عصاره های گل به عنوان رنگ های چند منظوره در صنعت لوازم آرایشی بخش 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

بسیاری از محصولات طبیعی در سیستم‌های پزشکی سنتی برای درمان تسکین علائم از درد و التهاب استفاده می‌شوند، [61] بنابراین، تأثیر عصاره‌های مورد تجزیه و تحلیل بر مهار فعالیت لیپوکسیژناز و پروتئیناز مورد بررسی قرار گرفت. در محدوده غلظت‌های مورد تجزیه و تحلیل (100-500 ug/mL)، عصاره آب CTE قوی‌ترین توانایی را برای مهار پروتئیناز نشان داد (شکل 4) (در 57 درصد برای غلظت 500 میکروگرم در میلی‌لیتر). این فعالیت با مهارکننده معروف پروتئیناز دیکلوفناک، که به عنوان شاهد استفاده می‌شود (حدود 89 درصد مهار در بالاترین غلظت آزمایش‌شده) مقایسه شد. با این حال، نتایج مشابهی برای عصاره GGE و KTE به دست آمد (به ترتیب حدود 56 درصد و 53 درصد برای بالاترین غلظت). مهار پروتئیناز کمتر برای عصاره PRE و PGE مشاهده شد. در آزمایش دیگری که توانایی مهار لیپوکسیژناز را اندازه گیری کرد، عصاره های آبی KTE و CTE بالاترین مقادیر را نشان دادند (به ترتیب حدود 67 درصد و 64 درصد بازدارندگی برای غلظت 500 میکروگرم در میلی لیتر). از دیکلوفناک نیز به عنوان شاهد استفاده شد. عصاره های GGE، PGE و PRE نیز دارای مقادیر قابل توجهی بالایی هستند (به ترتیب 60 درصد، 57 درصد و 54 درصد). همچنین اشاره شد که توانایی مهار آنزیم های LOX و پروتئیناز به غلظت عصاره بستگی دارد (شکل 5).

مطالعات قبلی نشان داد که بسیاری از ترکیبات پلی فنلی به طور قابل توجهی در فعالیت های ضد التهابی بسیاری از عصاره های گیاهی نقش دارند [62]. مطالعات دخالت ROS را در فرآیند التهابی نشان داده‌اند، و ترکیبات فنلی مانند گالیک و اسید کوئینیک ممکن است با مهار فعالیت لیپوکسیژناز، متابولیسم اسید آراشیدونیک را مسدود کنند، یا ممکن است به عنوان رادیکال‌های آزاد فعال واکنشی که در طی اسید آراشیدونیک تولید می‌شوند، عمل کنند. [63]. نتایج بدست آمده توسط بن سعد و همکاران. نشان می دهد که الاژیک اسید، گالیک اسید و پونیکالاژین A&B جدا شده از P. granatum تولید اکسید نیتریک (NO)، پروستاگلاندین E2 (PGE2) و اینترلوکین 6 (IL-6) در لیپوپلی ساکارید (LPS) ناشی از آن را مهار می کنند. ماکروفاژها RAW 267.4. اینکه آیا این ترکیبات به عنوان تنها عامل کار می کنند یا اثر هم افزایی دارند، هنوز یک سوال باقی می ماند [64]. از آنجایی که بسیاری از فلاونوئیدها دارای خواص ضد التهابی هستند، به دلیل رفتار آنتی اکسیدانی ذاتی آنها، در اختلالات التهابی مختلف نقش دارند.روش استخراج فلاونوئید pdf،به طور خاص، کوئرستین جالب ترین مولکول است زیرا با مسیرهای بیولوژیکی خاص تداخل دارد. علاوه بر این، مطالعات نشان می دهد که می تواند فرآیند التهابی درگیر در چندین مدل را از طریق مکانیسم های مختلف کاهش دهد[65]. به طور خاص، پروتئین کیناز فعال شده با AMP و مسیر هیستون/پروتئین داستیلاز (AMPK/SIRT1) منجر به مدیریت التهاب جالب‌تر می‌شود. بنابراین، فعال کننده های AMPK می توانند التهاب ماکروفاژها را کاهش دهند. کوئرستین و سایر فلاونوئیدها، به عنوان فعال کننده های AMPK و SIRT1، ممکن است با تداخل در این مسیر، التهاب را کاهش دهند [66]. همچنین نشان داده شده است که کوئرستین و مونوگلوکوزیدهای کورستین پتانسیل مهار LOX بالاتری دارند [67] Nair et al. خواص ضد التهابی عصاره KTE را با ارزیابی وجود فلاونول‌ها با بخش کوئرستین مانند manghaslin Qu 3-[2G] rhamnosylrutinoside، Qu 3-O-dirhamnoside و روتین نشان داده‌اند. این مولکول‌ها مهار شدید فعالیت COX{11}} و سرکوب جزئی ROS را نشان داده‌اند. به طور کلی، پلی فنول های موجود در CTE خواص ضد التهابی در التهاب ناشی از LPS در سلول های ماکروفاژ RAW 264.7 نشان دادند[68].

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

2.5. ارزیابی سمیت سلولی

در ایجاد مواد اولیه آرایشی و بهداشتی جدید، یکی از مهمترین ویژگی ها ایمنی استفاده از آنهاست. موادی که برای استفاده در لوازم آرایشی اختصاص داده شده اند، باید غیرسمی باشند، به ویژه در رابطه با سلول های پوست، مانند کراتینوسیت ها و فیبروبلاست ها. دو نوع آزمایش برای تعیین سمیت عصاره های تجزیه و تحلیل شده بر روی سلول های HaCaT و BJ استفاده شده است.فلاونوئیدهااولین مطالعه، با استفاده از سنجش جذب قرمز خنثی، ما را قادر می‌سازد تا بقای سلول‌های تیمار شده با عصاره‌های آنالیز شده را ارزیابی کنیم. این رنگ وارد لیزوزوم های یک سلول زنده می شود و در سیتوپلاسم سلول های مرده آزاد می شود. مشاهده شد (شکل 6) که عصاره CTE بالاترین توانایی را برای افزایش تکثیر سلول های HaCaT و BJ دارد. در مقایسه با شاهد، این عصاره به ترتیب در غلظت 250 میکرولیتر بر میلی‌لیتر (HaCaT و B) و 500 میکرولیتر بر میلی‌لیتر (سلول‌های BJ) حدود 20 درصد و 40 درصد بیشتر از پارامتر مورد آزمایش قرار گرفت. عصاره GGE در غلظت‌های 100 و 250 میکرولیتر بر میلی‌لیتر و عصاره KTE در غلظت 500 میکرولیتر بر میلی‌لیتر با اثر سمی کمی بر روی سلول‌های BJ مشخص شد. عصاره های دیگر تأثیر مثبتی بر روی زنده ماندن این سلول ها داشتند. عصاره‌های PRE و PGE در غلظت 100 میکرولیتر بر میلی‌لیتر تفاوت معنی‌داری با شاهد نداشتند و تکثیر سلول‌های BJ را حدود 10-15 درصد نسبت به شاهد در غلظت‌های 250 و 500 میکرولیتر افزایش دادند. میلی لیتر در مورد کراتینوسیت ها هیچ کاهشی در زنده ماندن سلول مشاهده نشد. برای عصاره‌های PGE، PRE و CTE، افزایش تکثیر با افزایش غلظت مشاهده شد، در حالی که کاهش در زنده‌مانی سلول با افزایش غلظت عصاره‌های KTE و GGE نشان داده شد.

دومین آزمایشی که برای تعیین سمیت سلولی عصاره های مورد آزمایش انجام شد، تست رسازورین (Alamar Blue) بود. نشان داده شده است (شکل 7) که زنده ماندن سلول ها به غلظت عصاره ای که سلول ها با آن انکوبه شده اند بستگی دارد. در مورد فیبروبلاست ها، عصاره های PRE، PGE و CTE با افزایش غلظت آنها باعث تکثیر سلولی بالاتری می شوند. در بالاترین غلظت آنالیز شده (500 میکرولیتر بر میلی لیتر)، حدود 20 درصد تکثیر بیشتر در مقایسه با شاهد مشاهده شد.هسپریدین استفاده می کنددر مورد عصاره‌های KTE و GGE، با افزایش غلظت عصاره‌ها، کاهش زنده‌مانی سلولی مشاهده شد. این عصاره ها در غلظت های 250 و 500 میکرولیتر بر میلی لیتر اثر سمی کمی بر BJ نشان دادند. در مورد کراتینوسیت ها، اثر مشابهی از عصاره های مورد تجزیه و تحلیل بر روی سلول های پوست مشاهده شد، اما توانایی آنها برای تکثیر به اندازه فیبروبلاست ها قوی نبود. بالاترین توانایی برای افزایش تکثیر کراتینوسیت برای عصاره CTE در کل محدوده غلظت های مورد تجزیه و تحلیل مشاهده شد. مقادیر مشابهی برای عصاره PRE در غلظت 250 میکرولیتر بر میلی لیتر و برای عصاره PGE در غلظت 500 میکرولیتر بر میلی لیتر به دست آمد. عصاره KTE نسبت به عصاره GGE اثر سمی قابل‌توجهی بالاتری بر سلول‌های HaCa نشان داد.

عصاره های آنالیز شده قبلاً به طور گسترده برای سمیت آنها برای سلول های پوست آزمایش نشده بودند. تنها چند مطالعه سمیت سلولی روی عصاره ها یا مواد اصلی فعال آنها، به ویژه در مورد سلول های سرطانی وجود دارد. نویسندگان مطالعات قبلی نشان دادند که این عصاره ها عموماً اثر سمی روی سلول های پوست ندارند و توانایی آنها در افزایش تکثیر سلولی اغلب به محتوای بالای پلی فنول ها، آنتوسیانین ها و فلاونوئیدها نسبت داده می شود [45،{1}} ]. برخی از نویسندگان همچنین نشان دادند که اجزای منفرد موجود در عصاره ها ممکن است اثر سمی روی سلول های پوست از خود نشان دهند، در حالی که عصاره به طور کلی چنین نیست. علی حجازی و همکاران [69] نشان داد که آلکالوئیدهای استخراج شده از Punica granatum برای رده های سلولی طبیعی و سرطانی سمی هستند، در حالی که کل عصاره سمی کمتری دارد. مطالعه نصیری و همکاران. [70] نشان می دهد که عصاره گل Punica granatum به دلیل توانایی آن در افزایش تکثیر سلول های پوست ممکن است در تسریع روند بهبود زخم مفید باشد. در تحقیقات قبلی ما [45]، نشان داده شد که عصاره های آب اتانولی به دست آمده از گیاهان مورد تجزیه و تحلیل با توانایی بالاتری در افزایش تکثیر سلول های BJ مشخص می شوند و عصاره های KTE و GGE اثر سمی کمتری بر این سلول ها نشان می دهند. .سیستانچ امپراتوری از دست رفتهاثر عصاره آب-اتانولی بر سلول‌های HaCaT مشابه عصاره‌های آبی خالص بود، اما در مورد عصاره‌های به‌دست‌آمده با اتانول، خواص تکثیر کمی مطلوب‌تری نسبت به عصاره‌های آبی مشاهده شد. تفاوت بین ترکیب هر دو نوع عصاره تجزیه شده ممکن است باعث ایجاد تفاوت در سمیت آنها شود. همانطور که نشان داده شد، عصاره های آب به اندازه عصاره های آب-اتانولی از نظر مواد فعال زیستی غنی نیستند. بیشترین تفاوت در محتوای روتین و ایزوکورسیترین مشاهده می شود.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

2.6.تعیین فاکتور محافظت در برابر آفتاب

اثرات نامطلوب اشعه ماوراء بنفش بر روی پوست ممکن است مدت کوتاهی پس از قرار گرفتن در معرض و حتی سال‌ها بعد آشکار شود. تابش خورشیدی دارای اثر سرکوب کننده سیستم ایمنی است که روند پیری پوست را با تمام عواقب مرتبط با آن از جمله افزایش سرطان زایی تسریع می کند[74]. روندهای مشاهده شده در حال حاضر نیاز روزافزونی به توسعه محصولاتی را نشان می دهد که نه تنها با سطح بسیار بالای ایمنی در استفاده مشخص می شود، بلکه چند کارکردی نیز دارد، به این معنا که محصولات دارای محافظ ضد تشعشع پوست با دامنه عمل گسترده تر از آنچه تاکنون استفاده شده است، می باشد. برخی از مواد گیاهی نقش ارزشمندی در این زمینه ایفا می کنند که نه تنها قادر به محافظت در برابر نور خورشید هستند، بلکه می توانند اثرات منفی تابش خورشیدی از قبل موجود بر روی پوست را نیز خنثی کنند [75-77]. تحقیقات انجام شده نشان داد که عصاره های گیاهی مورد تجزیه و تحلیل PRE، PGE، KTE، CTE و GGE با ضرایب SPF بالا مشخص می شوند.

تجزیه و تحلیل ضرایب (SPF) برای عصاره آبی به‌دست‌آمده از گیاهان فوق در غلظت‌های 10 و 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر انجام شد. برای هر گیاه مورد بررسی غلظت بالاتر عصاره منجر به افزایش معنی داری SPF شد.کسری فلاونوئید خالص میکرونیزه 1000 میلی گرم استفاده می کندمقایسه بین عصاره ها نشان می دهد که بالاترین مقادیر SPF برای عصاره KTE مشاهده شد که برای هر دو غلظت مورد بررسی وجود دارد. مشاهدات جالب دیگر این است که حتی در غلظت‌های کمتر مورد بررسی، عصاره KTE همچنان SPF بالایی از خود نشان می‌دهد، در حالی که مقادیر سایر عصاره‌ها به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. این زمانی مشخص می شود که ما تجزیه و تحلیل کنیم که نتیجه برای KTE چقدر بالاتر از سایر عصاره ها بوده است. برای غلظت 50 میلی گرم بر میلی لیتر، SPF با ضریب 1.2 (در مقایسه با PGE، CTE) به ضریب تقریباً 1.9 (در مقایسه با PRE، GE) بالاتر بود. همین محاسبه برای غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، فاکتورهایی از 1.4 (در مقایسه با PGE) تا فاکتورهایی در محدوده 2-3 (در مقایسه با CTE، GGE)، حتی تا فاکتورهایی مانند 10 در مقایسه با PRE. هنگام تمرکز روی عصاره KTE، می توان متوجه شد که کاهش غلظت عصاره توسط فاکتور 5 (از مقدار 50 میلی گرم در میلی لیتر به مقدار 10 میلی لیتر در میلی لیتر) منجر به کاهش مقدار SPF توسط فاکتور 3.4 می شود. ، به این معنی که SPF کندتر از غلظت کاهش می یابد. موارد فوق نشان می دهد که عصاره KTE حتی زمانی که در غلظت های پایین استفاده می شود می تواند کارآمد باشد (شکل 8).

2.7. از دست دادن آب ترانس اپیدرمی (TEWL) و اندازه گیری هیدراتاسیون پوست

با توجه به گستره وسیع فعالیت بیولوژیکی و دارویی مواد خام گیاهی، مواد گیاهی موجود در عصاره ها تاثیر بسزایی بر وضعیت پوست دارند. به طور خاص، ما در اینجا در مورد تأثیر متابولیت های ثانویه بر وضعیت پوست ما صحبت می کنیم [78،79].

در مرحله بعدی تحقیق، آنالیز هیدراتاسیون و TEWL انجام شد. اثر عصاره های مورد آزمایش بر روی پوست ارزیابی شد. اندازه‌گیری‌ها در فواصل زمانی 60 و 360 دقیقه‌ای برای غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره انجام شد. برای اندازه‌گیری TEWL، بیشترین درصد کاهش برای عصاره PGE نشان داده شد که در آن مقدار کنترل 13.9 به 8.71 کاهش یافت که منجر به کاهش درصدی 37 درصدی شد. همچنین ارزش تجزیه و تحلیل عصاره KTE را از این منظر دارد، زیرا این عصاره بالاترین مقادیر SPF را نشان می‌دهد. برای استخراج KTE، مقدار کنترل TEWL به مقدار 10.22 کاهش یافت که به معنای کاهش 26 درصدی است (شکل 9A).

با این حال، در مورد اندازه‌گیری ابزار دوم، نشان داده شد که عصاره‌های آنالیز شده باعث افزایش رطوبت نسبت به نمونه شاهد، هم پس از 60 دقیقه و هم بعد از 360 دقیقه می‌شوند.

در نتیجه آنالیزها، مشخص شد که عصاره های PRE، PGE، KTE، CTE و GGE آنالیز شده هیدراتاسیون پوست را افزایش می دهند (شکل 9B). افزایش خاصیت مرطوب کنندگی همراه با افزایش غلظت عصاره در فرآورده ها مشاهده شد. قوی ترین خواص مرطوب کنندگی عصاره های PRE و PGE به میزان 32 درصد و 29 درصد پس از 60 دقیقه و معادل 21 درصد و 22 درصد پس از 360 دقیقه مشاهده شده است. با این حال، کمترین سطح هیدراتاسیون پوست برای عصاره KTE برابر با 18 درصد پس از 60 دقیقه و نزدیک به 3 درصد پس از 360 دقیقه است.

2.8. تجزیه و تحلیل برنامه

2.8.1. تعیین پارامترهای رنگی عصاره ها

مواد موثره گل های گیاهی به دلیل رنگ طبیعی خود می توانند به عنوان رنگ طبیعی در بسیاری از محصولات تجاری مانند لوازم آرایشی و بهداشتی و مواد غذایی استفاده شوند. آنالیز رنگ برای عصاره های به دست آمده انجام شد (جدول 5).

عصاره‌های PRE، KTE و CTE بالاترین پتانسیل را به عنوان رنگدانه‌های آرایشی طبیعی دارند. با این حال، بالاترین مقادیر کروما (C*) برای CTE مشاهده شد. بر اساس مقدار پارامتر درجه h مشخص شد که رنگ زرد این عصاره است که با چشم غیرمسلح مشاهده و قابل مشاهده است. در مورد عصاره‌های KTE و PRE، با وجود مقدار C* پایین (2.8)، رنگ این عصاره‌ها با چشم غیرمسلح به وضوح قابل مشاهده است و برای PRE قرمز-بنفش و برای عصاره KTE آبی-بنفش مشخص شد. عصاره های آبی PGE و GGE به رنگ قرمز و کمی نارنجی بودند و مقادیر کرومای بدست آمده در سطح 1.3 بود. برای این رنگ، این مقادیر به طور قابل توجهی با چشم غیر مسلح قابل تشخیص نبودند.

2.8.2. تعیین پارامترهای رنگی لوازم آرایشی بر اساس عصاره ها

در سال‌های اخیر، نیاز شدیدی به تولید رنگ‌های جدید با منشأ طبیعی، به‌ویژه در صنایع غذایی و آرایشی وجود داشته است. در مقایسه با رنگ هایی که به صورت مصنوعی به دست می آیند، ممکن است تاثیر منفی کمتری بر سلامت انسان و محیط زیست داشته باشند [80]. عصاره‌های به‌دست‌آمده در فرمولاسیون یک مایع پاک‌کننده آرایش میسلار مدل استفاده شد. در هر فرمولاسیون در غلظت 1 درصد استفاده شد. نتایج پارامترهای رنگ لوازم آرایشی مدل در جدول 6 ارائه شده است.

مشاهده شد که افزودن 1 درصد عصاره آب از PRE، PGE، CTE و GGE به طور قابل توجهی بر رنگ پاک کننده آرایش تأثیر می گذارد. هر نمونه رنگی به وضوح با چشم غیرمسلح قابل مشاهده بود. عصاره PRE رنگ ماده آرایشی را به نارنجی تغییر داد و عصاره PGE، CTE و GGE آن را به زرد تغییر داد.

امکان استفاده از عصاره های آنالیز شده به عنوان رنگ های بالقوه با مقادیر نسبتاً بالای پاک کننده آرایش با عصاره/پایه پاک کننده آرایش تایید می شود که نشان دهنده تغییر قابل توجه رنگ در مدل آرایشی با افزودن عصاره در مقایسه است. به نمونه پایه (بدون افزودن عصاره). داده های ادبی [73] نشان می دهد که اگر مقادیر AE بالاتر از 5 باشد، رنگ توسط شب برهنه درک می شود و به عنوان یک اثر رنگ درک می شود. برای پاک کننده های آرایش حاوی عصاره های PRE، KTE و CTE، مقادیر AE به ترتیب 8.83، 9.17 و 8.14 به دست آمد. در مورد محصولات با عصاره PGE و GGE، هیچ تاثیر قابل توجهی در عصاره بر روی رنگ آماده سازی مشاهده نشد. مقادیر AE در محدوده 2 است.{12}}.82. این بدان معنی است که تفاوت رنگ فقط برای یک ناظر با تجربه قابل تشخیص است [80،81].

3. مواد و روشها

3.1. مواد گیاهی و روش استخراج

ماده گیاهی مورد استفاده در تحقیق، گلهای خشک P. rhoeas L.، P.granatum L.، C.ternatea L.، C.tinctorius L. و G.globosa L. بود که از فروشگاه گیاهی محلی تهیه شد. . فرآیند استخراج در حمام اولتراسونیک (Digital Mgtrasonic Cleaner، برلین، آلمان) انجام شد که با استفاده از روش توصیف شده توسط یانگ و همکاران انجام شد.[82]. برای تهیه عصاره آبی گیاهان مورد آزمایش از 10 گرم گل خشک و 100 گرم آب استفاده شد. این فرآیند به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انجام شد. سپس عصاره های به دست آمده جمع آوری و سه بار از طریق کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر شدند. پس از فیلتراسیون، عصاره ها تحت فشار کاهش یافته در دمای 40 درجه تبخیر شدند. از عصاره های خشک شده محلول استوک با غلظت 100 میلی گرم بر میلی لیتر تهیه شد و تا آنالیز بعدی در تاریکی 4 درجه نگهداری شد. از اختصارات زیر استفاده می شود: عصاره PRE—Papaver rhoeas، PGE—عصاره Punica granatum، GGE—عصاره Gomphrena globosa، CTE—عصاره Carthamus tinctorius، KTE—عصاره Clitoria ternatea.

3.2. تعیین ترکیبات زیست فعال با HPLC-UV-ESI-MS

عصاره های به دست آمده برای تعیین ترکیبات زیست فعال اصلی آنها با استفاده از HPLC (DionexUltiMate 300{{2{24}}}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) تجزیه و تحلیل شدند. با یک طیف سنج جرمی (4{34}}00 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Canada) مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) و یک جرم تله یون چهارقطبی سه گانه تحلیلگر. جداسازی کروماتوگرافی با یک سیستم فاز معکوس گرادیان به دست آمد. علاوه بر این، ستون کروماتوگرافی 100×4.6 میلی‌متر Kinetex 3.5 میکرومتر XB-C{10}} A با زنجیره‌های جانبی ایزو بوتیل و با فاز ثابت TMS با پوشش انتهایی استفاده شده با ستون محافظ ترکیب مشابه، از Phenomenex خریداری شد و در دمای 30 درجه نگهداری شد. . یک سیستم حلال دوتایی شامل 0.1 درصد (o/v) اسید فرمیک آبی به عنوان حلال A و متانول به عنوان حلال B در حالت گرادیان در طول 19.1 دقیقه از زمان اجرا استفاده شد. شرایط شستشو اعمال شده به شرح زیر بود: 0.{19}}.0 دقیقه 25-100 درصد B،15.0-17.0 دقیقه 100 درصد B،17.0-17.1 دقیقه. 100-25 درصد B,17.1-19.1 دقیقه 25 درصد B. نرخ جریان فاز متحرک 0.6 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 10 میکرولیتر بود. مایع شوینده توسط طیف‌سنج جرمی یونی الکترواسپری (ESI-MS) در حالت یون منفی کنترل شد و از m/z 20 تا 1000 Da اسکن شد. برای تجزیه و تحلیل کمی، آشکارساز MS چهار قطبی سه گانه در حالت اسکن نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) کار می کرد. شرایط بهینه آنالیز جرم و انتخاب یون های محصول برای ترکیبات فردی به صورت تجربی تعیین شد. برای این منظور، محلول‌های استاندارد ترکیبات مورد بررسی (1 نانوگرم در میلی‌لیتر) در ترکیب فاز متحرک با استفاده از پمپ تزریق که در تحویل نمونه ثابت کار می‌کند، معرفی شدند. پس از اطمینان از انتخاب یون پیش ساز صحیح، پتانسیل جداسازی (DP)، پتانسیل ورودی (EP)، پتانسیل خروج سلول برخورد (CXP) و انرژی برخورد (CE) برای هر انتقال MRM بهینه شد (جدول S1). دو انتقال MRM، یکی برای تعیین کمیت و دیگری برای تایید، بررسی شدند. پارامترهای MS به شرح زیر تنظیم شد: دمای مویرگی 600 درجه سانتی گراد، گاز پرده در 35 psi، گاز نبولایزر در 60 psi، و گاز خشک کردن در 50 psi. ولتاژ منبع حالت یونیزاسیون منفی -4500 V برای تعیین ترکیبات زیست فعال اعمال شد. نیتروژن به عنوان پرده و گاز برخورد استفاده شد. تجزیه و تحلیل داده ها با نرم افزار Analyst 1.5.1 پردازش شد. شناسایی ترکیبات انتخاب شده توسط جرم مولکولی و قطعه ورودی آنیون هر ترکیب انجام شد و با قطعه قطعه شدن MS2 تأیید شد. هویت نه ترکیب به همراه فرمول شیمیایی آنها، یون‌های مولکولی deprotonated و یون‌های قطعه مشخصه برای هر پیک جداگانه تعیین شد. شش ترکیب بر اساس منحنی کالیبراسیون تولید شده با استفاده از نواحی اوج شدیدترین انتقال‌های MRM استانداردهای تحلیلی تعیین شد. خطی بودن پاسخ آشکارساز برای ترکیبات کمی با تزریق استانداردهای کالیبراسیون در هشت سطح غلظت از 0.01 میکروگرم بر میلی‌لیتر تا 2 میکروگرم در میلی‌لیتر نشان داده شد. منحنی های کالیبراسیون خطی با ضرایب همبستگی (R) بیشتر از 0.99 بودند. در صورتی که نمونه ها در محدوده خطی آشکارساز CMS قرار نگرفتند، نمونه ها رقیق شدند.

استانداردهای تحلیلی اسید کینیک، اسید گالیک، اسید کافئیک، اسیدهای کافئوئیلکینیک (CQA، دو ایزومر:3- و 5-CQA)، و کوئرستین از سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا خریداری شد. ). تمام استانداردهای مورد استفاده از درجه تحلیلی (2 بیشتر یا مساوی 99 درصد خلوص) بودند.

محلول‌های استوک استاندارد با توزین دقیق و حل کردن 20 میلی‌گرم از هر استاندارد در 10 میلی‌لیتر متانول گرید LC-MS برای بدست آوردن غلظت 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد. رقت های سریالی 2.{{10}} ug/mL, 1.5 ug/mL,1.0 ug/mL, 0.5ug/mL,0 0.1 ug/mL، 0.05 ug/mL، 0.02 ug/mL، و 0.01 ug/mL با استفاده از محلول متانول درجه LC-MS ساخته شد. حد کمیت (LOQ) 0.01 ug/ml تعریف شد.

سنجش LC-MS/MS در سه تکرار انجام شد. داده های به دست آمده به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد.

3.3. تعیین خواص آنتی اکسیدانی

3.3.1.ABTS· به علاوه سنجش پاکسازی

ابتدا محلول ABTS با مخلوط کردن 19.5 میلی‌گرم ABTS و 3.3 میلی‌گرم پرسولفات پتاسیم با 7 میلی‌لیتر بافر فسفات (pH{5}}.4) تهیه شد و به مدت 16 ساعت در تاریکی حل شد. سپس محلول تا میزان جذب در حدود 1 رقیق شد.{9}}. جذب در طول موج 入{10}} نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس، 20 میلی‌لیتر عصاره KTE، PGE، PRE، CTE و GGE (10،100،250،500 میکروگرم بر میلی‌لیتر) با 980 میلی‌لیتر محلول رقیق شده ABTSe ​​پلاس مخلوط شد و سپس به مدت 10 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. در مرحله بعد، جذب نمونه‌های آماده‌شده با استفاده از اسپکتروفتومتر UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) در طول 入=734 نانومتر اندازه‌گیری شد. آب مقطر به عنوان بلانک استفاده شد. ABTS + scavenging از رابطه (1) محاسبه شد:

جایی که: به عنوان - جذب نمونه؛ Ac-جذب نمونه کنترل. اندازه گیری ها در سه تکرار برای هر نمونه استخراج شده انجام شد. این روش توسط Gawel-Beben و همکارانش توضیح داده شد. [83].

3.3.2. DPPH رادیکال رادیکال سنجش

توانایی عصاره ها در از بین بردن رادیکال های آزاد با استفاده از روشی که توسط برند-ویلیامز و همکارانش توضیح داده شده است، انجام شد. [84]. این مبتنی بر استفاده از رادیکال 1،1-دی فنیل-2-پیکریل هیدرازیل (DPPH) است. ابتدا 33 میکرولیتر از محلول‌های آبی عصاره‌ها در غلظت‌های 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر با 167 میکرولیتر محلول متانول DPPH (4 میلی‌مولار) مخلوط شد و به صفحه چاهی منتقل شد و سپس با تکان دادن مخلوط شد. سپس میزان جذب نمونه ها در طول موج 517 نانومتر اندازه گیری شد. اندازه‌گیری‌ها هر 5 دقیقه به‌مدت 30 دقیقه روی یک اسپکتروفتومتر UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) انجام شد. برای هر عصاره سه تکرار مستقل انجام شد. آب با محلول DPPH به عنوان شاهد استفاده شد. ظرفیت آنتی اکسیدانی به عنوان درصدی از مهار DPPH با استفاده از رابطه (2) بیان شد:

جایی که: به عنوان - جذب نمونه؛ Ac-جذب نمونه کنترل. اندازه گیری ها در سه تکرار برای هر نمونه استخراج شده انجام شد.

3.3.3. تشخیص سطوح درون سلولی گونه های اکسیژن فعال (ROS)

برای تعیین توانایی عصاره های تجزیه و تحلیل شده برای تولید تولید داخل سلولی گونه های اکسیژن فعال در سلول های HaCaT و BJ، از رنگ فلوروژنیک H، DCFDA استفاده شد. این ترکیب توانایی ورود به سلول ها از طریق انتشار غیرفعال را دارد، جایی که توسط استرازهای درون سلولی استیل می شود و به یک ترکیب غیر فلورسنت تبدیل می شود. اگر گونه های فعال اکسیژن در سلول وجود داشته باشد، این ترکیب به DCF بسیار فلورسنت تبدیل می شود. برای تعیین سطح داخل سلولی ROS در HaCaTs و BJ، سلول‌ها در 96-صفحه‌های چاهی کاشته شدند. سپس سلول ها در انکوباتور به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. محیط DMEM حذف شد و با 10 میکرومولار H2DCFDA (Sigma Aldrich، St.Louis، MO، USA) محلول در محیط DMEM بدون سرم جایگزین شد. سلول‌های HaCaT و BJ در H، DCFDA به مدت 45 دقیقه انکوبه شدند و سپس با عصاره‌ها در غلظت‌های ∶ 100، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر انکوبه شدند. سلول های تیمار شده با 1 میلی مولار پراکسید هیدروژن (H2O2) به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. نمونه های شاهد سلول هایی بودند که با عصاره های مورد آزمایش تیمار نشده بودند. فلورسانس DCF هر 90 دقیقه با استفاده از میکروپلیت خوان FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) در حداکثر تحریک 485 نانومتر و طیف انتشار 530 نانومتر اندازه‌گیری شد [85].

3.4. ارزیابی مهار متالوپپتیدازهای ماتریکس

3.4.1.تعیین فعالیت آنتی الاستاز

برای تعیین امکان مهار متالوپروتئیناز ماتریکس، نوتروفیل الاستاز (NE)، یک کیت فلورومتری (Abcam، ab118971) استفاده شد. آزمایش مطابق با دستورالعمل های پیوست شده به کیت و با روشی که توسط Niziol-Lukaszewska و همکارانش شرح داده شده است، انجام شد. [86]. آنالیزها در یک صفحه استاندارد 96-چاهی با کف صاف و شفاف انجام شد. برای تجزیه و تحلیل، از عصاره های گیاهی در غلظت های 100 و 250 میکروگرم بر میلی لیتر استفاده شد. در ابتدا، محلول‌های آنزیم NE، یک بستر NE و یک کنترل مهارکننده (SPCK) طبق دستورالعمل‌ها آماده شدند. محلول NE رقیق شده به همه چاهک ها اضافه شد و سپس نمونه های آزمایشی، کنترل بازدارنده و کنترل آنزیمی (Assay Buffer) به چاهک های بعدی اضافه شد. سپس نمونه ها مخلوط شده و در دمای 37 درجه به مدت 5 دقیقه انکوبه شدند. در این بین، مخلوط واکنش با مخلوط کردن بافر سنجش و بستر NE تهیه شد. مخلوط به هر چاه اضافه شد و کاملا مخلوط شد. فلورسانس بلافاصله در طول موج تحریک 入=400 نانومتر و تابش 入=505 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) اندازه گیری شد. توانایی مهار فعالیت NE آنالیز شده نمونه ها از رابطه (3) محاسبه شد:

نتیجه نهایی میانگین حسابی سه اندازه گیری مستقل بود.

3.4.2. تعیین فعالیت ضد کلاژناز

برای ارزیابی توانایی عصاره های به دست آمده در مهار فعالیت کلاژناز، از کیت فلورومتریک (Abcam, Cambridge, UK, ab211108) استفاده شد. آزمایش مطابق با دستورالعمل های پیوست شده به کیت و با روشی که توسط Niziol-Lukaszewska و همکارانش شرح داده شده است، انجام شد. [86]. آنالیزها در یک صفحه استاندارد 96-چاهی با کف صاف و شفاف انجام شد. برای تجزیه و تحلیل، از عصاره های گیاهی در غلظت های 100 و 250 میکروگرم بر میلی لیتر استفاده شد. ابتدا، کلاژناز (COL) در بافر آنالیز کلاژناز (CAB) حل شد. سپس نمونه های آنالیز شده به COL و CAB اضافه شدند. نمونه‌های کنترل بازدارنده با مخلوط کردن مهارکننده کلاژناز (1،{8}}فنانترولین (80 میلی‌مولار) با کلاژناز و بافر CAB تهیه شد. چاه‌های کنترل آنزیمی با مخلوط کردن COL رقیق شده با CAB تهیه شد. بافر CAB به عنوان کنترل پس‌زمینه استفاده شد. سپس نمونه ها به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند و با مخلوط کردن بستر کلاژناز با CAB مخلوط واکنشی تهیه شد و مخلوط واکنش تهیه شده به این ترتیب به تمام نمونه های آنالیز شده اضافه شد و کاملاً مخلوط شد و سپس فلورسانس در یک اندازه گیری شد. طول موج تحریک 490 نانومتر و گسیل 520 نانومتر اندازه‌گیری در حالت جنبشی به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انجام شد. توانایی مهار فعالیت COL عصاره‌های به‌دست‌آمده با رابطه (4) محاسبه شد:

3.5. تعیین خواص ضد التهابی

3.5.1. مهار دناتوره شدن پروتئین

فعالیت مهاری پروتئیناز عصاره های PRE، PGE، KTE، CTE و GGE طبق روش Sakat و همکاران [87] انجام شد که توسط Gunathilake و همکاران اصلاح شد.[88]. به طور خلاصه، محلول واکنش (2 میلی‌لیتر) شامل 1 میلی‌لیتر تریپسین 1 درصد در بافر 2{1{12}}}} میلی‌مولار Tris-HCl (pH7.4) و 1 میلی‌لیتر نمونه آزمایشی ({17}) بود. }.02 میلی لیتر عصاره 0.980 میلی لیتر آب). محلول انکوبه شد (37 درجه به مدت 5 دقیقه)، و سپس 1 میلی لیتر کازئین 0.8 درصد (w/v) اضافه شد و مخلوط به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. در پایان انکوباسیون، 2 میلی لیتر اسید پرکلریک 70 درصد برای تکمیل واکنش اضافه شد. مخلوط سانتریفیوژ شد و جذب مایع رویی در طول موج 210 نانومتر در برابر بافر به عنوان یک بلانک اندازه‌گیری شد. محلول بافر فسفات به عنوان شاهد استفاده شد. درصد مهار دناتوره شدن پروتئین با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

که در آن A1= جذب نمونه کنترل، و A2= جذب نمونه آزمایشی.

3.5.2. مهار فعالیت لیپوکسیژناز

توانایی عصاره‌های به‌دست‌آمده در مهار فعالیت لیپوکسیژناز با استفاده از روش توصیف‌شده توسط سروسواران و همکاران تعیین شد. 【89】. ابتدا 10 میکرولیتر از عصاره‌های گیاهی در غلظت‌های مختلف (100، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر) در یک صفحه چاهی با 160 میکرولیتر 100 میلی‌مولار PBS و 20 میکرولیتر محلول لیپوکسیژناز سویا (167 واحد) مخلوط شدند. میلی لیتر). نمونه ها در دمای 25 درجه به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند و پس از این مدت 10 میکرولیتر اسید لینولئیک سدیم برای شروع واکنش اضافه شد. سپس جذب نمونه ها در طول موج 234 نانومتر در مدت زمان 3 دقیقه در هر دقیقه با استفاده از دستگاه خوان FilterMax F5microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) اندازه گیری شد. دیکلوفناک به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. درصد مهار فعالیت لیپوکسیژناز از رابطه (6) محاسبه شد:

جایی که: همانطور که جذب نمونه آزمایش شده است، Ac جذب کنترل منفی است.

نتیجه نهایی میانگین حسابی سه اندازه گیری مستقل بود.

3.6. تجزیه و تحلیل سمیت سلولی

3.6.1. کشت سلولی

در این مطالعه، از دو رده سلولی پوست استفاده شد: کراتینوسیت‌های طبیعی انسانی (HaCaT) و فیبروبلاست‌ها (BJ). ماناساس، ویرجینیا، ایالات متحده آمریکا). سلول ها در محیط کشت دولبکو اصلاح شده ایگل (DMEM، صنایع بیولوژیکی، کرامول، CO، ایالات متحده آمریکا) با پیرووات سدیم، ال-گلوتامین و محتوای گلوکز بالا (4.5 گرم در لیتر) رشد کردند. این محیط همچنین با 10 درصد سرم جنین گاو (Gibco، Waltham، MA، USA) و 1 درصد با آنتی بیوتیک (100 U/mL پنی سیلین و 1000 ug/mL استرپتومایسین، Gibco) برای جلوگیری از آلودگی میکروبی غنی شد. سلول ها در انکوباتور در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب 95 درصد هوا و 5 درصد دی اکسید کربن رشد کردند.

3.6.2. سنجش آبی Alamar

پس از اینکه سلول‌های کشت‌شده (HaCaT و BJ) به تلاقی مطلوب رسیدند، محیط DMEM در فلاسک‌های کشت آسپیره شد. سلول های متصل به پایین دو بار با سالین استریل بافر فسفات شسته شدند. لایه سلولی با تریپسین جدا شد و سپس سلول ها در محیط DMEM تازه قرار گرفتند. سلول‌ها در 96-صفحه‌های کف مسطح چاهی (VWR، Radnor، PE، USA) قرار گرفتند و پس از اتصال به کف پلیت‌ها، سلول‌ها با عصاره‌ها (100، 250 و 500 ug/mL) تیمار شدند. سلول ها به مدت 24 ساعت انکوبه شدند.

تست سمیت سلولی با روش Alamar Blue (Sigma، R7017، Life Technologies، Bleiswijk، هلند) انجام شد. پس از انکوباسیون، محلول رسازورین با غلظت 60 میکرومولار به چاهک ها اضافه شد، سپس پلیت ها به مدت 2 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه قرار گرفتند. پس از این زمان، فلورسانس اندازه گیری شده است (入=570nm). هر غلظت عصاره در سه تکرار انجام شد.

3.6.3. سنجش جذب قرمز خنثی

سنجش جذب قرمز خنثی دومین آزمایشی است که برای تعیین سمیت سلولی PRE، PGE، KTE، CTE و GGE استفاده می شود. ابتدا،96-صفحات کف مسطح خوب همانطور که در بخش قبل توضیح داده شد آماده شدند. پس از 24 ساعت قرار گرفتن سلول ها در معرض عصاره ها، آنها آسپیره شدند و با رنگ قرمز خنثی (40 میکروگرم در میلی لیتر) جایگزین شدند و به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. پس از این مدت، سلول ها با سالین بافر فسفات شسته شدند. در مرحله بعد، بافر رنگ‌زدایی (150 میکرولیتر) به چاهک‌ها اضافه شد. سپس، جذب dve قرمز خنثی با اندازه گیری چگالی نوری (OD) در 540 نانومتر تعیین شد. هر غلظت عصاره در سه تکرار انجام شد.

3.7. تعیین فاکتور محافظت در برابر نور خورشید (In vitro)

فاکتور محافظت از آفتاب (SPF) با اندازه‌گیری جذب محلول آبی عصاره‌ها در غلظت‌های ug/mL 10 و ug/mL 50، در محدوده طول موج 290 تا 320 نانومتر در فواصل 5-nm تعیین شد. از نتایج به‌دست‌آمده، SPF از معادله منصور [90] محاسبه شد: که در آن∶ EE（λ）-طیف اثر اریتمال، I（入）-طیف شدت خورشیدی، ABS (入)-جذب محصول ضد آفتاب، CF- ضریب تصحیح (=10)، E(N)×I(λ) - مقادیر تعیین شده توسط Sayre استفاده شد [91].

3.8. از دست دادن آب اپی درمال (TEWL) و اندازه گیری هیدراتاسیون پوست

اندازه‌گیری‌های TEWL و هیدراتاسیون پوست با استفاده از پروب TEWAmeter TM 300 و پروب Corneometer CM 825 متصل به آداپتور MPA (Courage plus Khazaka Electronic، Köln، آلمان) انجام شد. پنج داوطلب در مطالعه شرکت کردند. روی ساعد خود. پوست، شش ناحیه (2×2 سانتی متر) مشخص شد، مقدار 0.2 میلی لیتر از عصاره های گیاهی مورد آزمایش در 5 محل استفاده شد، رتبه ششم، شاهد (بدون تیمار با هیچ نمونه) پس از 60 و 360 دقیقه سطح هیدراتاسیون و TEWL اندازه گیری شد و نتیجه نهایی میانگین حسابی (از هر داوطلب) پنج اندازه گیری مستقل (هیدراتاسیون پوست) و 20 اندازه گیری (TEWL) بود.

3.9. تهیه لوازم آرایشی مدل (پاک کننده آرایش) حاوی عصاره

یک مدل لوازم آرایشی (پاک کننده آرایش) تهیه شد. تمام اجزای مورد استفاده مطابق با الزامات EcoCert و COSMOS بودند. فرمول در جدول 7 نشان داده شده است.

این محصول با مخلوط کردن مواد (از ماده 1 تا ماده 6) در دمای اتاق تا زمانی که مایعی همگن به دست آید، تولید شد. در مرحله آخر pH فرمولاسیون تنظیم شد. پاک کننده آرایش به قسمت هایی تقسیم شد. مقدار 1 درصد از محلول های موجود عصاره به هر قسمت اضافه و کاملاً مخلوط شد.

3.10. تعیین پارامترهای رنگی عصاره ها و لوازم آرایشی (پاک کننده های آرایش) حاوی عصاره ها

نمونه‌های عصاره‌ها و لوازم آرایشی حاوی عصاره در دمای اتاق، 48 ساعت پس از تهیه آزمایش شدند. برای ارزیابی پارامترهای رنگ (مختصات CIELAB) از کروما متر CR-400 (Konica Minolta، Sensing Inc.، توکیو، ژاپن) استفاده شد. سیستم CIELAB توسط کمیسیون بین المللی روشنایی در سال 1978 تعریف شد. این سیستم بر اساس سه ویژگی رنگ است: L*, a*,b که L* یک متغیر روشنایی متناسب با مقدار در سیستم Munsell است و a* و b* مختصات رنگی هستند. مختصات a* و b* به ترتیب موقعیت روی محورهای قرمز/سبز و زرد/آبی را نشان می‌دهند (به علاوه یک=قرمز، -a=سبز؛ به علاوه b=زرد، - b =آبی).

بر اساس داده‌های به‌دست‌آمده: L*، a* و b*، پارامترهای رنگ زیر محاسبه شدند: chroma (C*) و hue (h). از معادلات زیر استفاده شد:

4. نتیجه گیری

بر اساس نتایج به‌دست‌آمده، می‌توان نتیجه گرفت که عصاره‌های گیاهی مورد آزمایش چندین ویژگی مثبت از خود نشان می‌دهند که به لطف آن می‌توان از آن‌ها در تولید لوازم آرایشی به عنوان ماده ایمن و زیست فعال استفاده کرد. نشان داده شده است که این گیاهان منبع غنی پلی فنول ها هستند که به آنها خاصیت آنتی اکسیدانی می دهد. PRE بهترین توانایی را در از بین بردن رادیکال های آزاد نشان داد، که احتمالاً به این دلیل است که در مقایسه با سایر گیاهان حاوی بیشترین پلی فنول است. PGE و PRE بهترین توانایی را برای کاهش تولید ROS در سلول ها نشان دادند. علاوه بر این، گیاهان هیچ گونه فعالیت سیتوتوکسیک نشان نمی دهند. تمام عصاره های آزمایش شده اثر مهاری بر روی آنزیم های الاستاز و کلاژناز نشان دادند که P. granatum و GGE بیشترین اثر بازدارندگی را داشتند. این ممکن است نشان دهد که این گیاهان می توانند در لوازم آرایشی به عنوان موادی استفاده شوند که روند پیری را کند می کنند. علاوه بر این، نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که این گیاهان دارای خواص ضدالتهابی هستند. در این مورد، CTE و KTE بهترین به نظر می رسید. KTE و PGE اثر محافظتی در برابر اشعه ماوراء بنفش حتی در غلظت های پایین نشان دادند. در غلظت‌های بالاتر، همه گیاهان اثر محافظتی در برابر اشعه ماوراء بنفش داشتند. علاوه بر این، گیاهان تأثیر مثبتی بر هیدراتاسیون پوست و کاهش از دست دادن آب از طریق پوست داشتند. عصاره های PRE، KTE و CTE ممکن است به عنوان رنگ های موثر در محصولات آرایشی استفاده شوند. مایع مدل برای پاک کردن آرایش حاوی عصاره های ذکر شده در بالا با رنگی تند و پایدار در طول زمان مشخص شد. رنگ لوازم آرایشی با عصاره PGE و GGE فقط توسط ناظران با تجربه قابل مشاهده است و بدون افزودن عصاره تفاوت قابل توجهی با نمونه آرایشی خالی ندارند. با توجه به تمام نتایج به‌دست‌آمده، می‌توان نتیجه گرفت که Papaver rhoeas، Clitoria ternatea و Carthamus tinctorius می‌توانند با موفقیت به‌عنوان منابع رنگ‌های زرد، نارنجی، آبی و بنفش در تولید لوازم آرایشی استفاده شوند که استفاده از آنها بی‌خطر خواهد بود. علاوه بر این، تأثیر مثبتی بر روی پوست خواهد داشت.

این مقاله از Molecules 2022, 27, 922 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules