مهارکننده فارنسیل ترانسفراز LNK-754 دیستروفی آکسون را کاهش می‌دهد و آسیب‌شناسی آمیلوئید را در موش‌ها کاهش می‌دهد، قسمت 2

تصویربرداری زنده از نورون ها

برای آزمایش‌های تصویربرداری زنده، نورون‌ها مانند بالا آماده شدند و در ظروف ته شیشه‌ای 35 میلی‌متری (MatTek # P35G-1.5-14C) به مدت 7 روز در کشت قرار گرفتند. سپس 10 نانومولار LNK-754 یا lonafarnib به محیط های شرطی شده اضافه شد، کشت های کنترل با DMSO به عنوان یک وسیله درمان شدند. پس از 48 ساعت درمان، محیط با محیط های شرطی شده از صفحات موازی نورون های درمان نشده جایگزین شد. 25 نانومتر LysoTracker-Green DND{11}} (#L7526، Invitrogen) به محیط شرطی شده اضافه شد و نورون ها به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شدند.

نورون ها بخش مهمی از سیستم عصبی هستند که قادر به دریافت، پردازش و انتقال اطلاعات هستند و اساس مادی هوش و رفتار انسان هستند. ایمنی تضمین مهمی برای مقاومت بدن انسان در برابر بیماری است. می تواند عوامل بیماری زا و سلول های غیر طبیعی را شناسایی و از بین ببرد و سلامت بدن را حفظ کند.

تحقیقات نشان می دهد که ارتباط قوی بین نورون ها و سیستم ایمنی وجود دارد. نورون ها می توانند با آزادسازی انواع انتقال دهنده های عصبی مانند نوراپی نفرین، اپی نفرین و غیره بر روی سیستم ایمنی تاثیر بگذارند. این انتقال دهنده های عصبی می توانند فعالیت سلول های ایمنی را تغییر دهند، تکثیر و عملکرد سلول های ایمنی را افزایش دهند و ایمنی بدن را بهبود بخشند. در عین حال، سیستم ایمنی نیز می تواند از طریق مسیرهای مختلف بر عملکرد نورون ها تأثیر بگذارد. سلول های ایمنی می توانند انواع سیتوکین ها و هورمون ها را ترشح کنند که از طریق مسیرهای ایمنی بر رشد، توسعه و عملکرد نورون ها تأثیر می گذارد.

علاوه بر این، عوامل روانی و اجتماعی می توانند بر ایمنی و عملکرد عصبی تأثیر بگذارند. احساسات منفی مانند استرس، اضطراب و افسردگی می توانند بر سیستم ایمنی و نورون ها تأثیر منفی بگذارند و ایمنی بدن را کاهش دهند. احساسات مثبت، روابط اجتماعی مثبت، و یک سبک زندگی سالم می تواند باعث رشد سالم سیستم ایمنی و نورون ها شود.

به طور خلاصه، یک رابطه تعاملی و متقابل حمایتی بین نورون ها و ایمنی وجود دارد. حفظ سلامت روان، مواجهه مثبت با زندگی و اتخاذ عادات خوب زندگی می تواند ایمنی بدن و رشد سالم نورون ها را تقویت کند. مشاهده می شود که باید حافظه خود را تقویت کنیم. Cistanche deserticola می تواند به طور قابل توجهی حافظه را بهبود بخشد، زیرا Cistanche deserticola همچنین می تواند تعادل انتقال دهنده های عصبی مانند افزایش سطح استیل کولین و فاکتورهای رشد را تنظیم کند. این مواد برای حافظه و یادگیری بسیار مهم هستند. علاوه بر این، گوشت همچنین می تواند جریان خون را بهبود بخشد و اکسیژن رسانی را تقویت کند، که می تواند اطمینان حاصل کند که مغز مواد مغذی و انرژی کافی را دریافت می کند، بنابراین نشاط و استقامت مغز را بهبود می بخشد.

روی روش های بهبود عملکرد مغز کلیک کنید

تصویربرداری تایم لپس از نورون ها با استفاده از میکروسکوپ میدان وسیع Ti2 انجام شد. تصویربرداری بلافاصله در 30 دقیقه شروع شد و بیش از 30 دقیقه ادامه یافت. نوردهی‌های 1- هر دقیقه گرفته می‌شد و 20 تا 30 ناحیه جداگانه در هر ظرف ظرف 30 دقیقه تصویربرداری می‌شد. کمی سازی فاصله و سرعت ذرات LysoTracker و تجزیه و تحلیل کیموگراف با استفاده از نرم افزار NIS Elements انجام شد و در زیر به تفصیل توضیح داده شد. در آزمایش‌های جداگانه، 1μM Lysosensor-Green DND{10}} (#L7535، Invitrogen) به رسانه‌های شرطی اضافه شد و تصاویر گرفته شده از نورون‌های زنده به مدت حداکثر 15 دقیقه با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Nikon A1 با شیئی 60X گرفته شد. (NA 1.4) و نرم افزار NIS Elements.

تصویربرداری زنده از بافت های مغز

{{0}}موش‌های 5XFAD ماهانه روزانه به مدت 3 هفته تزریق داخل رحمی شدند و پس از اتمام درمان، موش‌ها بیهوش شدند و با محلولی حاوی 1M KCl، 1MgCl2، 0.1mM کینورنات پرفیوژن شدند. 0.01 میلی‌مولار DL{11}}آمینو-5-فسفونوپنتانوئیک اسید، 5 میلی‌مولار گلوتاتیون، 25 میلی‌مولار گلوکز، 125 میلی‌مولار NaCl، 1.4 میلی‌مولار NaH2PO4 و 25 میلی‌مولار NaHCO3.

سپس مغزها به سرعت در ACSF اکسیژن دار یخی حاوی 2.5 میلی‌مولار KCl، 85 میلی‌مولار NaCl، 1.25 میلی‌مولار NaH2PO4، 25 میلی‌مولار NaHCO3، {{10}}}.5 میلی‌مولار CaCl2، 4 میلی‌مولار KCl، 4 میلی‌مولار KCl، 4 میلی‌مولار سوخو، 5 میلی‌مولار، 5 میلی‌مولار، 5 میلی‌مولار سوخو، 5 میلی‌مولار، 5 میلی‌مولار سوخو، 7 میلی‌مولار NaH2PO4، جدا شدند. 50uM C6H7NaO6، 0.1 میلی‌مولار کینورنات، 0.01 میلی‌مولار DL{26}}آمینو{27}}فسفونوپنتانوئیک اسید و 5 میلی‌مولار گلوتاتیون. برش های تاج 300 میکرومتری با استفاده از میکروتوم ارتعاشی Compresstome VF{30} (ابزار دقیق) به دست آمد و به مدت 30 دقیقه برای بازیابی در دمای 32 درجه در محلول اکسیژن دار ACSF حاوی 2.5 میلی مولار KCl، 85 میلی مولار Na25، NaCl, 85 mM Na25, 1، استراحت داده شد. 25 میلی‌مولار NaHCO3، 0.5 میلی‌مولار CaCl2، 4 میلی‌مولار، 4 MgCl2، 75 میلی‌مولار ساکارز، 25 میلی‌مولار گلوکز، 50 میکرومولار C6H7NaO6، 0.1 میلی‌مولار کینورنات، 0.01 میلی‌مولار DL{58}}5.

سپس برش‌ها به ظروف ته شیشه‌ای 35 میلی‌متری (MatTek # P35G-1.5-14C) حاوی ACSF اکسیژن‌دار با 25 نانومولار LysoTracker-Green و رقت 1:10000 1 میلی‌گرم/ منتقل شدند. میلی لیتر تیازین قرمز (#S570435، Sigma Aldrich) که در غیر این صورت با ACSF مورد استفاده در دوره بهبودی یکسان بود. زنده ماندن برش با استفاده از تصویربرداری با گذشت زمان از بافت ها تایید شد. برش ها با LysoTracker-Green و Tiazine Red به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند و سپس نواحی قشر مغز بلافاصله در همان محلول در دمای 32 درجه بر روی میکروسکوپ کانفوکال Nikon A1 با شیئی 60X (NA 1.4) و نرم افزار NIS Elements تصویربرداری شدند. بیش از 30 دقیقه نیست.

استخراج مغز و ایمونوبلات

موش‌ها با تزریق داخل صفاقی زایلازین (15 میلی‌گرم/کیلوگرم) و کتامین (1{5}}0 میلی‌گرم بر کیلوگرم)، پرفیوژن با سالین بافر فسفات (1XPBS) با فنیل متیل سولفونیل فلوراید (20 میکروگرم بر میلی‌لیتر) بیهوش شدند. لوپپتین (0.5 میکروگرم در میلی‌لیتر)، اورتووانادات سدیم (20 میکرومولار)، و دی تیوتریتول (0.1 میلی‌مولار)، و به دنبال آن برداشتن مغز انجام می‌شود. تمام بافرهای مورد استفاده برای استخراج پروتئین حاوی کوکتل III مهارکننده پروتئاز (#535140، Millipore) و بازدارنده Halt فسفاتاز (#78420، Thermo Fisher Scientific) بودند. بافت های همی مغز با استفاده از هموژنایزر دونس 1:10 (w/v) در 1XPBS وزن و به صورت دستی همگن شدند.

پس از همگن‌سازی، لیزات‌ها در دمای 0 گرم به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. بخش محلول (روی‌ناتانت) برداشته شد و گلوله با پیپت کردن در بافر (50 میلی‌مولار تریس، 0.15 مولار NaCl، 1 درصد اکتیل فنوکسی پلی‌اتوکسی اتانول (IGEPAL)، 1 میلی‌مولار EDTA0.1، 1 میلی‌مولار S.5، 1.5، EDTA، 1 میلی‌مولار S.5. % deoxycholate سدیم در pH8] به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شود.

نمونه ها به مدت 20 ثانیه روی یخ (Misonix XL{0}}) سونیک شدند و سپس در دمای 20800 گرم به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. بخش محلول در RIPA (سوپرناتانت) حذف شد و گلوله در 5M گوانیدین (pH 8.0) برای تجزیه و تحلیل پروتئین های نامحلول معلق شد. هر نمونه به مدت 20 ثانیه بر روی یخ قرار گرفت، به مدت 1 ساعت در دمای اتاق چرخانده شد و سپس در 20800 گرم به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شد. برای اندازه گیری غلظت پروتئین هر نمونه از روش بیسینکونیک اسید (BCA) (#23225، Thermo Fisher Scientific) استفاده شد.

برای وسترن بلات، 20 گرم پروتئین از هر نمونه روی ژل های 4 تا 12 درصد NuPAGE (Invitrogen) بارگذاری شد و با استفاده از بافر MOPS تحت شرایط کاهش یافته و دناتوره جدا شد. پروتئین ها بر روی غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید منتقل شدند و با استفاده از Pierce ECL (شیمی لومینسانس افزایش یافته؛ Thermo Fisher Scientific) توسعه یافتند. سیگنال‌های توسعه‌یافته با استفاده از ProteinSimple FCR (FluorChem R) و سیگنال‌های نورتابی شیمیایی بعدی با استفاده از نرم‌افزار AlphaView (ProteinSimple) اندازه‌گیری شدند. همه لکه‌ها با استفاده از ابزار تصحیح پس‌زمینه محلی به‌جز لکه‌های HDJ{3}} که با استفاده از ابزار پیوند پس‌زمینه در ارتباط با تصحیح پس‌زمینه چند منطقه‌ای (نرم‌افزار AlphaView) آنالیز شدند، تجزیه و تحلیل شدند.

الایزا 42

برای اندازه‌گیری A 42 در هموژنه‌های همی‌مغز از موش‌های 5XFAD، یک سنجش تجاری آنزیم پیوند ایمونوسوربنت (ELISA) (Thermo Fisher Scientific، KHB3441) با پیروی از دستورالعمل‌های سازنده برای آنالیز گوانیدین و A42 محلول در PBS در همی‌برین‌ها استفاده شد. برای اندازه‌گیری A 42 در مغز موش‌های hAPP/PS1، از یک ELISA تجاری موجود استفاده شد (h amyloid 42 ELISA high sensitive، Te Genetics Company، زوریخ، سوئیس). ELISA طبق پروتکل سازنده انجام شد.

ایمونوفلورسانس بافت مغز موش

پس از پرفیوژن، مغزها استخراج شد و همی‌مغز در فرمالین 1{16}} درصد و سپس انجماد در محلول ساکارز 30 درصد در 1XPBS تثبیت شد. یک میکروتوم لغزنده انجمادی برای برداشت مقاطع کرونر یا ساژیتال 30- میکرومتر استفاده شد. مقاطع به صورت متوالی در یک صفحه چاهی در محلول محافظ سرما (1xPBS، 30 درصد ساکارز و 30 درصد اتیلن گلیکول) قرار داده شدند و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه نگهداری شدند. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس با شستشوی مقاطع ابتدا سه بار در 1XTBS و سپس انکوبه کردن مقاطع در 16 میلی مولار گلیسین در 1XTBS به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. پس از 3 شستشوی اضافی در 1XTBS، مقاطع در سرم 5% بز در 0.25% Triton X{18}} در 1XTBS به مدت 2 ساعت در دمای اتاق مسدود شدند.

سپس مقاطع به مدت یک شب در آنتی بادی های اولیه در محلول 0.25% Triton X-100، 1% آلبومین سرم گاوی و 1XTBS در دمای 4 درجه انکوبه شدند. سپس ایمونوهیستوشیمی ثانویه با آنتی بادی های ثانویه نشاندار شده با الکسا فلور الاغ در غلظت 1:1000 (Thermo Fisher Scientific) انجام شد. ProLong Gold (#P36934، Thermo Fisher Scientific) برای نصب مقاطع قبل از تصویربرداری روی میکروسکوپ میدان گسترده Ti2 یا میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری Nikon A1 برای تعیین کمیت تصویر با استفاده از نرم‌افزار Nikon NIS Elements برای بدست آوردن استفاده شد.

همه تنظیمات اکتساب بین ژنوتیپ ها یکسان باقی ماندند و همه تصاویر در همان دوره تصویربرداری برای آزمایش های فردی (مرکز میکروسکوپ پیشرفته دانشگاه نورث وسترن و مرکز تصویربرداری نیکون) به دست آمدند.

کمیت تصویر

مغز موش

کمیت ایمونوفلورسانس ایمونوهیستوشیمی بافت مغز موش بر روی 3-5 بخش به ازای هر حیوان، از مختصات Bregma در حدود -0.94- تا -2.55mm انجام شد، که با استفاده از یک شی 10X در یک میکروسکوپ میدان گسترده Ti2 تصویربرداری شد. تجزیه و تحلیل کمی، از جمله اندازه و آستانه شدت، با استفاده از نرم افزار NIS-Elements نیکون (مرکز تصویربرداری نیکون دانشگاه نورث وسترن) انجام شد.

بسته به سیگنال، آستانه ها با استفاده از ابزار تجزیه و تحلیل عمومی بر اساس اندازه، شکل و کنتراست شی تنظیم شدند و سپس ماسک های باینری برای هر کانال و منطقه مورد نظر ایجاد شدند. آستانه گذاری به طور جداگانه در هر کانال انجام شد تا سیگنال های مورد علاقه را با بهینه سازی نسبت سیگنال به نویز و حذف سیگنال های پس زمینه غیر اختصاصی جدا کند. برای محاسبه LAMP1، BACE1، یا LysoTracker-Green ناحیه تحت پوشش، و همچنین اندازه گیری شدت فلورسانس LAMP1 و Lysosensor در نورون های اولیه، مناطق مورد نظر به صورت دستی با استفاده از NIS-Elements ردیابی شدند و یک لایه باینری برای هر منطقه مورد نظر ایجاد شد.

برای محاسبه نسبت LAMP1 به A 42، مساحت LAMP1 در نوریت های دیستروفیک به ناحیه A42 بر اساس پلاک فردی نرمال شد و میانگین نسبت ها به ازای هر موش بین گروه های درمانی کمی سازی شد. تجزیه و تحلیل ضریب همبستگی پیرسون برای BACE1 و LAMP1 با استفاده از عناصر NIS بر اساس هر پلاک بر روی پیش‌بینی‌های شدت حداکثر 30 میکرومتر تصاویر پشته Z گرفته شده با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری Nikon A1 با اندازه گام 1 میکرومتر انجام شد.

برای محاسبه نسبت LysoTrackerGreen به قرمز Tiazine، مساحت LysoTracker-Green در نوریت های دیستروفیک به ناحیه Tiazine Red بر اساس پلاک فردی نرمال شد و میانگین نسبت به ازای هر موش بین گروه های درمانی کمی سازی شد. چهار بخش تاج از مختصات Bregma تقریباً 7/1- تا 55/2- میلی متر برای محاسبه مساحت یا شدت هر سیگنال در هر ناحیه مغز مربوطه برای هر موش استفاده شد. تجزیه و تحلیل ناحیه پوشیده شده با پلاک و اندازه پلاک با استفاده از میانگین پنج بخش در هر موش از مختصات Bregma تقریباً 0.94- تا 2.55- میلی متر انجام شد. انتخاب بخش، اکتساب تصویر، ردیابی تصویر، و کمی سازی توسط فردی که نسبت به گروه های درمانی و ژنوتیپ ها نابینا بود، انجام شد.

نورون های اولیه

برای تعیین کمیت رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی LAMP1 در نورون های اولیه ثابت موش، سوماها به صورت دستی بر اساس مورفولوژی با استفاده از عناصر NIS ردیابی شدند و یک ماسک باینری برای هر ناحیه مورد نظر و کانال ایجاد شد. آستانه‌گذاری برای بهینه‌سازی سیگنال‌های LAMP1 و تمایز LAMP1 در نوریت‌ها، از جمله دندریت‌ها و آکسون‌ها، با جداسازی پیکسل‌های LAMP1 مثبت برای پیکسل‌های توبولین استفاده شد.

سیگنال‌های LAMP1 سلول سوم از کل منطقه LAMP1 حذف شدند تا وزیکول‌های LAMP1 در نوریت‌ها را تجزیه و تحلیل کنند. برای تجزیه و تحلیل تحرک LysoTracker-Green در نورون ها، تصاویر با استفاده از NISElements کمی سازی شدند. سرعت و فاصله کل ذرات LysoTrackerGreen در هر فریم با استفاده از ویژگی ردیابی خودکار حرکت در NIS-Elements ردیابی شد. یک آستانه بر اساس اندازه و شدت فلورسانس ذرات LysoTracker-Green برای حذف نویز پس‌زمینه تنظیم و برای همه فیلم‌ها اعمال شد.

برای تولید کیموگراف، تصویربرداری تایم لپس از تک نورون ها بر روی یک میکروسکوپ کانفوکال 6{2}}X انجام شد و آکسون ها از نظر مورفولوژیکی شناسایی شدند. درصد فرکانس ذرات در حال حرکت در جهت متجانس یا رتروگراد یا ساکن، با تقسیم تعداد ذرات برای هر گروه بر تعداد کل ذرات تعیین شد. برای تجزیه و تحلیل کیموگراف، ذرات متحرک به عنوان دارای سرعت بالای 0.1μM/sec تعریف شدند.

تحلیل آماری

نرم افزار GraphPad Prism v8 برای انجام تجزیه و تحلیل های آماری، از جمله تجزیه و تحلیل واریانس (ANOVA) با آزمون های پسا هوک در هنگام مقایسه بیش از دو نمونه و آزمون های t-paired زمانی که تنها دو نمونه در حال مقایسه بودند، استفاده شد. جزئیات آزمون خاص از جمله تعداد تکرارها، نوع تست های پس از مرگ و مقادیر P در افسانه های شکل بیان شده است. تمام کمی سازی ها با میانگین ± SEM رسم می شوند. وقتی مقدار P کمتر از 0.05 بود که با *P نشان داده شده بود، اهمیت نتیجه گرفت.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com