بخش Ⅰ: گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ توبولوزا آپوپتوز سلول های سرطان کبد را توسط مسیرهای وابسته به میتوکندری و MAPK القا می کنند و از طریق ترکیب با سیس پلاتین اثر ضد توموری را افزایش می دهند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

پنگفی یوان، چانگ شوانگ فو، یی یانگ، آیپیره آدیلا، فانگ فانگ ژو، شیان شیان وی، ویلان ژانگ، جی لو، ییجی لی، لیجی شیا، جینیائو لی

خلاصه

Cistanche tubulosaنوعی داروی گیاهی چینی است و عملکردهای بیولوژیکی مختلفی دارد. مطالعات قبلی نشان داده است کهگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa (CTPG)اثرات ضد توموری بر روی انواع سلول های تومور نشان می دهد. با این حال، اثرات ضد توموری CTPG بر سلول‌های HepG2 و BEL{1}} کارسینومای کبدی (HCC) هنوز مبهم است. مطالعه ما نشان داد که CTPG به طور قابل‌توجهی از رشد سلول‌های HepG2 و BEL{3}} از طریق القای توقف چرخه سلولی و آپوپتوز جلوگیری می‌کند، که با فعال‌سازی مسیرهای MAPK همراه بود که با فسفوریلاسیون تنظیم‌شده p38، JNK، همراه بود. و ERK1/2 و مسیر وابسته به میتوکندری که با کاهش پتانسیل غشای میتوکندری مشخص می شود. انتشار سیتوکروم c و برش کاسپاز-3، -7، -9، و PARP متعاقباً با درمان CTPG افزایش یافت. علاوه بر این، CTPG به طور قابل توجهی مهاجرت HepG2 را با کاهش سطوح متالوپروتئیناز ماتریکس-2 و فاکتورهای رشد اندوتلیال عروقی سرکوب کرد. جالب توجه است که CTPG نه تنها تکثیر سلول‌های طحال را افزایش می‌دهد، بلکه آپوپتوز سلول‌های طحال القا شده توسط سیس پلاتین را نیز کاهش می‌دهد. در مدل موش تومور H22، CTPG همراه با سیس پلاتین رشد سلول های H22 را بیشتر مهار کرد و عوارض جانبی سیس پلاتین را کاهش داد. روی هم رفته، CTPG رشد HCC را از طریق اثر مستقیم ضد توموری و اثر تقویت کننده غیرمستقیم ایمنی مهار کرد و اثر ضد توموری سیس پلاتین را بهبود بخشید.

کلید واژه ها

Cistanche tubulosaگلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، آپوپتوز، مسیر MAPK، مسیر وابسته به میتوکندری، سیس پلاتین، افزایش ایمنی.

مقدمه

پیش‌بینی می‌شود که سرطان کبد ششمین سرطان شایع تشخیص داده شده و چهارمین علت مرگ ناشی از سرطان در سراسر جهان در سال 2018 باشد، با حدود 841 000 مورد جدید و 782000 مرگ سالانه در آسیای جنوب شرقی (مغولستان، کامبوج و ویتنام) .1 در چین، سرطان کبد سومین علت اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در سال 2015 بود. در حال حاضر هپاتکتومی، پیوند کبد و ابلیشن از راه پوست روش های اصلی برای درمان HCC هستند. متأسفانه، این درمان‌ها برای 30 درصد از بیمارانی که سرطان کبد زودرس تشخیص داده می‌شوند مؤثر هستند، در حالی که بیماران مبتلا به سرطان پیشرفته کبد (که 40 درصد را شامل می‌شود) باید برای افزایش زمان بقای خود به درمان تسکینی تکیه کنند.3،4 سورافنیب در ترکیب با کبد کموآمبولی شریانی یک درمان تسکینی مهم و رایج برای اکثر بیماران مبتلا به HCC پیشرفته در منطقه آسیا-اقیانوسیه است.5 Sorafenib که توسط FDA در سال 2006 برای درمان سرطان پیشرفته کبد تایید شده است، یک مهارکننده کیناز چندگانه است که تکثیر سلول های تومور و عروق را مهار می کند. تولید و ترویج آپوپتوز سلول تومور. سورافنیب به طور قابل توجهی زمان بقای بیمار را 3 تا 5 ماه افزایش می دهد، اما عوارض جانبی جدی دارد و ارتباط نزدیکی با بروز مقاومت دارویی دارد. بنابراین، توسعه داروها یا استراتژی های جدید برای HCC ضروری است.

طب سنتی چینی (TCM) به تنهایی یا در ترکیب با استراتژی های دیگر برای درمان HCC استفاده شده است و مزایای بالینی از جمله طولانی شدن زمان بقا، بهبود کیفیت زندگی، کاهش عوارض جانبی و غیره را نشان داده است.سیستانچیک TCM حاوی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی (PhGs)، ایریدوئیدها، لیگنین و پلی ساکاریدها است که دارای عملکردهای بیولوژیکی مختلفی مانند عملکردهای ضد اکسیداسیون، ضد التهاب، ضد پیری، تقویت حافظه و تقویت سیستم ایمنی است. اجزای اصلی فعال ازسیستانچو دارای عملکردهای متعددی از جمله ضد اکسیداسیون، ضد التهاب، ضد آپوپتوز، محافظت از کبد و محافظت عصبی هستند.{3}} گروه ما گزارش داده بود کهگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa(CTPG) می‌تواند رشد ملانوم B16-سلول‌های F10، سلول‌های Eca-109 کارسینوم مری و سلول‌های HCC H22 را از طریق مسیرهای سیگنال‌دهی بیرونی یا درونی در شرایط in vitro یا in vivo مهار کند. علاوه بر این، CTPG اثر ایمنی تحریکی داشت.{4}}

در این مطالعه، ما اثر ضد توموری و مکانیسم CTPG را بر روی سلول‌های HepG2 و BEL{1}} در شرایط آزمایشگاهی بررسی کردیم، عملکرد تعدیل‌کننده ایمنی CTPG را در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی آنالیز کردیم و اثر درمانی CTPG همراه با شیمی‌درمانی را بیشتر ارزیابی کردیم. داروی سیس پلاتین در موش های تومور HCC H22 در داخل بدن. ما دریافتیم که CTPG می تواند رشد سلول های HepG2 و BEL{4}} را از طریق آپوپتوز وابسته به میتوکندری و مسیر سیگنالینگ MAPK مهار کند. CTPG با کاهش سطوح ماتریکس متالوپروتئیناز (MMP{8}}) ​​و فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) به طور قابل توجهی از مهاجرت سلول‌های HepG2 جلوگیری کرد. علاوه بر این، CTPG تکثیر و فعال سازی سلول های ایمنی را ترویج کرد و ایمنی موش ها را افزایش داد. نکته مهم این است که CTPG همراه با سیس پلاتین می تواند بیشتر از رشد سلول های H22 در داخل بدن جلوگیری کند و عوارض جانبی سیس پلاتین را کاهش دهد.

مواد و روش ها

حیوانات

موش های نر BALB/c، کونمینگ و ماده C57BL/6 6 تا 8 هفته ای از مرکز آزمایشگاه حیوانات، دانشگاه پزشکی سین کیانگ (اورومچی، سین کیانگ، چین) خریداری و در مرکز حیوانات دانشگاه سین کیانگ با دمای اتاق نگهداری شدند. (RT) 3±25 درجه و دوره نور تاریک 12/12 ساعت.

خطوط سلولی و کشت سلولی

سلول‌های H22 موش از Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (ووهان، هوبی، چین) خریداری شدند و سلول‌های HCC HepG2 و BEL{2}} انسانی از آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین کیانگ به‌دست آمدند. ، دانشگاه سین کیانگ (اورومچی، سین کیانگ، چین) و در محیط کشت RPMI 1640 (Gibco، ایالات متحده آمریکا) یا محیط کشت Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) (Gibco) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی غیرفعال شده با حرارت (MRC، چین)، 1 درصد L گلوتامین (100 میلی‌مولار)، 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، و 100 گرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در دمای 37 درجه در یک اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

ترکیبات اصلی CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, China) واجد شرایط و توسط HPLC اندازه گیری شدند. همانطور که قبلاً گزارش شده بود. و فاز متحرک شامل 2/0 درصد محلول اسید فرمیک و متانول با گرادیان 23 درصد تا 31 درصد بود. در مجموع 10 میکرولیتر نمونه تزریق شد و در 330 نانومتر شناسایی شد. استانداردهای اکیناکوزید و آکتئوزید (Yuanye، شانگهای، چین) برای تجزیه و تحلیل اجزای CTPG استفاده شد.

تجزیه و تحلیل زنده ماندن سلول

اثرات ضد توموری CTPG بر روی سلول‌های HepG2 و BEL{1}} با استفاده از MTT (3-(4, 5-دی متیل-2-تیازولیل)-2، {{7} ارزیابی شد. }}دی فنیل{8}}H-تترازولیوم برومید). سلول‌های HepG2 و BEL در 96-صفحه‌های چاهک (5 × 104 سلول/چاه) قرار گرفتند و با 0، 20 0، 400 و 600 میکروگرم در میلی لیتر CTPG به ترتیب به مدت 24 و 48 ساعت پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه. حدود 35 ug/mL سیس پلاتین (Yuanye) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سپس 100 میکرولیتر MTT (0.5mg/mL، رقیق شده با محیط بدون محیط FBS) به هر چاهک اضافه شد و به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه و CO2 5 درصد کشت داده شد. پس از انکوباسیون، پلیت ها با سرعت 1200 دور در دقیقه به مدت 7 دقیقه سانتریفیوژ شدند، محیط خارج شد و 200 ug/mL DMSO به هر چاهک اضافه شد تا بلورهای فرمازان تشکیل شده حل شود. مقادیر OD490 توسط یک خواننده میکروپلیت چاهی (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) اندازه گیری شد. برای ارزیابی اثرات CTPG بر روی سلول‌های طحال، سلول‌ها از موش‌های C57BL/6 جدا شدند و در صفحات چاهک با تراکم 1 × 105 سلول در چاهک قرار گرفتند. اسپلنوسیت ها به ترتیب با 0، 200، 400 و 600 ug/mL به مدت 24، 48 و 72 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. زنده ماندن سلول به صورت فرمول زیر محاسبه شد: زنده ماندن سلولی ( درصد )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 درصد .

تشخیص کی-67

تشخیص Ki{0}} طبق مطالعه قبلی ما انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌های BEL{2}} با غلظت‌های مختلف (۰، ۲۰۰، ۴۰۰ و ۶۰۰ میکروگرم در میلی‌لیتر) CTPG تیمار شدند. یا سیس پلاتین (35 میکروگرم در میلی لیتر). پس از 24 ساعت، سلول ها برداشت و با PBS شسته شدند، سپس طبق دستورالعمل سازنده با مجموعه بافر رنگ آمیزی Foxp3 (eBioscience، ایالات متحده آمریکا) ثابت و نفوذپذیر شدند. رنگ‌آمیزی داخل سلولی با استفاده از آنتی‌بادی کی کونژوگه FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) به مدت 15 دقیقه در RT انجام شد. نمونه ها با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur, CA, USA) آنالیز شدند.

تجزیه و تحلیل آپوپتوز سلولی و چرخه سلولی

سلول‌های HepG2 و BEL{1}} با تراکم 105×2.5 سلول در ظرف کشت و در دمای 37 درجه یک شبه انکوبه شدند. سلول ها پس از تیمار با غلظت های مختلف CTPG تریپسینیزه و با سانتریفیوژ برداشت شدند یا با مهارکننده کاسپاز (Z-VAD-FMK) یا مهارکننده کاسپاز-3 (Ac-DEVD-CHO) (بیوتیم، چین) به مدت 2 دوره پیش تیمار شدند. ساعت قبل از درمان CTPG پس از 24 ساعت، آپوپتوز توسط فلوسایتومتری تشخیص داده شد. به طور خلاصه، سلول‌های جمع‌آوری‌شده با PBS سرد (Gibco) شسته شدند و در بافر اتصال انکسین با 2.5μL Annexin V-FITC و 5μL محلول رنگ‌آمیزی PI-PE (Solarbio، پکن، چین) مجدداً معلق شدند و سپس سلول‌ها در RT انکوبه شدند. در تاریکی به مدت 15 دقیقه برای تجزیه و تحلیل توزیع چرخه سلولی، سلول ها پس از تیمار CTPG برداشت و در اتانول سرد 70 درصد در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه ثابت شدند. سلول ها با PI (BD Biosciences) در تاریکی به مدت 30 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها توسط فلوسایتوم اتر (BD FACSCalibur) آنالیز شدند. سطح بیان آپوپتوز سلولی و پروتئین های مربوط به چرخه توسط وسترن بلات تشخیص داده شد.

وسترن بلات

وسترن بلات طبق مطالعه قبلی ما انجام شد. 17 HCC با CTPG به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از دو بار شستشو با PBS سرد یخی، تمام سلول‌های چسبنده و شناور جمع‌آوری شدند و در بافر RIPA Lysis (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) به مدت 20 دقیقه روی یخ لیز شدند. پس از سانتریفیوژ در 12000 دور در دقیقه 4 درجه به مدت 10 دقیقه، غلظت پروتئین با استفاده از کیت سنجش اسید بیسینکونیک (Thermo Fisher Scientific, USA) طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد. همان غلظت پروتئین توسط 12 درصد SDS-PAGE جدا و به غشاهای PVDF منتقل شد. پس از شستشو با بافر PBST (PBS با 0.05 درصد توئین{11}})، غشاها با شیر بدون چربی 5 درصد در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت مسدود شدند و سپس با آنتی بادی های اولیه (Cell Signaling Technology, MA, USA) انکوبه شدند. ) در رقت های مناسب یک شب در 4 درجه . پس از 3 بار شستشو با PBST، غشاء با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با HRP (eBioscience) به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. پروتئین های هدف با استفاده از کیت سنجش ECL (Beyotime) شناسایی شدند. داده های اسکن در مقیاس خاکستری توسط Image J به دست آمد.

تجزیه و تحلیل پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm)

Δψm توسط رنگ JC{1}} نفوذپذیر در غشاء (بیوتیم) تعیین شد. به طور خلاصه، سلول‌های HepG2 و BEL{3}} با غلظت‌های مختلف CTPG ({4}}، 200، 400 و 600 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت تیمار شدند. تمام سلول ها جمع آوری و با بافر شستشوی JC{9}} شسته شدند. طبق دستورالعمل سازنده، سلول‌ها با پروب فلورسنت JC{10}} به مدت 20 دقیقه در RT رنگ‌آمیزی شدند. پس از دو بار شستشو با PBS، تمام نمونه ها توسط فلوسایتومتری (BD FACSCalibur) آنالیز شدند.

رنگ آمیزی Hoechst 33342

رنگ‌آمیزی Hoechst 33342 طبق مطالعه قبلی ما انجام شد. تغییرات مورفولوژیکی هسته‌ها با استفاده از رنگ اتصال DNA قابل نفوذ به غشاء Hoechst 33342 (Beyotime) مورد بررسی قرار گرفت. به طور خلاصه، سلول ها در یک صفحه چاهک با غلظت 1×105 سلول در چاهک در محیط 2 میلی لیتری تلقیح شدند. هنگامی که به 70 تا 80 درصد تلاقی رسید، سلول ها با 200، 400 و 600 میکروگرم در میلی لیتر CTPG یا سیس پلاتین به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سلول ها با PBS شسته و با 4 درصد پارافورمالدئید سرد در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه ثابت شدند. پس از شستشو با PBS، سلول ها با Hoechst 33342 در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها با میکروسکوپ معکوس فلورسانس (Nikon Eclipse Ti-E، ژاپن) مشاهده شدند.

سنجش مهاجرت

مهاجرت سلولی HCC از طریق روش التیام زخم تشخیص داده شد. به طور خلاصه، سلول‌های HepG2 (2×104 /چاه) در یک صفحه 24-چاه کاشته شدند. پس از رسیدن به تلاقی 8{16}} درصد، مرکز هر چاه یک بار با نوک پیپت 20 میکرولیتری خراشیده شد. پس از شستشو با PBS، سلول ها با سیس پلاتین (35 میکروگرم در میلی لیتر) یا غلظت های مختلف (0، 200، 400 و 600 میکروگرم در میلی لیتر) CTPG در دمای 37 درجه تیمار شدند. پس از 24 ساعت، تصاویر هر نمونه زیر میکروسکوپ (Nikon Eclipse Ti-E) گرفته شد. میانگین فواصل مهاجرت سلولی توسط Image J آنالیز شد. درصد بهبود زخم با معادله: بهبود زخم (درصد){14}}(1-منطقه خراش در نقطه زمانی نشان داده شده/منطقه خراش در 0 ساعت)×100 محاسبه شد. درصد . سطوح بیان پروتئین‌های مرتبط با مهاجرت سلولی MMP{19}} و VEGF توسط وسترن بلات شناسایی شد.

تکثیر و آپوپتوز اسپلنوسیت ها

برای تجزیه و تحلیل تکثیر، سلول‌های طحال از 3 موش C57BL/6 جدا و با CFSE (eBioscience) رنگ‌آمیزی شدند. سلول‌های نشاندار شده با CFSE به صفحات چاهی با تراکم 2×106 سلول در محیط 1 میلی‌لیتری در هر چاهک تلقیح شدند و با غلظت‌های مختلف CTPG (200، 400 و 600 میکروگرم در میلی‌لیتر) یا با 35 میکروگرم ترکیب شدند. سیس پلاتین / میلی لیتر به مدت 72 ساعت. آنالیز فلوسیتومتری پس از رنگ‌آمیزی با CD{12}}APC و CD{13}}PE (BD Biosciences) انجام شد. برای تجزیه و تحلیل آپوپتوز، سلول‌های طحال به صفحات چاهک با تراکم 2 × 106 سلول در محیط 1 میلی‌لیتری در هر چاهک تلقیح شدند و با غلظت‌های مختلف CTPG (200، 400 و 600 میکروگرم در میلی‌لیتر) تیمار شدند یا با آنها ترکیب شدند. سیس پلاتین به مدت 24 ساعت. آنالیز فلوسایتومتری پس از رنگ آمیزی با 2.5 میکرولیتر Annexin V-FITC و 5 میکرولیتر محلول PI-PE انجام شد.

ارزیابی ایمنی و فعالیت‌های تحریک‌کننده ایمنی CTPG در داخل بدن

برای ارزیابی فعالیت‌های تحریک‌کننده ایمنی درون تنی CTPG، موش‌های نر کونمینگ ۶ تا ۸ هفته‌ای به‌طور تصادفی به ۷ گروه (۵ موش/گروه) تقسیم شدند. تزریق زیر جلدی (sc, 200, 400 mg/kg)، تزریق داخل صفاقی (IP, 200, 400 mg/kg) و تزریق داخل معده (IG, 200, 400 mg/kg) هر 2 روز یکبار و در مجموع 7 بار انجام شد. ، در حالی که گروه کنترل هیچ درمانی دریافت نکرد. موش ها یک روز در میان وزن می کردند و وضعیت موش ها هر روز مشاهده می شد. پس از درمان CTPG، اندام‌های موش‌ها جدا و وزن شدند. شاخص های اندام بر اساس فرمول محاسبه شد: شاخص اندام=وزن اندام (میلی گرم)/وزن بدن (گرم). سلول‌های طحال جمع‌آوری شدند، شمارش شدند و با ضد CD{14}}APC، anti-CD19-PE، anti-CD49b FITC یا anti-CD{20}}APC، anti-CD{{ 22}}PE، ضد CD{24}}FITC (BD Biosciences). نمونه ها با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur) شناسایی شدند.

اثر ضد توموری CTPG همراه با سیس پلاتین در موش های حامل تومور H22

به موش‌های نر BALB/c 6 تا 8 هفته‌ای سلول‌های H22 (1.{5}} × 106 در هر موش در 100 میکرولیتر PBS) به صورت زیر جلدی تزریق شد. وقتی حجم تومور به حدود 60 میلی‌متر مکعب رسید، موش‌های حامل تومور به‌طور تصادفی به 4 گروه (6 موش/گروه) تقسیم شدند و با سیس پلاتین (4 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، CTPG (400 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، سیس‌پلاتین (4 میلی‌گرم/کیلوگرم) به‌علاوه CTPG درمان شدند. 400mg/kg) یا بدون درمان (گروه شاهد). موش های تومور به ترتیب در روزهای پنجم، هفتم، نهم، یازدهم و سیزدهم به صورت داخل صفاقی CTPG تزریق شدند. سیس پلاتین در روزهای هفتم و یازدهم به صورت وریدی تزریق شد. حجم تومور و وزن بدن یک روز در میان اندازه گیری شد. حجم تومور به صورت زیر محاسبه شد: حجم تومور (V)=a × b2 /2، که در آن a و b به ترتیب نشان‌دهنده طولانی‌ترین و کوتاه‌ترین قطر تومور است که با کولیس ورنیه اندازه‌گیری می‌شود. در روز بیستم، اندام ها و تومورها جداسازی و وزن شدند. سلول‌های طحال جمع‌آوری، شمارش و رنگ‌آمیزی با ضد CD{29}APC و anti-CD{31}}PE یا anti-CD{33}}FITC و anti-CD{35}}APC یا anti-CD11b-PE و anti-Gr-1-APC یا anti-CD4-FITC، anti-CD{44}}APC و anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . پس از آن، فرکانس و تعداد سلول ها توسط فلوسیتومتری (BD FACSCalibur) آنالیز شد.

تحلیل آماری

تمام داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) بیان شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم افزار Prism5 انجام شد.{2}}. پ<.05 was="" considered="" statistically="">

نتایج

CTPG از تکثیر سلول های HCC در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کرد

اجزای CTPG توسط HPLC با استفاده از استانداردهای اکیناکوزید و اکتئوزید (شکل تکمیلی 1A)، که اجزای اصلی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از سیستانچ بودند، واجد شرایط و کمی شدند. 18 با توجه به زمان نگهداری اوج و نواحی پیک، CTPG حاوی 28 درصد اکیناکوزید و 9.9 درصد اکتئوزید بود. علاوه بر این، محتوای پلی ساکاریدها در CTPG با روش فنل-سولفوریک اسید 34.8 درصد بود.19 سنجش MTT نشان داد که CTPG به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول های BEL-7404 و HepG2 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش می دهد. شکل 1A). به طور مداوم، تکثیر سلول های BEL{14}} به طور قابل توجهی توسط تیمار CTPG، که با رنگ آمیزی Ki{15}} آنالیز شد، مهار شد (شکل 1B). اثر CTPG بر تکثیر سلول‌های طحال در شرایط آزمایشگاهی نیز با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. ما مشاهده کردیم که CTPG تکثیر سلول های طحال را به روشی وابسته به دوز افزایش می دهد (شکل 1C).

مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) نقشی اساسی در بقا، تمایز و مقاومت دارویی سلول های سرطانی انسانی ایفا می کند. به منظور بررسی اینکه آیا مسیر سیگنالینگ MAPK در اثر مهاری CTPG بر تکثیر نقش داشته است از سلول‌های HCC، سطوح فسفوریلاسیون پروتئین‌های مختلف از مسیر سیگنال MAPK در سلول‌های HepG2 پس از درمان با CTPG در غلظت‌های مختلف و زمان‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. فسفوریلاسیون JNK (P-JNK) و P38 (P-P38) با درمان CTPG وابسته به دوز افزایش یافت. فسفوریلاسیون ERK (P-ERK) توسط تیمار CTPG 200 و 400 میکروگرم در میلی لیتر کاهش یافت، در حالی که P-ERK تحت تیمار CTPG 600 میکروگرم در میلی لیتر تنظیم شد (شکل 1D). علاوه بر این، سطوح P-JNK، P-p38، و P-ERK به روشی وابسته به زمان تنظیم شدند (شکل 1D). این نتایج نشان داد که CTPG ممکن است از تکثیر سلول های HCC از طریق مسیر سیگنالینگ MAPK جلوگیری کند.

توقف چرخه سلولی HCC ناشی از CTPG در فاز S

ما بیشتر تجزیه و تحلیل کردیم که آیا CTPG از طریق القای توقف چرخه سلولی، تکثیر سلولی HCC را مهار می کند یا خیر. پس از درمان با CTPG، تجمع سلول های BEL{0}} در فاز S به صورت وابسته به دوز مشاهده شد. به طور مشابه، CTPG همچنین باعث توقف چرخه سلولی HepG2 در فاز S شد و فرکانس ها از 40.66 درصد در گروه کنترل به 61.90 درصد در گروه تحت درمان با 600ug/mL CTPG افزایش یافت (شکل 2A). سیکلین ها و کینازهای وابسته به سیکلین (CDKs) نقش مهمی در کنترل و توسعه تقسیم سلولی ایفا می کنند، که 21 با فاز G2/M مرتبط بودند. سطح بیان Cyclin D1 با درمان CTPG وابسته به دوز کاهش یافت، اما G1 را به پیشرفت فاز S سطح بیان Cyclin B1، CDK1، و CDK2 نیز کاهش یافت. این پروتئین ها با فاز G2/M مرتبط بودند (شکل 2B). این نتایج نشان داد که CTPG تکثیر سلولی HCC را با القای توقف چرخه سلولی سرکوب می‌کند.

مسیر آپوپتوز وابسته به میتوکندری فعال شده با CTPG در سلول های HCC

ما همچنین تشخیص دادیم که آیا CTPG باعث آپوپتوز در سلول‌های HCC می‌شود یا خیر و دریافتیم که CTPG آپوپتوز را در سلول‌های HepG2 و BEL{1}} به شیوه‌ای وابسته به دوز القا می‌کند (شکل 3A). علاوه بر این، سطوح بیان Bax و Bcl{4}} به ترتیب با درمان CTPG به صورت وابسته به دوز افزایش و کاهش یافت (شکل 3B). آپوپتوز سلول های HepG2 با رنگ آمیزی Hoechst 33342 پس از درمان با CTPG به مدت 24 ساعت بیشتر تعیین شد. مورفولوژی هسته ای با میکروسکوپ فلورسانس معکوس مشاهده شد. همانطور که در شکل 3C نشان داده شده است، سلول های HepG2 کنترل به طور همگن رنگ آمیزی شدند در حالی که سلول های HepG2 تیمار شده با CTPG تراکم و تکه تکه شدن کروماتین را به روشی وابسته به دوز نشان دادند که مشابه سلول های HepG2 تیمار شده با سیس پلاتین بود. این نتایج نشان داد که CTPG آپوپتوز سلول های HCC را القا می کند.

یکپارچگی غشای خارجی میتوکندری به شدت توسط خانواده Bcl-2 تنظیم می‌شود و کاهش Δψm باعث آزاد شدن سیتوکروم c می‌شود که آبشار کاسپاز را برای القای آپوپتوز فعال می‌کند. ۲۳،۲۴ وقتی Δψm کاهش می‌یابد، JC{{ 3}} پلیمر (فلورسانس قرمز) به مونومرها (فلورسانس سبز) تجزیه می‌شود. بنابراین، Δψm سلول‌های HCC با رنگ‌آمیزی JC{5}} پس از تیمار CTPG به مدت 24 ساعت شناسایی شد. همانطور که در شکل 4 الف نشان داده شده است، شدت فلوئورسانس سبز کانال FL-1 کاملاً وابسته به دوز بود که توسط تیمار CTPG افزایش یافت در حالی که شدت فلورسانس قرمز کانال FL{10}} وابسته به دوز در هر دو کاهش یافت. سلول های BEL{12}} و HepG2. مشاهده میکروسکوپ فلورسانس معکوس نتیجه مشابهی را نشان داد (شکل 4B)، که نشان می‌دهد CTPG، Δψm سلول‌های HCC را کاهش می‌دهد. متعاقباً، مشاهده کردیم که سطوح سیتوکروم c در هر دو سلول BEL-7404 و HepG2 پس از درمان CTPG افزایش یافت (شکل 4C)، که بیشتر کاهش Δψm را در سلول‌های HCC تیمار شده با CTPG تأیید کرد.

انتشار سیتوکروم c می تواند کاسپاز آغازگر-9 را برای القای آپوپتوز فعال کند. نتایج آزمون وسترن بلات نشان می دهد که سطوح کاسپاز بریده شده-3، -7، و{{4} } افزایش یافت در حالی که سطح کاسپاز شکافته شده{5}} تغییر نکرد (شکل 5). کاسپاز فعال شده می‌تواند آنزیم ترمیم DNA پلیمراز (ADP-ribose) پلیمراز (PARP) را برای جلوگیری از ترمیم DNA و انباشته شدن آسیب DNA بشکند. نقش آبشار کاسپاز در آپوپتوز سلول HCC ناشی از CTPG به ترتیب با استفاده از بازدارنده کاسپاز (Z-VAD-FMK) و مهارکننده کاسپاز{13} (Ac-DEVD-CHO) بیشتر تعیین شد. Z-VAD-FMK به طور قابل توجهی آپوپتوز سلول های BEL-7404 و HepG2 القا شده توسط CTPG را معکوس کرد (شکل تکمیلی 1B). به طور مشابه، Ac-DEVD-CHO همچنین به طور قابل توجهی آپوپتوز سلول های HepG2 ناشی از CTPG را معکوس کرد (شکل تکمیلی 1C). نتایج نشان داد که CTPG با یک مسیر وابسته به میتوکندری آپوپتوز سلول‌های HCC را القا می‌کند.

CTPG مهاجرت سلولی HCC را در شرایط آزمایشگاهی سرکوب کرد

مهاجرت سلول های سرطانی یکی از فرآیندهای حیاتی در متاستاز تومور در نظر گرفته می شود. برای تعیین اینکه آیا CTPG بر مهاجرت سلولی HCC تأثیر می‌گذارد، تحرک سلولی HepG2 با روش التیام زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. همانطور که در شکل 6A و B نشان داده شده است، مهاجرت سلولی HepG2 به طور قابل توجهی توسط درمان CTPG به روشی وابسته به دوز مهار شد. خانواده MMP و VEGF نقش مهمی در مهاجرت سلول های تومور ایفا می کنند.28 پس از درمان CTPG به مدت 24 ساعت، سطوح MMP{7}} و VEGF به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 6C)، که نشان می دهد CTPG ممکن است تهاجم و متاستاز را سرکوب کند. HCC

CTPG ایمنی موش ها را تقویت کرد

گزارش شده است که پلی ساکاریدهای Cistanche deserticola دارای عملکردهای تعدیل کننده ایمنی از جمله ترویج تکثیر لنفوسیت ها و فعال کردن ماکروفاژها هستند. سلول های T 29 و سلول های B لنفوسیت های اصلی هستند که به ترتیب پاسخ های ایمنی سلولی و هومورال را واسطه می کنند. CTPG حاوی 34.8 درصد محتوای پلی ساکارید بود. بنابراین، ما اثرات CTPG را بر تکثیر سلول‌های T و سلول‌های B بررسی کردیم. همانطور که در شکل تکمیلی 2A نشان داده شده است، CTPG به طور قابل توجهی تکثیر سلول های T و سلول های B را به روشی وابسته به دوز حتی در حضور سیس پلاتین افزایش داد. جالب توجه است، CTPG به طور قابل توجهی آپوپتوز اسپلنوسیت های القا شده توسط سیس پلاتین را مهار کرد (شکل تکمیلی 2B)، که نشان می دهد CTPG می تواند عوارض جانبی سیس پلاتین را بر روی سیستم ایمنی موش بهبود بخشد.

ادامه مطلب، به قسمت Ⅱ...