سنتز سبز و خصوصیات نانوذرات آهن سنتز شده از عصاره آبی برگ Vitex Leucoxylon و کاربردهای زیست پزشکی آن

خلاصه:برای بدست آوردن عصاره آبی از روش استخراج سرد استفاده شدوایتکس لوکوکسیلونبرگ ها به نسبت 1:10. نانوذرات آهن (FeNPs) با استفاده از عصاره آبی برگ سنتز شدندV. leucoxylonبه عنوان یک عامل کاهش دهنده رویکرد گیاه پزشکی برای ساخت FeNP ها با مخلوط کردن 1 میلی لیتر عصاره گیاهی با 1 میلی مولار سولفات آهن مورد استفاده قرار گرفت. میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR)، طیف‌سنجی مرئی- فرابنفش (UV-Vis)، و طیف‌سنجی پرتو ایکس پراکنده انرژی برای بررسی FeNP‌های سنتز شده استفاده شد. واکنش کاهشی با تغییر رنگ محلول نشان داده شد و تشکیل رنگ سیاه تأیید کننده تشکیل FeNP ها است. بیشترین پیک جذب (حداکثر) در nm 395 در آنالیز طیفی UV-Vis یافت شد. طیف FTIR ازV. leucoxylonعصاره آبی برگ در برخی از قله ها یعنی 96/923 سانتی متر جابجایی نشان داد−1 و 1709.89 سانتی متر−1با گروه‌های عاملی کربوکسیلیک اسیدها، آلدئیدهای غیراشباع و کتون‌ها که فاقد طیف FTIR FeNP‌ها هستند و مسئول تشکیل FeNP هستند. FeNPs با قطر بین 45 تا 100 نانومتر در تصاویر SEM مشاهده شد. ایجاد FeNP ها توسط EDX تایید شد، که سیگنال قوی را در ناحیه آهن فلزی در 6-8 Kev نشان می دهد. XRD ماهیت کریستالی و قطر متوسط ​​136.43 نانومتر را نشان داد.آنتی اکسیدان,ضد التهاب، سیتوتوکسیک والتیام زخمآزمایشات آزمایشگاهی فعالیت قابل توجهی از FeNP ها را گزارش کردند. یافته‌های تجمعی مطالعه حاضر نشان می‌دهد که سنتز سبز FeNPsفعالیت بیولوژیکی آن را افزایش می دهدو ممکن است به عنوان خدمت کندیک عامل احتمالی ترمیم زخم پوستیوعامل سیتوتوکسیک علیه سرطان. مطالعه آینده در مورد شناسایی مکانیسم‌های دخیل در سنتز FeNPs توسطV. leucoxylonو کاربردهای زیست پزشکی آن

کلید واژه ها:وایتکس لوکوکسیلون; نانو ذرات آهن؛ SEM; التیام زخم؛ سیتوتوکسیک

مزایای CISTANCHE برایآنتی اکسیدان,ضد التهابسیتوتوکسیک والتیام زخم

1. معرفی

کاربرد نانوتکنولوژی در علم و فناوری برای تولید مواد جدید در سطح نانو زمینه‌ای است که به سرعت در حال رشد است [1]. نانوتکنولوژی با تولید مواد در سطح اتمی سر و کار دارد تا خواص متمایزی را به دست آورد که می تواند برای کاربردهای ترجیحی دستکاری شود. این زمینه با کاربردهای خود در علم و فناوری برای تولید مواد جدید در سطح نانو به سرعت در حال رشد است [2]. بخش‌های مختلف صنعتی در سال‌های اخیر نانوتکنولوژی را به دلیل کاربردهای آن در زمینه‌های سیستم‌های ذخیره‌سازی الکترونیکی [3]، بیوتکنولوژی [4]، جداسازی مغناطیسی و پیش تمرکز آنالیت‌های هدف، دارورسانی هدفمند [5] و وسایل نقلیه برای ژن و دارو پذیرفته‌اند. تحویل [3،5،6]. در نتیجه، این ذرات به دلیل طیف وسیعی از کاربردهایی که می‌توان از آن‌ها استفاده کرد، این پتانسیل را دارند که تأثیر قابل‌توجهی بر جامعه بگذارند. نانوذرات (NPs) توده‌هایی از ذرات هستند که اندازه آنها کمتر از صد نانومتر است و به عنوان جرم‌های ساختاری کلیدی در حوزه فناوری نانو در نظر گرفته می‌شوند. فعالیت بالاتر NP ها هم ویژگی تعیین کننده آنهاست و هم کیفیتی که برای آنها قابل توجه است [7]. نانوذرات آلی و معدنی دو طبقه بندی اولیه هستند که می توانند برای نانوذرات اعمال شوند. نانوذرات معدنی ممکن است شامل نانوذرات مغناطیسی، نانوذرات فلزات نجیب (مانند طلا و نقره) و نانوذرات نیمه هادی (مانند دی اکسید تیتانیوم و اکسید روی) باشند. نانوذرات آلی ممکن است شامل نانوذرات کربن باشند. نانوذرات معدنی توجه زیادی را به خود جلب می کنند زیرا خواص مواد برتر را همراه با تطبیق پذیری عملکردی ارائه می دهند. آنها به عنوان ابزارهای ممکن برای تصویربرداری پزشکی و همچنین برای درمان بیماری ها به دلیل ویژگی های اندازه ای که دارند مورد بررسی قرار گرفته اند [8]. خواص شیمیایی، فیزیکی و بیولوژیکی متنوع نانوذرات به شدت تحت تأثیر پارامترهای مختلفی از جمله اندازه و مورفولوژی نانوذرات و همچنین پوشش سطحی است که معمولاً در طول سنتز نانوذرات تعیین می‌شوند. از دست دادن فعالیت بیولوژیکی مورد نظر ناشی از کاهش پایداری کلوئیدی است. pH، قدرت یونی و تعداد زیادی پروتئین که تحت شرایط مربوطه با AgNP ها تعامل دارند، همگی بر پایداری کلوئیدی تأثیر دارند. در نتیجه، انتخاب تکنیک سنتز مناسب برای به دست آوردن خصوصیات ذرات مورد نظر برای کاربردهای خاص حیاتی است [9].

در حال حاضر، طیف گسترده ای از نانوذرات وجود دارد که می توانند با استفاده از انواع فرآیندهای فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و ترکیبی سنتز شوند. بر اساس یافته‌های تعداد زیادی از مطالعات تحقیقاتی، فرآیندهای فیزیکی و شیمیایی برای تولید نانوذرات شامل استفاده از حلال‌های آلی، ترکیبات خطرناک، مقادیر قابل‌توجهی انرژی و عوامل تثبیت‌کننده غیرقابل تجزیه زیستی است. بنابراین، در زمینه نانوتکنولوژی سبز، سنتز نانوذرات با استفاده از مواد طبیعی در دسترس مانند عصاره‌های گیاهی، میکروارگانیسم‌های مختلف، متابولیت‌های آن‌ها و چند ماده طبیعی هیومیک [11،12] به‌عنوان عوامل کاهنده و پوشاننده رو به افزایش است. روش‌های سنتز سازگار با محیط زیست برای تولید طیف گسترده‌ای از نانوذرات فلزی از جمله نقره، طلا، آهن، مس و روی استفاده شده است. توسعه روش های آسان و قابل قبول از نظر زیست محیطی برای سنتز نانوذرات یکی از محورهای اصلی فناوری نانو است. مواد زیستی مانند میکروارگانیسم ها و عصاره های گیاهی را می توان در فرآیند تهیه طیف گسترده ای از نانوذرات استفاده کرد [13،14]. با این حال، از آنجایی که برخی از ارگانیسم ها پاتوژن هستند، مقابله با آنها خطرناک است. برای رشد، میکروارگانیسم ها باید در محیط کشت نگهداری شوند و تحت شرایط کنترل شده دقیق، از جمله دما، pH و سایر پارامترها قرار گیرند. از آنجایی که فرآیند پرزحمت حفظ فرهنگ میکروبی را حذف می‌کند، سنتز NPs با استفاده از قطعات گیاه گاهی می‌تواند سودمندتر از سایر فرآیندهای بیولوژیکی باشد [15]. در نتیجه به دلیل ویژگی‌های ذاتی خود که شامل بهره‌برداری از منابع طبیعی، سرعت، سازگاری با محیط‌زیست و خوش‌خیم بودن است، توجه بسیاری را به خود جلب کرده است. این ویژگی های جذاب برای استفاده در کاربردهای پزشکی کاملا ضروری است. نانوذرات تولید شده توسط سنتز سبز دارای اندازه ای است که به خوبی تعریف شده و تحت کنترل است، آنها عاری از آلاینده هستند و روش ساده برای افزایش مقیاس است. اینها برخی از مزایای اضافی سنتز سبز هستند [16]. فعالیت بیولوژیکی نانوذرات سنتز شده تا حد زیادی توسط مواد سبز رنگ مورد استفاده برای پایداری و کاهش یون‌های فلزی تعیین و تنظیم می‌شود. یکی از ویژگی‌های ایده‌آل NPs باید این باشد که باید ظرفیت برجسته‌ای برای تمایز بین اهداف بالقوه (پاتوژن‌ها) و سلول‌های پستانداران (میزبان) داشته باشد [17].

به همین دلیل، عصاره آبی برگ های V. leucoxylon برای پتانسیل آن برای تسهیل تشکیل نانوذرات آهن (FeNPs) در تحقیق حاضر مورد بررسی قرار گرفت. آهن یکی از عناصری است که به فراوانی روی زمین یافت می شود. اخیراً به عنوان یک کلاس جدید از NP های مهم شناخته شده است زیرا دارای ویژگی های منحصر به فرد مختلفی از جمله اجباری بالا و ابرپارامغناطیس است. Cataly sis، دستگاه‌های الکترونیکی، ذخیره‌سازی اطلاعات، حسگرها، فناوری تحویل دارو، زیست‌پزشکی، دستگاه‌های ضبط مغناطیسی و پاکسازی محیط تنها برخی از بسیاری از کاربردهای جذابی هستند که از FeNPs استفاده کرده‌اند [18]. علاوه بر این، طبق تعدادی از مطالعات، FeNP ها ممکن است از عصاره های مختلف گیاهی ایجاد شوند. این عصاره های گیاهی شامل برگ اکالیپتوس گلوبولوس [19]، برگ انار [20] و خاکستر پوست موز [21] است. گیاه V. leucoxylon که در مطالعه حاضر مورد استفاده قرار گرفت، از خانواده Verbenaceae است. این درخت همچنین به عنوان درخت عفیف پنج برگ (کانادا: Sengeni، Holenekki، Hollalakki) شناخته می شود و می توان آن را در منطقه در کنار رودخانه ها در جنگل های همیشه سبز و نیمه همیشه سبز و جنگل های برگریز مرطوب در امتداد رودخانه ها یافت. ارتفاع آن تا 20 متر می رسد و جزو درختان خزان کننده متوسط ​​تا بزرگ طبقه بندی می شود. در طول جنگل های گات غربی هند، می توان آن را به تعداد زیاد یافت. گزارش شده است که تزریق عصاره برگ V. leucoxylon دارای طیف گسترده ای از فعالیت های دارویی مانند فعالیت های ضد التهابی، آنتی اکسیدانی، ضد روان پریشی، ضد افسردگی، ضد پارکینسونی و ضد چربی خون است [22]. محصولات طبیعی، در طول تاریخ و به ویژه در طب عامیانه، برای درمان طیف گسترده ای از بیماری ها و بیماری ها مورد استفاده قرار گرفته اند. قدمت این عمل به دوران باستان باز می گردد. روش‌های شیمی فرآورده‌های طبیعی که برای مدت طولانی وجود داشته‌اند، یافتن طیف گسترده‌ای از متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی را که از منابع زمینی و دریایی می‌آیند، ممکن ساخته است. تعداد قابل توجهی از این مواد طبیعی در حال حاضر برای استفاده به عنوان داروی بالقوه در نظر گرفته می شوند [23].

تعداد زیادی از مواد شیمیایی و مواد مغذی طبیعی وجود دارد که هنوز کشف نشده اند و برای بشریت مفید هستند. در نتیجه این امر، تقاضای فوری برای تحقیق و توسعه گزینه‌های درمانی نوآورانه وجود دارد که می‌توانند با موفقیت در مداخلات درمانی مورد استفاده قرار گیرند و در عین حال حداقل میزان اثرات نامطلوب را ایجاد کنند.

فرآیند سنتز سبز پیشنهادی در حال حاضر برای FeNPها متمایز و مقرون به صرفه است. در مطالعه حاضر، تلاشی برای ایجاد نانوذرات در دمای اتاق بدون استفاده از هیچ گونه مواد شیمیایی یا تکنیک فیزیکی انجام شد. گیاه لوکسیلون وایتکس در تلاشی برای سنتز نانوذرات آهن انتخاب شد و مدل‌های جامع سیستماتیک در شرایط آزمایشگاهی برای ارزیابی قدرت نانوذرات آهن انجام شد. تنها تعداد محدودی از مطالعات تحقیقاتی در مورد مفهوم نانوذرات و کاربردهای زیست پزشکی آنها بر روی این گیاه منتشر شده است. در نتیجه، ما تصمیم گرفتیم که انجام این تحقیق با در نظر گرفتن اهداف زیر مفید باشد: غربالگری برای فیتوکمیکال ها و اندازه گیری تعداد متابولیت های ثانویه در V. leucoxylon. سنتز سبز و خصوصیات FeNPs از V. leucoxylon. بررسی مقایسه ای اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی V. leucoxylon و FeNP های آن در شرایط آزمایشگاهی. فعالیت سیتوتوکسیک در شرایط آزمایشگاهی عصاره آبی برگ V. leucoxylon و FeNP های آن در برابر سرطان پوست، سرطان ریه و سرطان دهان. فعالیت ترمیم زخم در شرایط آزمایشگاهی عصاره آبی برگ V. leucoxylon و FeNP های مصنوعی آن با روش خراش - سایپرز، باشگاه دانش

2. مواد و روشها

2.1. مجموعه مواد گیاهی

در ماه مارس 2022، برگهای تازه V. leucoxylon از منطقه جنگلی Anshi در غرب گات در ناحیه اوتار کانادا در ایالت کارناتاکا در هند برداشت شد. برگ‌ها توسط دکتر کوترشا ک.، تاکسونومیست، گروه گیاه‌شناسی، کالج علوم کارناتاکا، درواد شناسایی و تأیید شدند. کارناتاکا، با مراجعه به نمونه کوپن سپرده شده در بخش گیاه شناسی، کالج علوم کارناتاکا، درواد، کارناتاکا. پس از جمع آوری، مواد برگ گیاه تازه در زیر آب جاری شسته شد، در آفتاب خشک شد و سپس با استفاده از آسیاب مکانیکی به پودر درشت تبدیل شد. این پودر در ظروف بسته بندی شده در دمای اتاق نگهداری می شد تا بتوان بعداً در فرآیند استخراج با حلال خام از آن استفاده کرد.

2.2. تهیه عصاره گیاهی

با استفاده از دستگاه سوکسله، 25 گرم برگ پودر شده به مدت 48 ساعت با 250 میلی لیتر آب مقطر استخراج شد. عصاره آبی با استفاده از روتو اواپراتور بیشتر تغلیظ شد و سپس در خشک کن خشک شد و سپس در بطری دربسته در دمای 4 درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد. برای سنتز FeNP ها، از عصاره آبی به عنوان یک عامل کاهش دهنده و تثبیت کننده استفاده شد.

2.3. حلال ها و معرف ها

تمام مواد شیمیایی و حلال های مورد استفاده از کیفیت تحلیلی برخوردار بودند و از Hi-media (هوبلی، هند) خریداری شدند.

2.4. تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی

پیروی از روشی که توسط Deepti و همکارانش توضیح داده شد. (2012)، عصاره آبی خام برگ V. leucoxylon از نظر کیفی برای حضور ترکیبات فیتوشیمیایی مختلف مانند فلاونوئیدها، آلکالوئیدها، فنل ها، گلیکوزیدها، استرول ها، لیگنین ها، ساپونین ها، آنتراکینون ها، قندهای احیا کننده مورد آزمایش قرار گرفت [2].

2.5. سنتز نانوذرات آهن

ابتدا 1 میلی لیتر عصاره آبی برگ V. leucoxylon به 1{2}} میلی لیتر محلول آبی 0.05 میلی مولار FeSO4 اضافه شد و مخلوط تکان داده شد. در دمای اتاق و در یک محیط تاریک، فرآیند مخلوط واکنش کامل انجام شد. واکنش اکسیداسیون/کاهش پس از انکوبه شدن مخلوط واکنش بی رنگ و واکنش برای مدت زمان لازم به وضوح قابل مشاهده بود [25]. به منظور حذف هر گونه اثری از عصاره آبی از FeNPهای تازه سنتز شده، که پس از سانتریفیوژ با سرعت 10، {7}} دور در دقیقه به مدت ده دقیقه در طول دوره واکنش مورد نظر در پودر خشک شوند، مخلوط آبی حاوی FeNPs سانتریفیوژ شد. بار دوم و دوباره در آب دوبار تقطیر پراکنده و خشک می شود [26].

2.6. خصوصیات FeNP ها

چندین روش مانند طیف‌سنجی مرئی فرابنفش (UV-Vis)، طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR)، میکروسکوپ الکترونی روبشی، و طیف‌سنجی پرتو ایکس پراکنده انرژی، پراش پرتو ایکس (XRD)، تجزیه‌کننده اندازه ذرات، و زتا پتانسیل، به منظور توصیف FeNPs مورد استفاده قرار گرفت.

2.6.1. تجزیه و تحلیل مبتنی بر طیف سنجی UV-مرئی

ابتدا مقدار 1 میلی لیتر محلول FeNPs کلوئیدی در کووت های کوارتز با استفاده از طیف سنجی مرئی UV (U-3310، هیتاچی، توکیو، ژاپن)، با استفاده از آب مقطر به عنوان مرجع و 0}.05 میلی مولار FeSO4 مورد ارزیابی قرار گرفت. به عنوان یک خالی، برای تأیید کاهش یون‌های آهن در محلول کلوئیدی [27].

2.6.2. تجزیه و تحلیل مبتنی بر FTIR

گروه‌های تابعی (گروه‌هایی) که بر روی سطح آهن متصل بودند و در سنتز FeNPs شرکت داشتند با استفاده از طیف‌سنجی FTIR (S700، Nicolet، MA، ایالات متحده آمریکا)، [28] شناسایی شدند. پس از 72 ساعت انکوباسیون، FeNP ها با سانتریفیوژ مکرر (3 تا 4 بار) از مخلوط های واکنش در 10، {6}} دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه جدا شدند. مایع رویی با آب دیونیزه شده جایگزین شد و گلوله به صورت پودر ذخیره شد. پس از خشک شدن، FeNPها با استفاده از فرآیند گلوله‌سازی برومید پتاسیم با نسبت 1:100 تحت آنالیز FTIR قرار گرفتند.

2.6.3. تجزیه و تحلیل مبتنی بر میکروسکوپ روبشی-الکترونی

میکروسکوپ الکترونی روبشی (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA) برای بررسی نانوذرات و تعیین شکل سطح آنها استفاده شد. بسترها بر روی یک بستر تمیز 5 میلی متر × 5 میلی متر Si جدا شده از یک ویفر با قطر 100 میلی متر آماده شدند. بستر به مدت 2 ساعت تا 6 ساعت اجازه داده شد تا واکنش نشان دهد و نمونه با سانتریفیوژ کردن محلول کلوئیدی با سرعت 10، {8}} دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه آماده شد. گلوله پس از بارها تریفیوژ مجدد، خشک شد، پس از آن مجدداً در آب دیونیزه پخش شد و این روش تکرار شد. در نهایت، گلوله خشک به دست آمد، که طبق روشی که توسط مؤسسه ملی استانداردها و فناوری، NIST [29] توصیف شده است، توسط تجزیه و تحلیل SEM مورد بررسی ساختاری قرار گرفت.

2.6.4. اشعه ایکس پراکنده انرژی

پس از خشک شدن بر روی یک شبکه مسی با پوشش کربن، FeNP های کاهش یافته با استفاده از EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA) تجزیه و تحلیل شدند که همچنین امکان تعیین ترکیب عنصری را فراهم کرد.

2.6.5. پتانسیل زتا

مشاهدات NP ها پتانسیل زتا ابزار مفیدی برای به دست آوردن بینش های اضافی در مورد پایداری نانوذرات کلوئیدی است. دامنه پتانسیل زتا اشاره ای به پایداری احتمالی کلوئید می دهد. به گفته ملندرز و همکاران. (2010)، اگر مقادیر پتانسیل زتا آنها مثبت تر از مثبت 30 میلی ولت یا منفی تر از 30 میلی ولت باشد، ذرات پایدار در نظر گرفته می شوند [30]. این واقعیت را باید در نظر گرفت. زتا متر لیزری به منظور بدست آوردن خوانش پتانسیل های زتا سطح استفاده شد (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, UK). نمونه های مایع نانوذرات، مجموعاً 5 میلی لیتر، با 50 میلی لیتر آب دوبار تقطیر رقیق شدند و 2 میلی متر بر متر مربع از کلرید سدیم به عنوان محلول الکترولیت معلق استفاده شد. پس از آن، pH اصلاح شد تا به حد مطلوب برسد. نمونه ها در مجموع به مدت 30 دقیقه هم زده شدند. پس از تکان دادن ظرف، pH در حالت تعادل مشخص شد و پتانسیل زتا ذرات فلزی تعیین شد. به منظور تعیین پتانسیل سطحی FeNPها از پتانسیل زتا استفاده شد. در هر نمونه، مقدار بیان شده میانگین نتایج سه اندازه گیری فردی بود. زمانی که مقادیر پتانسیل زتا از بالاتر از مثبت 30 میلی ولت تا کمتر از 30 میلی ولت متغیر بود، معیارهای پایداری نانوذرات تعیین شد [31].

2.6.6. آنالایزر اندازه ذرات

به منظور تعیین اندازه ذرات نمونه، آزمایش PSA بر روی آن پس از لیوفیلیزاسیون و سپس پراکندگی با استفاده از دستگاه اولتراسونیکاتور (SZ-100، Horiba، کیوتو، ژاپن) روی آن انجام شد.

2.6.7. تجزیه و تحلیل پراش اشعه ایکس (XRD).

نانوذرات آهن سنتز شده از عصاره آبی برگ V. leucoxylon تحت آنالیز XRD (Smart Lab SE، Rigaku، توکیو، ژاپن) قرار گرفتند تا ماهیت و همچنین اندازه متوسط ​​نانوذرات تعیین شود.

2.7. تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از روش های آزمایشگاهی

2.7.1. سنجش قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده یون آهن (FRAP)

با توجه به Oyaizu (1986)، با یک اصلاح جزئی، قدرت کاهش یون های آهن مورد ارزیابی قرار گرفت [32]. به مدت 3{15}} دقیقه در دمای 50 ◦C، 2.5 میلی‌لیتر بافر فسفات 20 میلی‌مولار و 2.5 میلی‌لیتر فریسیانید پتاسیم 1 درصد به 2.5 میلی‌لیتر عصاره برگ V. leucoxylon اضافه شد و با FeNP سنتز شد. ترکیب. پس از دوره جوجه کشی، مخلوط با 2.5 میلی لیتر اسید تری کلرواستیک 10 درصد وزنی بر وزن و 0.5 میلی لیتر کلرید آهن 0.1 درصد وزنی بر وزن، قبل از اینکه به مدت 10 دقیقه اضافی انکوبه شود، تکمیل شد. در نهایت، یک اسپکتروفتومتر UV-V برای تشخیص جذب در 700 نانومتر استفاده شد. به عنوان یک استاندارد، اسید اسکوربیک استفاده شد. هر نمونه سه بار مورد آزمایش قرار گرفت.

2.7.2. روش حذف پراکسید هیدروژن

بر اساس توانایی عصاره آبی برگ V. leucoxylon و FeNP های مصنوعی آن در حذف پراکسید هیدروژن، فعالیت آنتی اکسیدانی این ترکیبات مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا {0}}.6 میلی‌لیتر بافر فسفات (pH-7.4) حاوی 4 میلی‌مولار H2O2 به 0.5 میلی‌لیتر اسید اسکوربیک استاندارد با غلظت مشخص و همچنین لوله‌های حاوی عصاره‌های گیاهی در غلظت‌های مختلف اضافه شد. از 100 میکرولیتر تا 500 میکرولیتر (pH-7.4). با استفاده از یک بافر فسفات و محلول خالی بدون پراکسید هیدروژن، جذب محلول را در 230 نانومتر پس از 10 دقیقه ارزیابی کردیم. برای ایجاد کنترل به جای نمونه یا استاندارد از بافر فسفات استفاده شد [33]. هر نمونه سه بار مورد آزمایش قرار گرفت. برای محاسبه درصد بازداری از روش فرمول استفاده شد.

2.7.3. DPPH رادیکال آزاد پاکسازی

روش V. leucoxylon عصاره برگ و FeNP های سنتز شده برای توانایی آنها در از بین بردن رادیکال های آزاد با استفاده از رادیکال DPPH به عنوان یک معرف مورد آزمایش قرار گرفتند [34]. نمونه ها با محلول رادیکال DPPH (60 مولار) در اتانول (100 میکرولیتر) در غلظت های مختلف (w/v) ترکیب شدند. برای اندازه گیری جذب مخلوط در طول موج 517 نانومتر پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی در دمای اتاق از اسپکتروفتومتر UV-Vis استفاده شد. اسید اسکوربیک به عنوان استاندارد برای آزمایش استفاده شد. از معادله زیر برای تعیین فعالیت مهار DPPH هر نمونه استفاده شد:

که در آن Ac نشان دهنده جذب واکنش کنترل است که با مخلوط کردن 100 لیتر اتانول با 100 لیتر محلول DPPH انجام می شود و At نشان دهنده جذب نمونه آزمایش است. آزمایش ها در سه قلو انجام شد. مقدار IC50 برای هر نمونه محاسبه شد. سطح بالاتری از فعالیت رادیکال آزاد توسط مخلوط واکنش دارای جذب کمتر نشان داده شد.

2.7.4. سنجش فسفومولیبدن (PM).

فعالیت آنتی اکسیدانی کل با استفاده از روش استاندارد Prieto و همکاران، 1999 تعیین شد. هر لوله آزمایشی حاوی 3 میلی لیتر آب مقطر و 1 میلی لیتر محلول معرف مولیبدات، عصاره آبی برگ V. leucoxylon و FeNP های آن را در غلظت های مختلف از 100 میکرولیتر تا 500 میکرولیتر دریافت کرد. این لوله ها به مدت 90 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. جذب مخلوط واکنش در 695 نانومتر پس از تنظیم این لوله ها در دمای اتاق به مدت 20 تا 30 دقیقه پس از انکوباسیون اندازه گیری شد. استاندارد مرجع اسید اسکوربیک [35] بود.

2.8. ارزیابی فعالیت ضد التهابی In Vitro

اثر ضد التهابی عصاره آبی برگ V. leucoxylon و FeNP های تولید شده آن با استفاده از روش دناتوره سازی پروتئین که توسط Elias و همکاران، 1988 بیان شده بود، با تغییرات جزئی ارزیابی شد [36]. به عنوان یک داروی استاندارد، دیکلوفناک سدیم استفاده شد. مخلوط واکنش شامل 2 میلی لیتر از غلظت شناخته شده FeNP های تولید شده (100 گرم در میلی لیتر) با دیکلوفناک سدیم استاندارد (100 گرم در میلی لیتر) و 2.8 میلی لیتر سالین بافر با فسفات (PH 6.4) با 2 میلی لیتر تخم مرغ تازه مخلوط شد. آلبومین (1 میلی مولار) و در دمای 1 ± 27 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. دناتوره شدن با قرار دادن مخلوط واکنش در حمام آب در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه القا شد. پس از سرد شدن، جذب در طول موج 660 نانومتر با استفاده از آب دوبار مقطر به عنوان بلانک اندازه گیری شد. هر آزمون سه بار انجام شد. فرمول زیر برای محاسبه درصد مهار دناتوره شدن پروتئین استفاده شد:

جایی که، در=جذب نمونه آزمایشی؛ Ac=جذب کنترل.

2.9. تعیین فعالیت سیتوتوکسیک و ضد سرطانی نانوذرات آهن با استفاده از روش MTT

اثر V. leucoxylon و FeNP های سنتز شده آن بر زنده ماندن سلول های فیبروبلاست غیر سرطانی L292 و فعالیت ضد سرطانی آن بر روی سرطان پوست (A375)، سرطان ریه (A549) و سرطان دهان (KB-3-1) مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از روش استاندارد MTT، طبق کارمایکل و همکاران، (1987) [37]. تمام خطوط سلولی از مرکز ملی علوم سلولی (NCCS)، پونا، هند به دست آمد. مقادیر درصد مهار رشد سلولی (IC50) با استفاده از منحنی‌های دوز-پاسخ برای هر رده سلولی به دست آمد و از فرمول زیر برای محاسبه درصد مهار رشد استفاده شد. تبدیل MTT به یک محصول فورمازان بنفش توسط دهیدروژناز میتوکندری سلول های سالم اساس این آزمایش است [38].

2.10. مطالعه ترمیم زخم در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از تست خراش

قابلیت انتشار و مهاجرت سلول های رده سلولی L292 ناشی از نمونه هایی با غلظت های شناخته شده عصاره گیاهی و نانوذرات آهن در تحقیق حاضر مورد بررسی قرار گرفت [39]. صفحات کشت سلولی حیوانی با محیط DMEM همراه با 1{11}} درصد FBS و 2 درصد آنتی بیوتیک Pen-Strep (دارمشتات، آلمان) برای شروع فرآیند کشت سلولی استفاده شد. از نوک پیپت پلاستیکی استریل برای خراشیدن محل اتصال تک لایه سلول ها پس از رشد آنها به حدود 50،{6}} سلول در هر میلی لیتر استفاده شد. محلول PBS برای حذف هر گونه بقایای سلولی ناخواسته استفاده شد. به عنوان یک کنترل منفی، از سلول های تیمار نشده استفاده شد، در حالی که اسید آسکوربیک استاندارد به عنوان یک کنترل مثبت برای نمونه های پلیمری با غلظت شناخته شده استفاده شد. برای 24 ساعت بعد، سلول ها در دمای 37 درجه سانتیگراد با 5 درصد CO2 نگهداری شدند. برای بررسی مهاجرت نسبی سلول و بسته شدن زخم، لایه‌های سلولی خراشیده شده انکوبه شدند و در فواصل زمانی بین 0 تا 6 ساعت تا 12 ساعت و 24 ساعت تصویربرداری شدند. اندازه‌گیری نرم‌افزار MagVision (X64، 2016، Magnus، دهلی نو، هند) با وضوح 4× برای تعیین کمیت فاصله شکاف استفاده شد. برای تعیین میزان بسته شدن زخم و میزان مهاجرت از فرمول زیر استفاده شده است:

با توجه به موارد زیر: A{0}}h=ناحیه زخم بلافاصله پس از خاراندن اندازه‌گیری می‌شود. ATh=ناحیه زخم بعد از ساعت اندازه‌گیری شد. نرخ مهاجرت Rm=(μm/h); Wf=عرض زخم اولیه (µm); و T=زمان مهاجرت (ساعت).

2.11. تحلیل آماری

داده ها به صورت میانگین انحراف معیار و خطای استاندارد ارائه شده و هر آزمایش سه بار انجام شد. از نرم افزار SPSS نسخه 20 برای انجام تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) بر روی تفاوت میانگین نمرات موجود بین گروه ها استفاده شد.

بیشتر بخواهید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

فروشگاه:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop