تیره شدن پوست در نتیجه تجمع ملانین رنگدانه پوست است. برای مبارزه با این، طیف وسیعی از عوامل روشن کننده پوست به صورت تجاری در دسترس هستند که بیشتر آنها سنتز ملانین را مهار می کنند. رنگ زدایی ملانین یک روش جایگزین برای روشن شدن پوست است. در این مطالعه، ما نشان می‌دهیم که لیگنین پراکسیداز (LiP)، یک آنزیم خارج سلولی خالص‌شده از Phanerochaete chrysosporium NK{0}} جدا شده از خاک جنگل می‌تواند به طور موثر ملانین را در شرایط آزمایشگاهی تخریب و رنگ‌زدایی کند. شرایط رنگ‌زدایی شامل pH، دما، زمان انکوباسیون، غلظت آنزیم و افزودن واسطه برای بهینه‌سازی شرایط واکنش مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که pH 3، 40 درجه، IU/ml 15 و انکوباسیون 10 ساعت شرایط بهینه برای رنگ‌زدایی ملانین بودند. استفاده از واسطه، وراتریل الکل نیز برای افزایش اثربخشی کلون زدایی ملانین، با رنگ‌زدایی تا 92 درصد، مؤثر بود. نتایج میکروسکوپ الکترونی روبشی، فضای خالی روی گرانول‌های ملانین تیمار شده را در مقایسه با نمونه تیمار نشده نشان داد که نشان‌دهنده تخریب ملانین است. تغییراتی در ناحیه اثر انگشت ملانین مشاهده شد. برای مثال، بین اعداد موجی 1500-500 سانتی متر-1، وجود قله های جدید در ملانین تیمار شده در 1513، 1464، و 1139 سانتی متر-1 CH2، خمیدگی CH3، و کشش C-O-C نشان دهنده تغییرات ساختاری است. یک قله جدید در 2144 سانتی‌متر-1 (کشش آلکینیل C≡C) نیز در ملانین رنگ‌زدایی شده شناسایی شد. مطالعه سمیت سلولی نشان داده است که ملانین و LiP تیمار شده دارای اثرات سیتوتوکسیک پایینی هستند. با این حال، واسطه الکل وراتریل می تواند منجر به مرگ و میر بالا شود که نشان می دهد استفاده از آن باید به دقت در فرمولاسیون محصولات بهداشتی و مراقبت از پوست آزمایش شود. یافته های این مطالعه نشان می دهد که LiP تولید شده توسط Phanerochaete chrysosporium پتانسیل استفاده در صنایع پزشکی و آرایشی، به ویژه برای توسعه عوامل سفید کننده آرایشی مبتنی بر زیست را دارد.

با توجه به مطالعات مربوطه، سیستانچ یک گیاه رایج است که به عنوان "گیاه معجزه آسا طولانی کننده عمر" شناخته می شود. جزء اصلی آن سیستانوزید است که دارای اثرات مختلفی مانند آنتی اکسیدان، ضد التهاب و تقویت عملکرد سیستم ایمنی است. مکانیسم بین سیستانچ و سفید شدن پوست در اثر آنتی اکسیدانی گلیکوزیدهای سیستانش نهفته است. ملانین در پوست انسان از اکسیداسیون تیروزین کاتالیز شده توسط تیروزیناز تولید می شود و واکنش اکسیداسیون نیاز به مشارکت اکسیژن دارد، بنابراین رادیکال های آزاد اکسیژن در بدن به عامل مهمی در تولید ملانین تبدیل می شوند. سیستانچ حاوی سیستانوزید است که یک آنتی اکسیدان است و می تواند تولید رادیکال های آزاد را در بدن کاهش دهد و در نتیجه تولید ملانین را مهار کند.

روی Cistanches Herba For Whitening کلیک کنید

برای اطلاعات بیشتر:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

ملانین گروهی از رنگدانه های پیچیده، مقاوم و فراگیر چند حلقه ای زیست پلیمری پوست است که توسط سلول های پوستی تخصصی به نام ملانوسیت 1،2 تولید می شود. وظیفه اصلی آن محافظت از پوست در برابر اشعه های مضر UV نور خورشید با تشکیل کلاهک های فوق هسته ای در اطراف DNA سلول های پوست است. بسیاری از این عوامل روشن کننده پوست که از منابع طبیعی به دست می آیند، با مهار آنزیم های تیروزیناز، سرکوب بیوسنتز رنگدانه و از طریق برخی مسیرهای جایگزین، تولید ملانین را در سلول های پوست مهار می کنند. ترکیبات مختلفی مانند هیدروکینون، مونو بنزیل اترهای هیدروکینون، جیوه، کورتیکواستروئیدها و آربوتین در فرمولاسیون تجاری برای لوازم آرایشی سفیدکننده پوست استفاده می شوند، با این حال، کاربردهای آنها با عوارض جانبی جدی همراه بوده است. به عنوان مثال، گزارش شده است که جیوه باعث آسیب به کلیه ها می شود و سرب باعث اضطراب، افسردگی و روان پریشی 4،5 گزارش شده است. استفاده از کورتیکواستروئیدها ممکن است باعث سندرم کوشینگ، دیابت، فشار خون بالا، نارسایی آدرنال، سرکوب سیستم ایمنی، نازک شدن پوست، آکنه، درماتیت و هیپرتریکوزیس شود. تین و همکاران. (2009) گزارش داد که استفاده از آربوتین در مواد آرایشی سفیدکننده پوست برای غلظت‌های تا 3 درصد مؤثر بود اما افزایش بیشتر غلظت باعث اثرات سیتوتوکسیک شد. با توجه به این محدودیت ها، کاربرد این مهارکننده ها در لوازم آرایشی سفیدکننده پوست به طور گسترده توسط مقامات بهداشتی و ایمنی مورد انتقاد قرار گرفته است. پیشنهاد شده است که لوازم آرایشی سفیدکننده پوست تا سال 2021 با نرخ رشد سالانه 4.9 درصد به 155.44 میلیارد دلار برسد. با توجه به تقاضای فزاینده برای مواد سفید کننده پوست ایمن و طبیعی در سراسر جهان، کلونیزاسیون ملانین آنزیمی مورد توجه قابل توجهی قرار گرفته است.

آنزیم‌های خارج سلولی میکروبی مانند لاکاز، پراکسیداز منگنز، و لیگنین پراکسیداز (LiP) قبلاً برای رنگ‌زدایی ملانین آزمایش شده‌اند و به‌عنوان یک جایگزین بالقوه سازگار با محیط زیست برای مواد شیمیایی سمی در نظر گرفته شده‌اند. در این میان، LiP برای رنگ‌زدایی بسیار مؤثر بود. ملانین به دلیل پتانسیل ردوکس بالای آن برای اکسید کردن وراتیل الکل (VA) نسبت به سایر آنزیم‌های مرتبط. علیرغم پتانسیل اکسیداسیون بالا و کاتالیز کارآمد ملانین، تولید حجمی و مشکلات در تصفیه، محدودیت های اصلی برای کاربردهای تجاری LiP در عوامل سفید کننده پوست است. علاوه بر این، LiP فعالیت آنزیمی خود را برای کلون زدایی ملانین تحت پراکسید هیدروژن اضافی از دست می دهد، که برای اکسیداسیون ملانین حیاتی در نظر گرفته می شود. علاوه بر نقش مهم آن، H2O2 LiP را غیرفعال می کند و در نتیجه عملکرد کاتالیزوری آنزیم را کاهش می دهد.

نتایج

رنگ زدایی ملانین توسط Phanerochaete chrysosporium NK-1.سویه‌های قارچی برای رنگ‌زدایی ملانین مورد آزمایش قرار گرفتند. قارچ ها بر روی محیط جامد حاوی ملانین و VA به عنوان القا کننده لب تلقیح شدند. پس از هفت روز انکوباسیون، Phanerochaete chrysosporium NK-1 توانایی رنگ‌زدایی ملانین را نشان داد، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است.

شرایط برای رنگ زدایی مطلوب ملانین.pH آنزیم خالص شده برای رنگ‌زدایی ملانین مصنوعی در شرایط آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گرفت. اثرات شرایط مختلف بر رنگ‌زدایی ملانین 1{2}} مشاهده شد. ابتدا اثرات pH بر رنگ‌زدایی ملانین توسط LiP مورد بررسی قرار گرفت. برای این کار رنگ‌زدایی ملانین در شرایط pH مختلف از 2.{4}} تا 6.0 در دمای 30 درجه در حضور و عدم حضور VA برای یک دوره انکوباسیون 6 ساعت انجام شد. نتایج در شکل 2 نشان می دهد که به طور کلی رنگ زدایی ملانین در حضور VA در تمام شرایط pH بیشتر بود. به ویژه، در شرایط pH بالاتر برجسته تر است. VA می تواند به تشکیل رادیکال های کاتیونی کمک کند. در pH 3 و سپس 71 درصد در pH 2، در حالی که کمترین رنگ‌زدایی ملانین با 39 درصد در pH 6 مشاهده شد. رنگ‌زدایی ملانین به ترتیب 35 و 36 درصد در pH 5 و 6 مشاهده شد. رنگ‌زدایی ملانین توسط LiP در این مطالعه در شرایط pH پایین‌تر یعنی 2 و 3 بسیار کارآمد بود (شکل 2)، اگرچه سایر مطالعات شرایط pH بهینه را در 4 1 نشان دادند.

درجه حرارت. رنگ‌زدایی ملانین توسط LiP در دماهای مختلف از 20 تا 60 درجه در حضور و عدم حضور VA در یک دوره انکوباسیون 6 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. در غیاب VA، درصدهای مشابه (19 درصد) رنگ زدایی ملانین در دمای 20 و 30 درجه مشاهده شد (شکل 3). بیشترین و کمترین رنگ زدایی ملانین در صورت عدم وجود VA به ترتیب در دمای 40 و 50 درجه مشاهده شد. اما با VA در محلول، رنگ‌زدایی ملانین از 20 به 40 درجه افزایش و تا 60 درجه کاهش یافت. در حضور VA، بیشترین رنگ زدایی ملانین تقریباً 60 درصد در 40 درجه است. رنگ زدایی به طور کلی کمتر است زیرا آزمایش در شرایط pH ملایم تر انجام شد.

غلظت لب رنگ زدایی ملانین نیز با تغییرات در غلظت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، پنج غلظت مختلف، یعنی 5، 10، 15، 20، و 25 IU/mL LiP برای رنگ زدایی ملانین در حضور و غیاب VA مورد بررسی قرار گرفت. با کمال تعجب، موثرترین غلظت آنزیم 15 بود. IU/ml برای هر دو محلول با و بدون VA. پس از یک دوره انکوباسیون 6 ساعت، بیشترین رنگ‌زدایی ملانین 92 درصد در حضور VA و 70 درصد در غیاب واسطه با استفاده از غلظت آنزیم 15 IU/mL بود، در حالی که کمترین رنگ‌زدایی ملانین با 23 درصد در تیمار مشاهده شد. عدم وجود VA با استفاده از 5 IU/ml LiP. مشخص نیست که رنگ‌زدایی با غلظت‌های بالای آنزیم، یعنی IU/ml 20 و 25 کمتر مؤثر است (شکل 4).

زمان جوجه کشی آزمایش رنگ زدایی در 2، 4، 6، 8 و 10 ساعت انکوباسیون انجام شد. این واکنش ها در حضور و عدم حضور VA نیز انجام شد. نتایج نشان داد که اثر رنگ‌زدایی با زمان انکوباسیون، همانطور که انتظار می‌رود، همبستگی مثبت دارد (شکل 5). افزایش وسعت delocalization در جوجه کشی اولیه برجسته تر بود. بالاترین رنگ‌زدایی ملانین (68 درصد) پس از دوره انکوباسیون 10 ساعت در حضور VA و 59 درصد در غیاب VA مشاهده شد. رنگ‌زدایی ملانین پس از 2 ساعت انکوباسیون بدون VA به 15 درصد کاهش یافت. بنابراین، بر اساس نتایج آزمایش به این نتیجه رسیدیم که شرایط بهینه pH 3، 40 درجه، IU/ml 15 و انکوباسیون 10 ساعت است.

آنالیزهای SEM (میکروسکوپ الکترونی روبشی) و FTIR (طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه).تغییرات مورفولوژیکی و ساختاری در ملانین به ترتیب با SEM و FTIR مشخص شد. ملانین رنگ‌زدایی شده توسط SEM برای مشاهده هرگونه تغییر سطحی از نظر مورفولوژیکی آنالیز شد. ملانین مصنوعی بدون تیمار آنزیمی به عنوان شاهد استفاده شد. همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، فضای خالی بر روی گرانول های ملانین تیمار شده در مقایسه با نمونه تیمار نشده وجود داشت که نشان می دهد ذرات ملانین توسط آنزیم مورد حمله قرار گرفته اند.

ملانین رنگ زدایی شده نیز توسط FTIR با ملانین تیمار نشده به عنوان شاهد آنالیز شد (شکل 7). اثر انگشت مولکولی ملانین بی رنگ و درمان نشده به دست آمد و برای تایید هرگونه تغییر ساختاری در ملانین 13 تیمار شده مقایسه شد. کشش H یا ارتعاشات کششی N-H اسید کربوکسیلیک و گروه های فنلی. تغییرات در طیف FTIR ملانین درمان شده قابل توجه بود. پهنای باند در اعداد موج 3000-3500 cm-1 نشان دهنده وجود گروه های -NH و -OH در نمونه های کنترل و تیمار شده است. با این حال، شدت نمونه تیمار شده به طور قابل‌توجهی بیشتر از نمونه شاهد است، که نشان می‌دهد تیمار دارای افزودن این گروه‌های عملکردی به ساختار با حملات آنزیمی است. قله در 2884.4 cm-1 و 2822 cm-1 نشان دهنده حضور گروه های آلکیل در کنترل بود در حالی که در ملانین رنگ زدایی شده، اوج در شماره موج 2884.4 cm-1 وجود نداشت. اوج در 2822 cm-1 به طول موج 2835.92 cm-1 منحرف شد که نشان دهنده تغییرات ساختاری در ملانین تیمار شده در این منطقه نیز بود. اوج در عدد موج 1710 سانتی متر-1 در کنترل به حضور کربوکسیلیک اسید نسبت داده شد. این پیک نیز در ملانین رنگ‌زدایی‌شده وجود نداشت یا تا حد زیادی کاهش یافت، که دوباره تغییرات ساختاری در ملانین درمان‌شده را تأیید کرد. همچنین تغییراتی در ناحیه اثر انگشت وجود داشت. برای مثال، بین اعداد موجی 1500-500 سانتی متر-1، وجود قله های جدید در ملانین تیمار شده در 1513، 1464 و 1139 سانتی متر-1 نشان دهنده تغییرات ساختاری است. اوج جدیدی در 2144 سانتی‌متر در 1 نیز در ملانین رنگ‌زدایی شده شناسایی شد.

اثرات سمیت سلولیسمیت سلولی ملانین و LiP تجزیه شده با استفاده از روش سمیت سلولی میگو آب نمک 14،15 مورد بررسی قرار گرفت. در مطالعه حاضر، اثرات سیتوتوکسیک ملانین و LiP تیمار شده با نرخ زنده ماندن لارو میگو بیش از یا مساوی 90 درصد کم بود (جدول 1). افزایش غلظت LiP هیچ تاثیری بر زنده ماندن لارو میگو تا 80 ul/ml (~80 IU/ml) نداشت که نشان دهنده فعالیت کم سیتوتوکسیک آن است. در گروه کنترل مثبت با VA، میزان مرگ و میر 100 درصد بود، که نشان می دهد در استفاده از LiP در حضور VA به عنوان یک واسطه در زمینه های پزشکی و زیبایی باید احتیاط کرد.

بحث

در مورد دما، بیشترین رشد قارچ و تولید آنزیم در دمای 40 درجه بدست آمد که با زیستگاه طبیعی P. chrysosporium مطابقت دارد. توانایی LiP در تجزیه ملانین بر اساس شباهت ساختاری بین ملانین و لیگنین 18 است. اثربخشی تجزیه ملانین توسط LiP در شرایط آزمایشگاهی با عوامل متعددی مانند pH، دما، غلظت آنزیم و زمان انکوباسیون نیز مرتبط است. به عنوان وجود VA. همانطور که در شکل 8 نشان داده شده است، یک liP می تواند VA را به رادیکال های کاتیونی خود اکسید کند (VA∙ plus) و به عنوان یک واسطه ردوکس عمل می کند که ملانین را بیشتر از بین می برد.

H2O2 یک بستر ضروری به عنوان گیرنده الکترون نهایی در طول رنگ‌زدایی ملانین است. LiP به راحتی در غلظت اضافی غیر فعال می شود که باعث پارگی ساختار هم یا تشکیل ترکیب غیر فعال III می شود. گزارش شده است که این اثر بازدارندگی را می توان با اکسیداسیون رادیکال کاتیونی VA به VA کاهش داد. LiP رادیکال های کاتیون VA به VA را اکسید می کند، که به عنوان یک واسطه ردوکس برای رنگ زدایی ملانین عمل می کند. VA یک ترکیب طبیعی است که از قارچ های پوسیدگی سفید تولید می شود که انتظار می رود عوارض جانبی کمتری داشته باشد. با این حال، حضور واسطه VA منجر به مرگ و میر بالای ارگانیسم های آزمایش شده، در مقایسه با اثرات سیتوتوکسیک کم ملانین و LiP تیمار شده شده است. باید در فرمولاسیون محصولات بهداشتی و مراقبت از پوست به دقت آزمایش شود.

مواد و روش ها

جداسازی و شناسایی سویه های قارچی.جداسازی قارچی از یک محل آلوده انجام شد که برای مدت طولانی به عنوان محل تخلیه مواد چوبی استفاده می شد. نمونه در بطری های استریل گرفته شد و برای خالص سازی به آزمایشگاه منتقل شد. خالص‌سازی روی محیط دکستروز آگار ساحلی انجام شد. چهار کلنی قارچی مختلف از نمونه جدا و خالص سازی شدند. غربالگری بهترین سویه بر اساس رنگ زدایی ملانین و تولید زیست توده در حضور ملانین به عنوان تنها منبع کربن در محیط نمک معدنی (MSM) انجام شد. بر اساس غربالگری، ارگانیسم انتخاب شده با تعیین توالی DNA 5.8S rRNA و 18S rRNA با استفاده از پرایمرهای جهانی ITS{3}} و ITS-4 10 شناسایی شد. DNA ژنومی آنها طبق روش اندرسون و همکاران استخراج شد. 19. پس از خالص سازی، توالی یابی محصولات PCR انجام شد. توالی ها با استفاده از ابزار BLAST در NCBI تراز شدند و همولوگ ها برای فیلوژنی با استفاده از آنالیز ژنتیکی تکاملی مولکولی (MEGA) آنالیز شدند. بر اساس حداکثر احتمال، یک درخت همسایه برای شناسایی سویه قارچی جدا شده ساخته شد. توالی ها با شماره دسترسی KX064682.1 به GenBank NCBI ارسال شدند. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک نشان داد که ایزوله KX064682.1 سویه Phanerochaete chrysosporium NK{11}} است.

سنجش پلیت برای رنگ زدایی ملانین.قارچ پوسیدگی سفید، Phanerochaete chrysosporium NK-1، برای رنگ‌زدایی ملانین استفاده شد. Phanerochaete chrysosporium به تولید LiP معروف است. ملانین مصنوعی (B049-97-6) به عنوان مدل ملانین در تمام آزمایش‌های رنگ‌زدایی ملانین استفاده شد. یک محیط اصلاح شده با VA 2 به عنوان القا کننده لب برای آزمایش توانایی رنگ‌زدایی ملانین قارچ استفاده شد. برای کشت Phanerochaete chrysosporium NK{5}} از ظروف پتری استفاده شد. محیط با حل کردن 1{15}} گرم گلوکز، 2 گرم عصاره مالت، 4 گرم MgSO4·7H2O، 1 گرم KH2PO4، 0 تهیه شد.01 گرم FeSO4، 0.005 گرم ZnSO4، 0.2 گرم ملانین مصنوعی و 15 گرم آگار در 1- L آب مقطر. پلیت های پتری تلقیح شده در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شدند. میزان تغییر رنگ ملانین در زیر و اطراف کلنی قارچ مشاهده شد. مشخص شد که این قارچ قادر به رنگ‌زدایی ملانین است و بیشتر برای تهیه محلول‌های آنزیمی استفاده می‌شود.

تهیه آنزیم برای رنگ زدایی ملانین.محیط مایع کشت حاوی 10 گرم گلوکز، 0.2 گرم عصاره مخمر، 0 بود.07 گرم VA، 3.{13 }} گرم اسید تارتاریک، 1 گرم توئین 80، 0.2 گرم KH2PO4، 0.146 گرم CaCl2·2H2O، 0.157 گرم از K2HPO4، 0. CuCl2·2H2O، 0.54 میلی گرم FeCl3، 0.9 میلی گرم NaCl و 0.2 میلی گرم ملانین مصنوعی در هر لیتر آب مقطر 20. pH محیط با محلول های NaOH و HCl روی 4 تنظیم شد. فلاسک های 250 میلی لیتری حاوی مقدار کمی از محیط کشت 100 میلی لیتری اتوکلاو شده و با تلقیح 5 میلی لیتری تلقیح شدند. سپس فلاسک ها روی شیکر چرخشی در دمای 30 درجه به مدت 15 روز انکوبه شدند. نمونه های تکراری برای سنجش فعالیت LiP در فاصله زمانی 24 ساعت جمع آوری شد.

سنجش آنزیمیمعرف‌های سنجش LiP شامل ۲۵0 میلی‌مولار بافر تارتارات سدیم با pH ۵.۵، ۱۰ میلی‌مولار VA، و ۴ میلی‌مولار H2O2 (۳۰ درصد) بود. سنجش آنزیمی در یک کووت سیلیکا انجام شد و جذب در طول موج 310 نانومتر توسط یک اسپکتروفتومتر مرئی UV (Shimadzu، کیوتو، ژاپن) اندازه‌گیری شد. جذب در زمان های 0-30 ثانیه تحت شرایط محیطی کنترل شد. فعالیت آنزیم بر اساس قانون بیر، معادله محاسبه شد. (1) 21.

که در آن c، غلظت گونه های میرایی است. A قابلیت جذب نوری است. ε ضریب تضعیف مولی است. d طول مسیر نوری است. اندازه گیری فعالیت آنزیم شامل تعیین تغییر غلظت در طول زمان است، معادله. (2).

بهینه سازی برای افزایش تولید LiP و رنگ زدایی ملانین در شرایط آزمایشگاهی.بهینه سازی برای تولید افزایش یافته LiP از Phanerochaete chrysosporium NK-1 با استفاده از ملانین به عنوان بستر با استفاده از طرح Placket Burman انجام شد. یک Placket تمام قد مبتنی بر این واقعیت است که تأثیرات تعاملی بین متغیرهای مختلف را تضعیف می کند در حالی که فقط روندهای خطی را در نظر می گیرد، معادله. (3) 22.

که در آن Y نشان دهنده پاسخ و نمادها نشان دهنده ضریب رگرسیون و k تعداد عوامل مورد مطالعه است. در مجموع 9 عامل برای دستیابی به بالاترین غلظت LiP از Phanerochaete chrysosporium NK-1 برای رنگ‌زدایی ملانین موجود در محیط مورد مطالعه قرار گرفت. طرح Placket-Burman با 12 اجرای آزمایشی کل، همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است، ساخته شد. آزمایش ها در مجموع 35 روز انجام شد و پاسخ اندازه گیری شد (IU/mL فعالیت LiP). داده های تجربی با استفاده از نرم افزار آماری 'Design Expert 9' مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. محیط بهینه شده برای تولید افزایش یافته LiP استفاده شد و با رسوب آمونیوم خالص شد.

بهینه سازی تولید و تصفیه آنزیم.یک محیط غوطه ور برای تعیین زمان انکوباسیون بهینه از نظر فعالیت های LiP استفاده شد. همانطور که در شکل تکمیلی 1 نشان داده شده است، محلول کشت حداکثر فعالیت آنزیمی را در روز هشتم دارد که IU/ml 140 است. بنابراین از زمان انکوباسیون 8 روز برای تولید محلول آنزیمی استفاده شد.

در مجموع 12 آزمایش برای تعیین عوامل (9) که بر فعالیت های لب تأثیر می گذارد، انجام شد. در میان آزمایش‌ها، مقادیر پاسخ فعالیت LiP از 171 IU/ml تا 576 IU/ml، همانطور که در شکل تکمیلی 2 نشان داده شده است، متغیر است. 1{16}} (547 IU/ml). با توجه به تجزیه و تحلیل رگرسیون، دما، زمان، غلظت گلوکز، غلظت سوبسترا، و واسطه اثرات مثبت بر فعالیت LiP دارند. اثر عصاره مخمر ناچیز بود. عوامل دیگر اثرات منفی دارند. شرایط بهینه برای تولید LiP عبارتند از: زمان: 35 روز، دما: 40 درجه، گلوکز (در هر لیتر): 20 گرم، فروکتوز: 10 گرم، عصاره مخمر: 2 گرم، پپتون: 2 گرم، تلقیح: 10 میلی لیتر، واسطه سوبسترا: 0.1 میلی لیتر. سپس از این شرایط برای تولید تقویت‌شده LiP استفاده شد که با روش‌های رسوب آمونیوم و کروماتوگرافی ژل (Sephadex G{18}}) خالص‌سازی شد.

استخراج آنزیمی در pH، دما و زمان انکوباسیون بهینه انجام شد. ستون فیلتراسیون ژل سفادکس G75 برای جداسازی کسری از محتوای پروتئین از لیز سلولی در مورد گرادیان چگالی طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. فراوانی پروتئین‌ها در عصاره خام نیز از طریق تعداد نوارهایی که روی ژل سدیم دودسیل پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) ظاهر می‌شوند نشان داده شد. وزن مولکولی آنزیم خالص شده 46.{3}} کیلو دالتون بود که از تجزیه و تحلیل SDS-PAGE محاسبه شد (تکمیل شده در شکل 3). فعالیت آنزیمی پس از رسوب آمونیوم و خالص سازی با ژل کروماتوگرافی به ترتیب 684.{7}} و IU/ml 957.6 است.

آنزیم خالص شده برای رنگ‌زدایی ملانین در شرایط مختلف فیزیکوشیمیایی از جمله pH، دما، زمان انکوباسیون و غلظت آنزیم مورد استفاده قرار گرفت. ملانین مصنوعی (B049-97-6) به‌عنوان مدل ملانین در تمام آزمایش‌های رنگ‌زدایی ملانین طبق 23 مورد استفاده قرار گرفت.

آزمایش های رنگ زداییتأثیر pH بر رنگ‌زدایی ملانین. برای مشاهده تأثیر pH بر رنگ‌زدایی ملانین توسط LiP، واکنش‌های رنگ‌زدایی ملانین در pH از 2 انجام شد.0–6.{3}}. مخلوط واکنش حاوی 10 میکرولیتر از آنزیم خام حل شده در بافر TE و 1990 میکرولیتر 0.02 درصد وزنی بر وزن ملانین بود. این واکنش ها هم در حضور و هم در غیاب VA انجام شد. مخلوط های واکنش در دمای 30 درجه به مدت 6 ساعت انکوبه شدند. آزمایشات شاهد به طور موازی با جایگزینی LiP فعال با آنزیم دناتوره شده که در دمای 95 درجه جوشانده شده بود انجام شد. مخلوط‌های واکنش برای رنگ‌زدایی ملانین با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 540 نانومتر قبل و بعد از انکوباسیون بررسی شدند. راندمان رنگ‌زدایی آنزیم بر حسب درصد (درصد) بیان شد. رنگ‌زدایی ملانین با معادله محاسبه شد. (4) 11.

تأثیر زمان انکوباسیون بر رنگ‌زدایی ملانین. برای بهینه‌سازی زمان جوجه‌کشی، واکنش‌های رنگ‌زدایی ملانین در زمان‌های جوجه‌کشی از 2 تا 1{4}} ساعت انجام شد. مخلوط واکنش حاوی 10 میکرولیتر از آنزیم خام حل شده در بافر و 1990 میکرولیتر 0.02 درصد وزنی بر وزن ملانین در pH 4 در حضور و عدم حضور VA بود. سپس مخلوط‌های واکنش در دمای 30 درجه انکوبه شدند و درصد رنگ‌زدایی ملانین به‌دست آمد.

تجزیه و تحلیل SEM ملانین تخریب شده تغییرات مورفولوژیکی سطح ملانین با میکروسکوپ الکترونی روبشی (JEOL JSM{0}}، Peabody، MA، USA) 24 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ملانین تیمار نشده به عنوان شاهد استفاده شد. نمونه ها خشک شده و با نوار مسی (10×10 میلی متر مربع) با نوار کربنی دو طرفه (چسبنده از هر دو طرف) ثابت شدند. قطعات خرد شده با مواد شوینده شسته شده و قبل از تثبیت نمونه با خشک کن تفنگ حرارتی (KADA 85U/SMD) در دمای 200 درجه به مدت 2 دقیقه خشک شدند. هدایت خمیر نقره (SPI-CHEM، West Chester، PA، USA) برای اطمینان از هدایت پرتو الکترونی استفاده شد. طلا با پلاسمای ایجاد شده با شرایط ولتاژ بالا (جریان 25 میلی آمپر برای 50 ثانیه) و خلاء (10-2 ATM) روی نمونه رسوب کرد. مورفولوژی سطح نمونه ها با قدرت بزرگنمایی 3000 مورد بررسی قرار گرفت.

تجزیه و تحلیل FTIR ملانین بی رنگ شدهواکنش‌ها یا نمونه‌هایی که بیشترین رنگ‌زدایی ملانین را در آزمایش بهینه‌سازی نشان دادند، توسط طیف‌سنجی FTIR (مدل شماره 56، مرلین، آلمان) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نمونه ها سانتریفیوژ شدند (10،000 دور در دقیقه به مدت 1 دقیقه) و به عنوان مرحله آماده سازی برای تجزیه و تحلیل FTIR 20 در هوا خشک شدند. تجزیه و تحلیل کیفی نمونه های ملانین با استفاده از طیف سنج مادون قرمز نزدیک UV-Vis (NIR) انجام شد. Lambda 900/Perkin Elmer Instruments. طیف ها در محدوده 1000 تا 3500 سانتی متر-1 ثبت شدند. نمونه ها در گلوله های KBr با پراکندگی پودر تهیه شد. ملانین مصنوعی تیمار نشده به عنوان کنترل در این تجزیه و تحلیل استفاده شد.

سمیت سلولی ملانین و LiP تجزیه شدهآزمایش های کشندگی میگوی آب نمک برای بررسی سمیت سلولی ملانین تخریب شده 14،15 انجام شد. تخم های میگوی آب نمک در یک ظرف مستطیلی دارای آب دریا مصنوعی بیرون آمدند. ظرف حاوی یک تقسیم کننده پلاستیکی با سوراخ های کوچک بود و ظرف را به دو قسمت نابرابر تقسیم می کرد. تخمها در محفظه بزرگتر خالدار شده و پوشانده شده بودند تا از نفوذ نور جلوگیری شود، در حالی که محفظه کوچکتر با یک لامپ در بالای آن روشن می شد. لاروهای هچ شده توسط نور به سمت محفظه کوچک جذب شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون، ناپلی های بالغ با استفاده از یک پیپت پاستوریزه از محفظه روشن جمع آوری شدند.

تحلیل آماری.داده های تجربی با استفاده از نرم افزار آماری 'Design Expert 9' مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تصاویر گرافیکی با استفاده از سه آزمایش تجربی با انحراف معیار محاسبه شده ترسیم شد. اهمیت آماری اجرای آزمایشی با استفاده از ANOVA محاسبه شد.

در دسترس بودن داده ها

منابع

4. کلارکسون، TW، Magos، L. و مایرز، GJ سم شناسی جیوه - مواجهه فعلی و تظاهرات بالینی. N. Engl. جی. مد. 349، 1731-1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. درمانهای موضعی ملاسما و هیپرپیگمانتاسیون پس از التهاب. پوست درمانی Lett. 11، 1-6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Corticosteroids. کلین. درماتول. 15, 715-721 (1997).

7. Płonka، P. & Grabacka، M. سنتز ملانین در میکروارگانیسم ها: جنبه های بیوتکنولوژیکی و پزشکی. Acta Biochim. پول 53, 423-443 (2006).

8. لیم، ی.-ج. و همکاران اثرات مهاری آربوتین بر بیوسنتز ملانین هیپرپیگمانتاسیون ناشی از هورمون محرک ملانوسیت در بافت‌های پوست خوکچه هندی قهوه‌ای مایل به کشت. قوس. Pharmacal Res. 32, 367-373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. محصولات روشن کننده پوست مورد بازدید مجدد قرار گرفتند. بین المللی J. Cosmet. علمی 25, 169-181 (2003).

10. Rättö، M.، Chatani، M.، Ritschkof، A.-C. & Viikari, L. غربالگری میکروارگانیسم ها برای رنگ زدایی ملانین های تولید شده توسط قارچ های رنگ آبی. Appl. میکروبیول. بیوتکنول. 55، 210-213 (2001).

11. ناکازاکی، ک. و همکاران. خالص‌سازی، خصوصیات و شبیه‌سازی ژن Ceriporiopsis sp. سویه پراکسیدازهای MD-1 که ملانین موی انسان را بی رنگ می کند. Appl. محیط زیست میکروبیول. 74, 5106-5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas، FJ & Martínez، Á. T. تخریب میکروبی لیگنین: چگونه یک پلیمر بزرگ مقاوم در طبیعت به طور موثر بازیافت می شود و چگونه می توانیم از این مزیت استفاده کنیم. میکروب. بیوتکنول. 2, 164-177 (2009).

13. هولمز، EW و تامپسون، KD (اختراعات گوگل، 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Brine میگو سمیت سلولی، خواص ضد التهابی و ضد درد Woodfordia fruticosa Kurz fowers. ایران. جی. فارم. پاسخ: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. تست سمیت مواد دندانی ترمیمی با استفاده از لارو میگوی آب نمک (Artemia salina). J. Appl. علم دهان

16, 297-301 (2008). 16. فالاده، AO و همکاران. عملکردهای لیگنین پراکسیداز و کاربردهای آینده نگر Microbiologyopen 6, e00394.

17. سانگ، HJ رنگ‌زدایی ملانین توسط لیگنین پراکسیداز با H2O2 تولید شده در محل برای کاربرد لوازم آرایشی سفید کننده (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. تجزیه زیستی و درمان های بیولوژیکی سلولز، همی سلولز و لیگنین: یک مرور کلی. بین المللی میکروبیول. 5، 53-63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW تایپ مولکولی با تکثیر تصادفی DNA چندشکلی و هیبریداسیون جنوبی M13 جدایه های جفت مرتبط Aspergillus fumigatus. جی. کلین. میکروبیول. 34، 87-93 (1996).

20. صبار، م.ا و همکاران. تخریب زغال سنگ با رتبه پایین توسط Rhizopus oryzae جدا شده از یک معدن زغال سنگ پاکستان و افزایش انتشار مواد آلی آن. سوخت 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Purification, خصوصیات و فعالیت دپلیمریزاسیون زغال سنگ لیگنین پراکسیداز از Lenzitus betulina MTCC-1183. Appl. بیوشیمی. میکروبیول. 48، 583-589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. کاربرد طرح Plackett-Burman برای غربالگری اجزای رسانه برای تولید تاناز از پوسته برنامه با استفاده از تخمیر غوطه ور. بین المللی جی. فارم. Res. Rev. 2, 24-29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK رنگ زدایی ملانین توسط لیگنین پراکسیداز از Phanerochaete chrysosporium. بیوتکنول. فرآیند بیوشیمیایی. مهندس 9, 256 (2004).

24. Karp, JM et al. کشت سلول های بنیادی جنینی انسان بدون مرحله بدن جنینی، استخوان سازی را در شرایط آزمایشگاهی افزایش می دهد. سلول های بنیادی 24، 835-843 (2006).

تصدیق

مشارکت های نویسنده

منافع رقابتی

ناشرتوجه داشته باشیدSpringer Nature در مورد ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501