مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa آپوپتوز را در سلول های سرطان کبدی H22 از طریق مسیرهای سیگنال دهی بیرونی و درونی القا می کنند.

پنگفی یوان¹ و همکاران

خلاصه

زمینه: Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight یک داروی سنتی چینی است که ریشه گیاه Tamarix را انگلی می کند و برای درمان ناتوانی جنسی مردانه، عقیمی، ضعف بدن و به عنوان مقوی استفاده می شود. با این حال، اثر ضد توموری آن بر روی کارسینوم سلول های کبدی هنوز مبهم است. در اینجا، ما اثر ضد توموری را بررسی کردیمCistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی(CTPG) بر روی سلول‌های کارسینومای سلول‌های کبدی H22 در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی و مکانیسم‌های آن.

مواد و روش ها:مورفولوژی، زنده ماندن،آپوپتوزچرخه سلولی و پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm) سلول های H22 به ترتیب با میکروسکوپ معکوس، سنجش MTT و فلوسیتومتری مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. بیان و فعال شدن پروتئین ها درآپوپتوزمسیر توسط وسترن بلات شناسایی شد. اثر ضد توموری in vivo در یک مدل موش توموری که با استفاده از موش‌های نر کونمینگ ایجاد شده بود، ارزیابی شد.

نتایج:درمان CTPG به طور قابل توجهی رشد سلول های H22 را به روشی وابسته به دوز و زمان سرکوب کرد، که با افزایش همبستگی داشت.آپوپتوزو توقف چرخه سلولی در فازهای G0/G1 و G2/M. علاوه بر این، تراکم کروموزومی در سلول‌های H22 تیمار شده با CTPG مشاهده شد. تیمار CTPG به طور قابل توجهی نسبت Bax/Bcl{5}} را افزایش داد، Δψm را کاهش داد و آزادسازی سیتوکروم c را افزایش داد. سطوح کاسپاز و کاسپاز بریده شده در هر دو مسیر سیگنال دهی بیرونی و درونی به طور قابل توجهی افزایش یافت که به طور متوالی کاسپاز-7 و{9}} برای برش PARP افزایش یافت. در نهایت، CTPG رشد سلول‌های H22 را در موش‌ها مهار کرد و میزان بقای موش‌های تومور را بهبود بخشید.

نتیجه گیریاین نتایج نشان می دهد که CTPG رشد سلول های H22 را از طریق بیرونی و درونی سرکوب می کند.آپوپتوزمسیرها

کلید واژه ها: Cistanche tubulosa, گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید, آپوپتوز, مسیر سیگنالینگ, مدل موش توموری

Cistanche tubulosaگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی

زمینه

سرطان کبد در رتبه ششم بروز سرطان و چهارمین مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان قرار دارد. علاوه بر این، رتبه چهارم بروز سرطان و اولین مرگ و میر ناشی از سرطان را در کشورهایی با شاخص اجتماعی جمعیت شناختی پایین دارد [1]. در چین، سرطان کبد سومین علت مرگ ناشی از سرطان در سال 2015 است [2]. بیش از 90 درصد از سرطان های اولیه کبد را سرطان سلول های کبدی (HCC) در جهان تشکیل می دهند [3]. در حال حاضر، رزکسیون کبدی گزینه اصلی برای درمان HCC است. با این حال، کمتر از 30 درصد از بیماران مبتلا به HCC معیارهای رزکسیون درمانی کبدی را داشتند و میزان بقای کلی 5-ساله به دلیل نرخ بالای عود هنوز به اندازه 35-50 درصد است [4، 5] . در دسترس بودن گزینه های درمانی برای بیماران مبتلا به HCC متوسط ​​تا پیشرفته بسیار محدود است. سورافنیب، یک داروی هدفمند مولکولی، توسط FDA به عنوان درمان خط اول برای HCC پیشرفته تایید شده است. با این حال، سورافنیب تنها حدود 3 ماه بقا را طولانی می کند و نرخ پاسخ کمتر از 4 درصد است [6، 7]. توسعه داروها یا استراتژی های جدید علیه HCC ضروری است.

طب سنتی چینی (TCM) به تنهایی یا همراه با استراتژی‌های دیگر برای درمان HCC استفاده شده است و مزایای بالینی از جمله طولانی‌مدت زمان بقا، بهبود کیفیت زندگی، کاهش واکنش‌های جانبی و غیره را نشان داده است [8، 9]. سیستانچ، نوعی TCM، دارای عملکردهای بیولوژیکی مختلفی مانند ضد اکسیداسیون، ضد التهاب، ضد پیری و محافظت عصبی است [10، 11].گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدجزء اصلی فعال سیستانچ در نظر گرفته شده اند که دارای فعالیت های متنوعی از جمله آنتی اکسیدان، ضد التهاب، محافظت از کبد و محافظت عصبی هستند [12-15]. گروه ما گزارش داده استCistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی(CTPG) می تواند القاء کندآپوپتوزدر سلول های B{0}F10 ملانوم و مهار رشد تومورها در موش [16]. در این مطالعه، ما اثر ضد توموری CTPG بر سلول‌های HCC H22 را هم در شرایط in vitro و هم in vivo اندازه‌گیری کردیم و مکانیسم‌های آن را بررسی کردیم. ما متوجه شدیم که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)القاء شدهآپوپتوزدر سلول های H22 از طریق هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی رشد تومورهای H22 را در موش سرکوب کرد.

مواد و روش ها

خط تلفن

سلول های سرطان کبد H22 موش از آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین کیانگ، دانشگاه سین کیانگ (اورومچی، سین کیانگ، چین) به دست آمد و در محیط RPMI 1640 (Gibco) حاوی 100 U/ml پنی سیلین و 10 کشت داده شد. استرپتومایسین و 10 درصد سرم جنین گاوی غیرفعال شده با حرارت (Gibco) در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2.

سنجش MTT

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)از Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian، Xinjiang، چین) و ترکیبات اصلی CTPG خریداری شد.(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا واجد شرایط و کمیت شدند [16]. زنده ماندن سلول توسط 3-(4، 5-دی متیل تیازول-2-یل)-2، 5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) (Sigma, St. Louis, MO ارزیابی شد ، ایالات متحده) سنجش. سلول‌های H22 در 96-صفحه‌های چاهک با تراکم 2 × 104 سلول در محیط کشت 1{20}} ul در هر چاهک تلقیح شدند و در دمای 37 درجه کشت شدند. پس از 24 ساعت، سلول ها با غلظت های مختلف CTPG (0,100، 200، 300 و 400 ug/ml) یا 0.3 درصد DMSO (برابر با غلظت 400 ug/ml CTPG) به ترتیب به مدت 24، 48 و 72 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. پس از سانتریفیوژ در 1000 دور در دقیقه به مدت 7 دقیقه، مایع رویی دور ریخته شد و 100 میکرولیتر محلول MTT (5 میلی گرم در میلی لیتر در PBS) به هر چاهک اضافه شد. پلیت ها در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوبه شدند و 100 لیتر DMSO به آن اضافه شد تا کریستال های فرمازان تشکیل شده حل شود. مقادیر OD490 توسط یک خواننده میکروپلیت چاهی (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) 96- شناسایی شد. زنده ماندن سلول طبق فرمول: زنده ماندن سلولی ( درصد )=(ODtreated/ODuntreated) x 100 درصد محاسبه شد.

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی Cistanche tubulosa

تشخیص آپوپتوز

سلول های H22 با غلظت های مختلف CTPG تیمار شدند(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)({0}}، 100، 200، 300 و 400 ug/ml) یا 0.3 درصد DMSO به مدت 24 ساعت، و سپس با Annexin VFITC/Propidium یداید (PI) رنگ آمیزی شد.آپوپتوزکیت تشخیص (YEASEN، چین) طبق دستورالعمل سازنده. نمونه ها با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند.

تشخیص پتانسیل غشای میتوکندری

سلول های H22 با غلظت های مختلف CTPG تیمار شدند(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)(0، 200 و 400 ug/ml) به مدت 24 ساعت، و سپس با رنگ JC{5}} نفوذپذیر از غشاء (بیوتیم، چین) به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه رنگ آمیزی شد. پس از دو بار شستشو با بافر JC{8}}، نمونه‌ها مجدداً با 300 ul بافر JC{10}} معلق شدند و با فلوسایتومتری (BD FACSCalibur، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند.

تجزیه و تحلیل چرخه سلولی

سلول های H22 در ظروف کشت 6{2}} میلی متری تلقیح شدند و با غلظت های مختلف CTPG (0، 1{18}}0،200، 300 و 400 میکروگرم در میلی لیتر) یا 0.3 درصد DMSO به مدت 24 ساعت تیمار شدند. . تمام سلول ها جمع آوری و دو بار با PBS شسته شدند. سلول ها در اتانول سرد 70 درصد در دمای 20- درجه به مدت 2 ساعت تثبیت شدند و دو بار با PBS شسته شدند، سپس مجدداً در 300 میکرولیتر پروپیدیوم یدید/RNase بافر رنگ آمیزی (BD Biosciences) معلق شدند. پس از 10 دقیقه در دمای اتاق، نمونه ها با فلوسیتومتری (BD FACSCalibur، ایالات متحده آمریکا) جمع آوری شدند و توزیع چرخه سلولی با نرم افزار ModFit LT 3.0 تجزیه و تحلیل شد.

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدیکه درCistanche tubulosa

رنگ آمیزی Hoechst 33258

تغییرات مورفولوژیکی هسته سلولی H22 با رنگ آمیزی متصل شونده به DNA به غشاء، رنگ آمیزی Hoechst 33258 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سلول های H22 در یک صفحه چاهی با غلظت 1 × 105 سلول در چاهک در محیط 2 میلی لیتری کاشته شدند. پس از تلاقی 60 تا 70 درصد، سلول ها با CTPG تیمار شدند(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)(0، 100، 200، 300 و 400 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت. سلول ها جمع آوری و با 4 درصد پارافورمالدئید سرد در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه ثابت شدند. پس از شستشو با PBS، سلول ها با Hoechst 33258 (Beyotime، چین) در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها توسط یک میکروسکوپ فلورسانس معکوس (Nikon Eclipse Ti-E، ژاپن) مشاهده شدند.

وسترن بلات

آنتی کاسپاز-3، کاسپاز ضد شکاف-3، Anti-Bcl-2 و آنتی‌باکس از Beyotime Biotech Co., Ltd. (شانگهای، چین) خریداری شد. Anti-caspase-7, anti-cleaved-caspase-7, anti-caspase-8, anti-cleaved-caspase-8, anti-caspase-9, anti-caspase شکاف کاسپاز{20}}، آنتی PARP، PARP ضد شکاف، IgG-HRP ضد موش و IgG-HRP ضد خرگوش از Cell Signaling Technology خریداری شد. Anti{26}}اکتین از Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (پکن، چین) خریداری شد.

سلول های H22 با غلظت های مختلف CTPG تیمار شدند(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)({{0}}، 100، 200، 300 و 400 ug/ml) یا 0.3 درصد DMSO برای 24 ساعت. سلول ها جمع آوری و با محلول لیز سلولی RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) به مدت 30 دقیقه روی یخ لیز شدند. نمونه‌ها (12،{10}} گرم به مدت 15 دقیقه در 4 درجه) برای جمع‌آوری مواد رویی چرخانده شدند و غلظت پروتئین با کیت BCA (Thermo Fisher Scientific, USA) اندازه‌گیری شد. مقدار مساوی پروتئین در هر نمونه با 12 درصد SDS-PAGE جداسازی و به غشاهای PVDF (Biosharp، چین) منتقل شد. پس از مسدود شدن با بافر TBST حاوی 5 درصد شیر بدون چربی، غشاها به ترتیب با آنتی بادی های اولیه مربوطه و آنتی بادی های ثانویه کونژوگه شده با پراکسیداز ترب کوهی (HRP) انکوبه شدند. پس از شستشو با TBST، پروتئین های هدف توسط کیت سنجش ECL (Beyotime، چین) شناسایی شدند.

بیانیه حیوانات و اخلاق

موش های نر کونمینگ 6-8 هفته ای از مرکز آزمایشگاه حیوانات، دانشگاه پزشکی سین کیانگ (اورومچی، سین کیانگ، چین) خریداری شدند. موش ها در یک مرکز حیوانی با دمای استاندارد و چرخه نور در دانشگاه سین کیانگ نگهداری شدند. تمام مطالعات حیوانی بر اساس دستورالعمل های کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه سین کیانگ انجام شد. این پروتکل توسط کمیته اخلاقیات آزمایشات حیوانی آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین کیانگ (BRGE-AE001)، دانشگاه سین کیانگ تأیید شد.

مطالعه تومور موش

برای القای مدل موشی تومور، موش‌های نر کونمینگ به صورت زیر جلدی 6 سلول H22 1×10 در 100 میکرولیتر PBS به سمت راست تزریق شدند. پس از 3 روز، موش ها به طور تصادفی به 3 گروه (7 موش / گروه) تقسیم شدند. به گروه کنترل 0.1 میلی لیتر DMSO به صورت زیر جلدی در اطراف تومور تزریق شد. گروه‌های CTPG-200 و CTPG{10}} به صورت زیر جلدی 200 یا 400 میلی‌گرم بر کیلوگرم CTPG تزریق شدند.(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)در 0.1 میلی لیتر DMSO در اطراف تومور. موش ها هر 2 روز یکبار تا 21 روز تحت درمان قرار گرفتند. اندازه تومورها با استفاده از کولیس تا 25 روز اندازه گیری شد و حجم تومور طبق فرمول: حجم تومور (mm3)=(طول×عرض2)/2 محاسبه شد. پس از 25 روز، بقای موش های تومور تا پایان این مطالعه هر روز بررسی شد.

تحلیل آماری

معنی‌داری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه در بین گروه‌های تیمار و کنترل محاسبه شد. تمام داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) بیان شد. p < 0.05="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)کاهش زنده ماندن سلول های H22 در شرایط آزمایشگاهی

به منظور بررسی اثر ضد توموری CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)در HCC، سلول‌های H22 با غلظت‌های مختلف CTPG ({1}}، 100، 200، 300 و 400 میکروگرم بر میلی‌لیتر) در شرایط آزمایشگاهی تیمار شدند. پس از 24 ساعت، مورفولوژی سلول های H22 با استفاده از میکروسکوپ معکوس مشاهده شد. ما دریافتیم که مورفولوژی سلول های H22 به طور چشمگیری با درمان CTPG تغییر کرد. با افزایش غلظت CTPG، سلول ها کوچک و گرد شدند و تعداد سلول ها نیز به شدت کاهش یافت (شکل 1a). از روش MTT برای تجزیه و تحلیل زنده ماندن سلول های H22 پس از درمان CTPG به ترتیب برای 24، 48 و 72 ساعت استفاده شد. CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول های H22 را به صورت وابسته به دوز و زمان کاهش داد (شکل 1b). CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)در 300 ug/ml به بهترین سرعت بازدارندگی رسید (شکل 1c). مقادیر IC50 CTPG برای سلول های H22 236 ug/ml در 24 ساعت و 169.8 ug/ml در ساعت 48 است.

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)القا آپوپتوز در سلول های H22

برای بررسی اینکه آیا کاهش زنده ماندن سلول های H22 توسط القای واسطه انجام می شود یا خیرآپوپتوزسلول‌های H22 با غلظت‌های مختلف CTPG ({1}}، 100، 200، 300 و 400 میکروگرم در میلی‌لیتر) به مدت 24 ساعت تیمار شدند و با PI و Annexin V رنگ‌آمیزی شدند. نتایج فلوسایتومتری نشان داد که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)به طور قابل توجهی القا شده استآپوپتوزسلول های H22 (از جمله زود و دیرآپوپتوز) به روشی وابسته به دوز (شکل 2a). اگر چه دوز بالای CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)همچنین نکروز سلول های H22 را به طور قابل توجهی افزایش داد، نکروز به دلیل نسبت کمتر آن (8.3 درصد) در مقایسه با نکروز نقش جزئی در مهار رشد سلول های H22 ایفا می کند.آپوپتوز(52.6 درصد). علاوه بر این، پروتئین کل سلول های H22 پس از CTPG جدا شد(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان و بیان لنفوم سلول B ضد آپوپتوز 2 (Bcl-2) و پروآپوپتوز BCL{3}}پروتئین X مرتبط (Bax) توسط وسترن بلات شناسایی شد. داده‌های اسکن در مقیاس خاکستری نشان داد که میزان بیان Bax و Bcl{4}} به ترتیب افزایش و کاهش یافته است. نسبت Bax/Bcl{5}} بطور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 2b). این نتایج نشان می دهد که CTPG القا می کندآپوپتوزدر سلول های H22

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)باعث تراکم کروموزومی و توقف چرخه سلولی در سلول های H22 می شود

گزارش شده است که آسیب DNA و توقف چرخه سلولی ناشی از داروها می تواند رشد سلول های تومور را مهار کند و باعث شودآپوپتوزدر سلول های تومور [17، 18]. برای تشخیص مورفولوژی هسته در سلول های H22 پس از CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)تیمار به مدت 24 ساعت، سلول های H22 توسط Hoechst 33342 رنگ آمیزی شدند و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت معکوس مشاهده شدند. CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)سلول های تیمار شده افزایش وابسته به دوز کروماتین روشن هسته ها را نشان دادند، در حالی که سلول های تیمار نشده هسته های رنگ آمیزی همگن را نشان دادند (شکل 3a). توزیع چرخه سلولی در سلول های H22 با رنگ آمیزی PI پس از درمان CTPG به مدت 24 ساعت بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. همانطور که در شکل 3b نشان داده شده است، CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان به طور قابل توجهی نسبت سلول های فاز G0/G1- و G2/M را افزایش داد و نسبت سلول های فاز S را به طور قابل توجهی کاهش داد، که نشان می دهد CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)توقف فاز G0/G1 و G2/M را در سلول‌های H22 القا کرد. دوز بالای CTPG نیز به طور قابل توجهی نسبت سلول های زیر G1 را افزایش داد.

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)کاهش پتانسیل غشای میتوکندری و افزایش آزادسازی سیتوکروم c

مسیر وابسته به میتوکندری نقش مهمی در القا داردآپوپتوز[19، 20]. تغییرات پتانسیل غشای میتوکندری (Δψm) می تواند باشد

تحت نظارت رنگ آمیزی JC-1 ناشی از دانه های JC-1 (فلورسانس قرمز) می تواند با کاهش Δψm به مونومر (فلورسانس سبز) تجزیه شود [21]. بعد از CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)تیمار به مدت 24 ساعت، سلول های H22 با رنگ JC{2}} رنگ آمیزی شدند. داده های فلوسایتومتری نشان داد که فلورسانس قرمز در کانال FL-2 و فلورسانس سبز در کانال FL-1 به طور قابل توجهی کاهش یافته و با CTPG افزایش یافته است.(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)رفتار. نسبت سلول های PE-FITC پلاس به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 4a)، که نشان می دهد CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)Δψm را در سلول های H22 کاهش داد. این با افزایش نسبت Bax/Bcl{1}} مطابقت دارد. در نتیجه، ما مشاهده کردیم که آزادسازی سیتوکروم c به طور قابل توجهی بر CTPG افزایش یافته است(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان (شکل 4b). این نتایج نشان داد که CTPG ممکن است تا حدی القا شودآپوپتوزدر سلول های H22 از طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری (ذاتی).

CTPG مسیر کاسپاز را فعال کرد و از ترمیم DNA جلوگیری کرد

بعد، فعال شدن کاسپاز ناشی از CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)از طریق هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. بعد از CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)در درمان به مدت 24 ساعت، پروتئین کل از سلول های H22 جدا شد و سطح پرو و ​​کاسپازهای شکاف شده با وسترن بلات شناسایی شد. در مقایسه با کنترل نشده یا DMSO، CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان به طور قابل توجهی نه تنها سطح کاسپاز بریده شده-8 (مسیر بیرونی) بلکه سطح کاسپاز شکافته-9 (مسیر درونی) را افزایش داد (شکل 5). به‌تدریج، کاسپاز فعال-8 و -9 پروکاسپاز پایین‌دست-3 و -7 را که در شکل 5 مشاهده شد، شکافتند. کاسپاز فعال{10}} DNA را شکافت آنزیم ترمیم پلی (ADP-ribose) پلیمراز (PARP) برای جلوگیری از ترمیم DNA و تجمع آسیب DNA همانطور که در شکل 3a مشاهده شده است. این نتایج نشان داد که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)القاء شدهآپوپتوزدر سلول های H22 از طریق هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی.

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)رشد H22 HCC را در داخل بدن سرکوب می کند و میزان بقای موش های تومور را بهبود می بخشد.

در نهایت، اثر ضد توموری CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)بر روی HCC در مدل موش توموری، که با تزریق زیر جلدی سلول‌های H22 ایجاد شد، مورد بررسی قرار گرفت. پس از 3 روز از تزریق سلول H22، موش های تومور با CTPG تحت درمان قرار گرفتند(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)8 بار. وزن بدن موش ها و اندازه تومورها در نقاط زمانی مشخص شده کنترل شد. همانطور که در شکل 6a نشان داده شده است، وزن بدن موش ها در هر گروه تفاوت معنی داری ندارد، که نشان می دهد دوزهای انتخابی CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)هیچ عوارض جانبی آشکاری ندارند. جالب توجه است که رشد تومور در موش های تحت درمان با mg/kg 200 و mg/kg 400 CTPG به طور قابل توجهی مهار شد (شکل 6b). علاوه بر این، دو دوز CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان تا حد زیادی بقای موش‌های تومور (3/7، 3/7) را در مقایسه با گروه کنترل ({4}}/7) در پایان آزمایش بهبود بخشید (شکل 6b). ما همچنین دریافتیم که CTPG به طور قابل توجهی تکثیر سلول های طحال جدا شده از موش های نر کونمینگ را به روشی وابسته به دوز افزایش می دهد (شکل 6c)، که نشان می دهد CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)دارای اثر ایمنی تحریک کننده است.

بحث

TCM برای درمان بیماری های مختلف از جمله سرطان برای تاریخ طولانی مورد استفاده قرار گرفته است. گزارش شده است که TCM می تواند القا کندآپوپتوزدر انواع مختلف سلول های تومور از طریق مسیرهای سیگنالینگ بیرونی (با واسطه گیرنده مرگ) و درونی (وابسته به میتوکندری) برای اعمال اثرات ضد توموری [22-25]. این دو مسیر می توانند به ترتیب کاسپاز-8 و -9 را فعال کنند [24، 26]. در اینجا، ما آن CTPG را پیدا کردیم(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)به طور قابل توجهی رشد سلول H22 را از طریق القای آپوپتوز و توقف چرخه سلولی سرکوب کرد. سطوح کاسپاز بریده شده-8 و -9 به طور قابل توجهی توسط CTPG تنظیم شد.(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)درمان، نشان می دهد که هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی در القایآپوپتوز. مطالعه قبلی ما نشان داد که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)القاء آپوپتوز در سلول‌های ملانوم B{0}}F10 توسط یک مسیر وابسته به میتوکندری که باعث افزایش سطح کاسپاز بریده شده-9 اما نه کاسپاز-8 [16] شد. CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)ممکن است مسیرهای سیگنالی متمایز را در انواع مختلف سلول های تومور فعال کند.

یکپارچگی غشای میتوکندری به شدت توسط اعضای خانواده پروتئین BCL-2 از جمله Bax و Bcl-2 [27، 28] تنظیم می‌شود. نسبت Bax به Bcl{4}} نقش مهمی در وابسته به میتوکندری ایفا می کندآپوپتوزمسیر [29]. در سلول های H22 تحت درمان با CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)نسبت Bax/Bcl{0}} به طور قابل توجهی تنظیم شده بود، که ممکن است باعث کاهش Δψm و آزادسازی سیتوکروم c مشاهده شده در این مطالعه شود. در نتیجه، pro-caspase-9 شکافت و فعال شد. در نهایت، آغازگرهای کاسپاز فعال-8 و -9 اعدام کننده کاسپاز-3 را برای جدا کردن PARP برای جلوگیری از ترمیم DNA فعال کردند. روی هم رفته، این نتایج نشان داد که CTPG القا می شودآپوپتوزدر سلول های H22 از طریق هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی. در یک مدل موش تومور، CTPG به طور قابل توجهی رشد H22 HCC را سرکوب کرد و بقای موش های تومور را تا حد زیادی بهبود بخشید. جالب اینجاست که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)به طور وابسته به دوز، تکثیر سلول‌های طحال را از موش‌های کونمینگ افزایش داد، که با مطالعه قبلی ما مطابقت دارد [16]. این نتایج نشان داد که CTPG ممکن است رشد H22 HCC را در موش از طریق اثر مستقیم ضد توموری و تقویت غیرمستقیم ایمنی سرکوب کند.

Cistanche tululosaمحصولات

نتیجه گیری

CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)رشد سلول های H22 را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن سرکوب و القا کردآپوپتوزدر سلول های H22 از طریق هر دو مسیر سیگنالینگ بیرونی و درونی. این داده ها نشان داد که CTPG(Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید)ممکن است یک کاندید بالقوه برای درمان HCC باشد.

اختصارات

Bax: پروتئین X مرتبط با BCL-2-. Bcl-2: لنفوم سلول B 2; CTPG:Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی; HCC: کارسینوم کبدی؛ HRP: پراکسیداز ترب کوهی؛ MTT: 3-(4، 5-دی متیل تیازول-2-یل)-2، 5-دی فنیل تترازولیوم بروماید. PARP: آنزیم ترمیم DNA پلی (ADP-ribose) پلیمراز. TCM: طب سنتی چینی؛ Δψm: پتانسیل غشای میتوکندری

منابع مالی

این کار توسط پروژه معرفی استعدادهای سطح بالا منطقه خودمختار سین کیانگ اویغور به JL، کمک مالی بنیاد ملی علوم طبیعی چین (31460241) به JL، و صندوق راه اندازی دکتری دانشگاه سین کیانگ (BS160261 به XW و BS150236 تا YL).

در دسترس بودن داده ها و مواد

داده های خام برای این مطالعه در صورت درخواست منطقی برای نویسنده مربوطه در دسترس است.

مشارکت نویسندگان

JL و JL آزمایش ها را طراحی کردند. PY، JL، AA و YY آزمایش ها را انجام دادند. LX، XW و YL داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. PY، JL، و JL نسخه خطی را نوشتند. همه نویسندگان مقاله نهایی را مشارکت و تایید کردند.

تایید اخلاق

این مطالعه حیوانی توسط کمیته اخلاقیات آزمایشات حیوانی آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین کیانگ، دانشگاه سین کیانگ تایید شد.

منافع رقابتی

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع رقابتی ندارند.

یادداشت ناشر

Springer Nature با توجه به ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

مشخصات نویسنده

¹آزمایشگاه کلیدی منابع بیولوژیکی و مهندسی ژنتیک سین‌کیانگ، کالج علوم و فناوری زندگی، دانشگاه سین‌کیانگ، 666 جاده شنگلی، ارومچی، سین‌کیانگ 830046، چین.²کالج علوم زیستی، دانشگاه عادی سین کیانگ، جاده Xinyi 102، Urumqi 830054، سین کیانگ، چین.³بیمارستان تومور وابسته دانشگاه پزشکی سین کیانگ، ارومچی 830011، چین.

Cistanche tululosaمحصولات

از جانب: 'Cistanche tubulosa گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدیوادار کردنآپوپتوزدر سلول های سرطان کبد H22 از طریق مسیرهای سیگنال دهی بیرونی و درونی توسط Pengfei Yuan1 و همکاران

---یوان و همکاران. BMC Complementary and Alternative Medicine (2018) 18:275 https://doi.org/10.1186/s{6}}

منابع

1. همکاری جهانی بار بیماری سرطان، فیتزموریس سی، آلن سی، باربر RM، باررگارد ال، بوتا ZA، برنر اچ، دیکر دیکر، چیمد-ارکید او، داندونا آر، و همکاران. بروز جهانی، منطقه‌ای و ملی سرطان، مرگ و میر، سال‌های زندگی از دست رفته، سال‌های زندگی با ناتوانی، و سال‌های زندگی تعدیل‌شده با ناتوانی برای 32 گروه سرطانی، 1990 تا 2015: تجزیه و تحلیل سیستماتیک برای مطالعه بار جهانی بیماری. جاما اونکول. 2017؛ 3:524-48.

2. Chen W, Zheng R, Baade PD, Zhang S, Zeng H, Bray F, Jemal A, Yu XQ, He J. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 2016؛ 66: 115–32.3. انجمن اروپایی برای مطالعه کبد، سازمان اروپایی برای تحقیقات و درمان سرطان. دستورالعمل‌های عمل بالینی EASL-EORTC: مدیریت کارسینوم سلول‌های کبدی. جی هپاتول. 2012؛ 56:908-43.

4. Roayaie S, Obeidat K, Sposito C, Mariani L, Bhoori S, Pellegrinelli A, Labow D, Llovet JM, Schwartz M, Mazzaferro V. برداشتن سرطان کبد کمتر یا مساوی 2 سانتی متر: نتایج حاصل از دو مرکز غربی. کبد شناسی. 2013؛ 57: 1426-35.

5. Ting CT، Cheng YY، Tsai TH. تعامل گیاه دارویی بین فرمول سنتی محافظ کبد و سورافنیب بر سمیت کبدی، هیستوپاتولوژی و فارماکوکینتیک در موش صحرایی. مولکول ها. 2017؛ 22: E1034.

6. Llovet JM، Ricci S، Mazzaferro V، Hilgard P، Gane E، Blanc JF، de Oliveira AC، Santoro A، Raoul JL، Forner A، و همکاران. سورافنیب در کارسینومای سلولی پیشرفته کبدی. N Engl J Med. 2008؛ 359:378-90.

7. Cheng AL، Kang YK، Chen Z، Tsao CJ، Qin S، Kim JS، Luo R، Feng J، Ye S، Yang TS، و همکاران. اثربخشی و ایمنی سورافنیب در بیماران در منطقه آسیا و اقیانوسیه مبتلا به سرطان کبدی پیشرفته: یک کارآزمایی تصادفی شده، دوسوکور، فاز III و کنترل شده با دارونما. Lancet Oncol. 2009؛ 10:25-34.

8. Shi Z، Song T، Wan Y، Xie J، Yan Y، Shi K، Du Y، Shang L. مرور سیستماتیک و متاآنالیز داروهای سنتی چینی حشرات شیمی درمانی برای درمان سرطان کبد سلولی غیر جراحی. Sci Rep.2017; 7:4355.

9. Yang Z، Liao X، Lu Y، Xu Q، Tang B، Chen X، Yu Y. درمان اضافی با طب سنتی چینی نتایج را بهبود می‌بخشد و عوارض جانبی را در سرطان کبد کاهش می‌دهد: متاآنالیز کارآزمایی‌های تصادفی‌سازی و کنترل‌شده. Evid Based Complement Alternat Med. 2017؛ 2017: 3428253.

10. Lin LW، Hsieh MT، Tsai FH، Wang WH، Wu CR. فعالیت ضد درد و ضد التهاب ناشی از سیستانش دسرتیکولا در جوندگان. جی اتنوفارماکول. 2002؛ 83: 177-82.

11. Wu CR، Lin HC، Su MH. برگشت توسط عصاره های آبی ازCistanche tubulosaاز نقایص رفتاری در مدل موش شبیه بیماری آلزایمر: ارتباط با رسوب آمیلوئید و عملکرد انتقال دهنده عصبی مرکزی BMC Complement Altern Med. 2014؛ 14:202.

12. جیانگ ای، تو پی اف. تجزیه و تحلیل ترکیبات شیمیایی در گونه Cistanche. JChromatogr A. 2009؛ 1216: 1970-9.

13. Morikawa T، Pan Y، Ninomiya K، Imura K، Matsuda H، Yoshikawa M، Yuan D، Muraoka O. الیگو گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی اسیله شده با فعالیت محافظ کبد از گیاه صحراCistanche tubulosa.Bioorg Med Chem. 2010; 18:1882-90.

14. Nan ZD، Zeng KW، Shi SP، Zhao MB، Jiang Y، Tu PF.گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدبا فعالیت ضد التهابی از ساقه‌های Cistanche deserticola کشت شده در کویر تاریم. Fitoterapia.2013؛ 89:167-74.

15. Deng M، Zhao J، Tu P، Jiang Y، Li Z، Wang Y. Echinacoside سلول های عصبی SHSY5Y را از TNF-القا می کند.آپوپتوز. Eur J Pharmacol. 2004؛ 505:11-8.

16. لی جی، لی جی، آیپایر آ، گائو ال، هوو اس، لو جی، ژانگ اف.گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیداز جانبCistanche tubulosaرشد سلولهای B{0}F10 را هم در شرایط in vitro و هم in vivo با القایآپوپتوزاز طریق یک مسیر وابسته به میتوکندری. جی سرطان. 2016؛ 7: 1877-87.

17. Shang HS، Chang CH، Chou YR، Yeh MY، Au MK، Lu HF، Chu YL، Chou HM، Chou HC، Shih YL، و همکاران. کورکومین باعث آسیب DNA می شود و بر بیان پروتئین مرتبط در سلول های سرطان دهانه رحم انسان HeLa تأثیر می گذارد. Oncol Rep. 2016؛ 36:2207–15.

18. وانگ آر، ژانگ کیو، پنگ ایکس، ژو سی، ژونگ وای، چن ایکس، کیو وای، جین ام، گونگ ام، کنگ دی. استلتین B باعث توقف G1 می شود،آپوپتوزو اتوفاژی در سلول‌های A549 سرطان ریه سلول غیر کوچک انسان از طریق مسدود کردن مسیر PI3K/Akt/mTOR. Sci Rep. 2016; 6:27071.

19. Sinha K، Das J، Pal PB، Sil PC. استرس اکسیداتیو: مسیرهای وابسته به میتوکندری و مستقل از میتوکندریآپوپتوز. Arch Toxicol. 2013; 87:1157-80.

20. Zhang YS، Shen Q، Li J. طب سنتی چینی که مکانیسم‌های آپوپتوز را برای درمان سرطان مری هدف قرار می‌دهد. Acta Pharmacol Sin. 2016; 37:295-302.

21. Chong ZZ، Lin SH، Li F، Maiese K. نیکوتین آمید مهارکننده sirtuin بقای سلول های عصبی را در طول آسیب حاد اکسیژن از طریق AKT، BAD، PARP و مسیرهای "ضد آپوپتوز" مرتبط با میتوکندری افزایش می دهد. Curr Neurovasc Res. 2005؛ 2:271-85.

22. Hu B, Wang SS, Du Q. طب سنتی چینی برای پیشگیری و درمان سرطان کبد: از نیمکت تا بالین. جهانی جی هپاتول. 2015؛ 7:1209-32.

23. Hu B, An HM, Wang SS, Chen JJ, Xu L. اثرات پیشگیرانه و درمانی ترکیبات گیاهی چینی در برابر کارسینوم سلولهای کبدی. مولکول ها. 2016؛ 21:142.

24. Xu H، Zhao X، Liu X، Xu P، Zhang K، Lin X. اثرات ضد توموری طب سنتی چینی که مسیر آپوپتوز سلولی را هدف قرار می دهد. Drug Des Devel Ther. 2015؛ 9:2735-44.

25. لی وبر ام. هدف گیریآپوپتوزمسیرهای سرطان توسط طب چینی سرطان لت. 2013؛ 332:304-12.

26. شو جی، شی ی.آپوپتوزمسیرهای سیگنالینگ و هموستاز لنفوسیتی Cell Res. 2007؛ 17:759-71.

27. Tait SW، Green DR. میتوکندری و مرگ سلولی: نفوذپذیری غشای خارجی و فراتر از آن Nat Rev Mol Cell Biol. 2010؛ 11:621-32.

28. Galluzzi L، Kepp O، Kroemer G. Mitochondria: تنظیم کننده های اصلی سیگنالینگ خطر. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012؛ 13:780-8.

29. Martinou JC, Youle RJ. میتوکندری درآپوپتوز: اعضای خانواده Bcl-2 و دینامیک میتوکندری. Dev Cell. 2011؛ ​​21:92-101.