استخراج گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از سیستانچ توبولوزا با استخراج هموژنیزاسیون برشی با سرعت بالا

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

ونجینگ پی و رویلی گوئو

زمینه:

Cistanche tubulosaیک طب سنتی معروف چینی است که منشا آن سین کیانگ است. این به طور گسترده در شمال آفریقا، هند و غیره پراکنده شده است. هدف: جزء اصلی فعال زیستیC. tubulosaگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی (PhGs) است. Echinacoside و Acteoside اجزای شاخص برای تعیین PhGs هستند و عمدتاً برای محافظت از کبد، محافظت ایمنی و غیره استفاده می شوند. بنابراین استخراج PhGs از C. tubulosa بسیار مهم است. روش‌ها: در این مطالعه، روش‌های استخراج به کمک اولتراسوند (UAE)، استخراج به کمک مایکروویو (MAE) و استخراج همگن‌سازی برشی با سرعت بالا (HSHE) مقایسه شدند. علاوه بر این، شرایط استخراج روش HSHE بهینه شد. نتایج: نتایج نشان داد که روش HSHE بهتر از هر دو روش امارات متحده عربی و MAE بوده و پارامترهای استخراج بهینه HSHE غلظت اتانول 50 درصد، دمای استخراج 70 درجه، سرعت چرخش 16000 دور در دقیقه، زمان استخراج 2 دقیقه، نسبت جامد به مایع 1:9 و یک سیکل استخراج. بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب 1.366 و 0.519 درصد بود و نرخ انتقال اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب به 87 و 94 درصد رسید. نتیجه گیری: می توان نتیجه گرفت که روش HSHE روشی ساده، سریع و کارآمد برای استخراج PhGs از C. tubulosa است. نکات مهم: یک روش HSHE کارآمد و سازگار با محیط زیست برای استخراج PhGs از C. tubulosa مورد بررسی قرار گرفته است. شرایط بهینه روش HSHE برای استخراج PhGs از C. tubulosa به دست آمد. این تحقیق روش جدیدی را برای استخراج صنعتی PhGs ازC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaیک طب سنتی رایج چینی است که منشا آن سین کیانگ است. این به طور گسترده در شمال آفریقا، شبه جزیره عربستان، پاکستان و هند توزیع شده است و به طور رسمی در فارماکوپه چین در سال 2010 ثبت شد. جزء اصلی فعال زیستیC. tubulosaگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی (PhGs)، دسته ای از محصولات طبیعی محلول در آب از جمله اکیناکوزید، آکتئوزید، ایزواکتئوزید و 2-استیلاکتئوزید (1، 2) است. ساختار PhGها شامل قسمت‌های اسید سینامیک و هیدروکسی فنیل اتیل است که هر دو به ترتیب از طریق پیوندهای استری و گلیکوزیدی به گلوکوپیرانوز متصل هستند (3). مطالعات فارماکولوژیک نشان داده اند که PhG های C. tubulosa دارای عملکردهای دارویی بسیاری هستند، مانند ضد خستگی (4)، محافظت کننده عصبی (5-7)، محافظت از کبد (8-10)، و اثرات محافظت کننده ایمنی (11). بنابراین، استخراج موثر PhGs از C. tubulosa برای توسعه و استفاده از محصولات طبیعی اهمیت زیادی دارد.

روش‌های سنتی استخراج PhGs عبارتند از استخراج با رفلاکس داغ، استخراج با کمک اولتراسوند (UAE) و استخراج به کمک مایکروویو (MAE؛ 12-16). این روش ها دارای معایب مختلفی مانند راندمان پایین، زمان استخراج طولانی و هزینه های بالا هستند. در مقایسه با روش‌های سنتی، روش استخراج همگن‌سازی برشی با سرعت بالا (HSHE) یک روش استخراج نوظهور و جدید است و مزایای زمان استخراج سریع‌تر، ضایعات حلال کمتر، بازده بالاتر، دستگاه ساده‌تر و عملکرد آسان‌تر را دارد (17). اصل کار روش HSHE مبتنی بر یک کاتر داخلی چرخان است که توسط یک موتور با سرعت بالا هدایت می شود. نیروی برشی قدرتمندی توسط برش های داخلی و خارجی تولید می شود تا نمونه ها را مختل و مخلوط کند. این در حالی است که کاتر با چرخش با سرعت بالا باعث ایجاد اختلاف فشار بین حفره های داخلی و خارجی کاتر و در نتیجه انتقال جرم بین نمونه ها و حلال ها می شود. با ترکیب نیروی برشی بالا، نیروی برخورد، فشار و سایر نیروها، می توان به سرعت به تعادل محلول بین نمونه های جامد و حلال ها دست یافت (18). بنابراین، فرآیند استخراج HSHE را می توان در چند دقیقه، و حتی به سرعت ده ها ثانیه (19-22) تکمیل کرد.

اخیرا، HSHE در استخراج اجزای زیست فعال از محصولات طبیعی مختلف مورد بررسی قرار گرفته است (23-25). چنگ و همکاران از HSHE برای استخراج پنج لیگنان از میوه Schisandra Chinensis استفاده کرد (26). نتایج نشان داد که شرایط بهینه غلظت اتانول 75 درصد، زمان استخراج 1 دقیقه، نسبت جامد به مایع 1:19، ولتاژ استخراج 180 ولت و یک ذره نمونه بود. سایز 120 مش بازده کل پنج لیگنان در شرایط بهینه 014/0 ± 89/13 میلی‌گرم بر گرم بود. تانگ و همکاران از HSHE برای بدست آوردن روغن زیست فعال از دانه های پریلا استفاده کرد (27). شرایط بهینه زمان استخراج 2 دقیقه، نسبت جامد به مایع 1:10، ولتاژ استخراج 150 ولت و دو سیکل استخراج بود. عملکرد روغن دانه پریلا به 3/59 درصد رسید. نتایج فوق نشان می دهد که HSHE دارای مزایای زمان استخراج کوتاه، هزینه کم و بازده بالا است. با این حال، تحقیقات کافی در مورد استخراج PhGs توسط HSHE وجود ندارد.

در مطالعه حاضر، از HSHE برای بررسی کاربرد بالقوه آن در استخراج PhGs استفاده شدC. tubulosa. بازده PhGs توسط HPLC تعیین شد. سه روش استخراج، HSHE، امارات متحده عربی، و MAE، تحت شرایط یکسان مقایسه شدند. اثرات غلظت اتانول، دمای استخراج، سرعت چرخش، زمان استخراج، نسبت جامد به مایع، و تعداد چرخه‌های استخراج بازده مورد بررسی قرار گرفت. مزایا و معایب این کار و مراجع مقایسه و بحث شده است.

مواد و روش ها

معرف های مواد و شیمیایی

C. tubulosaاز Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (سین کیانگ، چین) خریداری شد. استانداردهای اکیناکوزید (خلوص بیشتر یا مساوی 98 درصد) و اکتئوزید (خلوص بیشتر یا مساوی 98 درصد) از شرکت فناوری بیولوژیکی استاندارد شانگهای (شانگهای، چین) خریداری شد. استونیتریل، متانول و اسید استیک از درجه HPLC بودند (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). اتانول با درجه تحلیلی از Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (تیانجین، چین) خریداری شد. در طول آزمایش از آب دیونیزه استفاده شد.

آنالیز HPLC

آنالیز HPLC بر روی کروماتوگرافی مایع Waters e2695 (واترز، میلفورد، MA) مجهز به آشکارساز UV/Visible 2489 و ستون Symmetry C18 (Waters)، 250 × 4.6 میلی متر، اندازه ذرات 5 میکرومتر انجام شد. غلظت اکیناکوزید و اکتئوزید با روش HPLC آنالیز شد. فاز متحرک شامل (1) استونیتریل و (2) محلول آبی اسید استیک یخبندان 2 درصد بود. برنامه شستشوی گرادیان در جدول 1 ارائه شده است.

طول موج شناسایی شده 330 نانومتر، سرعت جریان 1 میلی لیتر در دقیقه، حجم تزریق 10 میکرولیتر و دمای فر روی 30 درجه تنظیم شد. پیک کروماتوگرافی آنالیت با مقایسه زمان ماند آن با استانداردها تایید شد. کمی سازی با ادغام پیک با استفاده از روش استاندارد خارجی انجام شد.

آزمایش دقت با تزریق همان نمونه‌های استخراج پنج بار انجام شد. برای تست پایداری، همان نمونه‌ها با افزایش 0، 1، 2، 4، 12، 24 و 48 ساعت مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. آزمایش های بازیابی اکیناکوزید و اکتئوزید با افزودن استانداردها به نمونه های استخراج انجام شد. تمام نواحی پیک و زمان ماند اکیناکوزید و اکتئوزید ثبت شد. نتایج منحنی های کالیبراسیون برای اکیناکوزید و اکتئوزید در جدول 2 آمده است.

محاسبه بازده

Echinacoside و Acteoside به عنوان اجزای شاخص برای تعیین PhGs استفاده شدند. بازده اکیناکوزید یا اکتئوزید با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

Y{0}}CV/W×100 درصد (1)

که در آن Y=بازده اکیناکوزید یا آکتئوزید ( درصد ); C=غلظت اکیناکوزید یا آکتئوزید (mg/mL). V=حجم محلول استخراج (mL); و وزن W=پودر C. tubulosa (mg).

روش های استخراج PhGs

ساقه C. tubulosa ابتدا توسط یک آسیاب الکتریکی (JC{0}}g؛ Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) آسیاب شد و توسط یک غربال فیلتر (تقریباً 380 میکرومتر) فیلتر شد. سپس پودر C. tubulosa در آون با دمای 70 درجه خشک شد تا وزن ثابت شود. پنج گرم پودر C. tubulosa با حلال استخراج مخلوط شد و در یک بطری استخراج قرار گرفت. پس از آن، مخلوط مایع از قبل (30-80 درجه) به مدت 5 دقیقه در یک حمام آب با دمای ثابت (DF{7}}S؛ Jintan Analytical Instrument Co., Ltd، Jintan, China) گرم شد.

(الف) روش HSHE.-HSHE ​​توسط یک سیستم FA25 (FLUKO Co., Ltd، شانگهای، چین) انجام شد که شامل برش چرخان، موتور پرسرعت و کنترلر بود. سرعت چرخش کاتر داخلی در محدوده 10000-28000 دور در دقیقه تنظیم شد و زمان استخراج در محدوده 2-15 دقیقه تنظیم شد.

(ب) روش امارات متحده عربی. - پنج گرم نمونه خشک و 300 میلی لیتر متانول به طور دقیق وزن شده و به یک بطری استخراج اضافه شد. بطری استخراج در حمام اولتراسونیک غوطه ور شد و با توان اولتراسونیک 300 وات به مدت 10 دقیقه انجام شد. دمای استخراج روی 30 درجه تنظیم شد.

(ج) روش MAE. پنج گرم نمونه خشک شده و 300 میلی لیتر متانول به دقت وزن شده و به یک بطری استخراج اضافه شد. بطری استخراج در راکتور مایکروویو قرار داده شد و در 180 وات به مدت 10 دقیقه انجام شد. دمای استخراج روی 30 درجه تنظیم شد.

روش HSHE با روش‌های امارات متحده عربی و MAE با حلال استخراج، زمان استخراج، دمای استخراج، نسبت جامد به مایع و تعداد سیکل استخراج مقایسه شد. محلول استخراج شده توسط غشاء 22/0 میکرومتر 0 فیلتر شد و از طریق HPLC برای تعیین غلظت اکیناکوزید و آکتئوزید آنالیز شد. تمام مراحل استخراج سه بار تکرار شد

تعیین نرخ انتقال

بر اساس روش استاندارد در 2{10}}15 فارماکوپه چین، محتوای اکیناکوزید و آکتئوزید در پودر C. tubulosa تعیین شد (28). یک گرم پودر C. tubulosa و 50 میلی لیتر متانول 50 درصد به طور دقیق وزن شده و به یک فلاسک حجمی قهوه ای 50 میلی لیتری اضافه شد. مخلوط مایع وزن شده و به مدت 30 دقیقه خیس شد. سپس فلاسک حجمی قهوه ای در حمام اولتراسونیک غوطه ور شد و با توان اولتراسونیک 250 وات و فرکانس 35 کیلوهرتز به مدت 40 دقیقه انجام شد. مخلوط مایع دوباره وزن شد و 50 درصد متانول برای از دست دادن حلال اضافه شد. محلول استخراج توسط یک غشاء 0.22 میکرومتر فیلتر شد و با استفاده از HPLC برای تعیین غلظت اکیناکوزید و آکتئوزید آنالیز شد. فرآیند استخراج سه بار تکرار شد.

نرخ انتقال اکیناکوزید یا اکتئوزید با استفاده از معادله زیر محاسبه شد:

X= M1/M2 × 100 درصد (2)

که در آن X=نرخ انتقال اکیناکوزید یا آکتئوزید ( درصد ); کیفیت M{1}} اکیناکوزید یا اکتئوزید موجود در عصاره (میلی گرم). و کیفیت M{2}} اکیناکوزید یا اکتئوزید در پودر C. tubulosa (mg).

نتایج و بحث

اعتبار سنجی روش HPLC

پروفیل های HPLC اکیناکوزید و اکتئوزید از C. tubulosa با استفاده از HSHE در شکل 1 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که روش HPLC دقت خوبی در تجزیه و تحلیل کمی اکیناکوزید و اکتئوزید دارد. در زمان‌های مختلف ({16}}-48 ساعت)، RSD‌های نواحی پیک اکیناکوزید و آکتئوزید به ترتیب 1.71 و 1.70 درصد بود که نشان می‌دهد نمونه در ۴۸ ساعت پایدار بوده است. بازیابی اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب 99.3 و 99.1 درصد و RSD آنها به ترتیب 0.70 و 0.67 درصد بود که پایایی روش HPLC را تأیید می کند.

مقایسه روش های مختلف استخراج

مقایسه روش HSHE با روش های MAE و UAE در مورد بازده اکیناکوزید و اکتئوزید انجام شد که نتایج آن در شکل 2 نشان داده شده است. مشاهده شد که بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به دست آمده توسط HSHE بیشتر از بازده به دست آمده بود. توسط MAE و UAE. در مقایسه با MAE، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به دست آمده توسط HSHE به ترتیب 20.5 و 20.8 درصد بیشتر بود. و در مقایسه با امارات متحده عربی، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به دست آمده توسط HSHE به ترتیب 6.6 و 7.4 درصد بیشتر بود. این نتایج نشان می دهد که HSHE می تواند به طور قابل توجهی بازده PhGs را افزایش دهد.

بهینه سازی روش HSHE

پارامترهای استخراج PhGs توسط HSHE شامل غلظت اتانول، دمای استخراج، سرعت چرخش، زمان استخراج، نسبت جامد به مایع و تعداد چرخه‌های استخراج است (26، 29).

اثر غلظت اتانول بر استخراج PhGs

غلظت اتانول عامل مهمی است که بر بازده PhG ها تأثیر می گذارد. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، بازده اکیناکوزید و آکتئوزید از C. tubulosa تحت غلظت های مختلف اتانول مورد بررسی قرار گرفت. نشان داد که بازده اکیناکوزید از 0 به 30 درصد افزایش یافت و سپس با افزایش غلظت اتانول از 30 به 90 درصد کاهش یافت. بازده اکتئوزید از 0 تا 70 درصد افزایش و سپس با افزایش غلظت اتانول از 70 به 90 درصد کاهش یافت. هنگامی که غلظت اتانول 50 درصد بود، مجموع بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به حداکثر خود رسید. غلظت های مختلف اتانول دارای قطبیت های متفاوتی است که منجر به حلالیت های مختلف اکیناکوزید و اکتئوزید می شود. بنابراین غلظت بهینه اتانول 50 درصد بود.

تأثیر سرعت چرخش بر استخراج PhGs

شکل 5 اثرات سرعت های مختلف چرخش را بر بازده PhG ها نشان می دهد. بازده اکیناکوزید و اکتئوزید با افزایش سرعت چرخش افزایش یافت. افزایش سرعت چرخش می تواند نیروی برشی کاتر داخلی و خارجی را افزایش دهد و در نتیجه بازده PhG ها را افزایش دهد. سرعت چرخش بهینه 16000 دور در دقیقه بود.

اثر زمان استخراج بر استخراج PhGs

بازده اکیناکوزید و اکتئوزید در زمان های مختلف استخراج در شکل 6 نشان داده شده است. بازده اکیناکوزید و اکتئوزید با افزایش زمان استخراج پایدار بودند. بنابراین می توان نتیجه گرفت که PhGs را می توان به طور کامل از C. tubulosa در 2 دقیقه استخراج کرد و زمان بهینه استخراج 2 دقیقه بود.

اثر نسبت جامد به مایع بر استخراج PhGs

همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید تحت نسبت های مختلف جامد به مایع مورد بحث قرار گرفت. بازده اکیناکوزید و اکتئوزید از 1:3 به 1:9 افزایش یافت و از 1:9 به 1:24 پایدار شد. از آنجا که مقدار کمی از حلال استخراج نمی تواند به طور کامل اکیناکوزید و اکتئوزید را حل کند، نرخ انتقال جرم کاهش یافت. استخراج بیش از حد حلال ها باعث ضایعات غیر ضروری می شود. بنابراین نسبت بهینه جامد به مایع 1:9 بود.

تأثیر تعداد چرخه های استخراج بر استخراج PhGs

شکل 8 نشان می دهد که اثرات تعدادی از چرخه های استخراج بر بازده PhG ها. بازده اکیناکوزید و اکتئوزید با افزایش تعداد چرخه های استخراج افزایش یافت. با این حال، زمان استخراج به طور قابل توجهی با افزایش چرخه استخراج افزایش یافت و انرژی بیشتری مصرف شد. تعداد بهینه چرخه استخراج یک بود.

مقایسه روش HSHE با سایر روش‌های استخراج برای استخراج PhGs

نتایج روش HSHE در مقایسه با سایر روش‌های استخراج برای استخراج PhGs از C. tubulosa در جدول 3 آورده شده است. مواد و روش ها. علاوه بر این، فشار استخراج HSHE کمتر از روش استخراج مایع تحت فشار است و شرایط عملیاتی اولی ایمن تر است. مهمتر از آن، از جدول 3 می توان دریافت که HSHE کوتاه ترین زمان استخراج و کمترین مصرف حلال را در بین تمام روش های استخراج نشان می دهد. می توان نتیجه گرفت که روش HSHE دارای مزایای بسیاری از جمله راندمان بالا، شرایط عملیاتی ملایم، مصرف کم، تجهیزات ساده و بهره برداری آسان برای استخراج محصولات طبیعی است.

نتیجه گیری

در این مطالعه، یک روش HSHE کارآمد و سازگار با محیط زیست برای استخراج PhGs از C. tubulosa بررسی شده است. در مقایسه با روش‌های امارات متحده عربی و MAE، روش جدید HSHE بازده بالاتری از PhGs در شرایط یکسان تولید می‌کند. در مقایسه با روش MAE، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب 5/2{10}} و 8/20 درصد افزایش یافت. و در مقایسه با امارات متحده عربی، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب 6.6 و 7.4 درصد افزایش یافت. پارامترهای استخراج HSHE از PhGs از C. tubulosa بهینه شد. تحت پارامترهای بهینه شده، بازده اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب به 366/1 و 519/0 درصد و نرخ انتقال اکیناکوزید و اکتئوزید به ترتیب به 87 و 94 درصد رسید. روش HSHE دارای مزایای راندمان بالا، شرایط عملیاتی ملایم، سطح مصرف کم، تجهیزات ساده، عملیات آسان و هزینه کم است. این تحقیق روش جدیدی را برای استخراج صنعتی PhGs از C. tubulosa ارائه می‌کند.