طیف سنجی جرمی پشت سر هم با وضوح بالا الگوی گانگلیوزید خاصی را در بیماری کلیوی دیابتی اولیه بیماران دیابت نوع 2 شناسایی می کند.

خلاصه:

با توجه به اطلاعات ارزشمند ارائه شده توسط گلیکوسفنگولیپیدها به عنواننشانگرهای مولکولیو داده های محدود موجود برای تشخیص و شناسایی آنها در بیماران مبتلا بهبیماری کلیوی دیابتی نوع 2(DKD)، ما یک روش برتر مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (HR) و MS پشت سر هم (MS/MS) برای تعیین گانگلیوزیدها در ادرار ایجاد و اجرا کردیم.بیماران DKD. این مطالعه بر روی موارد زیر متمرکز بود: (i) آزمایش امکان سنجی منابع انسانی MS و MS/MS و عملکرد در نقشه برداری وتعیین توالی گانگلیوزیدهای کلیوی در دیابت نوع 2بیماران؛ (2) تعیین تغییرات درگانگلیوزید ادرار DKDبیماران درمراحل مختلف بیمارینورمو، میکرو و ماکروآلبومینوری در یک سنجش مقایسه ای با کنترل سالم. با توجه به وضوح بالا و دقت جرم، غربالگری MS مقایسه ای نشان داد که وضعیت سیالیلاسیون اجزای گانگلیوزید. اصلاح آنها توسط O-استیل، CH3COO-، O-fucosyl، و O-GalNAc. و همچنین ترکیب سرامید نشانگرهای احتمالی برای تشخیص زودهنگام DKD، ارزیابی پیشرفت بیماری و درمان بعدی است. علاوه بر این، بررسی ساختاری توسط MS/MS نشان داد که GQ1d(d18:1/18:0)، GT1 (d18:1/18:0) و GT1b(d18:1/18:{{{ 23}}) ایزومرها با ماکروآلبومینوری مرتبط هستند که در رابطه با نقش آنها در DKD مستلزم بررسی بیشتر است.

کلمات کلیدی: نانوالکترواسپری; طیف سنجی جرمی پشت سر هم با وضوح بالا؛ غربالگری؛ تجزیه و تحلیل تکه تکه شدن؛ بیماری کلیه دیابتی؛ نشانگرهای زیستی گانگلیوزید

1. معرفی

دیابت نوع 2 (DM) با وجود پیشرفت های علمی در این زمینه، همچنان یک چالش درمانی با شیوع دائمی در حال افزایش جهانی است. دیابت نوع 2 که با آسیب درازمدت مخرب ماکرو عروقی و میکروواسکولار همراه است، منجر به افزایش مرگ و میر می شود. بیماری کلیوی دیابتی (DKD) شایع ترین علت بیماری کلیوی مرحله نهایی (ESRD) در کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه است [1،2]. بنابراین، تشخیص زودهنگام DKD و مدیریت بهینه دیابت نوع 2 به منظور کاهش عوارض، عوارض و مرگ و میر بسیار مهم است. در حال حاضر، تشخیص و پیشرفت DKD به اندازه‌گیری آلبومینوری و کاهش مداوم نرخ فیلتراسیون گلومرولی (eGFR) وابسته است، که هر دو پارامتر پیش‌بینی متوسطی از وضعیت کلیوی آینده را نشان می‌دهند. تاریخچه طبیعی DKD شامل چندین مرحله بالینی است، از جمله موارد زیر: هیپرفیلتراسیون اولیه گلومرولی، وقوع میکروآلبومینوری یا ماکروآلبومینوری، کاهش میزان فیلتراسیون گلومرولی و ESRD. با این حال، تحقیقات اخیر آلبومینوری را به عنوان نشانگر بدتر شدن وضعیت در نظر می گیرد [3].

در دهه گذشته، علاقه خاصی به مفهوم ساب تلوسنتریک نشان داده شده است، که طبق آن توبول پروگزیمال و محفظه توبولو بینابینی می توانند نقش اساسی در شروع و پیشرفت DKD داشته باشند [4-6]. در این زمینه، توسعه بیومارکرهای گلیکومیک پیش‌آگهی و پیش‌بینی‌کننده توجه فزاینده‌ای را به خود جلب می‌کند و در طول سال‌ها مورد توجه بسیاری از گروه‌های تحقیقاتی قرار گرفته است [7-11].

گانگلیوزیدها دسته خاصی از گلیکوسفنگولیپیدها را با ساختار پیچیده ای که در تمام بافت ها و مایعات بدن شناسایی شده و به ویژه در سیستم عصبی مرکزی (CNS) فراوان است، نشان می دهند [12]. گانگلیوزیدها به عنوان اجزای ضروری غشای دولایه سلول عصبی، نقش حیاتی در رشد، بلوغ و پیری مغز، واسطه چسبندگی، فعال شدن، تکثیر، تحرک و رشد دارند. گانگلیوزیدها از یک سرامید با ترکیب متفاوت با توجه به پایه اسفنگوئید، باقی مانده‌های اسید چرب ریشه‌دار در لایه بیرونی غشاء و یک زنجیره الیگوساکارید سیالیله تشکیل شده‌اند که غشا را می‌پوشاند و در برهمکنش‌های خاص و ضروری با سایر مولکول‌های محیط اطراف شرکت می‌کند. گانگلیوزیدها از طریق گردش نرمال سطح سلولی که به عنوان "ریزش سطح سلولی" شناخته می شود، تا حدودی در فضای بین سلولی آزاد می شوند.

از آنجا که بیان، توزیع و ساختار گانگلیوزیدها مشخص شده است که نوع سلول و بافت خاص است و در طول رشد بافت، بلوغ، پیری و مهم‌تر از همه در حالت‌های پاتولوژیک متفاوت است [12]، گانگلیوزیدها از با ارزش‌ترین‌ها محسوب می‌شوند. نشانگرهای تشخیصی و عوامل درمانی آینده نگر

چندین روش با استفاده از قطعات بیوپسی سرم یا کلیه برای شناسایی گانگلیوزید کلیه در بیماران دیابت نوع 2 استفاده شده است، مانند رنگ آمیزی ایمنی لایه نازک [7،8]، کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا (HPTLC) [9]، اسپکتروفتومتری [10]. ] و طیف سنجی جرمی (MS) [11].

با توجه به اطلاعات ارزشمندی که می تواند توسط گانگلیوزیدها به عنوان نشانگرهای مولکولی بافت عصبی [12] ارائه شود و داده های محدود موجود تا کنون در تشخیص و شناسایی گلیکوزفنگولیپیدها در ادرار بیماران DKD، ما یک روش برتر مبتنی بر توسعه و پیاده سازی کردیم. در نانوالکترواسپری (nanoESI) با وضوح بالا (HR) MS برای تعیین گانگلیوزیدها در ادرار بیماران مبتلا به دیابت. این گزینه برای HR MS با مزایای ارائه شده توسط این روش در تجزیه و تحلیل مخلوط پیچیده گانگلیوزیدهای استخراج شده از ادرار انسان هدایت می شود. قدرت تفکیک بالا ابزار: (i) امکان تشخیص یون‌هایی با مقادیر نزدیک m/z را فراهم می‌کند، که در غیر این صورت نمی‌توان آن‌ها را در یک نمونه چند جزئی ناهمگن حاوی گونه‌هایی با طول‌ها و معماری‌های مختلف زنجیره گلیکان و ترکیب‌های متفاوت از هم تشخیص داد. سرامید؛ (ب) اساساً نیاز به جداسازی مخلوط با روش‌های کروماتوگرافی مایع یا الکتروفورتیک قبل از تجزیه و تحلیل MS را برطرف می‌کند. (iii) دقت جرم بالایی را فراهم می کند که قابلیت اطمینان شناسایی سازه را تا حد زیادی افزایش می دهد. و (IV) نه تنها بینش بهتری در مورد پیچیدگی گانگلیوزیدوم مرتبط با DM ارائه می‌کند، بلکه داده‌هایی را در مورد گونه‌هایی با نقش بیومارکر بالقوه بر اساس اطمینان بالا در تعیین جرم برای یون‌های مولکولی و قطعه‌ای ارائه می‌دهد.

این مطالعه مقدماتی با هدف تعیین گانگلیوزیدهای ادرار با نقش بیومارکر درتشخیص زودهنگام DKDبر روی موارد زیر متمرکز شد: (الف) آزمایش امکان‌سنجی و عملکرد HR MS و MS پشت سر هم (MS/MS) توسط تفکیک ناشی از برخورد با انرژی بالا (HCD) در نقشه‌برداری گانگلیوزیدهای کلیوی در بیماران دیابت نوع 2. (ب) تعیین تغییرات در بیان مخلوط‌های گانگلیوزید بومی از نمونه‌های ادرار بیماران دیابت نوع 2 در یک سنجش مقایسه‌ای با کنترل‌های سالم و شناسایی نشانگرهای زیستی کشف‌شده. برای این منظور، ما یک پلت فرم بیو تحلیلی مدرن مبتنی بر nanoESI HR MS را بر روی یک ابزار Orbitrap تنظیم شده برای عملکرد در حالت یون منفی در هر دو غربالگری MS و تکه تکه شدن MS/MS برای تجزیه و تحلیل ساختاری دقیق بهینه کردیم.

2. نتایج و بحث

2.1. غربالگری مقایسه ای نمونه ها توسط نانوESI HR MS

نمونه های گانگلیوزید A1، A2، A3 و C توسط nanoESI یکی پس از دیگری به Orbitrap MS تزریق شدند و در حالت یون منفی تحت شرایط ابزاری یکسان غربال شدند. در هر مورد، سیگنال جریان یون کل (TIC) به مدت 2 دقیقه به دست آمد و طیف هایی را از تجمع 100 اسکن تولید کرد. با توجه به حساسیت بالای روش، حتی تحت شرایط محدود زمانی بکار گرفته شده، طیف جرمی به دست آمده دارای نسبت سیگنال به نویز بالا و الگوی یون مولکولی غنی است.

ارزیابی داده های نقشه برداری تولید شده در شرایط یکسان، تفاوت های قابل توجهی را در تعداد و نوع اجزای گانگلیوزید بیان شده در نمونه های A1، A3 و C نشان داد، در حالی که هیچ تفاوتی بین نمونه های A1 و A2 مشاهده نشد. این نتایج در جدول 1 خلاصه شده است، که به طور مقایسه ای ساختارهای شناسایی شده در مخلوط های بومی A1، A3 و C را همراه با مقادیر تجربی m/zexp سیگنال های شناسایی شده و مقادیر نظری m/ztheor مربوط به ساختارهای پیشنهادی فهرست می کند.

وضوح بالا و دقت توده پلت فرم MS به کار گرفته شده، تمایز و شناسایی را بر اساس اندازه گیری دقیق جرم 37 جزء مجزای گانگلیوزید و فوکوگانگلیوزید ادرار در سه نمونه افزایش داد. گونه های کشف شده متعلق به 15 کلاس مختلف، از جمله اصلاحات زنجیره گلیکان اصلی (جدول 2) هستند و میانگین جرمی با دقت عالی 4 ppm به آنها اختصاص داده شده است.

یک ارزیابی دقیق از ساختارهای جدول 1 نشان داد که از بین تمام نمونه ها، مخلوط A3 که مربوط به ماکروآلبومینوری است (از این رو به مرحله پیشرفته DKD)، حاوی بیشترین تعداد ترکیبات گانگلیوزید متمایز است، یعنی 19، و به دنبال آن نمونه C با 12 گونه مجزا و نمونه A1 با 10 گونه.

در مقایسه با نمونه‌های A1 و C، A3 همچنین: (i) دارای بیشترین تعداد گونه‌ها با طولانی‌ترین زنجیره O-گلیکان متعلق به کلاس G1 و برجسته‌ترین تنوع ترکیبات سرامید است. (ii) بالاترین تعداد کلاس‌های گانگلیوزید بیان شده{4}} را به ترتیب در مقابل تنها 6 در نمونه A1 و 6 در نمونه C ارائه می‌کند. (iii) حاوی بیشترین تعداد گانگلیوزید است که دارای یک هسته ساکارید تغییر یافته توسط O-استیل غیر کربوهیدرات، و همچنین تغییرات بیولوژیکی مرتبط با کربوهیدرات O-fucosyl و O-GalNAc است. (iv) تنها عصاره ادراری حاوی ساختارهای گانگلیوزیدی است که با اتصال O-GalNAc اصلاح شده است، یعنی GalNAc-GS1(t18:1/18:{18}})، که به عنوان یک مولکول چهار لایه deprotonated و sodiated در m/z 1176.8266 شناسایی شده است. و GalNAc-GQ1(d18:1/18:{26}})، به عنوان یک مولکول دوبرابر deprotonated در m/z 1310.1271. همانطور که در شکل 1a-c قابل مشاهده است، نشان می دهد که نسبت کلاس های گانگلیوزید بیان شده در سه نمونه، و در هیستوگرام مقایسه ای نشان داده شده در شکل 2، عصاره A3 وضعیت سیالیلاسیون خاصی را نشان می دهد، که تحت سلطه پلی سیالوترکیبات است. به جز گانگلیوتتراز مونوسیالیله GM1 (d18:1/16:1) که به صورت [M{37}}H+ ] 2- در m/z 756.9078 و GM3 مونوسیالیله شده (d18:0/24: 0) شناسایی شده به عنوان یک مولکول دوبرابر deprotonated در m/z 645.3956، همه 17 گونه دیگر حاوی بیش از یک باقی مانده Neu5Ac در نیمه گلیکان خود هستند. علاوه بر این، از آنجایی که کمتر از هفت تری سیالو GT1، چهار پنتاسیالو GQ1 و حتی یک GS1 هپتاسیالیله کشف شد، بدیهی است که در کنار تعداد و تنوع ساختارها، طول هسته‌های گلیکان و تغییرات محیطی آنها، سیالیلاسیون کلی بالا وجود دارد. محتوا نشان دهنده یکی دیگر از ویژگی های خاص ماکروآلبومینوری است.

جدول 1. گونه های گانگلیوزید در نمونه های A1، A3 و C با غربالگری (-) nanoESI Orbitrap MS شناسایی شدند. د: پایه اسفنگوئید دی هیدروکسیله. t: پایه اسفنگوئید تری هیدروکسیله.

یک مشاهدات بالینی مرتبط نیز از روش مقایسه ای A1 در مقابل C ظاهر می شود. در حالی که در نمونه کنترل، C، بالاترین درجه سیالیلاسیون گانگلیوزیدهای شناسایی شده چهار است، که از طریق دو گانگلیوتتراوز GQ1 تتراسیالیله شده که در ترکیب آگلیکون لیپیدی آنها متفاوت است، در نمونه A1، بالاترین درجه سیالیلاسیون چهار است. در کنار گانگلیوزیدهای دی، سه، و تتراسیالیله شده، مخلوط A1 حاوی یک گانگلیوتتراز پنتاسیال GP1 (d18:1/18:{10}}) است که به عنوان یون [M{11}}H+ ] 4- در m/z 676.5569، که دقت جرم عالی 2.95 ppm را به آن اختصاص داد. چنین داده هایی مربوط به وضعیت سیالیلاسیون نمونه های بررسی شده نشان می دهد که درجه سیالیلاسیون گانگلیوزیدهای کلیوی از صفت C پیشرفت DKDواثربخشی درمان.

جدول 2. نمای جدول بندی شده از طبقات گانگلیوزید ادرار شناسایی شده همراه با بیان متفاوت آنها در نمونه های A1، A3 و C. نمادها: x=کلاس شناسایی شد. -=کلاس شناسایی نشد.

بررسی دقیق ساختار آگلیکون نشان می دهد که، به جز تفاوت های مشخص در ترکیب زنجیره گلیکان، گانگلیوزیدهای بیان شده در سه نمونه نیز تفاوت هایی در ساختار سرامیدهای خود نشان می دهند. مشهودترین تغییرات قسمت لیپیدی مربوط به فرآیند کمتر متداول تری هیدروکسیلاسیون باز اسفنگوئیدی است که در مخلوط های گانگلیوزیدهای A1 و A3 رخ می دهد و طول غیر معمول زنجیره های اسید چرب که فقط در A3 وجود دارد. هر یک از نمونه های A1 و A3 حاوی دو گونه با پایه اسفنگوئید تری هیدروکسیله سرامید بودند. بنابراین، GT1(t18:0/18:0) و GT1(t18:0/20:0) در نمونه A1 کشف شدند، در حالی که بیشتر ساختارهای پیچیده تری هیدروکسیله GT1 (t18:1/24:3) و Fuc-GT3 (t18:1/18:3) در نمونه A3 یافت شد.

قابل توجه است، نمونه A3 همچنین شواهدی از گونه‌های حاوی اسیدهای چرب با زنجیره بلند (VLCFA) را نشان می‌دهد. یک VLCFA یک ساختار لیپیدی نادر است که شامل 23 تا 27 اتم کربن در زنجیره اسیدهای چرب است. چهار گونه VLCFA غیرمعمول حامل 24 اتم کربن در زنجیره اسید چرب در نمونه A3 شناسایی شدند: GM3(d18:0/24:{{10}})، GT1(t18:1 /24:3)، O-Ac GT1 (d18:0/24:0)، و Fuc-GT1 (d18:0/24:0)، که یک ساختار همچنین دارای تری هیدروکسیلاسیون پایه اسفنگوئیدی غیرمعمول و سه پیوند دوگانه در زنجیره اسیدهای چرب است، در حالی که دو ساختار به ترتیب به هسته گلیکان O-Ac و گروه فوکوسیل متصل هستند.

این ویژگی‌های بخش‌های سرامید در نمونه‌های A1 و A3 که در نمونه کنترل یافت نشد. شباهت بین A1 و A2. و تفاوت‌های بارز شناسایی‌شده در A3 نشان می‌دهد که در کنار ترکیب کربوهیدرات و وضعیت سیالیلاسیون، ساختار بخش لیپیدی در گانگلیوزیدهای کلیوی یکی دیگر از نشانگرهای احتمالی DKD اولیه است. علاوه بر این، به نظر می رسد تغییرات در ترکیب سرامید به مراحل آلبومینوری بستگی دارد. سرامیدهای پیچیده که تری هیدروکسیلاسیون پایه اسفنگوئیدی را نشان می دهند و VLCFA به نظر می رسد با مراحل پیشرفته آلبومینوری مرتبط باشد. با توجه به اینکه تعداد غیرمعمول سه پیوند دوگانه در زنجیره اسیدهای چرب تنها در نمونه A3 از طریق دو گونه مختلف Fuc-GT3 (t18:1/18:3) و GT1 (t18:1/24:3) مشاهده شد. به نظر می رسد، مکانیسم تشکیل پیوند دوگانه نیز با پیشرفت DKD مرتبط است.

اثرات منفی ناشی از تجمع لیپید در کلیه، در هر دو سطح گلومرولی و لوله ای، مختص سلول است. علاوه بر این، سمیت چربی با انواع مختلفی از لیپیدها مرتبط است، که در میان آنها گانگلیوزیدها نقشی در مرحله مرکزی دارند [13].

محتوای کلیوی گانگلیوزیدها، در میان سایر طبقات لیپید، در سلول‌های پادوسیت و همچنین سلول‌های توبول پروگزیمال، در مدل موش DN افزایش یافت [14]. لوله های پروگزیمال ممکن است در معرض سطوح بالایی از لیپیدهای ادراری، از جمله گانگلیوزیدها، به دلیل افزایش محتوای اسید چرب در هر مولکول آلبومین در اوایل DKD [15] قرار گیرند. پیامدهای مستقیم تجمع لیپید در بخش‌های نفرون مربوط به تغییرات ساختاری و عملکردی است که منجر به اختلال در پردازش آلبومین در اوایل دوره دیابت نوع 2 می‌شود.

اکثریت قریب به اتفاق مطالعاتی که بر خصوصیات گانگلیوزید کلیوی تمرکز دارند، بر مدل‌های تجربی نفروپاتی دیابتی تکیه دارند. با بهترین دانش ما، این اولین مطالعه ترجمه انسانی از تحقیقات پایه تا کاربرد بالینی است که در مورد الگوی گانگلیوزید ادراری خاص در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 گزارش می دهد. اهمیت عملی مطالعه ما در نشان دادن ارتباط درجه سیالیلاسیون گانگلیوزیدهای ادراری و ساختار سرامیدهای آنها با DKD اولیه است که بر اساس سطح آلبومینوری انجام می شود.

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

خرید برای جزئیات بیشتر مشخصات:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop

برای عفونت کلیه، عصاره طبیعی ارگانیک سیستانچ را با 25% اکیناکوزید و 9% آکتئوزید دریافت کنید.