تماس:jerry.he@wecistanche.com

Vinita D. Apraj1، Nancy S. Pandita2

1 گروه علوم زیستی، 2 گروه شیمی، دانشکده علوم Sunandan Divatia، NMIMS SVKM، Vile-Parle (W)، بمبئی، ماهاراشترا، هند

سیستانچ اثر ضد پیری دارد

چکیده

سابقه و هدف: پوست مرکبات مشبک بلانکو به طور سنتی به عنوان مقوی، معده، قابض و ضد نفخ استفاده می شود. در مراقبت از پوست نیز مفید است. هدف: مطالعهضد پیریپتانسیل عصاره های الکلی پوست C. reticulata Blanco با استفاده از روش های آنتی اکسیدانی و ضد آنزیمی آزمایشگاهی

مواد و روش‌ها: عصاره‌های گیاهی به روش سوکسلاسیون (CR HAE- Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata) و روش خیساندن (CR CAE- Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata) به دست آمد. تجزیه و تحلیل کمی و کیفی فیتوشیمیایی انجام شد. علاوه بر این، در شرایط آزمایشگاهیآنتی اکسیدانآنالیزهای ضد آنزیمی و کروماتوگرافی گازی - طیف سنجی جرمی (GC-MS) انجام شد. یافته‌ها: محتوای فنلی و فلاونوئیدی کل CR HAE بیشتر از CR CAE بود. مقدار EC5{51}} CR HAE و CR CAE برای 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, Superoxide anion و 2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 16/40 ± 33/33 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 78/15 ± 73/254 میکروگرم بر میلی‌لیتر، 25/11 ± 27/221 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 79/23 ± 20/354 میکروگرم بر میلی‌لیتر، و 1/2 ± 16/59 میکروگرم بر میلی‌لیتر، و 1/2 ± 16/2 میکروگرم در میلی‌لیتر و 17/2 ± میکروگرم در میلی‌لیتر مقادیر ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن برای CR HAE و CR CAE به ترتیب برابر با 1243 و 1063 میکرومول 6-هیدروکسی-2،5،7،8-تترا متیل کرومان-2-کربوکسیلیک اسید بر گرم ماده بود. فعالیت های ضد کلاژناز و ضد الاستاز برای هر دو CR HAE و CR CAE مورد ارزیابی قرار گرفت. مقادیر EC50 CR HAE و CR CAE برای آنتی کلاژناز و آنتی الاستاز به ترتیب 6.38 ± 329.33 میکروگرم بر میلی لیتر، 8.04 ± 466.93 میکروگرم بر میلی لیتر و 0.22 ± 0.24 mg/ml، 0.09 ± 0.09 mg/ml بود. CR HAE فعالیت ضد کلاژناز و ضد الاستاز قوی تری نسبت به CR CAE نشان داد. تجزیه و تحلیل GC-MS CR HAE انجام شد زیرا CR HAE بالاتر از خود نشان دادآنتی اکسیدانو پتانسیل ضد آنزیمی نسبت به CR CAE. نتیجه‌گیری: از لایه‌برداری C. reticulata می‌توان استفاده کردضد چروکفرمولاسیون های مراقبت از پوست

کلمات کلیدی: 1،1-دیفنیل-2-پیکریل هیدرازیل، 2، 2'-آزینو-بیس (3-اتیل بنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید)، ضد چروک، الاستاز، کروماتوگرافی گازی - ظرفیت جذب رادیو اکسژنی، طیف سنجی جرمی

خلاصه

• پتانسیل ضد پیری پوست Citrus reticulata Blanco از طریق پوست مورد ارزیابی قرار گرفت

• درونکشتگاهیآنتی اکسیدانو سنجش ضد آنزیمی

• دو نوع استخراج انجام شد و عصاره ها مورد تجزیه و تحلیل کمی و کیفی فیتوشیمیایی قرار گرفتند. عصاره به‌دست‌آمده توسط Soxhlation (CR HAE) محتوای فنلی و فلاونوئیدی کل بالاتری نسبت به عصاره به‌دست‌آمده از خیساندن (CR CAE) نشان داد.

• CR HAE فعالیت مهارکنندگی رادیکال آزاد DPPH و سوپراکسید قوی را نشان داد در حالی که، فعالیت مهاری ABTS هر دو عصاره مشابه بود. ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC) CR HAE بیشتر بود. نشان دهنده پتانسیل آنتی اکسیدانی قوی آن است

• فعالیت های مهاری آنزیم کلاژناز و الاستاز در شرایط آزمایشگاهی برای هر دو عصاره مورد ارزیابی قرار گرفت و CR HAE پتانسیل قوی ضد کلاژناز و ضد الاستاز را نشان داد که نشان دهنده توانایی ضد پیری آن است.

• تجزیه و تحلیل GC-MS CR HAE وجود ترکیبات مختلف را نشان داد

عمدتا شامل پلی متوکسی فلاون ها می باشد. CR HAE فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد آنزیمی امیدوارکننده ای از خود نشان داد و می تواند به عنوان یک پتانسیل مورد استفاده قرار گیرد.ضد چروکعامل درضد پیریفرمولاسیون های مراقبت از پوست

مخفف مورد استفاده: ECM: ماتریکس خارج سلولی، UV: ماوراء بنفش، ROS: گونه های اکسیژن فعال، MMP: ماتریکس متالوپروتئیناز، Chc: کلستریدیوم هیستولیتیکوم کلاژناز، DPPH: 2، 2-diphenyl-Masl-Gazomatyl-Gazromatry: طیف‌سنجی، RT: دمای اتاق، میکروگرم GAE/ میلی‌گرم: میکروگرم معادل اسید گالیک / میلی‌گرم، وزن بر وزن: وزن به حجم، میکروگرم QE/

میلی گرم: میکروگرم کوئرستین معادل / میلی گرم، CR HAE: عصاره الکلی داغ Citrus reticulata Blanco، CR CAE: عصاره الکلی سرد Citrus reticulata Blanco، EC50: نیمه حداکثر غلظت موثر، PMS NADH: NADH: NADH: NADH: Phentrouetete DMSO: دی متیل سولفوکسید، APS: پرسولفات آمونیوم، AAPH: 2،2-آزوبیس(2-آمیدین-پروپان) دی هیدروکلراید، TROLOX: (±) 6-هیدروکسی-2،5،7،8-کرمان-کاربوکسیلیک اسید، ORAC: ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن، FALGPA: N‑[3-(2-Furyl) acryloyl)]-Leu-Gly-Pro-Ala، SANA: Succinyl-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Pi-Alitation فاکتور، MSD: آشکارساز انتخابی جرم

مقدمه

مهمترین نقش پوست برای انسان ایجاد حائل بین محیط داخلی و خارجی بدن است. از نظر درونی، پوست از کل پدیده فیزیکوشیمیایی لازم برای زندگی محافظت کرده و از آن محافظت می کند، از نظر خارجی مانعی در برابر نیروهای مکانیکی است. پوست بزرگترین عضو بدن است.[1] این عضو بسیار حساس است و به راحتی در اثر عفونت و بیماری آسیب می بیند.

این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.{4}} توزیع شده است، که به دیگران اجازه می‌دهد تا زمانی که به نویسنده اعتبار داده می شود و آثار جدید تحت شرایط یکسان مجوز می گیرند.

مشکلات پوستی می تواند به دلیل عوامل مختلفی مانند آلودگی محیطی، قرار گرفتن بیش از حد در معرض اشعه ماوراء بنفش، سن افراد، میکروارگانیسم های مضر، عادات غذایی، استرس و مواد شیمیایی ایجاد شود. درمان و مراقبت از پوست نه تنها برای داشتن پوستی سالم، بلکه برای رفاه کلی فرد نیز ضروری است.[2]

یکی از مشکلات مهم پوست در دنیای امروز، پیری زودرس پوست است. روند پیری پوست به دو دسته پیری درونی و بیرونی تقسیم می شود. پیری ذاتی پوست یا پیری طبیعی ناشی از تغییر خاصیت ارتجاعی پوست در طول زمان است. پیری بیرونی پوست عمدتاً در نتیجه قرار گرفتن در معرض تابش خورشید (پیری عکس) است. رادیکال های آزاد که در اثر استرس اکسیداتیو تشکیل می شوند، نقش عمده ای در سیر پیری درونی و بیرونی دارند.[3] پوست از سه لایه اصلی تشکیل شده است. اپیدرم، درم و زیر پوست. اجزای اصلی درم فیبرهای کلاژن و الاستین هستند. کاهش کلاژن و الاستین منجر بهچین و چروکتشکیل.[4] دلیل اصلی این است که پوست شروع به افتادگی و شکل گیری می کندچین و چروکتجزیه الاستین و کلاژن است. آنزیم های کلاژناز و الاستاز مسئول تجزیه اجزای مختلف ماتریکس خارج سلولی (ECM) یعنی کلاژن و الاستین هستند. الاستین پروتئینی است که به لطافت و استحکام پوست کمک می کند. هنگامی که پوست شما کشیده می شود، این الاستین است که آن را به وضعیت طبیعی خود باز می گرداند. کلاژن یک پروتئین فیبری است. کلاژن در بین پروتئین ها به دلیل استحکام کششی بسیار بالایی که دارد باعث استحکام پوست می شود.چین و چروکنتیجه ترکیبی از پیری درونی و بیرونی و همچنین افزایش سطح آنزیم های کلاژناز و الاستاز است.[5]

لوازم آرایشی به طور منظم و جهانی در اشکال مختلف برای افزایش زیبایی استفاده می شود. لوازم آرایشی مراقبت از پوست، لایه سطحی پوست را با محافظت بهتر در برابر محیط نسبت به پوست درمان نشده، درمان می‌کنند.[6] تقاضای فزاینده ای برای لوازم آرایشی مراقبت از پوست صورت وجود دارد. بر اساس داده‌های مانیتور، هزینه جهانی محصولات مراقبت از پوست در سال 2012 82 میلیارد دلار بود که دو سوم هزینه‌ها را مراقبت از پوست صورت تشکیل می‌داد. یک گزارش توسط تحقیقات و بازارها، انتظار دارد که درآمد صنعت محصولات مراقبت از پوست جهانی در سال 2018 از 100 میلیارد دلار عبور کند. انتظار می‌رود بخش مراقبت از صورت همچنان بر بازار تسلط داشته باشد. افزایش تقاضا برایضد پیریمحصولات و نگرانی فزاینده برای استفاده از محصولات مراقبت از پوست طبیعی و ارگانیک از عوامل اصلی محرک صنعت مراقبت از پوست هستند.[7] لوازم آرایشی به تنهایی برای مراقبت از پوست و اعضای بدن کافی نیست. برای بررسی آسیب و پیری پوست نیاز به ترکیب مواد فعال دارد. این مواد فعال گیاهی که حاوی مواد فعال هستند برای حفظ سلامت پوست بسیار ضروری هستند. لوازم آرایشی با مواد فعال گیاهی در حال حاضر به عنوان یک راه حل مناسب برای مشکل فعلی در حال ظهور است.[8] در مطالعه حاضر پوستضد پیریپتانسیل عصاره های الکلی پوست Citrus reticulata Blanco با سنجش آنتی اکسیدان، آنتی کلاژناز و آنتی الاستاز آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت. C. reticulata Blanco (Rutaceae) معمولاً به نام Narangi یا Santra (نارنجی) شناخته می شود. میوه آن ملین، مقوی، قابض، مقوی و رفع کننده استفراغ است.[9] پوست میوه به طور سنتی به عنوان مقوی، معده، قابض، ضد نفخ و ضد اسکوربوت استفاده می شود. پوست مرکبات به عنوان یک محصول جانبی از صنعت میوه مرکبات در نظر گرفته شده است، اما گزارش شده است که حاوی چندین عنصر فعال با غلظت بسیار بالاتر از خمیر است.[10] پوست میوه نیز برای مراقبت از پوست مفید است.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

اسید اسکوربیک، کورستین، کلرید آهن، کربنات سدیم (Na2CO3)، نیتریت سدیم (NaNO2)، هیدروکسید سدیم (NaOH)، کلرید آلومینیوم (AlCl3)، 1،1-دیفنیل-2-پیکریل هیدرازیل (DPPH)، پانکریل هیدرازیل (DPPH)، الخارک 0.3.4.21.36)، سوکسینیل-آلا-آلا-آلا-p-نیتروآنیلید (SANA)، کلستریدیوم هیستولیتیکوم کلاژناز (ChC) (EC.3.4.23.3)، N-(3-[2-Furyl-Leo-Acry) Gly-Pro-Ala (FALGPA)، نمک فلورسین سدیم، 2،2-azobis (2-methyl propionamidine) دی هیدروکلراید (AAPH) و اسید گالیک از Sigma Chemical Co. (سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) 2، 2 خریداری شد. دی آمونیوم -آزینو بیس (3-اتیل بنزوتیازولین-6-سولفونیک اسید)

نمک (ABTS)، (±) 6-هیدروکسی-2،5،7،8-تترا متیل کرومان-2-کربوکسیلیک اسید (TROLOX) از Fluka، ایالات متحده آمریکا. تترازولیوم نیترو آبی (NBT)، متوسولفات فنازین (PMS) و نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید - نمک دی سدیم احیا شده (NADH) از SRL Pvt به دست آمد. Ltd.، بمبئی، هند آمونیوم در سولفات (APS) از Rankem، هند خریداری شد.

مجموعه مواد گیاهی

میوه های C. reticulata Blanco، Rutaceae در ژانویه 2013 از بمبئی (هند) به دست آمد. شناسایی طبقه بندی مواد گیاهی توسط دکتر CS Latto، دانشگاه مومبای تایید شد. احراز هویت در موسسه تحقیقاتی آغارکار، پونا انجام شد.

استخراج مواد گیاهی

میوه ها به طور کامل زیر آب شسته شدند. پوست از میوه ها جدا شد و در سایه خشک شد. سپس مواد خشک شده به صورت پودر در آمده و در ظرف دربسته در دمای اتاق نگهداری می شود. حدود 50 گرم پودر خشک شده با 300 میلی لیتر متانول استخراج شد. عصاره های گیاهی با استفاده از سوکسله (CR HAE- Hot Alcoholic Extract of Citrus reticulata) و روش خیساندن (CR CAE- Cold Alcoholic Extract of Citrus reticulata) به دست آمد. استخراج سوکسله در دمای 65 درجه به مدت 10-12 ساعت انجام شد. خیساندن سرد با تکان دادن مداوم انجام شد. که در آن مخلوط پودر گیاه و متانول روی یک شیکر چرخشی (REMI CIS-24 PLUS) نگهداری شد و به مدت 72 ساعت در 100 دور در دقیقه در RT تنظیم شد. عصاره ها با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره فیلتر شدند. 1، و فیلترها سپس تحت فشار کاهش یافته تبخیر شدند و با استفاده از یک اواپراتور چرخشی (R‑205، تجهیزات آزمایشگاهی بوچی، Flawil، سوئیس) در دمای 50 درجه خشک شدند. عصاره های خشک شده تا زمان استفاده بعدی در بطری های برچسب دار، استریل و درب دار در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی اولیه عصاره ها

عصاره ها همانطور که در بالا ذکر شد تحت آزمایش های مختلف فیتوشیمیایی کیفی برای شناسایی ترکیبات شیمیایی موجود در مواد گیاهی طبق روش های توصیف شده قرار گرفتند.[11]

تعیین محتوای فنلی کل

محتوای فنلی کل (TPC) با معرف Folin-Ciocalteu با استفاده از روش داده شده تعیین شد.[12] به 0.5 میلی‌لیتر از هر نمونه، 2.5 میلی‌لیتر رقت 1:10 معرف Folin-Ciocalteau و 2 میلی‌لیتر Na2CO3 (7.5 درصد w/v) اضافه شد و با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی ماوراء بنفش در 765 نانومتر انکوبه شد. نتایج به صورت میکروگرم معادل اسید گالیک در هر میلی گرم عصاره (میکروگرم GAE/mg عصاره) بیان شد.

تعیین محتوای فلاونوئید کل

محتوای فلاونوئید کل (TFC) با روش رنگ سنجی AlCl3 اندازه گیری شد.[13]

مقدار کمی (1 میلی‌لیتر) از عصاره‌ها یا محلول‌های استاندارد کوئرستین (2{8}}، 4{13}}، 60، 80 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به یک بالن حجمی 10 میلی‌لیتری حاوی 4 میلی‌لیتر اضافه شد. آب مقطر. به فلاسک 0.30 میلی لیتر NaNO2 5 درصد و پس از 5 دقیقه 0.3 میلی لیتر AlCl3 10 درصد اضافه شد. پس از 5 دقیقه، 2 میلی لیتر NaOH 1 مولار اضافه شد و حجم آن با آب مقطر به 10 میلی لیتر رسید. محلول مخلوط شد و جذب در برابر مواد خالی در طول موج 510 نانومتر اندازه‌گیری شد. TFC به صورت میکروگرم کوئرستین معادل در هر میلی گرم عصاره (میکروگرم QE/mg عصاره) بیان شد.

سنجش آنتی اکسیدانی

1، 1-دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل روش مهار رادیکال آزاد

فعالیت مهار رادیکال های آزاد با استفاده از روش داده شده با برخی تغییرات ارزیابی شد.[14] فعالیت مهار رادیکال های آزاد با روش داده شده با برخی تغییرات ارزیابی شد. حجم 1 میلی لیتر از غلظت های مختلف (1{5}} 0-800 میکروگرم بر میلی لیتر) نمونه های آزمایشی با 200 میکرولیتر (0.36 میلی گرم در میلی لیتر) محلول متانول DPPH مخلوط شد. پس از تکان دادن، مخلوط در تاریکی در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شد و سپس جذب در طول موج 517 نانومتر اندازه‌گیری شد. اسید اسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

روش مهار آنیون سوپراکسید سیستم فنازین متوسولفات-NADH

فعالیت مهار سوپراکسید با روش داده شده ارزیابی شد.[15] بافر تریس HCl (3 میلی‌لیتر، 16 میلی‌مولار، pH 8.{4}}) حاوی 0.75 میلی‌لیتر محلول NBT (50 میکرومولار)، 0}.75 میلی‌لیتر NADH ( محلول 78 میکرومولار، و 0.3 میلی لیتر محلول نمونه عصاره (50-350 میکروگرم بر میلی لیتر) در متانول مخلوط شدند. واکنش زمانی آغاز شد که 0.75 میلی لیتر محلول PMS (10 میکرومولار) به مخلوط اضافه شد. مخلوط واکنش در دمای 25 درجه به مدت 5 دقیقه انکوبه شد و جذب در 560 نانومتر در برابر نمونه های خالی مربوطه قرائت شد. اسید اسکوربیک به عنوان استاندارد استفاده شد.

2، 2'-azino-bis ({{4}اتیل بنزوتیازولین-6-اسید سولفونیک) مهار رادیکال

سنجش طبق روش داده شده انجام می شود.[16] کاتیون‌های رادیکال ABTS با واکنش ABTS و APS و انکوبه کردن مخلوط در دمای اتاق در تاریکی به مدت 16 ساعت تولید شدند. به طور خلاصه، حجم کل واکنش حاوی 10 میلی‌مولار PBS pH 7.4 (کنترل مثبت یا محلول‌های آزمایشی) با غلظت‌های مختلف بود. محلول رادیکال ABTS به غلظت نهایی 0.219 میلی مولار اضافه شد. مخلوط واکنش مخلوط شد و بلافاصله در 734 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان (VERSA max، Molecular devices، USA) قرائت شد. یک واکنش کنترل بدون نمونه آزمایشی انجام شد. اسید گالیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

توانایی عصاره ها در از بین بردن رادیکال های DPPH، PMS-NADH و رادیکال آزاد ABTS با فرمول زیر محاسبه شد:

فعالیت مهار رادیکال (درصد)=([Abs of control - Abs of sample]/Abs of control) × 100، که در آن Abs جذب در طول موج ذکر شده در حضور یا عدم حضور عصاره های آزمایشی است.

سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن

این سنجش طبق روش توصیف شده انجام شد.[17] مخلوطی از 140 میکرولیتر قبل از جوجه کشی حاوی 20 میکرولیتر محلول آزمایشی یا TROLOX با غلظت های مختلف است. 75 میلی مولار بافر فسفات سدیم، pH 7.4. 120 میکرولیتر سدیم فلورسئین (117 نانومولار) مخلوط و در دمای 37 درجه به مدت 10 دقیقه انکوبه شد. پس از انکوباسیون، 60 میکرولیتر AAPH (40 میلی مولار) اضافه شد و به مدت 15 ثانیه مخلوط شد. واکنش به مدت 90 دقیقه در دمای 37 درجه انجام شد. اندازه‌گیری‌های فلورسانس در فیلترهای 485 نانومتری تحریک و انتشار 520 نانومتری انجام شد.

سنجش آنزیمی

سنجش آنتی کلاژناز

سنجش مهار کلاژناز با روشی که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد، [18] که مبتنی بر هیدرولیز FALGPA توسط کلاژناز برای تولید FA-Leu و Gly-Pro-Ala است. سنجش در بافر 5{7}} میلی مولار Tricine (4{18}} 0 میلی‌مولار NaCl و 10 میلی‌مولار CaCl2، pH 7.5) انجام شد. ChC برای استفاده در غلظت اولیه 0.8 واحد در میلی لیتر در بافر حل شد. بستر مصنوعی، FALGPA، در بافر Tricine به 2 میلی مولار حل شد. عصاره های نمونه با آنزیم در بافر به مدت 15 دقیقه قبل از افزودن سوبسترا برای شروع واکنش انکوبه شدند. مخلوط واکنش نهایی (75 میکرولیتر حجم کل) حاوی 25 میکرولیتر بافر 50 میلی مولار Tricine، 25 میکرولیتر عصاره آزمایشی (250-4000 میکروگرم بر میلی لیتر) و 25 میکرولیتر از 0.1 واحد آنزیم ChC بود. کنترل با بافر 50 میلی مولار Tricine به عنوان عصاره آزمایش در بافر Tricine (50 میلی مولار) حل شد، در حالی که کاتچین به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. پس از افزودن 50 میکرولیتر از سوبسترای 2 میلی مولار FALGPA، فعالیت کلاژناز بلافاصله در 340 نانومتر به مدت 20 دقیقه با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان 96 چاهی (Bio-Tek M Quant, FLX 800) اندازه گیری شد.

سنجش آنتی الاستاز

سنجش به کار گرفته شده بر اساس روش های موجود در ادبیات است.[19] این سنجش در بافر 0.2 میلی مولار Tris-HCL (pH 8.{4}}) انجام شد. الاستاز پانکراس خوک (PE - EC 3.4.21.36) برای ایجاد یک محلول استوک 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در بافر Tris-HCL {{10}.2 میلی‌مولار حل شد. سوبسترا N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA) در بافر 0.8 میلی مولار حل شد. عصاره های آزمایشی (0.156-10 mg/ml) با آنزیم به مدت 20 دقیقه قبل از افزودن سوبسترا برای شروع واکنش انکوبه شدند. مخلوط واکنش نهایی (مجموع 250 میکرولیتر) حاوی 50 میکرولیتر عصاره گیاهی، 160 میکرولیتر بافر، 20 میکرولیتر آنزیم و 20 میکرولیتر سوبسترا بود. از کاتچین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. کنترل های منفی با استفاده از بافر Tris-HCL انجام شد. جذب بلافاصله در 410 نانومتر اندازه‌گیری شد و سپس به‌مدت 20 دقیقه به‌طور مداوم با استفاده از میکروپلیت‌خوان 96 چاهی (Bio-Tek M Quant, FLX 800) اندازه‌گیری شد. درصد مهار برای هر دوی این سنجش ها توسط: فعالیت مهار آنزیم ( درصد )=(1- [B/A]) × 100 محاسبه می شود

جایی که، A=فعالیت آنزیم بدون نمونه، B=فعالیت در حضور نمونه.

کروماتوگرافی گازی - تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی

شرایط زیر برای تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی (GC-MS) اتخاذ شد.[20]شناسایی مؤلفه‌ها با استفاده از کروماتوگرافی گازی Agilent 7890 همراه با آشکارساز جرمی بی‌اثر 5975 C (MSD) توسط DegilejectsAmpox در TriplesA انجام شد. نمونه‌بر خودکار 7693 در Agilent 19091S-433: ستون HP‑5MS (30 متر × 250 میکرومتر × 0.25 میکرومتر). هلیوم به عنوان گاز حامل (1 میلی لیتر در دقیقه) استفاده شد. دمای انژکتور و آشکارساز در 250 درجه نگه داشته شد. دمای ستون به مدت 3 دقیقه روی 60 درجه برنامه ریزی شد و سپس با 10 درجه در دقیقه به مدت 2 دقیقه تا 160 درجه افزایش یافت. دمای بیشتر تا 300 درجه (در 15 درجه در دقیقه) افزایش یافت. طیف جرمی بیش از 40-500 amu در حالت EI به دست آمد. ترکیبات شسته شده با مقایسه داده های طیف جرمی با داده های استاندارد موجود در کتابخانه موسسه ملی استاندارد و فناوری شناسایی شدند. ترکیبات اصلی عصاره متانولی سوکسله از پوست C. reticulata Blanco (CR HAE) با تجزیه و تحلیل GC-MS شناسایی شد.

تحلیل آماری

مقادیر EC50 به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد، تجزیه و تحلیل آماری توسط تجزیه و تحلیل واریانس یک راه و سپس آزمون مقایسه چندگانه توکی انجام شد (05/0 < 0)="" که="" در="" آن،="" همه="" نمونه‌ها،="" یعنی="" عصاره‌های="" آزمون="" و="" استاندارد="" مثبت="" با="" یکدیگر="" مقایسه="" شدند.="" تمام="" محاسبات="" با="" استفاده="" از="" graphpad="" prism="" (نسخه="" 5.0،="" نرم="" افزار="" graphpad،="" ایالات="" متحده="" آمریکا)="" انجام="">

نتایج و بحث

تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی اولیه عصاره ها

تجزیه و تحلیل اولیه فیتوشیمیایی عصاره متانولی C. reticulata Blanco نشان دهنده وجود کربوهیدرات ها، اسیدهای آمینه، فلاونوئیدها، تانن ها و مشتقات فنلی، استروئیدها و غیره است [جدول 1].

جدول 1: آنالیز فیتوشیمیایی اولیه عصاره متانولی پوست Citrus reticulata Blanco

FeCl3: کلرید آهن. CR HAE: عصاره الکلی داغ Citrus reticulata Blanco; CR CAE: عصاره الکلی سرد Citrus reticulata Blanco

تعیین محتوای فنلی کل

فنول ها، به ویژه پلی فنل ها، طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی مفید را در پستانداران از خود نشان می دهند، از جمله ضد ویروسی، ضد باکتریایی، محرک سیستم ایمنی، ضد آلرژی، ضد فشار خون، ضد ایسکمیک، ضد آریتمی، ضد ترومبوز چربی خون، ضد لخته خون اثرات محافظ کبدی، ضد التهابی و ضد سرطان‌زایی.[21،22] چندین مطالعه نشان داده‌اند که فلاونوئیدها به عنوان جاذب‌کننده آنیون‌های سوپراکسید، اکسیژن منفرد، رادیکال‌های هیدروکسیل و رادیکال‌های پراکسیل لیپیدی عمل می‌کنند.[23،24] TPC و TFC. برای هر دو عصاره با استفاده از منحنی های استاندارد تعیین شد [شکل 1]. CR HAE محتوای فنلی بالاتری را نشان داد، یعنی 4.69 ± 187.93 میکروگرم GAE/mg عصاره نسبت به CR CAE، یعنی 2.40 ± 58.66 میکروگرم GAE/mg عصاره. TFCها برای CR HAE و CR CAE تقریباً مشابه بودند، یعنی به ترتیب 171.72 ± 4.13 میکروگرم QE / mg عصاره و 169.88 ± 9.79 میکروگرم QE / mg عصاره.

تعیین محتوای فلاونوئید کل

فعالیت آنتی اکسیدانی نباید بر اساس یک نتیجه باشدآنتی اکسیدانمدل تست در عمل، چندین روش آزمایش آزمایشگاهی برای ارزیابی انجام می شودآنتی اکسیدانفعالیت ها با نمونه های مورد علاقه.[25] در پژوهش حاضر به ارزیابی آن پرداخته ایمآنتی اکسیدانپتانسیل CR HAE و CR CAE توسط مختلفآنتی اکسیدانسنجش‌هایی شامل سنجش مهار رادیکال آزاد DPPH، سنجش مهار آنیون سوپراکسید، سنجش مهار رادیکال ABTS و سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن (ORAC).

سنجش آنتی اکسیدانی

1، 1-دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل روش مهار رادیکال آزاد

DPPH رادیکال آزاد یکی از رایج ترین روش های مورد استفاده برای آزمایش فعالیت اولیه مهار رادیکال عصاره های گیاهی است. راآنتی اکسیدانفعالیت عصاره های گیاهی حاوی اجزای پلی فنل به دلیل ظرفیت آنها برای اهدای اتم های هیدروژن یا الکترون ها و از بین بردن رادیکال های آزاد است.[26] بنابراین، رنگ بنفش DPPH به -دی فنیل-پیکریل هیدرازین (زرد) کاهش می یابد. نتایج نشان می‌دهد که CR HAE و CR CAE تا 85 درصد از رادیکال‌های آزاد DPPH را از بین می‌برند [شکل 2]. اسید اسکوربیک به عنوان کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت و تا 92 درصد فعالیت مهاری نشان داد. CR HAE کمی بالاتر نشان دادآنتی اکسیدانفعالیت نسبت به CR CAE. مقادیر EC50 (μg/ml) در جدول 2 بیان شده است.

روش مهار آنیون سوپراکسید سیستم فنازین متوسولفات-NADH اگرچه آنیون سوپراکسید یک اکسید کننده ضعیف است، اما در نهایت تولید می کند.

جدول 2: ارزش EC عصاره متانولی Citrus reticulata Blanco Peel برای سنجش DPPH، سوپراکسید، ABTS، آنتی کلاژناز و آنتی الاستاز

رادیکال‌های هیدروکسیل قوی و خطرناک و همچنین اکسیژن منفرد، که هر دو به استرس اکسیداتیو کمک می‌کنند.[27] رادیکال‌های سوپراکسید از اکسیژن محلول توسط جفت PMS-NADH تولید می‌شوند و می‌توانند با توانایی آنها در کاهش NBT اندازه‌گیری شوند. کاهش جذب در 560 نانومتر با عصاره گیاه نشان دهنده توانایی آنها در خاموش کردن رادیکال های سوپراکسید در مخلوط واکنش است. CR HAE فعالیت مهار سوپراکسید قوی نسبت به CR CAE نشان داد [شکل 3]. اسید اسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد و آنیون سوپراکسید را تا 52 درصد از بین می برد. مقادیر EC50 (μg/ml) محاسبه و در جدول 2 بیان شد. CR HAE موثرتر از CR CAE بود (0.05 < p)="" زیرا="" مقدار="" ec50="" کمتر="" (μg/ml)="" و="" قوی="" را="" نشان="">آنتی اکسیدانفعالیت.

2، 2'-azino-bis ({{4}اتیل بنزوتیازولین-6-اسید سولفونیک) مهار رادیکال

سنجش ABTS بر اساس مهار نور توسط رادیکال های ABTS است. یکآنتی اکسیدانبا توانایی اهدای اتم هیدروژن، رادیکال آزاد پایدار را خاموش می کند، فرآیندی که با تغییر در جذب همراه است که می تواند به روش اسپکتروفتومتری دنبال شود.[28] فعالیت ABTS از نظر درصد مهار کاتیون رادیکال آزاد ABTS توسطآنتی اکسیدان هادر هر نمونه مقادیر ABTS CR HAE، CR CAE و اسید گالیک در جدول 2 ارائه شده است. CR HAE و CR CAE فعالیت مهار رادیکال ABTS را به صورت وابسته به غلظت نشان دادند و دوتا 59 درصد را مشاهده کردند. اسید گالیک تا 79 درصد از توانایی مهار ABTS را نشان داد [شکل 4]. مقادیر EC5{5}} (μg/ml) به‌دست‌آمده برای CR HAE و CR CAE تفاوت معنی‌داری را نشان نداد (05/0 > P) و نشان داد که هر دو عصاره پتانسیل مهار ABTS تقریباً مشابهی دارند.

سنجش ظرفیت جذب رادیکال اکسیژن

سنجش ORAC به عنوان یک سنجش بیولوژیکی مرتبط‌تر از سایر روش‌های اندازه‌گیری در نظر گرفته می‌شودآنتی اکسیدانقدرت، زیرا واکنش‌های انتقال اتم هیدروژن را اندازه‌گیری می‌کند و in vivo را شبیه‌سازی می‌کندآنتی اکسیدانعمل.[29] همچنین اندازه گیری می کند که چگونه اجزای محلول در آب و محلول در چربی یک ماده طبیعی از یک هدف استاندارد شده در برابر اکسیداسیون توسط پراکسیل نیتریت، رادیکال های هیدروکسیل، آنیون سوپراکسید و

اکسیژن تک، و بر اساس مقایسه با یک امتیاز ایجاد می کندآنتی اکسیدانکنترل. [30] در مطالعه حاضر، ما مقادیر ORAC را برای CR HAE و CR CAE اندازه گیری کردیم و بر حسب TROLOX (میلی مول TROLOX معادل بر گرم ماده) بیان شد [شکل 5]. CR HAE مقدار ORAC بالاتری (1243 میلی مول TROLOX معادل بر گرم ماده) نسبت به CR CAE (1063 میکرومول TROLOX معادل بر گرم ماده) نشان داد [جدول 2].

سنجش آنزیمی

سنجش آنتی کلاژناز

متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) خانواده ای از آنزیم های پروتئولیتیک هستند که اجزای مختلف ECM را تجزیه می کنند. کلاژناز یکی از اعضای خانواده MMP است و مسئول تخریب کلاژن است. کلاژناز از باکتری C. histolyticum (ChC) (C 3.4.24.3) یکی از معدود پروتئینازهایی است که قادر به تجزیه ناحیه مارپیچ سه گانه کلاژن بومی تحت شرایط فیزیولوژیکی و شرایط آزمایشگاهی با استفاده از پپتیدهای مصنوعی به عنوان سوبسترا است. اثر محافظتی عصاره های گیاهی در برابر آنزیم کلاژناز را می توان با استفاده از ChC و سوبسترای مصنوعی FALGPA بررسی کرد.[31] در مطالعه حاضر، فعالیت مهاری کلاژناز برای CR HAE و CR CAE مورد بررسی قرار گرفت. از کاتچین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج نشان داد که عصاره CR HAE نسبت به CR CAE در مهار آنزیم کلاژناز مؤثرتر بود و تا 76 درصد مهار را نشان داد [شکل 6]. اثربخشی بر حسب مقدار EC50 (μg/ml) اندازه‌گیری شد و در جدول 2 بیان شد.

سنجش آنتی الاستاز

الاستاز تنها آنزیمی است که قادر به تجزیه الاستین است. مهار آنزیم الاستاز می تواند خاصیت ارتجاعی و لطافت پوست را حفظ کند.[32] به لحاظضد پیرییافتن مهارکننده های آنزیم الاستاز می تواند مفید باشد

برای جلوگیری از از بین رفتن خاصیت ارتجاعی پوست و در نتیجه افتادگی پوست. در روش آنتی الاستاز، الاستاز پانکراس خوک به روش اسپکتروفتومتری با استفاده از [N-Succ-(Ala) 3-p-nitroanilide] به عنوان سوبسترا مورد سنجش قرار گرفت و مقدار p-nitroaniline با اندازه گیری جذب در 41 تعیین شد. 6}} نانومتر اثرات مهاری CR HAE و CR CAE بر فعالیت الاستاز مورد بررسی قرار گرفت. از کاتچین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. CR HAE در مقایسه با CR CAE فعالیت مهاری الاستاز قوی نشان داد و تا 80 درصد مهار مشاهده شد [شکل 7]. مقادیر EC50 (mg/ml) در جدول 2 بیان شد و مشاهده شد که CR HAE قوی تر از CR CAE است (05/0 > P). مقدار EC50 به‌دست‌آمده برای کاتچین بسیار کمتر نشان‌دهنده فعالیت قوی ضد الاستاز و نقش آن به عنوان یک ماده قوی است.ضد پیریجزء. کیم و همکاران، 2004 نشان دادند که کاتچین و اپی گالوکاتچین گالات جدا شده از چای سبز (Camellia sinensis) مهارکننده های قوی ضد الاستاز هستند.

کروماتوگرافی گازی - تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی

CR HAE بالاتر نشان دادآنتی اکسیدانو توانایی های ضد پیری در مقایسه با CR CAE؛ بنابراین، تجزیه و تحلیل GC-MS CR HAE برای درک اجزای موجود در آن انجام شد. در مجموع 20 ترکیب مختلف شناسایی و در جدول 3 ارائه شد. کروماتوگرام 20 پیک را در زمان ماند در محدوده 2.95 دقیقه تا 44.45 دقیقه نشان داد [شکل 8]. بزرگترین اوج در 44.11 دقیقه با 44.37 درصد سطح به عنوان اسید بوتیل فسفونیک، پنتیل 4-(2-phenylprop-2-yl) فنیل استر شناسایی شد. Zab و همکاران، 2012 [33] گزارش کردندآنتی اکسیدانو فعالیت ضد توموری اسید بوتیل فسفونیک، پنتیل 4-(2-فنیل پروپ-2-یل) فنیل استر موجود در عصاره اتانولی C.reticulata. دی هیدرو) یا 4-کرومانون (21.43 درصد مساحت) که نوعی

فلاوانون دی ماجو و همکاران، 2005 [34] فلاونون ها را از مرکبات جدا کردند و وابسته به ساختار را نشان دادند.آنتی اکسیدانفعالیت. سایر ترکیبات 3', 4', 5, 7, 8-pentamethoxyflavone و 4', 5, 7, 8-tetramethoxyflavone انواع پلی متوکسی فلاون (PMF) هستند. PMF طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی را نشان می دهد. اخیراً، هو و همکاران، 2012 [35] PMF های هیدروکسیله شده از پوست مرکبات را جدا و شناسایی کردند و فعالیت های بیولوژیکی آن ها از جمله خاصیت ضد التهابی و ضد سرطان را بررسی کردند. سایر ترکیبات شناسایی شده عبارتند از D-Limonene (1.46 درصد مساحت)، 4H-Pyran-4-one، 2، 3-dihydro-3، 5-dihydroxy-6-methyl (1.46 درصد سطح)، 2-Methoxy-phenol 1.67 درصد مساحت) و n-هگزادکانوئیک اسید (2.51 درصد سطح) و می تواند باضد پیریپتانسیل لایه برداری C. reticulata Blanco. ساختار تمام ترکیبات شناسایی شده در شکل 9 ارائه شده است.

نتیجه

عصاره C. reticulata Blanco در برابر پیری پوست از طریق آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفتآنتی اکسیدانسنجش آنتی کلاژناز و آنتی الاستاز. این مطالعه نشان داد که عصاره متانولی (سوکسلیشن) امیدوارکننده استآنتی اکسیدانو فعالیت ضد آنزیمی و می تواند به عنوان یک قوی استفاده شودضد چروکعامل درضد پیریفرمولاسیون های مراقبت از پوست

تصدیق

نویسندگان از آزمایشگاه Underwriters (UL)، بنگلور، هند، برای تجزیه و تحلیل GC-MS و درمان های طبیعی، بنگلور، هند، برای تجزیه و تحلیل ORAC تشکر می کنند.

حمایت مالی و حمایت مالی

صفر

تضاد علاقه

تداخل منافع وجود ندارد.