فعالیت استروژنیک گلیکوزیدها از گیاه سیستانش دسرتیکولا به عنوان کمک کننده گیرنده های استروژن در شرایط آزمایشگاهی

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

هوی سونگ، ون-لان لی، شیانگ-مینگ سان، یانگ هو، جینگ-شین دینگ، یو-بین جی، جینگ-یا وانگ

مقدمه

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" به زبان چینی)، یک داروی گیاهی سنتی چینی است که برای اولین بار در ShenNongBenCaoJing ثبت شد، هزاران سال است که برای درمان کمبود کلیه، ناتوانی جنسی، یبوست پیری و کمبود خون استفاده می شود.[1] عمدتاً در مناطق بیابانی شمال غربی چین مانند گانسو و سین کیانگ پراکنده است.[2] تحقیقات فارماکولوژی مدرن نشان داد که C. deserticola می تواند عملکردهای دارویی گسترده ای مانند تنظیم هورمون، تعدیل کننده ایمنی، آنتی اکسیدان، محافظت عصبی، ضد التهابی و فعالیت استروژنی را پیش ببرد. اجزای فعال اصلی با اثرات بیولوژیکی مختلف.[5،6]

گیرنده های استروژن (ERs-) و ER زیرگروه های ER هستند که می توانند عملکردهای فیزیولوژیکی را تنظیم کنند.[7] این پروتئین‌ها می‌توانند رونویسی ژن‌های هدف را با اتصال به توالی‌های تنظیم‌کننده DNA مرتبط در هسته سلول تنظیم کنند. هر دو زیرگروه به طور قابل توجهی در سیستم های قلبی عروقی و عصبی مرکزی بیان می شوند.[8،9] ER عمدتاً در غده پستانی، رحم، تخمدان، استخوان، اندام تناسلی مردانه و پروستات وجود دارد. ER عمدتاً در پروستات، تخمدان و مثانه وجود دارد.[10،11] علاوه بر این، برخی از نقش‌های فیزیولوژیکی مشترک برای این دو نوع فرعی وجود دارد، مانند رشد و عملکرد تخمدان‌ها و محافظت از سیستم قلبی عروقی. [12،13] تحقیقات قبلی در گروه ما مکانیسم شبیه به استروژن GCها را با روش تجزیه و تحلیل متابولومیک نشان داد.[14] در یک مطالعه مستمر، مکانیسم فعالیت استروژنی GCها را بر روی رده‌های سلولی MCF-7 مربوط به ERها تحلیل کردیم.

مواد و روش ها

ابزار

دستگاه جوجه کشی ECO-170P-230 از شرکت New Brunswick Scientific (China) Ltd.، Bio-Rad 680 microplate reader، و دستگاه الکتروفورز از Bio-Rad Laboratories, Inc.، میکروسکوپ CX21 از Olympus Co., Ltd. ، سیستم تصویربرداری ژل GIS-2019 از Tanon Science and Technology Co., Ltd.، صفحه تخت از Corning Inc.، فلوسیتومتری EPICS-XL از Beckman-Coulter Inc. و StepOnePlus Real-Time واکنش زنجیره ای پلیمراز بود. سیستم (PCR) از شرکت Thermo Fisher Scientific بود.

مواد شیمیایی و معرف ها

GCها طبق روشی که قبلاً گزارش شده بود در آزمایشگاه ما تهیه شدند، [14] و خلوص GCها 52 درصد (آکتئوزید به عنوان نشانگر برای تعیین GCها استفاده شد) توسط اسپکتروفتومتری فرابنفش تعیین شد. استرادیول (E2) از Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (شانگهای، چین) خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS) و RPMI-1640 از Gibco Co., Ltd.، صفحه تخت 96 چاهی از Corning Inc. و دی متیل سولفوکسید (DMSO) و 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) از شرکت Sigma-Aldrich خریداری شد. معرف TRIZol، کیت رونویسی معکوس (RT) و کیت TB Green™ RT-PCR از TaKaRa Co., Ltd., Dalian، چین خریداری شد. آنتی‌بادی‌های Anti-ER Rabbit pAb، anti-ER Rabbit pAb، و آنتی‌بادی‌های اکتین از Wanlei Biotechnology Co., Ltd. خریداری شدند. همه مواد شیمیایی رایج دیگر از تامین‌کنندگان تجاری استاندارد خریداری شدند.

آماده سازی نمونه

تهیه گلیکوزیدهای محلول سیستانچس

عصاره GCs در DMSO حل شد تا محلولی با غلظت 0.1051 گرم در میلی لیتر به دست آید و در دمای 4 درجه نگهداری شد. RPMI-1640 بدون فنل قرمز برای رقیق کردن محلول موجود در غلظت‌های مختلف قبل از استفاده استفاده شد.

تهیه محلول استوک استرادیول

عصاره E2 در DMSO حل شد و محلول استوک با غلظت 27/27 میلی گرم در میلی لیتر 0 تهیه شد و در دمای 4 درجه نگهداری شد. RPMI-1640 بدون فنل قرمز برای رقیق کردن محلول موجود در غلظت‌های مختلف قبل از استفاده استفاده شد.

تهیه سرم جنین گاوی تحت درمان با دکستران زغال چوب

صدها میلی لیتر FBS با 250 میلی گرم پودر زغال چوب فعال و 25 میلی گرم دکستران مخلوط شد. پس از انکوباسیون به مدت 45 دقیقه در دمای 55 درجه، مخلوط در 4 درجه و 1000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی با استفاده از غشای PES Millipore Express فیلتر شد تا زغال چوب درمان شده با دکستران (CDT)-FBS به دست آید و در دمای 20- درجه نگهداری شود.

کشت سلولی

رده های سلولی سرطان سینه انسان MCF-7 از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) به دست آمد. علاوه بر این، سلول ها با محیط RPMI-1640 حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین در دمای 37 درجه تحت اتمسفر 5 درصد CO2 مرطوب شده کشت داده شدند. سلول ها در محیط RPMI-1640 فاقد فنل قرمز حاوی 5 درصد CDT-FBS 4 روز قبل از سنجش MTT کشت داده شدند تا استروژن در سلول ها پاک شود.

تجزیه و تحلیل تکثیر سلولی استرادیول در رده‌های سلولی MCF-7

تکثیر سلولی با استفاده از روش MTT برای سلول های MCF-7 اندازه گیری شد.[15،16] E2 در محیط کشت RPMI-1640 حاوی {7}}.1 درصد DMSO در غلظت های نهایی {{27} حل شد. }}.1، 1، 10، 100 و 1000 نانومتر. رده های سلولی MCF-7 به مدت 4 روز در محیط کشت RPMI-1640 فاقد فنل قرمز کشت داده شدند. پس از سه بار شستشو با سالین بافر فسفات (PBS)، 100 میکرولیتر از محیط RPMI-1640 بدون FBS به صفحات 96 چاهی در 1.5 × 104 در هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن، سلول ها با غلظت های مختلف محلول E2 به مدت 72 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس 100 میکرولیتر محلول MTT (mg/mL 5/0) به هر چاهک اضافه شد. سلول ها به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. در نهایت 150 میکرولیتر DMSO برای حل کردن بلورهای فورمازان اضافه شد. جذب در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت خوان اندازه گیری شد و نرخ تکثیر (PR) محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل تکثیر سلولی گلیکوزیدهای سیستانچ در رده های سلولی MCF-7

تکثیر سلولی با استفاده از روش MTT برای سلول‌های MCF-7 اندازه‌گیری شد. GCها در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 0.1 درصد DMSO در غلظت‌های نهایی 0 حل شدند.0175، 0.175، 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم /ml. رده های سلولی MCF-7 در محیط کشت RPMI-1640 فاقد فنل قرمز حاوی 5 درصد CDT-FBS به مدت 4 روز کشت داده شدند. پس از سه بار شستشو توسط PBS، 100 میکرولیتر از محیط RPMI-1640 بدون FBS به صفحات 96 چاهی در 1.5 × 104 در هر چاه اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن، سلول ها با غلظت های مختلف محلول GCs به ترتیب به مدت 24، 48 و 72 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس 100 میکرولیتر محلول MTT (mg/mL 5/0) به هر چاهک اضافه شد. سلول ها به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. در نهایت 150 میکرولیتر DMSO برای حل کردن بلورهای فورمازان اضافه شد. جذب در طول موج 570 نانومتر توسط میکروپلیت خوان اندازه گیری شد و PR محاسبه شد. RPMI-1640 بدون فنل قرمز و محیط حاوی E2 (2.725 × 10-3 میکروگرم در میلی لیتر) به ترتیب گروه های منفی و مثبت بودند.

تجزیه و تحلیل تکثیر سلولی گلیکوزیدهای سیستانچ با فولوسترانت در رده‌های سلولی MCF{0}}

تکثیر سلولی با استفاده از روش MTT برای سلول‌های MCF-7 اندازه‌گیری شد. GCها در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 0.1 درصد DMSO در غلظت‌های نهایی 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم بر میلی‌لیتر حل شدند. رده های سلولی MCF-7 در محیط کشت RPMI-1640 فاقد فنل قرمز حاوی 5 درصد CDT-FBS به مدت 4 روز کشت داده شدند. پس از سه بار شستشو توسط PBS، 100 میکرولیتر از محیط RPMI-1640 بدون FBS به صفحات 96 چاهی در 1.5 × 104 در هر چاه اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن، سلول ها با غلظت های مختلف محلول GCs تیمار شدند و با فولوسترانت (6.06 × 10-5 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. سپس 100 میکرولیتر محلول MTT (mg/mL 5/0) به هر چاهک اضافه شد. سلول ها به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. در نهایت 150 میکرولیتر DMSO برای حل کردن بلورهای فورمازان اضافه شد. جذب در طول موج 570 نانومتر توسط میکروپلیت خوان اندازه گیری شد و PR محاسبه شد. RPMI-1640 بدون فنل قرمز و محیط حاوی E2 (2.725 × 10-3 میکروگرم در میلی لیتر) به ترتیب گروه های منفی و مثبت بودند.

سنجش چرخه سلولی

GCها در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 0.1 درصد DMSO در غلظت‌های نهایی 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم بر میلی‌لیتر حل شدند. رده های سلولی MCF-7 در محیط RPMI-164{45}} فاقد فنل قرمز حاوی 5 درصد CDT-FBS به مدت 4 روز کشت داده شدند. پس از سه بار شستشو توسط PBS، 1 میلی لیتر از محیط RPMI-1640 بدون FBS به صفحات 6 چاهی در هر چاهک 2.5×105 اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت انکوبه شد. پس از آن، سلول ها با غلظت های مختلف محلول GCs تیمار شدند و با فولوسترانت (6.06 × 10-5 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. سپس سلول‌ها جمع‌آوری و سه بار با PBS شسته شدند، در 4 درجه، دور 1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و با اتانول 70 درصد در دمای 20- درجه یک شب ثابت شدند. پس از دو بار شستشو با PBS، سلول ها با محلول PI (50 میلی گرم بر میلی لیتر) حاوی 1 میلی گرم در میلی لیتر RNase A و 0.1 درصد Triton X-100 به مدت 30 دقیقه در تاریکی در دمای 4 درجه رنگ آمیزی شدند. چرخه سلولی با استفاده از فلوسیتومتری شناسایی شد و شاخص تکثیر (PI) به شرح زیر محاسبه شد. RPMI-1640 بدون فنل قرمز و محیط حاوی E2 (2.725 × 10-3 میکروگرم در میلی لیتر) به ترتیب گروه های منفی و مثبت بودند. PI=(S به علاوه G2 M)/(G0 /G1 به علاوه S به علاوه G2 M) × 100 درصد

جداسازی RNA و تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی

برای اندازه‌گیری سطح mRNA، از روش RT-quantitative PCR (qPCR) استفاده شد. RNA کل سلولی با معرف TRIZol استخراج شد. برای qPCR، RNA از 4 میکروگرم RNA کل با استفاده از کیت RT به cDNA رونویسی معکوس شد. آنالیزهای RT-PCR با استفاده از کیت TB Green™ RT-PCR انجام شد. تمامی پروتکل ها طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. جفت پرایمر مورد استفاده برای تقویت ER 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (به جلو) و 5'-TGGCTGGACACACATATAGTCGTT-3' (معکوس) بود. جفت پرایمر مورد استفاده برای تقویت ER 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (به جلو) و 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (معکوس) بود. شرایط PCR برای ER و ER 94 درجه برای 3 دقیقه و سپس 37 و 40 سیکل به ترتیب، 94 درجه برای 30 ثانیه، 58 درجه برای 2 دقیقه و 72 درجه برای 2 دقیقه بود. جفت پرایمر مورد استفاده برای تقویت GAPDH 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (به جلو) و 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (معکوس) بود. شرایط PCR برای GAPDH 94 درجه برای 3 دقیقه و سپس 30 سیکل 94 درجه برای 30 ثانیه، 58 درجه برای 2 دقیقه و 72 درجه برای 2 دقیقه بود. هر بار آزمایش RT-qPCR بیش از دو بار تکرار شد. برای این منظور از GAPDH به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. بیان ژن نسبی ER/ER ترانسفکتانت ها در رابطه با سلول های کنترل محاسبه شد: 2-(∆∆Ct).

وسترن بلاتینگ

بیان پروتئین های ER و ER با استفاده از روش وسترن بلات به عنوان روش گزارش شده با تغییرات جزئی شناسایی شد. به طور خلاصه، سلول‌های MCF-7 در صفحات 6 چاهی با 2.5 × 105 سلول در هر چاهک رشد کردند و به ترتیب با GCs در غلظت‌های 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم بر میلی‌لیتر به‌مدت 48 ساعت تیمار شدند. پس از انکوباسیون، عصاره های کل سلولی با استفاده از بافر RIPA حاوی 1 میلی مولار PMSF تهیه شد. پروتئین‌های موجود در عصاره‌های کل سلولی با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم-پلی آکریل آمید 12 درصد جدا شده و سپس به غشاهای پلی‌وینیلیدین دی فلوراید منتقل شدند. غشاء با 5 درصد (w/v) شیر بدون چربی حل شده در بافر TBST مسدود شد و به نوبه خود با آنتی بادی های اولیه و ثانویه انکوبه شد. آنتی بادی های متصل مشاهده شد.

تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین و انحراف معیار بیان شد و معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون t Student با نرم‌افزار SPSS 21.{1}} (IBM Co., Ltd. America) انجام شد. پ<0.05 was="" considered="" statistically="">

نتایج

پس از 24 ساعت درمان با E2، تکثیر سلول های MCF-7 به وضوح افزایش یافت [شکل 1a]. 10 نانومولار محلول E2 می تواند رشد سلول ها را به وضوح تحریک کند (123.89 درصد). با این حال، با افزایش غلظت E2، توانایی تکثیر سلولی ضعیف شد. از این رو، 10nM غلظت بهینه E2 در این آزمایش بود.

گروه GCs در غلظت های 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم بر میلی گرم می تواند تکثیر رده های سلولی MCF-7 را با روشی وابسته به زمان و دوز افزایش دهد و تفاوت معنی داری با گروه منفی نشان داد [شکل 1b]. در مقایسه با یک گروه منفی، گروه E2 تکثیر آشکاری را نشان داد (120.06 درصد).

گروه دارویی ترکیبی (CMG) (فولوستران با E2 یا GCs) در محیط CDT-FBS با سلول های MCF-4 انکوبه شدند. پس از 72 ساعت انکوباسیون، CMG می‌تواند به شیب PR در مقایسه با گروه دارویی منفرد (IMG) منجر شود (01/0 < 0)="" [شکل="">

تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری نشان داد که GCها می توانند مقدار PI را کمی افزایش دهند که نشان می دهد GCها می توانند سلول های فاز G{{0}}}/G1 را به فازهای S و G2/M پیش ببرند [شکل 2 و جدول 1] و DNA سلول را ارتقا دهند. سنتز. نتیجه نشان می‌دهد که مکانیسم GCها در MCF-7 مشابه مکانیسم E2 است. در CMG (fulvestrant با GCs)، مقدار PI سلول PI به مقدار IMG کمی کاهش یافت (P <>

تجزیه و تحلیل RT-PCR نشان داد که بیان mRNA ژن ER و ER در مقایسه با گروه کنترل (01/0 < 0) به روشی وابسته به دوز پس از درمان با غلظت‌های مختلف GCs به مدت 48 ساعت افزایش یافته است [شکل 3a و b].

نتیجه وسترن بلات نشان می‌دهد که پس از درمان با غلظت‌های مختلف GCs به مدت 48 ساعت، محتوای پروتئین‌های ER و ER در MCF-7 با GCs به صورت وابسته به دوز افزایش می‌یابد [شکل 3c-e]

نتیجه

در این تحقیق تأثیر GCها بر تکثیر و چرخه سلولی MCF-7 به ترتیب با روش MTT و فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. GCها می توانند تکثیر سلول های MCF-7 را در غلظت های 1.75، 17.5 و 175 میکروگرم در میلی لیتر پس از انکوبه به مدت 72 ساعت افزایش دهند. با این حال، زمانی که CCs و fulvestrant با هم استفاده می‌شوند، این افزایش کاهش می‌یابد. GCها می‌توانند مقدار PI سلول‌های MCF-7 را افزایش دهند، سلول فاز G1 را کاهش دهند و سلول فازهای S و G2 را افزایش دهند.

Fulvestrant یک آنتاگونیست اختصاصی ER است که با ایجاد اختلال در دیمریزاسیون گیرنده و حمل و نقل هسته ای وابسته به انرژی، مکان یابی هسته ای ER را مسدود می کند.[17] در این تحقیق، نتیجه‌گیری تأیید کرده است که فولوسترانت می‌تواند تکثیر GCها را در سلول‌های MCF-7 تضعیف کند و می‌تواند بر تبدیل چرخه سلولی تأثیر بگذارد. از این رو، این مطالعه فعالیت استروژنی GCها را نشان داد و همچنین ER هدف GCها است. در آزمایش RT-PCR و وسترن بلات، بیان mRNA و پروتئین ER و ER در سلول‌های MCF-7 با افزایش غلظت GCs افزایش یافت. از این رو، GCها می توانند با توجه به mRNA و پروتئین های تنظیم شده ER و ER در فعالیت استروژنی نقش داشته باشند.