی مانند تاو، که با آسیب شناسی آلزایمر مرتبط شده اند، مناسب است. چندین کاربرد قبلی TDP در آشکار کردن ناهمگنی پروتئوم مغزی منطقه ای و تغییرات عصبی در پاسخ به محرک های مختلف، نویدبخش است. .27-30

با این حال، TDP نمونه‌های پیچیده معمولاً به تکنیک‌های شکنش آفلاین برای کاهش پیچیدگی نمونه نیاز دارد، زیرا پروتئوم انسانی از نظر اندازه و فراوانی چندین مرتبه بزرگ را در بر می‌گیرد و پروتئین‌ها معمولاً با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس (LC) به خوبی حل نمی‌شوند.

این تقسیم‌بندی آفلاین را می‌توان با الکتروفورز گیر افتادن کسر مایع شسته‌شده با ژل، کروماتوگرافی حذف اندازه، کروماتوگرافی تبادل یونی یا خالص‌سازی میل ترکیبی انجام داد.

متأسفانه، تفکیک آفلاین معمولاً با نیاز به نمونه برداری طولانی، بازده و توان عملیاتی را کاهش می دهد. 36 جداسازی تحرک یونی فاز گاز یک جایگزین شکنش جذاب است که می تواند بین ابعاد LC و MS بدون نیاز به مراحل پردازش نمونه اضافی معرفی شود.

طیف سنجی تحرک یونی شکل موج نامتقارن میدان بالا (FAIMS) با معرفی اخیر دستگاه FAIMS Pro، که طراحی مدولار آن امکان ترکیب آسان تحرک یون را در چندین ابزار Orbitrap فعلی فراهم می کند، به ویژه برای این کار مناسب است.

FAIMS که به آن طیف سنجی تحرک دیفرانسیل نیز گفته می شود، یون ها را در یک گاز حامل بر اساس ترکیبی از عوامل مانند اندازه، بار، یا شکل از طریق معرفی یک شکل موج نامتقارن با میدان های الکتریکی زیاد و کم جدا می کند.38 برای جلوگیری از برخورد یون ها با الکترود، یک انحراف در مسیر یون از طریق اعمال یک ولتاژ جبرانی DC (CV) وارد می شود که امکان انتقال انتخابی آن یون را فراهم می کند.

کاربرد FAIMS برای آنالیز پروتئین دست نخورده تا حد زیادی محدود به جداسازی همسازهای پروتئین های منفرد یا ترکیبات کوچکی از پروتئین ها بوده است؛ 40-45

با این حال، FAIMS اخیراً برای آنالیزهای پروتئینی دست نخورده و بومی با استفاده از تجزیه و تحلیل سطح استخراج مایع استفاده شده است. در اینجا، ما آنالیز FAIMS-TDP را برای یک نمونه بافت کامل از قشر فرونتال داخلی (MFC) یک بیمار آلزایمر اعمال می کنیم.

اسکن در محدوده CV -50 تا -20 CV با پله‌های خارجی به ما امکان داد تا تعیین کنیم که چگونه مدولاسیون FAIMS CV بر ویژگی‌های یون‌های منتقل شده از طریق واحد FAIMS استوانه‌ای تأثیر می‌گذارد و چگونه می‌توان از این رابطه برای هدف قرار دادن پروتئوفرم‌ها بر اساس اندازه استفاده کرد.

FAIMS-TDP شناسایی‌های پروتئوفرم را در یک CV در مقایسه با بدون FAIMS بیش از دو برابر کرد و بازجویی عمیق‌تر از پروتئوفرم‌های مربوط به بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی، از جمله -، -، و -synucleins، PARK7، ایزوفرم‌های تاو اسپلایس و چندین پروتئوفرم سالم A را فعال کرد.

در مجموع، این کار توضیح می‌دهد که چگونه می‌توان شناسایی‌های بیشتر پروتئوفرم‌ها و پوشش پروتئوم را به‌طور تکرارپذیر از طریق شکنش فاز گاز با FAIMS در TDP به دست آورد.

روش ها

آماده سازی نمونه

نمونه MFC از مرکز بیماری آلزایمر دانشگاه راش دریافت شد. شرکت کنندگان سالمندان مستقر در کلینیک بودند که از سال 1992 تا 2005 با شکایات و/اختلال حافظه ثبت نام کردند.

آنها در کلینیک حافظه راش از نظر زوال عقل احتمالی مورد ارزیابی قرار گرفتند و با اهدای مغز به عنوان بخشی از هسته بالینی مرکز اصلی بیماری آلزایمر موافقت کردند. این مطالعه توسط هیئت بررسی نهادی مرکز پزشکی دانشگاه راش تایید شد.

پس از مرگ، بستگان بعدی رضایت خود را برای کالبد شکافی ارائه کردند. طبقه بندی کلی تشخیصی شناختی بیمار، زوال عقل آلزایمر بدون هیچ دلیل دیگری برای اختلال شناختی بود، 51 در حالی که فاصله پس از مرگ 230 دقیقه بود.

تمام مراحل نمونه برداری با احتیاطات BSL{{0}} انجام شد. 33 میلی گرم از بافت MFC ذخیره شده در 80- درجه به لوله های 1.5 میلی لیتری LoBind Eppendorf (Eppendorf, Cat# 022431081) با افزودن 0.5 میلی لیتر بافر همگن سازی متشکل از 8 مولار اوره، 10 میلی لیتر بی کربنات مامونیم (ABCM) و تریس({11}}کربوکسی اتیل)فسفین (TCEP) در pH7.5.

هموژنیزاسیون از طریق اختلال فیزیکی با استفاده از یک گلوله با موتور دستی به مدت 3{4} ثانیه (BioVortexer با SpiralPestle؛ Biospec 1083 و 1017)، قبل از افزودن 0.5 میلی لیتر بافر همگن سازی در دمای اتاق به دست آمد.

سپس نمونه در دمای 37 درجه به مدت 60 دقیقه در 1200 دور در دقیقه با استفاده از ترمومیکسر انکوبه شد تا امکان استخراج و دناتوره شدن پروتئین های سلولی فراهم شود. پلت کردن مواد نامحلول در اوره با سانتریفیوژ در 18،{5}} گرم به مدت 20 دقیقه در دمای 22 درجه انجام شد، و مایه رویی حاصل به 3 میلی لیتر بافر شستشو (WB؛ 8 مولار اوره، 10 میلی مولار ABC، pH7) اضافه شد. 0.5) در یک فیلتر 4 میلی لیتری 100 کیلو دالتون با وزن مولکولی قطع (MWCO) برای حذف گونه های بزرگ MW.

پس از 1 ساعت سانتریفیوژ در دمای 22 درجه و 5000 گرم، حجم احتباس شده 200 میکرو زمین و حجم فیلتر 3.8 میلی لیتر بود. 3.8 میلی‌لیتر از فیلتر به یک فیلتر MWCO 3 کیلو دالتون منتقل شد تا آلاینده‌های مولکولی کوچک و پپتیدهای کم MW حذف شود.

فیلتر MWCO 3 کیلو دالتون در دمای 22 درجه و 7300 گرم به مدت 1 ساعت سانتریفیوژ شد و حجم محتوی 200 میکرولیتر را به دست آورد. 200 میکرولیتر احتباس از فیلتر 100 کیلو دالتون MWCO یک بار دیگر با رقیق کردن آن به 4 میلی لیتر با WB و فیلتر کردن مجدد آن از طریق همان فیلتر شسته شد.

این جریان به همان فیلتر 3 کیلو دالتون MWCO که در بالا ذکر شد اضافه شد و یک بار دیگر متمرکز شد.

200 میکرولیتر نهایی احتباس از شستشوی فیلتر 3 کیلو دالتون MWCO به یک لوله 1.5 میلی لیتری LoBindEppendorf منتقل شد. برای اسیدی کردن نمونه، 10 میکرولیتر اسید فرمیک 10 درصد (FA) اضافه شد که منجر به غلظت 0.5 درصد FA در نمونه نهایی شد.

نمونه در 18،{1}} گرم به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد تا مواد رسوب‌شده را قبل از اندازه‌گیری غلظت پروتئین با استفاده از روش بی‌سینکونیک اسید (BCA) حذف کند.

استانداردهای آلبومین سرم گاوی در 8 مولار اوره، 10 میلی مولار ABC، و 0.5٪ FA تهیه شد تا هر گونه سهم بافر بالقوه در سنجش BCA را در نظر بگیرد. غلظت پروتئین با سنجش BCA 1.1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین شد، که مربوط به بازده نهایی 0.22 میلی‌گرم از کل پروتئین بازیابی شده در نمونه ~20 0 میکرولیتری است. نمونه با WB حاوی 0.5٪ FA تا 0.5 میلی گرم در میلی لیتر رقیق شد و تا تجزیه و تحلیل LC-MS در دمای 80- درجه نگهداری شد.

باید توجه داشته باشیم که آزمایش‌های اولیه (داده‌های منتشر نشده) با استفاده از کوکتل سنتی بازدارنده پروتئاز/فسفاتاز در بافر همگن‌سازی ما منجر به نتایج گمراه‌کننده BCAassay و LC-MS به دلیل حفظ چندین جزء کوکتل توسط فیلتر 3KMWCO شد.

علاوه بر این، بسیاری از مهارکننده‌های فسفاتاز و پروتئاز که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرند، از نظر شیمیایی با عوامل کاهنده مانند TCEP ناسازگار هستند. با در نظر گرفتن این ناسازگاری‌ها، و اینکه انتظار می‌رود شرایط شدیداً دناتوره‌کننده 8 مولار اوره با 10 میلی‌مولار TCEP، اکثر پروتئازها را غیرفعال کند، ما معتقد بودیم که تخریب پروتئولیتیک همچنان در این شرایط به حداقل می‌رسد.

تجزیه و تحلیل LC-MS/MS و تنظیمات FAIMS

نمونه‌ها با استفاده از سیستم Waters NanoACQUITY UPLC با فازهای متحرک متشکل از {0}}.2% FA در H2O (فاز متحرک A) و 0.2% FA در ACN (فاز متحرک B) آنالیز شدند.

هر دو پیش ستون به دام انداختن (100 میکرومتر id، طول 5 سانتی‌متر) و ستون تحلیلی (75 میکرومتر id، طول 50 سانتی‌متر) دوغاب‌هایی بودند که با مواد بسته‌بندی C2 (5 و 3 میکرومتر برای تله/تحلیلی، به ترتیب، 300 A، فناوری روش‌های جداسازی) بسته‌بندی شده بودند. . نمونه ها در یک حلقه 5 میکرولیتری، مربوط به 2.5 میکروگرم از مقدار ماده بارگذاری شده، بارگیری شدند و به ستون تله گذاری با جریان ایزوکراتیک 5٪ b با سرعت 3 میکرولیتر در دقیقه در مدت 20 دقیقه تزریق شدند.

جداسازی با گرادیان 5-50 درصد b در مدت 180 دقیقه با سرعت 300 نانولیتر در دقیقه انجام شد. برای تجزیه و تحلیل MS/MS پروتئین ها، سیستم NanoACQUITY به یک طیف سنج جرمی Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid مجهز به رابط FAIMS Pro جفت شد.

پارامترهای منبع شامل ولتاژ الکترواسپری 2.2 کیلو ولت، دمای مویرگی انتقال 275 درجه و دامنه فرکانس رادیویی قیف یونی 60 درصد بود. FAIMS بر روی وضوح استاندارد بدون جریان گاز حامل اضافی کنترل شده توسط کاربر و ولتاژ پراکندگی 5- کیلوولت (معادل میدان پراکندگی 33.3 کیلوولت بر سانتی متر)، 50 تنظیم شد در حالی که CV بسته به آزمایش متفاوت بود (به عنوان "پله های خارجی" نامیده می شود. ").

Fusion Lumos روی حالت کاربرد "پروتئین دست نخورده" تنظیم شد، که فشار سلول N2 تفکیک تله C با انرژی بالاتر (HCD) را به 2 mTorr کاهش می‌دهد و داده‌ها به صورت یک نمایه کامل جمع‌آوری شد. داده‌های MS1 و MS2 با وضوح 120 و 60 کیلو، اسکن‌های میکرو 3 و 2، در محدوده 500–2،{12}} m/z و 400–2،{15}} m/z و با اهداف AGC به ترتیب 5 × 106 و 5 × 105 بود.

MS1 و MS2 با حداکثر زمان تزریق 400 میلی ثانیه نیز به دست آمد. تنظیمات وابسته به داده شامل انتخابی از 6 شدیدترین یون برتر، حذف یون‌های پایین‌تر از حالت بار5+، گنجاندن حالت‌های شارژ نامشخص، و حذف دینامیک پس از یک مشاهده برای 30 ثانیه بود.

یون های انتخاب شده برای MS2 در یک پنجره ± 1.5 m/z جدا شده و از طریق تفکیک ناشی از برخورد (CID) با انرژی برخورد 35 درصد تکه تکه شدند. به دلیل وابستگی کمتر انرژی برخورد نرمال شده برای دستیابی به طیف های تکه تکه شدن پروتئین قابل تفسیر، از CID به جای HCD استفاده کردیم، در نتیجه وسعت مشاهدات پروتئوفرم خود را بر پوشش توالی اولویت دادیم.

مجموعه داده‌ها برای هر CV FAIMS در سه نسخه جمع‌آوری شد. همه فایل‌های خام در مخزن داده MassIVE ذخیره شده‌اند و می‌توان از طریق دسترسی MSV000086696 یا با PXD023607 در ProteomeXchange به آنها دسترسی داشت.

For more information:1950477648nn@gmail.com