تماس:jerry.he@wecistanche.com

لین بای|گیینگ شی|یا جون یانگ|وی چن|لیان فنگ ژانگ|چوان کین

سیستانچ اثر ضد پیری دارد

خلاصه

زمینه: کاهش مربوط به زمان در ظرفیت بازسازی و هموستاز اندام یکی از ویژگی های اصلی استسالخورده. Rehmannia glutinosa و Astragalus membranaceus به عنوان داروهای گیاهی سنتی چینی برای تقویت ایمنی و عمر طولانی استفاده می شود. با این حال مکانیسمی که این داروی گیاهی پیری را کند می کند ناشناخته است. در این مطالعه، مکانیسم گیاهی را بررسی کردیماثر ضد پیری.

مواد و روش ها: موش ها به مدت 10 ماه با جیره های حاوی R. glutinosa یا A. membranaceus تغذیه شدند. گروه کنترل با رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. فنوتیپ ها با استفاده از سیستم نمره دهی و تجزیه و تحلیل بقا ارزیابی شدند. درصد فنوتیپ‌های پیری سلول‌های بنیادی خونساز (HSCs) با تجزیه و تحلیل مرتب‌سازی سلولی فعال شده با فلورسانس تعیین شد. عملکرد و مکانیسم HSC ها با روش کلونوژنیک و واکنش زنجیره ای پلیمراز بلادرنگ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج:اثر ضد پیریR. glutinosa به دلیل افزایش عملکرد HSC ها است. موش های تغذیه شده با R. glutinosa ویژگی های کند شده را نشان دادندسالخوردهروند، از جمله کاهش پیری و افزایش نرخ بقا. آنالیز فلوسایتومتری کاهش تعداد سلول های Lin-Sca1 به علاوه c-kit- (LSK)، HSC های طولانی مدت (LT-HSCs) و HSC های کوتاه مدت (ST-HSCs) را در گروه R. glutinosa نشان داد. در شرایط آزمایشگاهی، سنجش‌های کلونوژنیک افزایش توانایی خود تجدیدی LT-HSCs از گروه R. glutinosa و همچنین حفظ سکون LSK از طریق بیان p18 افزایش یافته را نشان داد. گروه R. glutinosa همچنین کاهش سطح گونه‌های اکسیژن فعال و درصد سلول‌های -gal پلاس را از طریق کاهش پروتئین p53 و p16 مرتبط با پیری سلولی نشان داد.

نتیجه گیری: Rehmannia glutinosa اعمال می کندضد پیریبا حفظ سکون و کاهش پیری HSC ها تأثیر می گذارد.

کلمات کلیدی: ضد پیری، سلول های بنیادی خونساز، آرامش، Rehmannia glutinosa

1|مقدمه

پیری به عنوان کاهش عملکرد وابسته به زمان که بیشتر ارگانیسم‌های زنده را تحت تأثیر قرار می‌دهد تعریف می‌شود.1 طول عمر ارگانیسم‌ها عمدتاً توسط سلول‌های بنیادی حفظ می‌شود. سلول‌های بنیادی بافتی، ظرفیت خود نوسازی را دارند و به انواع سلول‌های مؤثر تمایز می‌یابند. با این حال، در طول فرآیند پیری، این ظرفیت خود تجدیدی کاهش می‌یابد و در نهایت منجر به تجمع بافت‌های ترمیم‌نشده و آسیب‌دیده در ارگانیسم‌های پیر می‌شود. ۴ از دست دادن توانایی حفظ تعادل بین سکون و تمایز در سلول بنیادی/پیش‌ساز. محفظه ممکن است منجر به مرگ یا بیماری های مرتبط با سن شود.2 علاوه بر این، مطالعات اخیر نشان می دهد که جوان سازی سلول های بنیادی ممکن است فنوتیپ پیری را معکوس کند.5،6 در سیستم خونساز، سلول های بنیادی خونساز (HSCs) مسئول تولید سلول های خونی هستند. در موش های مسن، سیستم خونساز اختلال سلول های لنفوئید T و B را نشان می دهد و تعداد سلول های میلوئیدی افزایش می یابد. HSCهای مسن فعالیت خودبازسازی و کاهش توانایی بازسازی خونسازی را نشان دادند. به طور قابل‌توجهی، تغییرات مربوط به سن در بخش HSC در میزبان پیر به‌عنوان کم‌خونی، افزایش تمایل به نئوپلاسم‌های میلوپرولیفراتیو، کاهش عملکرد ایمنی و افزایش بروز سرطان ظاهر می‌شود.{11}} با این حال، مکانیسم پیری HSC و اثرات داروهای گیاهی بر پیری HSC ناشناخته است

مردم از زمان های قدیم نگران به تعویق انداختن روند پیری و جوان ماندن بوده اندضد پیریتمرکز فعلی تحقیقات است. طب سنتی چینی توجه فزاینده ای را برای درمان بیماری های مختلف مرتبط با افزایش سن به خود جلب کرده است. بسیاری از گیاهان مورد استفاده در طب سنتی چینی از طریق مکانیسم‌های مختلف اثرات مثبتی در برابر پیری دارند. Rehmannia glutinosa و Astragalus membranaceus هزاران سال است که به طور گسترده در این راه مورد استفاده قرار می گیرند.

Rehmannia glutinosa برای درمان اختلالات دیابتی مختلف، تقویت متابولیسم استخوان در پوکی استخوان و مهار التهاب کبد و فیبروز استفاده می شود. علاوه بر این، این گیاه دارای اثرات دیگری از جملهضد خستگیخواص ضد افسردگی و محافظت کننده عصبی. در چند سال گذشته، مطالعات فارماکولوژیک روی R. glutinosa و اجزای فعال آن عمدتاً بر روی اثرات گسترده آن بر روی خون، غدد درون ریز، قلب و عروق و سیستم عصبی متمرکز شده است. بنابراین نشان داده شد که R. glutinosa دارای سیستم ایمنی قوی است. فعالیت های افزایشی، که مبنای نظری را برای مطالعات بیشتر فراهم کرده است.

Astragalus membranaceus دارای خواص مقوی، محافظت کننده کبد، ادرارآور و خلط آور است و نشان داده شده است که تعدیل کننده ایمنی از خود نشان می دهد.ضد التهاب،وآنتی اکسیدانتوضیح مکانیسم‌های مولکولی زیربنای اثرات داروهای سنتی چینی در عمل بالینی، گامی کلیدی به سوی کاربرد جهانی آن‌ها است، و این موضوع در حال حاضر موضوع مورد علاقه تحقیقاتی شدید است.

بنابراین، در این مطالعه، ما به موش‌ها رژیم غذایی حاوی R. glutinosa و A. membranaceus را به مدت 10 ماه تغذیه کردیم تا مکانیسم زیربنایی توانایی R. glutinosa برای افزایش طول عمر را بررسی کنیم.

2|مواد و روش ها

2.1|گروه بندی و درمان حیوانات

موش های ماده C57BL/6J در یک محیط عاری از بیماری زا نگهداری شدند و با یک رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. استفاده از حیوانات در این مطالعه توسط کمیته‌های مراقبت و استفاده از حیوانات مؤسسه علوم آزمایشگاهی حیوانات دانشکده پزشکی پکن تأیید شد. موش‌ها (10 ماهه) به‌طور تصادفی به سه گروه (n=20/گروه) تقسیم شدند. گروه کنترل با یک رژیم غذایی استاندارد (Beijing HFK Biosicence، پکن، چین) تغذیه شدند. رژیم غذایی دو گروه دیگر با R. glutinosa و A. membranaceus (پزشکی چینی پکن تانگ رن تانگ، پکن، چین) به ترتیب با دوز 200 میلی گرم در روز به مدت 10 ماه تکمیل شد. این دوز با استفاده از روش عادی سازی سطح بدن برای تایید دوزهای دارو از مطالعات انسانی تا مطالعات موش انتخاب شد. وزن بدن هر 2 ماه تعیین می شد و بقا روزانه ثبت می شد.

2.2|ارزیابی درجه پیری

یک سیستم نمره گذاری برای ارزیابی درجه پیری بر اساس معیارهای تعریف شده توسط تاکدا و همکاران به کار گرفته شد. هر موش در 18 ماهگی امتیازدهی شد و امتیازات در هر دسته جمع‌بندی شد تا نمره کلی تعیین شود.

2.3|فلوسیتومتری

سلول ها از تیموس، طحال، خون محیطی (PB) و مغز استخوان (BM) برداشت شدند. طحال و تیموس فورا برداشته شدند، با سالین شسته و وزن شدند. طحال و تیموس به آرامی در یک هموژنایزر شیشه ای همگن شدند و سلول ها در سالین استریل بافر فسفات (PBS) معلق شدند. سلول‌های PB برای لیز سلول‌های قرمز خون (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) اعمال شدند. سلول‌های BM با شستشوی استخوان درشت نی و استخوان ران با PBS استریل جدا شدند. تمام سلول‌ها با فیلتراسیون در یک مش نایلونی استریل جدا شدند و به مدت 30 دقیقه در 4 درجه با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلوروفور رنگ‌آمیزی شدند: آنتی‌CD3 کونژوگه با فیکواریترین (PE) (G4.18)، آنتی‌کونژوگه آلوفیکوسیانین (APC) - CD4 (OX35) و ضد CD8a کونژوگه با PE-Cy7 (OX8). برای سلول‌های BM، نشانگرهای دودمان با استفاده از CD4 ضد موش کونژوگه با بیوتین (RM4-5)، CD5 (53-7.3)، CD8a (53-6.7)، CD11b (M1/70)، B220 (RA3-6B2)، رنگ‌آمیزی شدند. TER119 (TER-119) و Gr1 (RB6-8C5) و به دنبال آن رنگ آمیزی با آنتی بادی APC-eFluor {37}}استرپتاویدین کونژوگه نیز از eBioscience (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. آنتی بادی های زیر برای رنگ آمیزی سطح استفاده شد: ایمونوگلوبولین APC (Ig)M (II/41)، ایزوتیوسیانات فلورسینات (FITC) IgD (11-26)، PE-Cy7 Sca-1 (D7)، PE Flt3 ( A2F10)، FITC B220 (RA3-6B2)، FITC CD34 (RAM34)، PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34)، PE CD16/CD32 (93) و PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). تمام آنتی بادی ها از eBiosciences (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) به دست آمدند. داده ها توسط FACS به دست آمد

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) و با استفاده از نرم افزار FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA) تجزیه و تحلیل شد.

2.4|تجزیه و تحلیل چرخه سلولی

برای تجزیه و تحلیل چرخه سلولی، کل سلول های BM برای نشانگرهای سطح سلول های بنیادی (Lin-Sca-1 plus c-KitHigh؛ LSTKs) رنگ آمیزی شدند، سپس ثابت و نفوذ پذیر شدند (00-5123-43؛ Becton Dickinson). ) قبل از رنگ آمیزی با FITC Ki-

67 آنتی بادی و 7-آمینواکتینومایسین D (7-AAD). جمع آوری داده ها بر روی FACS Aria II (Becton Dickinson) انجام شد. داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo تجزیه و تحلیل شد.

2.5|رنگ آمیزی گال مرتبط با پیری

فعالیت مرتبط با پیری (SA) - gal نیز با استفاده از فلوسیتومتری با استفاده از C12FDG همانطور که توسط سازنده (Molecular Probes، یوجین، OR، ایالات متحده آمریکا) توضیح داده شد، مورد سنجش قرار گرفت. به طور خلاصه، سلول های بنیادی ابتدا برای نشانگرهای سطح سلولی رنگ آمیزی شدند و سپس با 100 نانومول L-1 بافیلومایسین A1 به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه برای القای قلیایی شدن لیزوزومی انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، سلول ها با 2 میلی مول L- 1 C12FDG به مدت 1 تا 2 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند و سپس با استفاده از FACS Aria I (Becton Dickinson) آنالیز شدند.

2.6|تعیین تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS).

سلول ها با دی کلرو-دی هیدرو-فلورسین دی استات (DCFH-DA؛ Beyotime، شانگهای، چین) در دمای 37 درجه به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند. DCFH-DA به طور غیرفعال در سلول ها منتشر می شود، جایی که توسط استرازها استیل می شود و دی کلروفلورسین 2'،7' غیر فلورسنت (DCFH) تشکیل می دهد. مقدار فلورسانس منتشر شده با مقدار ROS در سلول ارتباط دارد. داده ها بر روی FACS Aria I (Becton Dickinson) جمع آوری و با استفاده از نرم افزار FlowJo تجزیه و تحلیل شدند.

2.7|تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی (PCR).

RNA کل با استفاده از معرف TRIZol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) طبق دستورالعمل سازنده از سلول ها استخراج شد. ژن های مورد علاقه از RNA های کل تیمار شده با DNase I با استفاده از رونوشت معکوس M-MLV (Promega، Madison، WI، USA) تکثیر شدند.

و پرایمرهای poly-dT. پرایمرهای مورد استفاده برای PCR به شرح زیر بودند: p21 (5'-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3' و 5'-CGAAGAGAGACAACGG- CACACT-3'، Tm=60 درجه، 30 سیکل)، p53 (5'-CATGAACCGCCGACC- TATC- 3′ و 5′‐TCCCGGAACATTCTCGAGGC‐3′, Tm=62 درجه , 35 چرخه, p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ and 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm {{235} درجه چرخه ها)، p57 (5′- AGGAGCAGGACGAGAATCAA-3′ و 5′- TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT-3′، Tm=61 درجه، 30 چرخه)، p19 (5′-ATGGGTCGCAGCAGGTTCTTGTGT′-3CCGTGTGTGTGT-30 ′، Tm=61 درجه، 35 چرخه)، p18 (5'-GGGACCTAGAGCAACTTACT-3' و 5'-TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA-3'، Tm=61 درجه، 30 چرخه)، گلیسرآلدئید 3- فسفات دهیدروژناز (5'-GAGCGAGACCCCACTAACAT-3' و 5'-TTCACACCCATCACAAACAT-3'، Tm=60 درجه، 25 سیکل). Real-time (RT) - PCR با استفاده از SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo، کیوتو، ژاپن) در سیستم تشخیص ABI StepOne™ (Applied Biosystems، Foster City، CA، USA) انجام شد.

2.8|سنجش کلونوژنیک

HSCهای بلندمدت (LT) با مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS) دسته بندی شدند و سپس در صفحات سلولی 96 چاهی با استفاده از محیط پایه متیل سلولز کشت داده شدند (HSC007؛ R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). . برای هر نمونه ده چاه تکراری تهیه شد. ما از صفحه کشت سلولی 96 چاهی، سه سلول در هر چاه استفاده کردیم. دو هفته پس از کاشت، تعداد و اندازه کلنی ها در زیر میکروسکوپ شمارش شد.

2.9|تحلیل آماری

داده ها با استفاده از ANOVA یک طرفه با استفاده از نرم افزار Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) و GraphPad Prism (نرم افزار GraphPad, La Jolla, CA, USA) تجزیه و تحلیل شدند. داده ها به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شد. P < 0.05="" برای="" نشان="" دادن="" معناداری="" آماری="" در="" نظر="" گرفته="">

3|نتایج

3.1|R. glutinosa و A. membranaceus اثرات ضد پیری داشتند

برای تاییداثرات ضد پیریاز R. glutinosa و A. membranaceus، اثرات تجویز به عنوان یک مکمل غذایی (200 میلی گرم در روز) را بررسی کردیم. پس از آن، وزن بدن، درجه پیری و میزان بقای موش‌ها را ثبت کردیم. وزن بدن موش هایی که با R. glutinosa یا A. membranaceus تغذیه می کردند در مقایسه با گروه کنترل طبیعی بود، اگرچه کاهش وزن بدن گروه R. glutinosa و A. membranaceus در 20 ماهگی مشاهده شد (شکل 1A). تجزیه و تحلیل درجه پیری نشان داد که با افزایش سن در گروه های R. glutinosa و A. membranaceus در مقایسه با گروه کنترل، نمره درجه بندی ثابت و غیر قابل برگشت افزایش می یابد، اگرچه این افزایش در گروه A. membranaceus مشخص تر بود. گروه (شکل 1B). نمره بالا به دلیل شروع زودتر از دست دادن انفعال و واکنش پذیری، از دست دادن براقی پوست و افزایش درشتی، ریزش مو، ضایعات پریوفتالمیک، افزایش لوردوکیفوز ستون فقرات و افزایش قابل توجه در شدت آنها بود. 18 موش در A گروه موش membranaceus خصوصیات فنوتیپ پیری مشخص تری از جمله از دست دادن براقی پوست و ریزش مو را نشان دادند. منحنی‌های بقا نشان داد که طول عمر موش‌ها در گروه‌های R. glutinosa و A. membranaceus کمی بیشتر از گروه کنترل بود (شکل 1C). این داده ها تایید کرداثرات ضد پیریاز هر دو R. glutinosa و A. membranaceus، اگرچه R. glutinosa در کند کردن روند پیری کارآمدتر بود.

شکل 1 Rehmannia glutinosa و Astragalus membranaceus داشتنداثرات ضد پیری. موش ها با جیره های حاوی R. glutinosa یا A. membranaceus (2{4}}0 میلی گرم در روز) تغذیه شدند. گروه کنترل با رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. A، تغییرات در وزن بدن موش ها هر 2 ماه اندازه گیری شد. ب، تغییرات در امتیاز درجه بندی پیری موش با افزایش سن. ج، منحنی های بقا. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار است. n=20 موش/گروه. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار است. n=5 موش/گروه.*P <0.05، ***p=""><>

3.2|R. glutinosa تعداد سلول های بنیادی خونساز را کاهش داد

تصور می‌شود فرسودگی سلول‌های بنیادی پیامد یکپارچه انواع آسیب‌های مرتبط با افزایش سن و یکی از دلایل اصلی پیری بافت و ارگانیسم است. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که جوان‌سازی سلول‌های بنیادی ممکن است فنوتیپ پیری را در سطح ارگانیسم معکوس کند. فرض کرد کهاثرات ضد پیریR. glutinosa با افزایش عملکرد سلول های بنیادی واسطه می شود. بنابراین، ما آنالیز فلوسایتومتری تعداد سلول‌های بنیادی/پیش‌ساز خون‌ساز جدا شده از موش‌های 20 ماهه را که با جیره‌های حاوی R. glutinosa یا A. membranaceus (200 میلی‌گرم در روز) تغذیه شده بودند، به مدت 10 ماه انجام دادیم (شکل 2A). . درصد LSK ها در گروه های R. glutinosa و A. membranaceus کاهش یافت (شکل 2B). تعداد HSCهای LT و کوتاه مدت (ST) در گروه R. glutinosa در مقایسه با تعداد در گروه کنترل تقریباً دو برابر کاهش یافت (شکل 2C-D). تعداد بیشتری از پیش سازهای لنفوئیدی رایج (CLPs) در گروه R. glutinosa در مقایسه با تعداد در گروه کنترل (شکل 2I) شناسایی شد. هیچ تفاوتی در تعداد پیش سازهای چند توان (MPPs)، پیش سازهای میلوئیدی (CMPs)، پیش سازهای گرانولوسیت-ماکروفاژ (GMPs) و پیش سازهای مگاکاریوسیت-اریتروئید (MEPs) در گروه R. glutinosa در مقایسه با تعداد در گروه R. glutinosa وجود نداشت. گروه کنترل. در گروه A. membranaceus، تفاوت معنی داری در تعداد LT- و ST- HSCs در مقایسه با تعداد در گروه کنترل وجود نداشت (شکل 2C-D). علاوه بر این، تفاوتی در تعداد سلول‌های MPP، CMP، MEP و CLP در مقایسه با تعداد سلول‌های گروه کنترل وجود نداشت (شکل 2E، 2F، 2H و 2I). با این حال، تعداد GMPs در گروه A. membranaceus کاهش یافت. بنابراین، موش های تغذیه شده با رژیم غذایی مکمل با R. glutinosa تعداد سلول های بنیادی خونساز و پیش ساز را کاهش دادند.

3.3|R. glutinosa عملکرد را افزایش داد و سکون HSC ها را حفظ کرد

برای ارزیابی عملکرد HSCها، پتانسیل کلونوژنیک LT-HSCها در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. ما سلول‌های LT-HSCs را با استفاده از FACS در محیطی مبتنی بر متیل سلولز دسته‌بندی کردیم و بعد از 14 روز تعداد و اندازه کلنی‌ها را شمارش کردیم. در مقایسه با تعداد و اندازه کلنی‌های تولید شده توسط سلول‌های موش در گروه کنترل، سلول‌های موش‌های گروه R. glutinosa افزایشی در تعداد کلنی‌ها، به‌ویژه برای اندازه‌های کوچک نشان دادند (P {2}}.0241. ) و کلون با اندازه بزرگ (P=0.0418)، در حالی که تفاوتی در تعداد موش های گروه A. membranaceus وجود نداشت (شکل 3). افزایش اندازه و تعداد کلنی در گروه R. glutinosa نشان داد که این گیاه پتانسیل خود تجدیدی LT-HSCs را افزایش می دهد.

اکثر HSC ها در موش های بالغ ساکن می مانند؛ بنابراین، حفظ سکون سلولی یک مکانیسم ضروری برای خود نوسازی سلول های بنیادی است. گروه A. membranaceus; بنابراین، ما وضعیت چرخه سلولی HSC ها را از طریق تجزیه و تحلیل نشانگر سلولی پرولیفراتیو Ki-67 همراه با تعیین محتوای DNA 7-AAD در جمعیت LSK بررسی کردیم. ما تعداد سلول‌های LSK را در فاز G0 در گروه‌های R. glutinosa و A. membranaceus در مقایسه با گروه کنترل مشاهده کردیم (شکل 4A). این نتایج نشان داد که R. glutinosa و A. membranaceus خاموشی HSCs را حفظ کردند.

تجزیه و تحلیل زمان واقعی PCR تنظیم‌کننده‌های چرخه سلولی در سلول‌های LSK نشان داد که p18، p19 و p57 نقش‌های مهمی در حفظ سکون HSC ایفا می‌کنند.{4}} هیچ تغییر آشکاری برای p57 و p19 مشاهده نشد (شکل 4C-). D)، و p18 در گروه R. glutinosa در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت و در گروه A. membranaceus کمی افزایش یافت (شکل 4B).

شکل 2 Rehmannia glutinosa و Astragalus membranaceus بر تعداد سلول های بنیادی/پروژنیتور خونساز تأثیر گذاشتند. موش ها (سالخورده

20 ماه) با جیره‌های حاوی R. glutinosa یا A. membranaceus (2{30}}0 میلی‌گرم در روز) به مدت 10 ماه (n=5/گروه) تغذیه شدند. گروه کنترل با رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. سلول‌های تازه جدا شده مغز استخوان (BM) با آنتی‌بادی‌های مشخص‌شده رنگ‌آمیزی شدند و با فلوسیتومتری آنالیز شدند. A، نمایه های رنگ آمیزی نماینده جمعیت سلول های بنیادی خونساز BM و سلول های پیش ساز. B، درصد سلول های Lin-Sca1 به علاوه c-kit- (LSKs) در سلول های BM. C-I، تعداد سلول های (C) بلند مدت (LT؛ Lin-، Sca- 1 plus، c-Kit، CD34 plus -، Flt3-). D، کوتاه مدت (ST؛ Lin–، Sca– 1 plus، c–Kit، CD34 plus plus، Flt3–)؛ E، اجداد چند توان (MPP؛ Lin-، Sca-1 plus، c-Kit plus، Flt3 plus)؛ F، پیش ساز میلوئید مشترک (CMP؛ Lin-، Sca-1-، c-Kit-، CD34 plus، CD16/CD32-). G، پیش ساز گرانولوسیت-ماکروفاژ (GMP؛ Lin-، Sca-1-، c-Kit-، CD34 plus، CD16/CD32 plus). H، پیش ساز مگاکاریوسیت-اریتروئید (MEP؛ Lin-، Sca-1-، c-Kit-، CD34-، CD16/CD32-). و من، پیش ساز لنفوئیدی رایج (CLP؛ Lin-، Sca-1low، c-Kitlow، CD127 plus). داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار است. n=5 موش/گروه. *P <0.05، **p=""><>

3.4|R. glutinosa پیری HSCs را به تاخیر انداخت

مکمل غذایی طولانی مدت با R. glutinosa می تواند طول عمر موش ها را افزایش دهد. پیری سلولی با افزایش سن افزایش می یابد. بنابراین، ما پیری HSC را در موش‌های پیر با آنالیز فلوسیتومتری HSCهای رنگ‌آمیزی SA-gal با استفاده از یک زیرلایه فلورسنت-gal (C12FDG) بررسی کردیم. گروه R. glutinosa، نشان می دهد که R. glutinosa پیری سلول LSK را به تاخیر می اندازد (شکل 5A).

گونه های فعال اکسیژن نقش عمده ای در پیری HSC ایفا می کنند و از دست دادن سکون HSC اغلب با افزایش ROS سلولی مرتبط است. تجزیه و تحلیل ROS داخل سلولی در LSK ها نشان داد که سطوح در گروه R. glutinosa در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافته است. گروه (شکل 5B). این داده ها نشان داد که R. glutinosa ممکن است HSC را حفظ کند و عملکرد HSC را با کاهش سطوح ROS افزایش دهد.

سپس بیان چندین ژن درگیر در پیری سلولی را با تجزیه و تحلیل RT-PCR سلول های LSK بررسی کردیم. مقایسه کرد

شکل 3 عملکرد سلول های بنیادی خونساز با مکمل رژیم غذایی Rehmannia glutinosa افزایش یافته است. پتانسیل کلونوژنیک در شرایط آزمایشگاهی سلول های ستاره ای کبدی طولانی مدت از موش (n=3)

با گروه کنترل، بیان پروتئین‌های مرتبط با پیری سلولی p53 و p16 در گروه R. glutinosa کاهش یافت (شکل 5D-E). اما بیان p53 و p16 به طور قابل توجهی بین گروه A. membranaceus و گروه کنترل کاهش یافت (شکل 5D-E). در مجموع، این داده‌ها نشان می‌دهند که چندین ژن مرتبط با چرخه سلولی کلیدی و پیری سلولی، عملکرد HSCs را در موش‌های تغذیه‌شده با رژیم‌های غذایی حاوی R. glutinosa تنظیم می‌کنند.

3.5|R. glutinosa ایمنی سلول های B را افزایش داد

لنفوسیت های B و T هر دو برای پاسخ های ایمنی مهم هستند. لنفوسیت های T نقش مهمی در ایمنی سلولی و تنظیم آن دارند، در حالی که لنفوسیت های B عمدتا در ایمنی هومورال شرکت می کنند. تکثیر لنفوسیت ها فوری ترین شاخص منعکس کننده ایمنی آلی است. برای بررسی نقش در تقویت ایمنی، اثرات R. glutinosa و A. membranaceus بر تکثیر لنفوسیت مورد بررسی قرار گرفت.

موش های گروه R. glutinosa کاهش تعداد HSCs و افزایش تعداد CLP را نشان دادند. آنالیز فلوسایتومتری افزایش تعداد سلول های B بالغ (B220 به علاوه) را در PB، BM و طحال موش های گروه R. glutinosa در مقایسه با اعداد شناسایی شده در گروه کنترل نشان داد (شکل 6A). با این حال، تفاوت معنی‌داری در تعداد سلول‌های T (CD4 پلاس و CD8 پلاس)، مونوسیت‌ها و گرانولوسیت‌ها (CD11b پلاس) بین دو گروه وجود نداشت (شکل 6B-D). بنابراین، این نتایج نشان می‌دهد که R. glutinosa رژیم غذایی، ایمنی سلول‌های B را افزایش می‌دهد.

شکل 4 مکمل های غذایی Rehmannia glutinosa و Astragalus membranaceus سکون سلول های بنیادی خونساز را حفظ کردند. الف، درصد سلول ها در هر مرحله از چرخه سلولی. تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری 7-آمینواکتینومایسین D (7-AAD) و رنگ آمیزی Ki-67 سلول های Lin-Sca1 به علاوه c-kit- (LSKs). B، تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی بیان ژن سلول LSK مرتب شده. GAPDH برای نرمال سازی استفاده شد. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار سه آزمایش است. *P < 0.05،="" **p="">< 0.01،="" ***p=""><>

شکل 5 مکمل رژیم غذایی Rehmannia glutinosa پیری سلول های ستاره ای کبدی (HSC) را کاهش داد. موش‌ها (2{7}} ماهه) با رژیم‌های غذایی حاوی Rehmannia glutinosa یا Astragalus membranaceus (200 میلی‌گرم در روز) به مدت 10 ماه (n {{4}) تغذیه شدند. }}/گروه)؛ گروه کنترل با رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. A، تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری سلول های SA--gal مثبت Lin-Sca1 به علاوه c-kit- (LSK) با استفاده از یک بستر فلورسنت -گالاکتوزیداز (C12FDG). B، درصد سلول‌های مثبت گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) در LSKs. تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری LSK های ROS مثبت. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (SD) هستند. *P < 0.05،="" ***p=""><0.001. ج،="" الگوی="" بیان="" ژن‌های="" مرتبط="" با="" پیری="" سلولی="" در="" lsks.="" gapdh="" برای="" نرمال="" سازی="" استفاده="" شد.="" داده="" ها="" نشان="" دهنده="" میانگین="" ±="" انحراف="" معیار="" سه="" آزمایش="" است.="" *p=""><0.05، **p=""><0.01، ***p=""><>

4|بحث

در این مطالعه، ما مکانیسم آن را بررسی کردیماثرات ضد پیریR. glutinosa یا A. membranaceus با مکمل رژیم غذایی موش با گیاهان دارویی با دوز 200 میلی گرم در روز به مدت 10 ماه. R. glutinosa اثرات ضد پیری از خود نشان می دهد، از جمله کاهش پیری و افزایش بقای HSCs و همچنین

افزایش ایمنی سلول های B از نظر مکانیسماثرات ضد پیریما دریافتیم که R. glutinosa تعداد HSC ها را کاهش داد، در حالی که ظرفیت تکثیر افزایش یافت. علاوه بر این، R. glutinosa سکون HSC را حفظ کرد و تعداد سلول‌های SA--gal مثبت و سطوح ROS را از طریق تنظیم p18، p53 و p16 کاهش داد. در ترکیب، نتایج ما تایید کرد کهاثرات ضد پیریاز R. glutinosa در موش ها با حفظ سکون و افزایش عملکرد HSC ها دارو مصرف می شود.

Rehmannia glutinosa که هزاران سال است به عنوان داروی گیاهی سنتی چینی مورد استفاده قرار گرفته است، می تواند برای درمان هیپوگلیسمی در اختلالات دیابتی مختلف استفاده شود. همچنین گزارش شده است که عصاره R. glutinosa متابولیسم استخوان را افزایش می دهد. R. glutinosa پاسخ های التهابی و سندرم ها را مهار می کند، 30،31 و با از بین بردن رادیکال های آزاد در برابر آسیب سلولی محافظت می کند.اثرات ضد پیریو با افزایش ظرفیت تکثیر LT-HSCها و کاهش تعداد سلول های SA-gal مثبت و سطوح ROS، ایمنی سلول های B را افزایش داد.

مشخص شده است که درجه آسیب اکسیداتیو با افزایش سن در سلول ها و بافت های مختلف افزایش می یابد. استرس اکسیداتیو یک عامل تعیین کننده حیاتی در خود نوسازی HSC است. از دست دادن سکون LT-HSC اغلب با افزایش ROS سلولی مرتبط است، که به طور منفی با خود تجدیدی HSCs مرتبط است. کاتالپول یک گلوکوزید ایریدوئید است که در ریشه R. glutinosa یافت شده است. کاتالپول در مطالعه قبلی مهار استرس اکسیداتیو، آسیب DNA و کوتاه شدن تلومر را از طریق مسیر PGC-1 /TERT نشان داد.33 در مطالعه ما، سطح ROS در سلول های LSK از گروه R. glutinosa در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت. بنابراین R. glutinosa با مهار استرس اکسیداتیو در HSC ها، بقای موش ها را طولانی تر می کند.

شکل 6 تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری درصد سلول های ایمنی بالغ در خون محیطی (PB)، مغز استخوان (BM)، طحال و تیموس. موش‌ها (2{9}} ماهه) با رژیم‌های غذایی حاوی Rehmannia glutinosa یا Astragalus membranaceus (200 میلی‌گرم در روز) به مدت 10 ماه (n=5/گروه) تغذیه شدند. گروه کنترل با رژیم غذایی استاندارد تغذیه شدند. A، تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری درصد سلول های B (B220 plus) در PB، BM، و طحال. B، آنالیز فلوسایتومتری درصد سلولهای مونوسیت و گرانولوسیت (CD11b plus ) در PB و BM. C و D، آنالیز فلوسایتومتری درصد سلول های CD4 plus و CD8 plus در PB، طحال و تیموس. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار است. *P <>

Astragalus membranaceus همچنین در طب سنتی چینی برای تقویت ایمنی، کاهش قند خون و ارتقاء آپوپتوز سلول های تومور استفاده می شود و همچنین دارایآنتی اکسیداسیونوضد پیریخواص در این مطالعه، ما دریافتیم که مکمل غذایی با A. memranaceus به مدت 10 ماه در مقایسه با موش‌های کنترل هیچ اثر آشکاری نداشت، در حالی که وزن موش‌ها در 20 ماهگی کاهش یافت. بنابراین، A. membranaceus ممکن است برای درمان LT برای موش های تغذیه شده نامناسب باشد.

در نتیجه، نتایج ما نشان می‌دهد که R. glutinosa می‌تواند طول عمر موش‌ها را با حفظ آرامش و افزایش عملکرد HSCs افزایش دهد. علاوه بر این، R. glutinosa می تواند سطوح بین سلولی ROS و تعداد سلول های SA--gal مثبت را کاهش دهد و ایمنی سلول B را افزایش دهد.

قدردانی

این مطالعه تا حدی توسط بنیاد ملی علوم چین (31672374)، صندوق نوآوری CAMS برای علوم پزشکی (CIFMS) (2016- 12M-1-012) و صندوق جوانان PUMC (2017310018) پشتیبانی شد.

تضاد علاقه

هیچ یک.

مشارکت های نویسنده

همه نویسندگان فهرست شده شرایط نویسندگی را دارند. CQ و LFZ این آزمایش ها را تصور و طراحی کردند. LB آزمایش‌ها را انجام داد و آزمایش نسخه اصلی را نوشت. GYS داده های FACS را انجام و تجزیه و تحلیل کرد. YJY این آزمایش را در مورد طب سنتی چینی طراحی کرد. WC موش ها را مدیریت کرد. همه نویسندگان مقاله را خوانده و تایید کرده اند.