بیان بیش از حد GRP78 باعث تحریک PINK1-میتوفاژی محافظت عصبی با واسطه IP3R قسمت 2 می شود

2.5. وسترن بلات

ما موش‌ها را با Dolethal (n=4) در 7 dpi بیهوش کردیم تا قطعات نخاع L4-L5 (طول 5- میلی‌متر) را برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات بدست آوریم. نمونه ها را در نیتروژن مایع منجمد می کنیم.

در سال های اخیر، نتایج تحقیقات بیشتر و بیشتری نشان داده است که رابطه نزدیکی بین بلات پروتئین و حافظه وجود دارد. پروتئین بلات یک تکنیک تحلیلی برای تشخیص بیان پروتئین است که به طور گسترده در تحقیقات علوم اعصاب استفاده شده است.

ارتباط بین نورون ها ارتباط نزدیکی با ذخیره سازی حافظه دارد. بلات پروتئینی می تواند وضعیت اتصال بین نورون ها و بیان پروتئین های پیش و پس از سیناپسی را تشخیص دهد و نقش مهم پروتئین ها را در شکل گیری و ذخیره سازی حافظه بیشتر آشکار کند.

مطالعات نشان داده اند که بیان پروتئین های عصبی پیش سیناپسی ارتباط نزدیکی با شکل گیری و ذخیره حافظه دارد. به عنوان مثال در طی فرآیند یادگیری و حافظه، نورون ها بیان پروتئین های پیش سیناپسی را تغییر می دهند و این تغییر به شکل گیری و ذخیره خاطرات جدید مربوط می شود. علاوه بر این، برخی از مطالعات همچنین نشان داده اند که تغییرات در بیان برخی از پروتئین ها با بیماری های عصبی مانند بیماری آلزایمر مرتبط است.

بنابراین، بلات پروتئین می‌تواند درک عمیقی از وضعیت اتصال بین نورون‌ها و تغییرات در بیان پروتئین‌های مرتبط فراهم کند و مکانیسم مولکولی نورون‌ها را آشکار کند. این برای مطالعه مکانیسم شکل گیری حافظه و بیماری های عصبی از اهمیت زیادی برخوردار است.

به طور خلاصه، رابطه بین بلات پروتئین و حافظه نقش پروتئین ها را در ارتباط بین نورون ها و ذخیره حافظه نشان می دهد. این ایده ها و دستورالعمل های جدیدی را برای مطالعه مکانیسم شکل گیری حافظه و بیماری های عصبی ارائه می دهد. بیایید به طور فعال تحقیقات علوم اعصاب را ترویج کنیم و به سلامت و طول عمر کمک کنیم! مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی حافظه را بهبود بخشد زیرا دارای اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد پیری است که می تواند به کاهش پاسخ های اکسیداتیو و التهابی در مغز کمک کند و در نتیجه از سلامت اعصاب محافظت کند. سیستم علاوه بر این، سیستانچ همچنین می‌تواند رشد و ترمیم سلول‌های عصبی را افزایش داده و در نتیجه اتصال و عملکرد شبکه‌های عصبی را افزایش دهد. این اثرات می تواند به بهبود حافظه، توانایی یادگیری و سرعت تفکر کمک کند و همچنین می تواند از بروز اختلالات شناختی و بیماری های عصبی جلوگیری کند.

روی روش های بهبود عملکرد مغز کلیک کنید

نمونه‌ها با همگن‌سازی در بافر لیز (20 میلی‌مولار HEPES، pH 7.7، 251 میلی‌مولار ساکارز، 1 میلی‌مولار EDTA، 1 میلی‌مولار EGTA، و یک کوکتل از پروتئاز (سیگما-آلدریچ) و مهارکننده‌های فسفاتاز (روش، بازل) ذخیره یا پردازش شدند. ) با هموژنایزر پاتر روی یخ.

پس از سانتریفیوژ لیزات ها در گرم 800 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، مایع رویی را به عنوان بخش پس از هسته جمع آوری کردیم و پروتئین ها را با BCAassay (Pierce Chemical Co.) تعیین کردیم.

برای وسترن بلات، ما 30 میکروگرم از بخش‌های L4-L5 پس از هسته‌ای را از هر حیوان روی ژل‌های SDS-پلی آکریل آمید 12 درصد بارگذاری کردیم تا جداسازی الکتروفورتیکی پروتئین‌ها و سپس انتقال به غشای PVDF در سیستم BioRadcuvette در 25 میلی‌مولار انجام شود. تریس، pH 8.4، 192 میلی مولار گلیسین، 20٪ (v/v) متانول.

ما غشاها را با 5% BSA در PBS به علاوه 0.1% Tween-20 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق مسدود کردیم و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد یک شبه با آنتی بادی اولیه: آنتی‌- -اکتین موش انکوبه کردیم. 1:10000؛ SigmaAldrich)، موس anti-GRP78 (1:500، Sigma-Aldrich)، ضد CV موش (1:1000، Invitrogen)، خرگوش ضد HSP60 (1:500، آنتی بادی آنلاین)، موس ضد NDUFA9 (1:1000، Invitrogen)، موش anti-OPA1 (1:1000، BD Biosciences)، ضد پارکین خرگوش (1:500، Abcam، کمبریج، انگلستان)، موش anti-PINK1 (1:500، Abcam)، خرگوش anti-NRF2 (1:500، Abcam)، anti-MNF2 (1:500، Abcam)، خرگوش anti-GRP75 (1:500، Abcam).

پس از چندین شستشو، غشاها به مدت 2 ساعت با یک آنتی بادی ثانویه مناسب کونژوگه با ترب کوهی پراکسیداز (1:5{5}}00، ناقل) انکوبه شدند. غشاء با استفاده از یک مخلوط نورتابی شیمیایی 1:1 (0.5 مولار لومینول، 79.2 میلی مولار اسید p-کوماریک، 1 مولار Tris-HCl، pH 8.5) و (8.8 مولار پراکسید هیدروژن، 1 مولار Tris-HCl؛ pH 8.5) و تصاویر با دستگاه ژنوم ژنوم گرفته شد و با نرم افزار Gene Snap و Gene Tools (Syngene) آنالیز شد.

2.6. مدل In Vitro

سلول‌های NSC34 در محیط اصلاح‌شده با گلوکز بالا (DMEM، Biochrom، Cambridge، UK) همراه با 1{5}}% سرم جنین گاو (Sigma-Aldrich)، 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی سیلین و محلول پنی سیلین/استرپتومایسین 0.5 X کشت داده شدند. (Sigma-Aldrich) و در انکوباتور رطوبت دار در دمای 37 درجه سانتیگراد تحت 5% CO2 نگهداری می شود، اساساً همانطور که قبلاً توضیح داده شد [26].

پس از 4 روز کشت سلولی بدون تغییر محیط، سلول های NSC34 دارای یک فنوتیپ متمایز مانند بودند که با حضور نوریت های طولانی مشخص می شد. در روز چهارم، داروها به سلول ها اضافه شدند. محلول های Tun (Sigma-Aldrich، میسوری، ایالات متحده آمریکا) و EFV (Bristol-Myers Squibb، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) در غلظت 10X تهیه و در DMEM حل شدند.

پس از 24 ساعت، با انکوبه کردن سلول‌ها با محلول MTT 4 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به مدت 3 ساعت، بقای سلول‌ها را از بین برد. بلورهای فرمازان آبی تشکیل شده در DMSO حل شدند و جذب در 570 نانومتر با دستگاه میکروپلیت خوان (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA) اندازه‌گیری شد.

2.7. نوکلئوفکشن

ما یک میلیون سلول را با پلاسمید 2 میکروگرم برای بیان GFP، GRP78، HAPARK، sh-eGFP موش، sh-PINK1 موش (ID 68943، Tebu-bio)، موش sh-Hspa5 (ID 14828، Tebu-bio) و /یا موس sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) با استفاده از Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Switzerland) و کیت Nucleofactor V (Lonza) به دنبال توصیه‌های سازنده.

برای تجزیه و تحلیل سیتومتری ایستا، سلول ها را در {{0}}صفحه خوبی که با کلاژن 10% پوشانده شده بود کاشتیم. پس از کشت، سلول ها را با 4% PFA تثبیت کردیم، دو بار با PBS شستشو دادیم و بافر مسدودکننده حاوی PBS 0.3% (v/v)Triton X-100 و 10% سرم جنین گاوی را ذخیره کردیم یا متعاقباً اضافه کردیم. پس از 3 روز کشت سلولی، داروهای محلول در DMEM اضافه شد.

برای این آزمایش‌ها، ما از 1 میکرومولار Tun (سیگما-آلدریچ)، 10 µMCCCP (سیگما-آلدریچ)، 5 میکرومولار CsA (سیگما-آلدریچ)، یا 10 میکرومولار BAPTA-AM (سیگما) استفاده کردیم. پس از 5 ساعت پس از درمان، سلول ها را برای ایمونوسیتوشیمی با 4٪ PFA تثبیت کردیم یا آنها را در بافر RIPA اصلاح شده (5{23}} mM Tris-HCl، pH 7.5،150 میلی مولار NaCl، 1 میلی مولار EGTA) همگن کردیم. 1٪ NP{18}}، 0.5٪ دئوکسی کولات سدیم، 0.1٪ SDS، کوکتل های پروتئاز و فسفاتاز) برای ایمونوبلات. ایمونوهیستوشیمی با شستشوی نمونه‌ها دو بار با PBS و انکوباسیون با بافر مسدودکننده حاوی PBSplus 0.3% (v/v) Triton X{25}} و 10% سرم جنین گاوی انجام شد.

ما با آنتی بادی های اولیه زیر جوجه کشی کردیم: خرگوش anti-IP3R (1:200، Abcam)، موش anti-HA (1:2000، Abcam)، موش anti-GRP78 (1:200، Sigma-Aldrich)، و خرگوش anti-HSP60 (1:500، آنتی بادی آنلاین). برای ارزیابی زنده ماندن توسط MTT همانطور که در بالا توضیح داده شد، درمان را به مدت 24 ساعت ترک کردیم.

2.8. اندازه گیری تولید سوپراکسید میتوکندری و ΔψM

سلول ها با 2.5 میکرومولار MitoSOX برای آنالیز سوپراکسید یا با 2.5 μMTMRM برای تجزیه و تحلیل ΔψM، هر دو از Probes Molecular و Invitrogen در طول 30 دقیقه آخر درمان انکوبه شدند. فلورسانس با میکروسکوپ IX81 Olympus شناسایی و با استفاده از نرم افزار سیتومتری استاتیک اندازه گیری شد.

2.9. اندازه گیری الکتروشیمیایی مصرف اکسیژن

سلول ها (1 × 106 در هر 1 میلی لیتر در HBSS) در یک محفظه گازدار در دمای 37 درجه سانتیگراد هم زده شدند. اندازه گیری ها با یک الکترود O2 نوع کلارک (Rank Brothers، کمبریج، انگلستان) گرفته شد و با داده های Dup.18 ثبت شد. دستگاه اکتساب (WPI) بلافاصله پس از 5-درمان با وسیله نقلیه یا Tun.

2.10. شکنش میتوکندری و سیتوزولی

سلول‌ها در بافر لیز (10 میلی‌مولار HEPES، pH 7.4، 1 میلی‌مولار EGTA، 250 میلی‌مولار ساکارز، و کوکتلی از پروتئازها (سیگما آلدریچ) و مهارکننده‌های فسفاتاز (روش)) با هموژنایزر پاتر روی یخ همگن شدند.

پس از سانتریفیوژ کردن لیزات در 2{3}}× گرم به مدت 5 دقیقه، مایع رویی در 10000× گرم به مدت 12 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی به عنوان کسر محلول (S2) در نظر گرفته شد و حاوی پروتئین های سیتوزولی و میکروزوم ها است.

پلت (P2) کسر میتوکندری غنی شده بود که در بافر اصلاح شده RIPA (5{9}} میلی مولار Tris-HCl، pH 7.5، 150 mM NaCl، 1 میلی مولار EGTA، 1% NP مجدداً معلق شد{8 }}، 0.5٪ سدیم دئوکسی کولات، 0.1٪ SDS، کوکتل پروتئاز و فسفاتاز) و غلظت پروتئین با استفاده از روش BCA تعیین شد. سپس نمونه ها برای وسترن بلات پردازش شدند.

2.11. میکروسکوپ الکترونی انتقالی

ما بخش‌های L{{0}}L5 (برش‌های 1- میلی‌متری) نخاع را در محلول ثابت‌کننده 2% (w/v) PFA و 2.5% (v/v) گلوتارآلدئید (درجه EM) غوطه‌ور کردیم. در 0.1 M PBS، pH 7.4 و آنها را به مدت 2 ساعت روی یک سکوی تکان دار قرار داد، سپس در 1% (w/v) PFA ثابت کرد و متعاقباً با 1% (w/v) تتروکسید اوسمیوم (TAAB Lab) ثابت شد. ) حاوی 0.08% (w/v) هگزاسیانوفرات پتاسیم (Sigma-Aldrich) در PBS به مدت 2 ساعت.

ما چهار شستشو با آب دیونیزه و آبگیری متوالی در استون انجام دادیم. تمام مراحل در دمای 4◦C انجام شد که قبلاً توضیح داده شد [33]. ما نمونه ها را در رزین EPON قرار دادیم و در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت پلیمریزه کردیم.

نمونه ها برای به دست آوردن مقاطع نیمه نازک (1 میکرومتر) با میکروتوم Leicaultracut UCT، رنگ آمیزی شده با محلول آبی تولویدین آبی 1٪ (w/v) پردازش شدند و با میکروسکوپ نوری برای شناسایی نواحی شاخ شکمی غنی شده با MNs مورد بررسی قرار گرفتند.

مقاطع بسیار نازک (70 نانومتر) با یک چاقوی الماسی برش داده شدند، روی شبکه های پوشش داده شده قرار گرفتند و با محلول های اورانیل استات معمولی و سیترات سرب رینولدز تضاد کردند.

در نهایت، ما مقاطع را با یک میکروسکوپ الکترونی عبوری (Jeol 1400) مجهز به دوربین GatanUltrascan ES1000CCD مشاهده کردیم. ما سه برش را در هر شرایط انتخاب کردیم، سه MN را در هر بخش تجزیه و تحلیل کردیم و با استفاده از ابزار ImageJ، مساحت هسته‌ها را در مقایسه با مساحت کل MN اندازه‌گیری کردیم.

2.12. بیوانفورماتیک و آمار

ما از تحلیل واریانس (ANOVA) برای مقایسه مقادیر در بین گروه‌های آزمایشی مختلف برای داده‌هایی که با فرض نرمال بودن مطابقت داشتند، استفاده کردیم. تفاوت‌های بین گروه‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه، و به دنبال آن آزمون چند دامنه‌ای تعقیبی توکی، یا با استفاده از آزمون t استودیو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. همه تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism5 انجام شد (n=3–5؛ p < 0.05 برای معنی دار بودن).

3. نتایج

3.1. متن

3.1.1. تجزیه و تحلیل پروتئومی بیان بیش از حد GRP78 میتوکندری را به عنوان هدف اصلی نشان داد

به منظور شناسایی مکانیسم های مولکولی منجر به محافظت عصبی با واسطه بیان بیش از حد GRP78، ما یک آنالیز پروتئومی بدون برچسب مقایسه ای انجام دادیم تا تفاوت های کمی و کیفی بین حیوانات آسیب دیده RA که با آدنوویروس ها برای بیان بیش از حد GRP78 (Ad-GRP78 to be neurotective) آلوده شده بودند را شناسایی کنیم. از MNs یا بتا-گالاکتوزیداز (Ad-ß-Gal) به عنوان شاهد [20].

هفت روز پس از آسیب (dpi) بر اساس مطالعات قبلی انجام شده در آزمایشگاه ما، نقطه زمانی انتخابی برای آنالیز بود [20،25]. در مقایسه قبلی بین مدل بازسازی پس از آکسوتومی دیستال و بخیه عصب سیاتیک در مقابل مدل RA دژنراتیو ما، مشاهده کردیم که رویدادهای سیگنالینگ تا 7 dpi مشابه بودند، زمانی که رویدادهای دژنراتیو واگرا پس از RA ظاهر شدند [20،25].

تجزیه و تحلیل بدون برچسب LC-MS/MS بخش‌های پس از هسته‌ای از بخش‌های نخاع L{3}L5 منجر به شناسایی 1420 پروتئین، با حداقل دو پپتید در هر پروتئین همانطور که قبلاً برای نمونه‌ها و مطالعات دیگر گزارش شده بود، شد [25] .

در مجموع 566 و 732 پروتئین یا پپتید به ترتیب به دلیل بیان بیش از حد Ad-GRP78 یا Ad-ß-Gal در حیوانات آسیب دیده RA نسبت به حیوانات آسیب دیده RA که به ویروس آلوده نشده بودند، به طور قابل توجهی تغییر کردند (p < 0 0.05) (جدول S1 و S2).

ما هر دو لیست را مقایسه کردیم و متوجه شدیم که 220 به دلیل بیان بیش از حد Ad-GRP78 به طور منحصر به فردی تغییر یافته اند (جدول S3). حاشیه نویسی عملکردی این پروتئین ها با استفاده از ابزار پایگاه داده برای حاشیه نویسی، تجسم و کشف یکپارچه (DAVID) به ما امکان شناسایی را می دهد. مهم ترین عملکردهای بیولوژیکی در مجموعه داده ها (FDR <0.05) [34،35].

بیان بیش از حد GRP78 منجر به تفاوت در سطوح پروتئین های درگیر در فرآیندهای میتوکندری، عملکرد و اجزای آن شد (جدول S4A-C، شکل S1A-C). اصطلاحات هستی شناسی ژن (GO) و تجزیه و تحلیل مسیر غنی سازی KEGG این داده ها نشان داد که در حیوانات آلوده به Ad-GRP78 کاهش قابل توجهی در سطوح بسیاری از پروتئین ها با عملکرد میتوکندری وجود دارد، از جمله پروتئین های صورت بیرونی و داخلی میتوکندری، پروتئین های مجتمع تنفسی، و پروتئین های ماتریکس

ما تفاوت در سطوح پروتئین آشکار شده در لیست پروتئومی را تأیید کردیم، مانند GRP75، که تنظیم مثبت شد (p < 0.05) و زیرواحد مجتمع V (CV )، کاهش یافت (p=0.03) در گروه های GRP78 همانطور که انتظار می رود (شکل 1A).

در کل فهرست، 2-اگزگلوتارات/پروتئین ناقل مالاتارات OGC (SCL25A11)، MT-ND3 (یک سرکوب کننده تومور که در شاتل تمالات-آسپارتات شرکت می کند و حوضچه NADH را در مجموعه ماتریکس میتوکندری تولولو بازسازی می کند، بسیار کاهش یافته است) بودند. عملکرد I)، زیرواحد NADH دهیدروژناز 3 از کمپلکس I، گامامینو بوتیریک اسید آمینوترانسفراز ABAT، و زیرواحد یوبی کوینول-سیتوکروم C ردوکتاز کمپلکس III. در مقابل، تعداد کمی از پروتئین‌ها تنظیم مثبت شدند (شکل 1B).

همانطور که انتظار می‌رفت، پروتئین یک تنظیم‌شده GRP78 بود، و پروتئین‌های دیگر تنظیم‌شده ناقل اسید آمینه EAAT2، که عمدتاً در غشای پلاسمایی و گاهی در میتوکندری در سیناپس‌های تحریکی قرار دارد، و هیدروکسی‌اسیل-CoA دهیدروژناز HADHA، که سه مرحله آخر بتا میتوکودر را کاتالیز می‌کند. اکسیداسیون اسیدهای چرب با زنجیره بلند

ما تجزیه و تحلیل را گسترش دادیم تا بررسی کنیم که آیا پروتئین‌های دیگر در پروتئین‌های مرتبط با عملکرد میتوکندری اورمیتوکندری از فهرست پروتئومی اصلاح شده‌اند تا تأثیر عملکردی میتوکندری را تأیید کنیم (شکل 1C).

ما مشاهده کردیم که آتروفی نوری GTPase 1 مربوط به دینامین حفظ شده توسط میتوکندری (OPA1)، که در همجوشی [36] دخالت دارد، تنظیم شده بود (p <{4}}.1). LONP1، یک پروتئاز وابسته به ATP که تخریب انتخابی پلی پپتیدهای نادرست تا شده را واسطه می کند، تمایل به افزایش نشان داد، اما هیچ تفاوتی در سطوح یوبی کینون NDUFA9، فاکتور رونویسی NRF2، که ژن های حاوی عناصر پاسخ آنتی اکسیدانی یا دینامین های دیگر را تنظیم می کند، مشاهده نشد. GTPase مرتبط با انفوزیون، مانند میتوفوسین 2 (MFN2) [36].

خلاصه ای جامع از تغییرات یافت شده در میتوکندری در این طرح در شکل 1D نشان داده شده است. دینامیک میتوکندری برای پاسخ های استرس به عنوان فیوز میتوکندری آسیب دیده برای تبادل مواد مهم است، و شکافت میتوکندری اجازه جداسازی میتوکندری آسیب دیده و میتوفاژی بعدی را می دهد [37].

با توجه به اینکه تعداد عمده پروتئین‌های تنظیم‌شده در میتوکندری قرار دارند و هیچ تغییر آشکاری در مورد فعالیت همجوشی میتوکندری با تجزیه و تحلیل MFN2 و نسبت اشکال L/S OPA1 مشاهده نشد (شکل 1C)، نشانگرهای مربوط به میتوفاژی را بررسی کردیم.

به طور کلاسیک، تخریب میتوکندری وابسته به اتوفاژی به دنبال دپلاریزاسیون اتفاق می‌افتد و معمولاً با افزایش انباشتگی فسفاتاز و کیناز 1 (PINK1) ناشی از فسفاتاز و تنسینهومولوژی (PTEN) در طول کامل در غشای خارجی میتوکندری ایجاد می‌شود.

متعاقباً، پارکین بین حلقه ای E3 یوبیکوئیتین-پروتئین لیگاز برای علامت گذاری پروتئین غشای خارجی میتوکندری از یوبیکوئیتیلاسیون میتوکندری دپلاریزه شده [38-41] به کار گرفته می شود. بالای شکل 2A هیچ تغییری در سطوح پارکین نشان نمی‌دهد، اما کاهش قابل‌توجهی از PINK1 تمام قد ناشی از آسیب RA در قسمت L{10}}L5 نخاعی همان طرف نسبت به کنترل در 7 dpi را نشان می‌دهد. در مقابل، بیان بیش از حد GRP78 باعث کاهش پارکین شد اما سطح PINK1 را پس از RA در مقایسه با بیان کنترلی پروتئین غیر مرتبط -Gal دو برابر کرد (شکل 2A، پایین).

تنظیم مثبت PINK1 تمام طول با القای میتوفاژی [42] مطابقت دارد و کاهش پارکین ممکن است مربوط به وضعیت پیشرفته از بین رفتن اندامک ها باشد که توسط بقیه پروتئین های میتوکندری مشاهده شده است.

ما بیشتر محل یابی میتوکندری ها و پروتئین های مرتبط با ریز لوله های 1A/1B با زنجیره سبک 3 (LC3) را مورد بررسی قرار می دهیم که یک جزء کلیدی از ماشین آلات ماکرواتوفاژی اصلی و برای فرآیند میتوفاژی ضروری است [43].

با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال، ما افزایش قابل توجهی در هم‌محلی‌سازی میتوکندری‌ها مشاهده کردیم که با استفاده از ضد COX IV، با LC{2}}پنکتای مثبت پس از RA فقط در MN‌های آسیب‌دیده که GRP78 را در 7 dpi بیان می‌کنند، نشان‌گذاری شده‌اند (شکل 2B).

ما وجود میتوفاژی را در MN های حذف شده تنها در هنگام بیان بیش از حد GRP78 با تجزیه و تحلیل نمونه با استفاده از میکروسکوپ الکترونیکی انتقال تایید کردیم.

ما واکوئل‌های فراوانی را با میتوکندری‌های غرق‌شده، مشخصه میتوفاژی [37]، شبیه میتوفاگوزوم‌ها، و چندین ERcisternae در ارتباط نزدیک با میتوکندری‌ها در MNs حیوانات Ad-GRP78 مشاهده کردیم، اما آنها را در Ad{3}Gal RA-inju شناسایی نکردیم. نمونه های موش در dpi 5 (شکل 2C).

شکل 1. بیان بیش از حد GRP78 در حیوانات آسیب دیده RA پروتئین های میتوکندری را هدف قرار می دهد. (الف) Immunoblot و نمودار میله‌ای که میانگین تغییرات چین‌خوردگی (± SEM) سطوح پروتئین GRP78، GRP75 و CV را در بخش‌های L{5}L5 نخاع درGRP78 در مقابل نشان می‌دهد.

-Gal بیان بیش از حد موش های RA آسیب دیده با 7 نقطه در اینچ. سطوح به مقادیر اکتین نرمال شدند (n=4؛ * p < 0.05 در مقابل Ad- -Gal، آزمون t Student). (ب) هیستوگرام تغییرات چین پروتئین میتوکندری که با تجزیه و تحلیل پروتئومی بخش‌های L{8}}L5 نخاع در حیوانات آسیب‌دیده از RA که GRP78 را بیش از حد بیان می‌کنند در مقایسه با گروه Ad{12}}Gal با 7 dpi بدست آمد. (C) Immunoblot و نمودار میله‌ای که میانگین تغییرات چین‌خوردگی (± SEM) NDUFA9، LONP1، NRF2، MFN2، OPA را به اکتین عادی نشان می‌دهد. (تفاوت معنی داری بین گروه ها وجود نداشت. آزمون تی دانشجویی). (د) میتوکندری های شماتیک با پروتئین های تغییر یافته با بیان بیش از حد GRP78 در بخش های نخاع L{21}L5 از حیوانات آسیب دیده در RA که با رنگ زرد (کاهش) یا آبی (افزایش یافته) در 7dpi مشخص شده است.

شکل 2. میتوفاژی پس از RA در موش هایی که GRP78 را بیش از حد بیان می کنند، در داخل بدن مدوله می شود. (الف) بلات‌های ایمنی و نمودارهای میله‌ای مربوطه برای تجزیه و تحلیل تغییر برابری PINK1 و PARK در سطوح پروتئین (میانگین ± SEM) نرمال‌شده به سطوح اکتین، در بخش‌های نخاع L4-L5 در موش‌های آسیب‌دیده RA در مقابل.

کنترل (بالا) یا از گروه های Ad{{0}}Gal و Ad-GRP78 (پایین) با 7 نقطه در اینچ. (n=4؛ * p < 0.05، آزمون t دانشجویی). (B) سمت چپ، میکروعکس‌هایی از MNهای نماینده در محل همان طرف از حیوانات آسیب دیده RA که تزریق داخل نخاعی گروه‌های AAVrh10-GFP یا AAVrh10-GRP78 در 7 dpi دریافت کردند. نمونه ها برای COX IV (قرمز) و LC3 (سبز) رنگ آمیزی شدند و با فلورسنت Nissl (آبی) رنگ آمیزی شدند.

نوار مقیاس=10 میکرومتر و بزرگ‌نمایی دیجیتال در ورودی‌ها 10X.

توجه داشته باشید که هم‌محلی‌سازی فقط در گروه AAVrh10-GRP78 مشاهده می‌شود. سمت راست، نمودار میله ای که تجزیه و تحلیل درصد نقاط محلی سازی COX IV و LC3 را نشان می دهد. میانگین ± SEM محل یابی COX IV و LC3 (n=4؛ ** p < 0.01، آزمون t-Student). (C) تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نماینده که در آن میتوکندری ها در MNs نخاع متمایز می شوند: الف، تصویر سیتوپلاسم MN که حیوان کنترل میتوکندری را نشان می دهد. ب، تصویر سیتوپلاسم MN از موش صحرایی آسیب دیده از گروه Ad{12}}. ج، تصویر سیتوپلاسم MN از موش صحرایی آسیب دیده با RA از گروه Ad-GRP78 با تعدادی میتوکندری غرق شده با ستاره های قرمز. d، تصویر با بزرگنمایی بالاتر در (C) نشان داده شده است که یک تماس بزرگ میتوکندری و ER را نشان می دهد. میله های مقیاس در شکل ها نشان داده شده است.

در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که بیان بیش از حد GRP78 ممکن است MNهای قطع شده با میتوفاژین را پس از RA القا کند و می‌تواند باعث تقویت محافظت عصبی شود.

3.1.2. بیان بیش از حد GRP78 عملکرد آسیب دیده میتوکندری را بازیابی می کند

سپس اثر بیان بیش از حد GRP78 را بر روی میتوکندری در مدل آزمایشگاهی استرس ER بررسی کردیم زیرا این توهین در اوایل پس از آسیب RA در داخل بدن که قبلاً گزارش شده بود ظاهر می شود [20،26]، و این یک روش قابل اعتماد برای غربالگری عوامل محافظت کننده عصبی جدید است [2،44]. ].

این مدل از تونیکامایسین (Tun) استفاده می‌کند که یک القاکننده استرس ER است که باعث تشکیل واسطه‌های N-acetylglucosamine-lipid می‌شود، در نتیجه از گلیکوزیلاسیون پروتئین‌های تازه سنتز شده جلوگیری می‌کند و منجر به تا شدن اشتباه پروتئین‌ها می‌شود. ما از آن استفاده کردیم زیرا یک مسیر ترشحی متوقف شده نیز گزارش شده است که در فرآیند نورودژنراتیو پس از RA [26] کلیدی است.

ما ابتدا تأیید کردیم که نوکلئوفکشن سلول‌های شبه نورون حرکتی NSC34 با یک ناقل مناسب منجر به تولید GRP78 می‌شود (شکل 3A). در این سلول ها، بیان GRP78 به طور قابل توجهی باعث افزایش بقا در محیط حاوی Tun شد (شکل 3B).

اگرچه درمان Tun به طور معمول خود GRP78 را القا می کند، این بیان درون زا بسیار دیر است (تا 24 ساعت) (شکل S2). ما همچنین نمی‌دانیم که آیا می‌توانیم تعیین کنیم که آیا بیان بیش از حد GRP78 دارای اثرات محافظتی عصبی در مدل دیگری در شرایط آزمایشگاهی است که قبلاً گزارش داده بودیم که چندین ویژگی مرگ MN پس از آسیب RA را تولید می‌کند [26].

این مدل بر اساس آسیب اسکلت سلولی ناشی از نوکودازول است که با پلیمریزاسیون میکروتوبول ها تداخل دارد. بیان GRP78 قابلیت زنده ماندن سلول های کشت شده را در حضور نوکودازول نیز افزایش داد (شکل 3B).

سپس، عملکرد میتوکندری را با اندازه‌گیری تولید گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) در میتوکندری با استفاده از MitoSOX، پتانسیل غشای میتوکندری (∆ψm) با استفاده از متیل‌استر متیل متیل رودامین (TMRM) و میزان مصرف O2 در سلول‌های NSC34 ما در معرض استرس ER ارزیابی کردیم. با یا بدون بیان بیش از حد GRP78.

به عنوان کنترل مثبت، ما از efavirenz (EFV)، یک عامل میتوتوکسیک که هر سه پارامتر را تغییر می دهد استفاده کردیم [45]. ما مشاهده کردیم که سطوح MitoSOX به تدریج پس از افزودن Tun افزایش یافت و تا 24 ساعت به اهمیت آماری رسید و تولید ROS به طور قابل توجهی در سلول های تیمار شده با EFV از ساعت اول پس از درمان با توجه به کنترل های تحت درمان با وسیله نقلیه افزایش یافت (شکل S3A).

بیان بیش از حد GRP78 منجر به سطوح پایین‌تر میتوکندری ROSin با توجه به سلول‌های بیانگر GFP در 24 ساعت پس از درمان Tun یا EFV شد (شکل 3C). Δψm پس از 5 و 24 ساعت درمان Tun و پس از 24 ساعت درمان EFV فرو ریخت (شکل S3B). بازیابی این پارامتر با بیان بیش از حد GRP78 در سلول های تیمار شده با Tun یا EFV به دست آمد (شکل 3D).

میزان مصرف O2 در طی 80 دقیقه تجزیه و تحلیل پس از افزودن Tun در سلول‌هایی که GFP را بیان می‌کنند کاهش یافت (شیب -0.063.0.2=0. R{4}})، اما مصرف O2 با وجود وجود Tun در سلول‌های GRP78- که بیش از حد بیان می‌کنند (شیب 0.221-، R{10}}.99) پایدار است (شکل 3E، سمت چپ).

پس از 5 ساعت، تنفس در سلول‌های دارای بیان بیش از حد GRP طبیعی بود و به شدت در سلول‌های بیان‌کننده GFP به خطر افتاد (شکل 3E، سمت راست). در مجموع، این نتایج نشان می دهد که GRP78 عملکرد نارسایی میتوکندری ناشی از استرس ER یا سمیت میتوتوکسیک را کاهش می دهد.

For more information:1950477648nn@gmail.com