هایپرگلیسمی باعث ایجاد ایمنی آموزش دیده در ماکروفاژها و پیش سازهای آنها می شود و آترواسکلروز را تقویت می کند.

زمینه:

با وجود درمان های کاهش دهنده گلوکز، خطر قلبی عروقی در دیابت همچنان بالاست. ما فرض کردیم که هیپرگلیسمی باعث ایجاد ایمنی تمرین‌شده در ماکروفاژها می‌شود و ویژگی‌های پیش‌آتروژنیک پایدار را ارتقا می‌دهد.

علاوه بر این، در انواع مختلف ادبیات نیز متوجه شدیم که گیاهی به نام سیستانچ در بهبود ایمنی تأثیر زیادی دارد. سیستانچ یک داروی سنتی چینی با طیف وسیعی از عملکردهای تنظیم کننده سیستم ایمنی است. انتشار عوامل، بهبود عملکرد اندام های ایمنی، و راه های دیگر برای تقویت ایمنی بدن انسان. بنابراین، در زندگی روزمره، افراد می توانند با مصرف متعادل گیاه گیاه سیستانچ دسرتیکولا، برای پیشگیری و درمان بیماری های مختلف، ایمنی خود را تقویت کنند.

روی محصول مکمل cistanche deserticola کلیک کنید

مواد و روش ها:

ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان از موش‌های کنترل و موش‌های مبتلا به دیابت در گلوکز فیزیولوژیکی (5 میلی‌مول در لیتر) رشد داده شدند و در معرض توالی‌یابی RNA (n=6)، سنجش توالی‌یابی کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز قرار گرفتند (n{2}}) و تعیین توالی ایمونوپسیتاسیون کروماتین (n=6) برای تعیین ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی. پیوند مغز استخوان از موش‌های مبتلا به (n=9) یا بدون (n=6) دیابت به موش‌های Ldlr −/− (نورموگلیسمی) برای ارزیابی اهمیت عملکردی آن در داخل بدن استفاده شد. شواهد ایمنی آموزش‌دیده ناشی از هیپرگلیسمی در سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان از بیماران مبتلا به دیابت (n=8) ​​در مقایسه با افراد کنترل (n=16) و در ماکروفاژهای پلاک آترواسکلروتیک انسانی برداشته‌شده توسط میکرودیزکسیون لیزری جستجو شد. .

نتایج:

در ماکروفاژها، گلوکز خارج سلولی بالا بیان ژن پیش التهابی و ویژگی های عملکردی پرواتروژنیک را از طریق مکانیسم های وابسته به گلیکولیز افزایش داد. ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان از موش های دیابتی این ویژگی ها را حفظ کردند، حتی زمانی که در گلوکز فیزیولوژیکی کشت شدند، که نشان دهنده ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی است. پیوند مغز استخوان از موش‌های دیابتی به موش‌های Ldlr −/− (نورموگلیسمی) باعث افزایش آترواسکلروز ریشه آئورت شد و یک شکل پایدار و مرتبط با بیماری از ایمنی ذاتی آموزش‌دیده را تایید کرد. سنجش یکپارچه برای کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز، ایمونوفراسپیتاسیون کروماتین و تجزیه و تحلیل توالی RNA سلول های بنیادی خونساز و ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان یک اثر آغازگر پیش التهابی را در دیابت نشان داد. الگوی کروماتین باز عامل رونویسی فاکتور 1 مربوط به Runt (Runx1). به طور مشابه، رونوشت‌های ماکروفاژهای پلاک آترواسکلروتیک و لکوسیت‌های محیطی در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 برای اهداف Runx1، مطابق با نقش بالقوه در بیماری‌های انسانی، غنی شدند. مهار دارویی Runx1 در شرایط آزمایشگاهی فنوتیپ آموزش دیده را مهار کرد.

نتیجه گیری:

ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی ممکن است توضیح دهد که چرا هدف قرار دادن گلوکز بالا در کاهش خطر ماکرو عروقی در دیابت بی اثر است و اهداف جدیدی را برای پیشگیری و درمان بیماری پیشنهاد می کند.

کلید واژه ها:

دیابت شیرین ◼ اپی ژنتیک ◼ گلوکز ◼ التهاب ◼ ماکروفاژها

دیابت با خطر بالای آترواسکلروز و عوارض آن، از جمله انفارکتوس میوکارد همراه است. هیپرگلیسمی یک ویژگی اصلی در دیابت نوع 1 و نوع 2 است و درمان ها عمدتاً بر کاهش گلوکز خون متمرکز شده اند. درمان فشرده کاهنده گلوکز در کاهش خطر عروقی در بیماران مبتلا به دیابت نوع 1 موثر است، اما اثر آن برای چندین سال به تعویق افتاد2 و به طور موقت از کنترل گلوکز خون قطع می شود. یک اثر متوسط ​​بر پیامدهای عروقی مرتبط با آترواسکلروز مانند انفارکتوس حاد میوکارد. 4-6 خطر مداوم عوارض قلبی عروقی، حتی پس از کاهش گلوکز، اثر میراث یا حافظه متابولیک نامیده می‌شود، اما مکانیسم‌های اساسی مبهم باقی می‌مانند.

آترواسکلروز یک بیماری التهابی مزمن است که با رسوب و حفظ لیپوپروتئین های اصلاح شده و تجمع سلول های ایمنی در دیواره شریان های بزرگ مشخص می شود. ماکروفاژها در تمام مراحل آترواسکلروز کلیدی هستند و به طور گسترده به عنوان اهداف درمانی در نظر گرفته می شوند. ماکروفاژها در پاسخ به لیپوپلی ساکارید لیگاند گیرنده شبه Toll (LPS) و اینترفرون (IFN) یا ترمیمی بافتی (M2)، به عنوان مثال، در پاسخ به اینترلوکین (IL) به فنوتیپ های متضاد، یعنی پیش التهابی (M1) تقسیم شده اند. )-4، اگرچه در داخل بدن دامنه عملکردی آنها بدون شک پیچیده تر است.

هیپرگلیسمی پیشرفت آترواسکلروز را تشدید می کند و رگرسیون پلاک را به تاخیر می اندازد، 10 با افزایش بیان ژن های پیش التهابی و مقاومت در برابر القای بیان ژن مرتبط با M{{1}. محرک های درونی و محیطی، که به نوبه خود، به طور قابل توجهی بر عملکرد مرتبط با ایمنی و بیان ژن تأثیر می گذارند.12 در پاسخ به IL{7}}، ماکروفاژهای M2 در درجه اول اسیدهای چرب را متابولیزه می کنند و به فسفوریلاسیون اکسیداتیو متکی هستند.13 در مقابل، ماکروفاژهای M1 به گلوکز و تغییر به گلیکولیز هوازی، مشابه اثر واربورگ در سرطان نیاز دارند. این تغییرات متابولیک در نتیجه تحریک سیتوکین رخ می دهد، اما می تواند عملکرد ماکروفاژها را نیز تعیین کند. از جمله گلیکولیز هوازی یا فعال شدن مسیر موالونات، 17،18 حافظه سلولی ذاتی ایمنی درازمدت (به نام ایمنی آموزش دیده) را از طریق تغییرات اپی ژنتیکی و تغییرات ساختار کروماتین القا می کند.19 تداوم طولانی مدت مونوسیت های آموزش دیده در گردش توسط برنامه ریزی مجدد ایجاد می شود. از پیش سازهای مغز استخوان (BM) آنها.20

ما فرض کردیم که ایمنی آموزش دیده در پاسخ به گلوکز بالا، حافظه هیپرگلیسمی دیابتی را در مورد آترواسکلروز به حساب می آورد. بر این اساس، ما به دنبال تعیین اینکه آیا تغییرات مرتبط با بیماری ناشی از هیپرگلیسمی در عملکرد مونوسیت و ماکروفاژ وجود دارد یا خیر و آیا این تغییرات پس از بازیابی گلوکز طبیعی ادامه می‌یابد، که دلالت بر برنامه‌ریزی مجدد اساسی دارد، بودیم. ما مطالعات مربوط به عملکرد سلولی، متابولومیک، ترانس کریپتومیکس و اپی ژنومیک را ترکیب کردیم تا مشخص کنیم که چگونه هیپرگلیسمی متابولیسم را تغییر می دهد تا فعال سازی طولانی مدت را از طریق تغییرات اپی ژنتیکی تعدیل کند. ما بررسی کردیم که چگونه این تغییرات ممکن است در سطح سلول های بنیادی خونساز (HSC) و در ماکروفاژهای تمایز یافته رخ دهد. اهمیت عملکردی از طریق پیوند BM در مدل موش آترواسکلروز آزمایش می‌شود، و یافته‌ها با بازجویی از ماکروفاژهای استخراج‌شده از خون محیطی انسان و پلاک‌های آترواسکلروتیک توسط میکرودیسکشن با لیزر (LCM) تأیید می‌شوند. یافته های ما ممکن است مقاومت عوارض ماکرو عروقی دیابت را به درمان های مرسوم کاهش دهنده گلوکز توضیح دهد.

مواد و روش ها

منابع داده

داده های تولید شده در این مطالعه در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ژن بیان شده است و از طریق شماره دسترسی GSE176068 قابل دسترسی است.

حیوانات

Murine BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) in vivo facility by the Institutional Animal Care and Use Committee regulations (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care accredited facility, project reference 70195 IVAT). All other animal protocols were conducted by the UK Home Office under the guidance of the operation of the Animals (Scientific Procedures) Act 1986, complying with all ethical regulations and the institutional review board guidelines (project license 30/3374; January 27, 2016). Wild-type C57BL/6J (12–14 weeks old) were randomly assigned to control or diabetic experimental groups. Diabetes was induced through an intraperitoneal injection of streptozotocin at a low dose range (42–45 mg·kg−1·/d−1) over 5 consecutive days. After 6 weeks after the final streptozotocin injection, diabetic mice with nonfasted blood glucose levels >13.9 mmol/L معدوم شد و بافت جمع آوری شد.

خطوط سلولی

تمام رده های سلولی در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 رشد کردند. سلول های L929 در محیط موسسه یادبود پارک رازول که حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS)، 2 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین و 2 میلی مول در لیتر گلوتامین بود، رشد کردند. سلول‌های L929 به مدت 7 تا 8 روز تا محل تلاقی کامل رشد داده شدند و محیط‌های شرطی‌شده برداشته شدند، به قسمت‌هایی تقسیم شدند و در دمای 20- درجه تا زمانی که مورد نیاز بود ذخیره شدند. سلول های اندوتلیال موش مشتق شده از پوست در 25 میلی مول در لیتر گلوکز DMEM با 10 درصد FBS، 2 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین و 2 میلی مول در لیتر گلوتامین کشت داده شدند.

ماکروفاژهای مشتق از BM

ماکروفاژهای مشتق شده از BM (BMDMs) مورد استفاده در این مطالعه با شستشوی BM از استخوان ران و استخوان درشت نی موش و آبکاری روی ظروف پتری بدون کشت بافت در DMEM گلوکز کامل 5 میلی مول در لیتر (مکمل با 10 درصد FBS، 2 درصد پنی سیلین) تولید شدند. - استرپتومایسین و 2 میلی مول در لیتر گلوتامین) به اضافه 20 درصد محیط کشت سلولی L929 برای تمایز. پس از تمایز به مدت 7 روز، BMDM ها به طور مثبت انتخاب شدند، با تراکم 2×105 سلول در میلی لیتر کشت شدند و در DMEM گلوکز کامل 5 میلی مول در لیتر (مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد) با 10 نانوگرم در میلی لیتر اینترفرون موشی نوترکیب (IFN) تحریک شدند. - ؛ R&D Systems، UK) به اضافه 100 نانوگرم در میلی لیتر LPS (Sigma-Aldrich، UK)، 10 نانوگرم در میلی لیتر موش نوترکیب IL{18}} (سیستم های تحقیق و توسعه، انگلستان)، یا کنترل فقط رسانه ای به مدت 16 ساعت قبل از استفاده . BMDMها همچنین به طور همزمان در شرایط مختلف گلیسمی (5 میلی مول در لیتر DMEM گلوکز با افزودن گلوکز برای ایجاد غلظت نهایی 11 یا 20 میلی مول در لیتر گلوکز) یا یک شرایط کنترل اسمزی (مانیتول؛ 5 میلی مول در لیتر گلوکز DMEM) کشت داده شدند. به علاوه 15 میلی مول در لیتر مانیتول). مطالعات متابولیک در غیاب یا حضور 10 میلی مول در لیتر دی کلرواستات (سیگما آلدریچ، انگلستان) یا 1 میلی مول در لیتر 2-دئوکسی دی گلوکز (سیگما آلدریچ، انگلستان) انجام شد.

جداسازی HSC

HSC ها با کیت تخلیه خونساز ماوس MagniSort (ThermoFisher Scientific، UK) با شستشوی BM از استخوان ران و استخوان درشت نی موش و انکوباسیون با نشانگرهایی برای حذف سلول های متعهد به اصل و نسب (CD3، CD4، B220، Ter119، و Gr1) جدا شدند. HSC ها HSC ها در لوله های مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس 5 میلی لیتری در DMEM کامل 5 میلی مول در لیتر (یا 20 میلی مول در لیتر گلوکز یا مانیتول برای تحریکات نوع وحشی مشخص) با افزودن 100 نانوگرم در میلی لیتر LPS به اضافه 10 نانوگرم در میلی لیتر IFN کشت داده شدند. - یا 10 نانوگرم بر میلی‌لیتر موش نوترکیب IL{15}} (R&D Systems، UK) به مدت 16 ساعت برای تجزیه و تحلیل وسترن بلات یا 2 ساعت برای سنجش برای تجزیه و تحلیل توالی کروماتین قابل دسترسی ترانسپوزاز (ATAC-seq).

مدل حافظه داخلی BMDM In Vitro

BM موش به BMDM ها همانطور که در بالا توضیح داده شد در 5 یا 2{12}} میلی مول در لیتر گلوکز به مدت 1، 2، 4 یا 7 روز تمایز یافت. BMDM ها از طریق چسبندگی به طور مثبت انتخاب شدند، مجدداً در DMEM 5 mmol/L کامل قرار داده شدند و به مدت 48 ساعت در انکوبه قرار گرفتند تا یک دوره نرمال سازی گلوکز فراهم شود. سپس BMDM ها برای استفاده با 1{14} ng/mL IFN- به اضافه 100 نانوگرم در میلی لیتر LPS یا محیط کنترل به مدت 16 ساعت در غیاب یا حضور 0.25، 0.5، 1، 5 یا 10 میکرومول در لیتر Ro تحریک شدند. 5-3335 (Merck Millipore، UK) قبل از استفاده برای تجزیه و تحلیل بیان ژن.

جداسازی مونوسیت موش

مونوسیت های موش از خون محیطی با کیت جداسازی مونوسیت موش EasySep (Stemcell Technologies، کانادا) طبق پروتکل سازنده جدا شد. سلول ها بلافاصله برای سنجش چسبندگی استاتیک استفاده شدند.

کیت سنجش نرخ ATP در زمان واقعی Seahorse XFe 96

آنالیز شار خارج سلولی با کیت سنجش سرعت ATP XFp RealTime بر روی BMDMها (8×1{7}}4 سلول در هر چاه؛ 5 چاهک تکراری در هر حیوان و شرایط)، طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. سه اندازه گیری میزان مصرف اکسیژن پایه و سرعت اسیدی شدن خارج سلولی قبل از تزریق غلظت های مختلف گلوکز (5 یا 2 0 mmol/L) یا کنترل (مانیتول، پورت تزریق A) انجام شد. پس از 7 اندازه‌گیری دیگر، ترکیبات الیگومایسین (2 میکرومول در لیتر؛ پورت تزریق B) و آنتی‌مایسین A (0.5 میکرومول در لیتر) و روتنون (0.5 µmol/L؛ پورت تزریق C)، از سنجش میزان ATP Real-Time XFp کیت، به طور متوالی با 3 اندازه گیری بعدی تزریق شد. مقدار ATP تولید شده توسط گلیکولیز و شاخص نرخ ATP (میزان تولید mitoATP / نرخ تولید ATP گلیکولیتیک) به طور خودکار با Wave (نسخه 2.6، Agilent) محاسبه شد.

سنجش چسبندگی استاتیک

سلول‌های اندوتلیال موش مشتق از پوست به منظور تلاقی روی ورقه‌های شیشه‌ای در 12-شاخه‌های چاهی رشد کردند و توسط فاکتور نکروز تومور موش نوترکیب 10 نانوگرم در میلی‌لیتر (R&D Systems، UK) به مدت 16 ساعت فعال شدند. مونوسیت‌های خون محیطی تحریک‌نشده یا تحریک‌نشده با IFN به علاوه LPS (یا BMDM‌های موش‌های دیابتی استرپتوزوتوسین که در 5 میلی‌مول در لیتر گلوکز کشت شده‌اند) با کیت پیوند سلولی فلورسنت PKH67 (سیگما-آلدریچ، دستورالعمل‌های سازنده بریتانیا) به رنگ سبز برچسب‌گذاری شدند. سلول‌های نشاندار شده به سلول‌های اندوتلیال با تراکم 104×5 در هر لایه پوششی به مدت 1 ساعت قبل از حذف محیط و سلول‌های غیر متصل، شسته شده با سالین بافر فسفات (PBS) و تثبیت در پارافورمالدئید 4 درصد اضافه شدند. چهار تصویر در هر جلد به دست آمد. تعداد سلول های چسبیده و نشاندار شده شمارش شد. و تصاویر به ازای هر برگه به ​​طور متوسط ​​محاسبه شد. روشنایی تصاویر نمایش داده شده به همان اندازه روی ImageJ تنظیم شده است.

سنجش فوم سل

BMDM های تحریک نشده یا تحریک نشده (LPS به اضافه IFN-) روی ورقه های شیشه ای در 12-صفحات چاهی رشد داده شدند و با 25 میکروگرم بر میلی لیتر لیپوپروتئین با چگالی کم DiI-استیله (LDL؛ Bioquote، US) به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. محیط کشت و باقیمانده LDL استیله شده با DiI حذف شد و سلول ها 3 بار با PBS شسته و در 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شدند. لیپید با Oil Red O رنگ‌آمیزی شد و روکش‌ها با DAPI نصب شدند. تصاویر کنتراست فاز از رنگ‌آمیزی Oil Red O و تصاویر فلورسنت از هسته‌ها (4 تصویر در هر روکش) گرفته شد و به ترتیب برای تعیین مقدار چربی یا تعداد سلول‌ها با نرم‌افزار ImageJ استفاده شد. سپس سطح لیپید در هر تصویر به تعداد سلول‌ها در هر تصویر نرمال شد و نتایج به صورت تغییر برابر بیش از 5 میلی‌مول در لیتر نمونه‌های کنترل گلوکز (برای آزمایش‌های گلوکز BMDM) و نمونه‌های کنترل (برای آزمایش‌های BMDM دیابتی) بیان می‌شوند. روشنایی تصاویر نمایش داده شده به طور یکنواخت تنظیم شده است.

آزمایش پیوند BM دیابتی

BM transplantation experiments were performed at The Jackson Laboratory. Diabetes was induced in CD68–green fluorescent protein (GFP) transgenic mice as previously described for 4 weeks. Diabetic CD68-GFP mice with nonfasted blood glucose levels >13.9 mmol/L و موش های کنترل CD{2}GFP هم سن به عنوان اهداکنندگان BM مورد استفاده قرار گرفتند. BM از موش‌های اهداکننده جمع‌آوری شد، و 5×106 سلول زنده به‌صورت داخل وریدی به موش‌های LdLr-/- گیرنده B6.129S{9}} Ldlr-tm1Her/J تحت تابش کشنده (2×500 راد) تزریق شد. ). پس از پیوند، همه حیوانات دریافت‌کننده به مدت 12 هفته تحت یک رژیم غذایی غربی قرار گرفتند (رژیم‌های منبع باز D12079B؛ 1 درصد چربی، 40 درصد کیلو کالری). خون کامل در هفته های 4، 8 و 12 پس از پیوند برای آنالیز فلوسایتومتری سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) و برای نظارت بر سطوح پیوند و ارزیابی تعداد جمعیت لکوسیت جمع آوری شد. پیوند، هر 4 هفته پس از پیوند ارزیابی شد، با رنگ‌آمیزی سلول‌ها با antiCD45 و ارزیابی نسبت نسبی CD45 به علاوه سلول‌های GFP به علاوه در میان کل جمعیت CD45 به علاوه بررسی شد. در 12 هفته، موش‌ها معدوم شدند، خون کامل جمع‌آوری شد و سرم‌ها برای اندازه‌گیری تری گلیسیرید، اسیدهای چرب غیر استریفیه، LDL و کلسترول لیپوپروتئین با چگالی بالا پردازش شدند. موش ها با PBS پرفیوژن شدند و به دنبال آن پرفیوژن و تثبیت با 4 درصد پارافورمالدئید در طول شب انجام شد. قلب و آئورت تشریح شد و تا زمان پردازش در اتانول 70 درصد قرار گرفت.

آنالیز پلاک ریشه آئورت و ایمونوفلورسانس

برای تعیین کمیت بار پلاک، ریشه‌های آئورت تثبیت شده با پارافورمالدئید در محیط برش بهینه قرار داده شدند و بر روی صفحه‌ای موازی با دهلیزها برش داده شدند. برای تعیین کمیت حجم پلاک، محتوای لیپید پلاک، 21 و محتوای کلاژن، 5 بخش، که به طور مساوی در ریشه آئورت توزیع شده بودند، رنگ آمیزی تری کروم ماسون-گلدنر (Merck، UK) شدند. به طور خلاصه، مقاطع در محلول Bouin در دمای اتاق به مدت 1 ساعت تثبیت شدند، به مدت 5 دقیقه در آب جاری شسته شدند و سپس از طریق پروتکل کیت رنگ‌آمیزی Masson-Goldner از انکوباسیون 7{11}} درصدی اتانول دوم مطابق با دستورالعمل سازنده قرار گرفتند. زمان بندی پروتکل سپس اسلایدهای خیس زایلن با Neo-Mount سوار شدند و با شیشه پوشش مهر و موم شدند. مشخصات پلاک بر روی نرم افزار Image Pro Plus نسخه 6.0 (Media Cybernetics، Silverspring، MD) اندازه گیری شد و داده ها به عنوان میانگین همه بخش ها نمایش داده شد.

سپس ایمونوفلورسانس بر روی 6 بخش مجاور انجام شد. مقاطع برای محتوای ماکروفاژها با GFP (خرگوش anti-GFP، A6455، Invitrogen) یا نشانگر ماکروفاژ galectin{3}} (بز anti-galectin 3، AF1197، R&D Systems)، برای محتوای سلول های عضله صاف با -اکتین رنگ آمیزی شدند. اکتین ضد عضله صاف خرگوش، ab32575، Abcam PLC)، و برای علائم اپی ژنتیکی H3K4me3 (پلی کلونال خرگوش به هیستون H3 [تری متیل K4]، Ab8580، Abcam PLC) و H3K27ac (پلی کلونال خرگوش به هیستون H3 [استیل K27]، Abcam PLC). برای رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس، بخش ها با PBS به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق هیدراته شدند و به مدت 1 ساعت با بافر مسدود کننده DAKO (Agilent، UK) مسدود شدند. آنتی بادی اولیه تا 1 میکروگرم در میلی لیتر در DAKO رقیق شد و یک شبه در دمای 4 درجه به بخش ها اضافه شد. آنتی بادی های ثانویه 1:200 در DAKO رقیق شدند و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق اضافه شدند (ضد خرگوش خر [A488]، A21206، Life Technologies؛ ضد بز خر [A594]، A11058، ThermoFisher Scientific). برش‌ها در نهایت DAPI مونتاژ شدند (محیط نصب گلیسرول با DAPI و DABCO، Abcam، UK). تصاویر فلورسنت با نرم افزار Image J آنالیز شدند.

بیان ژن

RNA کل با کیت RNeasy Plus Mini (Qiagen، UK) جدا شد و با اسپکتروفتومتر مرئی UV Nanodrop 2{2}}00 اندازه‌گیری شد. سنتز cDNA با 0.2 تا 2 میکروگرم RNA در یک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با کیت رونویسی معکوس QuantiTect (Qiagen، UK)، طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. PCR کمی بلادرنگ بر روی cDNA 5 نانوگرم بر میکرولیتر با پروب های Taqman مخصوص B2m (Mm00437762)، Il{9}} (Mm00446190)، Il{11}} (Mm00462531_ m1)، iNos انجام شد. (Mm00440502)، Ym1 (Mm00657009)، و Fizz1 (Mm00556208). PCR کمی با TaqMan universal master mix II با UNG روی سیستم PCR Real-Time QuantStudioTM 7 Flex (ThermoFisher) انجام شد. تمام داده‌های PCR به بیان ژن داخلی خانه‌دار (B2m) نرمال‌سازی شدند و با روش 2-ΔCT برای محاسبه بیان mRNA نسبی آنالیز شدند.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول ها در PBS سرد یخی شسته شدند و در بافر لیز سنجش رادیو ایمونوپسیتاسیون (15{3}} mmol/L NaCl، 1.{5}} درصد IGEPAL CA{4}}، 0.5) لیز شدند. درصد سدیم دئوکسی کولات، 0.1 درصد SDS، 50 میلی مول در لیتر تریس، pH 8.0) همراه با مهارکننده های پروتئاز و فسفاتاز. غلظت پروتئین با استفاده از روش بیسینکونیک اسید (Pierce BCA Protein Assay Kit، ThermoFisher Scientific، UK) طبق دستورالعمل های سنجش تعیین شد. غلظت های مساوی از پروتئین بارگیری شد و روی ژل SDS-PAGE (4 تا 12 درصد Bis-Tris Gel، Life Technologies، UK) برای جداسازی اجرا شد. پروتئین ها بر روی یک غشای نیتروسلولز (Bio-Rad، UK) منتقل شدند و با آنتی بادی های خاص همانطور که با -اکتین نشان داده شد (آنتی{18}}اکتین موش [15G5A11/E2]، Invitrogen) به عنوان نگهبان خانه و کنترل بارگیری شدند. غشاها (SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate، Thermo Scientific، UK) ساخته شدند و با نورتابی شیمیایی در ایستگاه تصویر Biorad شناسایی شدند.

نمونه های انسانی و جداسازی LCM ماکروفاژهای پلاک

تمام تحقیقات بالینی توسط اعلامیه هلسینکی انجام شد و نمونه ها تحت قانون بافت انسانی بریتانیا (2004) ذخیره شدند. این مطالعه توسط هیئت بررسی اخلاق مربوطه تایید شد و همه افراد رضایت آگاهانه کتبی ارائه کردند. بیمارانی که منتظر اندارترکتومی کاروتید بودند، انتخاب شدند و پلاک‌های کاروتید به‌تازگی در زمان جراحی جمع‌آوری شدند (ویژگی‌های بیمار در فایل اکسل I در ضمیمه داده خلاصه شده است). پلاک های کاروتید کاشته شده در PBS استریل سرد یخ شسته شدند، در محیط برش بهینه منجمد شدند و در دمای 80- درجه نگهداری شدند تا پردازش شوند.

LCM با یک سیستم PALM Microbeam LCM (Carl Zeiss GmbH، آلمان) با استفاده از رویکرد "اسلاید راهنما" اقتباس شده انجام شد. 22،23 نمونه پلاک کاروتید تازه در 15 میکرومتر برش داده شدند. اسلایدهای راهنما شامل 3 بخش متوالی بودند: بخش اول با پروتکل کیت رنگ‌آمیزی Masson-Goldner برای کمک به تعیین مکان‌های میکروآناتومیک رنگ‌آمیزی شد و 2 قسمت بعدی برای هر یک از ماکروفاژها رنگ‌آمیزی شد (موش ضد انسان CD68 [کلون KP{7}). }]، داکو، کمبریج انگلستان) یا سلول های عضلانی صاف (اکتین آنتی انسانی موش [کلون 1A4]، داکو، کمبریج انگلستان). بخش‌های بعدی (تا 15) بر روی لام‌های غشایی LCM (ThermoFisher Scientific، UK) و رنگ‌آمیزی کرسیل بنفش آماده برای پردازش فوری برش داده شدند. خوشه های سلولی ماکروفاژ به صورت دستی بر اساس رنگ آمیزی اسلاید راهنما با استفاده از نرم افزار PALM RoboSoftware (نسخه 4.5، Carl Zeiss GmbH، آلمان) شناسایی شدند. مجموع منطقه مورد نظر بین 3 و 5×106 میکرومتر مربع بر روی یک کلاهک چسبی Zeiss PALM (Carl Zeiss GmbH، آلمان) با لیزر گرفته شد. طبق پروتکل سازنده، سلول‌ها بلافاصله لیز شدند، روی یخ خشک منجمد شدند و در دمای 80- درجه نگهداری شدند تا RNA با میکرو کیت RNEasy (Qiagen، انگلستان) استخراج شود.

ریزآرایه ماکروفاژ پلاک انسانی

Isolated plaque macrophage RNA concentration was determined with the Agilent RNA 6000 Pico LabChip on the Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, US). Samples with an RNA integrity number >5 مورد به تقویت RNA، بیوتینیلاسیون، و تجزیه و تحلیل ریزآرایه بیان ژن منتقل شدند. این نمونه ها برای پردازش بیشتر به خدمات ژنومیک کمبریج (دپارتمان آسیب شناسی، دانشگاه کمبریج، انگلستان) ارسال شدند. تقویت و بیوتینیلاسیون با کیت Ovation Pico WTA V2 (Nugen Technologies Inc، ایالات متحده) انجام شد و سپس هیبریداسیون به ترتیب تصادفی روی 2 Illumina Human HT12 v4 انجام شد.{5}} BeadChips (Illumina، ایالات متحده) برای به حداقل رساندن دسته ای. / تنوع تراشه. Illumina BeadArrays با بسته آرایه مهره Bioconductor (نسخه 2.24.{8}}) ​​24،25 با استفاده از نرمال سازی نمایی عادی پردازش شد. مجموعه‌های کاوشگر در هر ژن بر اساس حداکثر محدوده بین چارکی جمع شدند تا از مقادیر شدید اجتناب شود اما تنوع در تمام نمونه‌ها ثبت شود. مجموعه پروب های بدون حاشیه و کنترل از تجزیه و تحلیل بیشتر حذف شدند. بیان دیفرانسیل (DE) لیست نهایی 21036 ژن با بسته Bioconductor limma (نسخه 3.30.13)26 برای مقایسه دیابت با کنترل، تنظیم برای وضعیت علامت دار/بدون علامت ارزیابی شد. با توجه به در دسترس بودن مجموعه داده های متعامد و 8 نمونه در هر گروه، ما از مقدار نسبتاً ملایم تنظیم شده P استفاده کردیم.<0.2 with no fold change cutoff to select genes to pursue.

جداسازی مونوسیت انسانی

خون وریدی محیطی (15 تا 20 میلی‌لیتر) از اهداکنندگان سالم در لوله‌های پوشش‌داده‌شده با K{2}}EDTA (BD Vacutainer، نیوجرسی) گرفته شد و ظرف 1 ساعت پردازش شد. پلاسما و بخش غنی شده با سلول های تک هسته ای با سانتریفیوژ کردن خون کامل بر روی ستون های Accuspin Histopaque{4} (سیگما-آلدریچ، ایالات متحده) طبق دستورالعمل سازنده به دست آمد. بخش غنی‌شده با سلول‌های تک هسته‌ای برای جداسازی مونوسیت با کیت جداسازی مهره‌های انتخابی منفی (کیت غنی‌سازی مونوسیت انسانی EasySep بدون تخلیه CD16، StemCell Technologies، کانادا)، به دنبال پروتکل توصیف‌شده سازنده، به جلو برده شد.

جداسازی و تحریک سلول های تک هسته ای خون محیطی انسان

بیماران مبتلا به دیابت و بیماران کنترل پس از تأیید اخلاقی محلی و منطقه‌ای در مؤسسه کارولینسکا، استکهلم (2011/{1}}/1 و 2009/{4}}/1) برای مطالعات بالینی انتخاب شدند. PBMC ها از نمونه های خون محیطی جمع آوری شده پس از ناشتا بودن یک شبه با SepMate (StemCell Technologies) و Lymphoprep (StemCell Technologies) طبق دستورالعمل سازنده جدا شدند. PBMC های جدا شده منجمد شده و در 90 درصد FBS و 10 درصد دی متیل سولفوکساید نگهداری شدند.

PBMC های ذخیره شده ذوب شده و در PBS با سانتریفیوژ (500 گرم به مدت 10 دقیقه) شسته شدند، سلول های زنده شمارش و در چاهک های جداگانه یک صفحه کشت بافت چاهی در DMEM فیزیولوژیکی (کم) گلوکز، 10 درصد FBS، 2 قرار گرفتند. mmol/L L-گلوتامین و 1 درصد پنی سیلین و استرپتومایسین. PBMC ها یک شب استراحت کردند و با وسیله نقلیه PBS یا 100 نانوگرم در میلی لیتر LPS و 10 نانوگرم در میلی لیتر IFN- نوترکیب (R&D Systems) به مدت 6 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از تحریک، PBMC ها در RLT (QIAGEN) لیز شدند، به صورت ناگهانی منجمد شدند و در دمای 80- درجه نگهداری شدند. همانطور که توضیح داده شد RNA جدا شد و تحت تعیین توالی RNA (RNAseq) قرار گرفت.

متابولومیک و اندازه گیری متابولیت

مونوسیت های انسانی جدا شده با تراکم 3.5×1{17}}5 سلول در هر نمونه در DMEM گلوکز کامل 5 میلی مول در لیتر کشت داده شدند، محیطی که با گلوکز تکمیل شده بود تا غلظت نهایی 20 میلی مول در لیتر گلوکز ایجاد شود. یا محیطی با مانیتول 15 میلی مول در لیتر در لوله های مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس 5 میلی لیتری به مدت 12 ساعت. لیزات سلولی با استخراج با متانول سرد به مدت 20 دقیقه روی یخ خشک تهیه و در نیتروژن مایع منجمد شدند. در روز تجزیه و تحلیل، نمونه‌ها گرداب شدند و سپس در دمای 10 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند. یک نمونه کنترل کیفیت تلفیقی با مخلوط کردن 60 میکرولیتر هر عصاره نمونه تهیه شد و به صورت دوره ای در طول اجرای کلی تحلیلی برای تایید عملکرد روش تجزیه و تحلیل شد. نمونه‌ها با یک فیلتر سانتریفیوژ 0.{18}}µm Ultrafree-MC (5000 گرم، 3 دقیقه) فیلتر شدند و سپس به ویال‌های کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی منتقل شدند. آنالیزهای متابولومیک غیرهدفمند همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. به طور خلاصه، نمونه‌ها بر روی کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق‌العاده Thermo Ultimate 3000 همراه با یک Orbitrap Q-Exactive با استفاده از سوئیچینگ قطبی (مثبت - منفی) که با قدرت تفکیک جرمی 7000 کار می‌کند، تجزیه و تحلیل شدند. عرض کامل در نصف حداکثر. ترکیبات آب دوست با استفاده از ستون Thermo Accucore aQ RP C18 (150×2.1 mm, 2) بر روی ستون Merck Sequant ZIC-HILIC (150×4.6 mm, 5-μm particle size) و ترکیبات آبگریز از نظر کروماتوگرافی جدا شدند.{38 }} اندازه ذرات میکرومتر). متابولیت ها با استفاده از یک پایگاه داده داخلی شناسایی شدند. 27 غنی سازی مجموعه متابولیت و آنالیز مسیر متابولیک بر روی تمام اندازه گیری های متابولیت با استفاده از MetaboAnalyst (نسخه 4.0) انجام شد.

برای اندازه‌گیری متابولیت BMDM و HSC، سلول‌ها همانطور که قبلاً توضیح داده شد با تراکم 5×105 در هر چاهک کشت داده شدند و رویی کشت روی ABX Pentra 400 (Horiba) اجرا شد تا گلوکز اندازه‌گیری شود (ABX Pentra Glucose PAP CP, Horiba, UK) و سطوح لاکتات (ABX Pentra Lactic Acid). اندازه‌گیری‌ها به غلظت‌های گلوکز و لاکتات موجود در محیط کشت کامل سلولی کنترل که در شرایط مشابه اما نه در حضور سلول‌ها انکوبه شده بودند، نرمال شد. لیزهای سلولی BMDM برای اندازه گیری سطوح سوکسینات (Succinate Assay Kit، Abcam، UK) طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد.

تجزیه و تحلیل ATAC-seq

Control or diabetic isolated HSCs or BMDMs, unstimulated or stimulated with IL-1β or LPS+IFN-γ for 2 hours, respectively, in 5 mmol/L glucose DMEM were used for ATAC-seq analysis according to a previously described protocol.28 Briefly, nuclei from 50000 HSCs or 75000 BMDMs per replicate were isolated, lysed on ice, and immediately put through transposition reaction using Tn5 transposase and TD buffer (Illumina, US) for 30 minutes at 37°C. Library amplification (NEBNext High Fidelity 2× PCR master mix, New England Biolabs, US) was followed by SPRI size selection to exclude fragments >1200 جفت باز غلظت DNA با فلوئورومتر کیوبیت (Life Technologies) اندازه‌گیری شد و توزیع اندازه کتابخانه با تراشه حساسیت بالای DNA Bioanalyser (Agilent، UK) ارزیابی شد. تقویت کتابخانه با پرایمرهای سفارشی Nextera انجام شد. 28 کتابخانه ها توسط مرکز توالی پزشکی زیستی در CeMM با استفاده از پلتفرم Illumina HiSeq 3000/4000 و پیکربندی 50-bp تک خواندنی توالی یابی شدند.

خواندن برای کیفیت کنترل شد و از آداپتورهای باقی مانده حذف شد. سپس خوانده‌ها با ژنوم موش (Mm10) با Bowtie (نسخه 2.2.6) در حالت "محلی حساس" تراز شدند. قرائت های تراز شده برای حذف موارد با کیفیت پایین (کیفیت نگاشت کمتر یا مساوی 10) یا نگاشت خواندن به دنباله های میتوکندری فیلتر شدند. موقعیت های شروع تراز به شیوه ای آگاه از رشته (4 جفت باز، 5-5 جفت باز، 28) قبل از اوج فراخوانی با MACS2 (نسخه 2.1.129) جابه جا شدند. نواحی محدود شده متفاوت با DiffBind (نسخه 2.4.830) با مرکز اوج (قله=100) و edgeR.31 شناسایی شدند.

سپس آنالیز مسیر بر روی پیک‌های غنی‌شده در نمونه‌های دیابتی انجام شد (نرخ کشف نادرست [FDR] کمتر یا برابر با {{0}}.1) با وارد کردن مکان اوج کروموزوم در ابزار غنی‌سازی مناطق ژنومی از حاشیه‌نویسی. نسخه 3.0).32 نواحی اوج دیفرانسیل سپس با رسوب ایمنی MEME-کروماتین (ChIP; نسخه 4.12.0)، 33 تجزیه و تحلیل شدند که تجزیه و تحلیل جامع موتیف را برای شناسایی هر گونه نقوش اتصال شناخته شده یا ناشناخته ای که غنی شده (غنی شده) انجام می دهد. نقوش E<0.05; minimum width, 6; minimum number of sites, 3).

شناسایی هدف فاکتور 1 رونویسی مرتبط با اجرا

MEME-ChIP نواحی ATAC-seq فاکتور رونویسی مربوط به Runt 1 (RUNX1) را به عنوان یک تنظیم کننده بالقوه در هر دو IL-1 و HSCهای دیابتی تحریک نشده شناسایی کرد. MEME GOMo (نسخه 4.12.{8}}) ​​33 برای اسکن پروموتورهای موش و انسان (-1000، به علاوه 200) برای موتیف RUNX1 (MA002.2) مورد استفاده قرار گرفت. علاوه بر تجزیه و تحلیل غنی سازی هستی شناسی ژن، GOMo فهرستی از ژن های شناسایی شده به عنوان هدف را برمی گرداند. این بازدیدها به پروموترهای حفاظت‌شده محدود شده در موش و انسان با مقادیر P تجربی محدود شد.<0.05 or 0.01. Mouse Genome Informatics identifiers were converted to Mouse Ensembl identifications on the Mouse Genome Informatics website and then to Human Ensembl identification and gene symbol using the Ensembl BioMart interface. For values of P<0.05, 1300 target genes were converted, of which 1251 were represented on the arrays; for values of P<0.01, there were 355 converted and 347 on the arrays. The overrepresentation of RUNX1 target genes among the DE genes was assessed by the Fisher exact test as implemented in R. The heatmap package (version 1.0.8) was used to generate the heat maps, with row-normalized log2 values shown for DE genes. Both genes and samples were clustered by Pearson correlation.

تجزیه و تحلیل RNA-seq

BMDMهای کنترل یا دیابتی (n=6)، که در 5 mmol/L کشت شده و با LPS به علاوه IFN- به مدت 6 ساعت تحریک شده بودند یا سلولهای کنترل تحریک نشده، برای تجزیه و تحلیل RNA-seq استفاده شدند. به طور خلاصه، طبق دستورالعمل سازنده، RNA با کیت جداسازی mRNA/miRNA mirVana (ThermoFisher Scientific، UK) جدا شد. مقدار RNA کل با سیستم کمیت فلورومتری کیوبیت (Life Technologies) و عدد یکپارچگی RNA با سیستم الکتروفورز خودکار Experion (Bio-Rad) تعیین شد. کتابخانه های RNA-seq با کیت آماده سازی نمونه TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina، UK) با استفاده از رباتیک جابجایی مایع Sciclone و Zephyr (PerkinElmer، UK) تهیه شدند. غلظت کتابخانه با سیستم کمیت فلورومتری کیوبیت (Life Technologies، UK)، و توزیع اندازه با سیستم الکتروفورز خودکار Experion (Bio-Rad، ایالات متحده) ارزیابی شد.

برای توالی‌یابی، نمونه‌ها در مقادیر هم‌مولار رقیق و ترکیب شدند و بر روی ابزارهای Illumina HiSeq 3000/4000 در پیکربندی 50-bp تک‌خوانی توسط مرکز توالی‌یابی زیست‌پزشکی در CeMM تعیین توالی شدند. فراخوان های پایه ارائه شده توسط نرم افزار Illumina Real-Time Analysis متعاقباً به فرمت نقشه تراز باینری (Illumina2bam) قبل از مولتی پلکس کردن (BamIndexDecoder) به فایل های نقشه تراز باینری منحصر به فرد و نمونه از طریق ابزار Illumina2bam (1.17.3) تبدیل شدند. کتابخانه ها توسط مرکز توالی یابی زیست پزشکی در CeMM تهیه و تعیین توالی شدند.

قرائت ها با استفاده از STAR (نسخه 2.5.3a34) در حالت شمارش ژن (quantMode GeneCounts) با حاشیه نویسی Gencode (نسخه M16) با ژنوم موش (GRCm38/mm10) تراز شدند (که مگا رونوشت Gm20388 برای جلوگیری از همپوشانی ژن ها حذف شد). شمارش در R (نسخه 3.3.3) بارگذاری شد و پس از حذف رونوشت ها با edgeR (نسخه 3.16.535) آنالیز شد.<0.5 mapped reads per million sequenced in all samples (13568 transcripts retained). Genes with adjusted values of P<0.05 and fold change >1.5 به عنوان DE در نظر گرفته شد. جداول DE و لیست های ژنی به عنوان فایل اکسل II در مکمل داده (تحریک نشده) و فایل اکسل III در مکمل داده (LPS به علاوه IFN-تحریک شده) گنجانده شده است. تابع edgeR cpm برای log-normalize کردن شمارش ها (پرونده Excel IV در ضمیمه داده) برای نقشه های حرارتی و سایر نمودارها استفاده شد. نقشه های حرارتی با نقشه حرارتی پکیج R (نسخه 1.836.{5}}) تولید شد. نمایش بیش از حد تجزیه و تحلیل ژن های هدف RUNX1 در بین ژن های DE در بیماران دیابتی در مقایسه با نمونه های LPS کنترل به علاوه IFN- همانطور که قبلا برای داده های آرایه انسانی توضیح داده شد انجام شد.

توالی تراشه

در مجموع 106×1 سلول در میلی لیتر با 1 درصد فرمالدئید در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه ثابت شد، با PBS شسته شد و در دمای 80- درجه نگهداری شد. سلول‌ها با کروماتین EasyShear Kit–Low SDS (Diagenode، بلژیک) برش داده شدند و با دستگاه فراصوت Bioruptor Pico (شماره کاتالوگ B01080010، Diagenode، بلژیک) مطابق توصیه‌های سازنده، فراصوت شدند. سیستم رسوب ایمنی MAGnify کروماتین (Thermo Scientific) برای انتخاب قطعات کروماتین با استفاده از آنتی هیستون H3 (تری متیل K4؛ ab8580) یا آنتی هیستون H3 (استیل K27؛ ab4729) استفاده شد. کتابخانه های توالی یابی با کیت آماده سازی کتابخانه DNA NEBNext Ultra II طبق دستورالعمل سازنده تهیه شد. به طور خلاصه، تراشه خالص یا DNA ورودی به پایان تعمیر و A-tail و به دنبال آن بستن آداپتور انجام شد. اندازه DNA متصل شده با آداپتور با دانه های SPRI Ampure XP (Agencourt) انتخاب شد و با پرایمرهای توالی یابی سازگار با Illumina غنی شد. کتابخانه‌های نهایی با مهره‌های SPRI Ampure XP برای حذف دایمرهای آداپتور خالص‌سازی شدند و با استفاده از پلتفرم Illumina HiSeq 3000/4000 و پیکربندی 50-bp تک‌خوانی توسط مرکز توالی‌یابی زیست‌پزشکی در CeMM توالی‌یابی شدند.

بیوانفورماتیک

برای بررسی رابطه بین باز بودن کروماتین و بیان ژن در BMDM های تحریک نشده، پیک های ATAC-seq دیابت در مقابل کنترل (تغییرات برابر log2) و سطح mRNA ژن های نزدیک (تغییرات log2 برابر) با همبستگی خطی پیرسون مقایسه شدند.

قرائت‌های حاصل از آزمایش‌های ATAC-seq، H3K4me3 ChiP-sequence (ChIPseq) و H3K27ac ChiP-seq در نمونه‌های نماینده با استفاده از مرورگر ژنوم یکپارچه، با ارتفاع مسیر در هر آزمایش و نوع سلول مقیاس‌گذاری شد تا تفاوت‌های سیستماتیک در عمق خواندن را در نظر بگیرد.

تحلیل آماری

تمامی تجزیه و تحلیل های آماری داده های غیر توالی در نرم افزار GraphPad Prism انجام شد. داده ها برای توزیع نرمال با آزمون نرمال بودن Shapiro-Wilk تجزیه و تحلیل شدند. مقایسه بین 2 گروه با استفاده از آزمون t-test دانشجویی یا آزمون U Mann-Whitney به ترتیب برای داده های توزیع شده نرمال یا غیرعادی محاسبه شد. مقایسه بین چند گروه با استفاده از آنالیز ANOVA راه یا 2-راه با تصحیح تعقیبی Bonferroni محاسبه شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار برای داده های توزیع شده نرمال یا میانه ± محدوده بین چارکی برای داده های توزیع شده غیرعادی گزارش می شوند. چندین تکرار و سایر جزئیات آماری را می توان در افسانه های شکل یافت. برای هر دو آزمایش in vivo و in vitro، n تعداد حیوانات منفرد یا داوطلبان یا بیماران سالم است. تغییرات فولد به صورت میانگین مقدار شرایط آزمون تقسیم بر میانگین مقدار کنترل محاسبه می شود.

نتایج

هیپرگلیسمی دیابتی متابولیسم سلولی را تغییر می دهد، بیان ژن پیش التهابی و عملکرد آن را تحریک می کند.

گلیکولیز هوازی بیان ژن پیش التهابی (M1) را افزایش می دهد، 37 و هایپرگلیسمی نیز بیان ژن مرتبط با M{2}} را ترویج می کند. .

تجزیه و تحلیل متابولوم مونوسیت‌های اولیه انسانی نشان داد که گلوکز خارج سلولی بالا (20 mmol/L) نمایه متابولیک را در مقایسه با شرایط فیزیولوژیکی گلوکز اسمزی (5 میلی‌مول در لیتر) تغییر می‌دهد. تجزیه و تحلیل مسیر (شکل 1A) نشان داد که گلوکز بالا باعث تغییرات قابل توجهی در چرخه اسید تری کربوکسیلیک (FDR, 0.{10}}02) و متابولیسم پیروات (FDR, 0.005) می‌شود که با افزایش سوکسینات، مالات مشخص می‌شود. شکل 1B)، سطوح لاکتات و پیروات (شکل 1C) به ترتیب، با تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه متابولیت (شکل 1D) که اثر Warburg را برجسته می کند (FDR، 0.04).

شکل 1. گلوکز بالا متابولیسم سلولی را تغییر می دهد. تجزیه و تحلیل مسیر متابولیک اندازه‌گیری‌های فردی برای (B) سوکسینات، مالات، (C) لاکتات و پیروات و (D) تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه متابولیت (Metaboanalyst) برای نمونه‌های متابولومیک لیزات سلول مونوسیت انسانی (n=5). تجزیه و تحلیل شار خارج سلولی بر روی ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان موش (بیوانالایزر اسب دریایی؛ n{2}} حیوان منفرد) اندازه‌گیری شده (E) نرخ اسیدی خارج سلولی (ECAR) و (F) نرخ مصرف اکسیژن (OCR) در پاسخ به گلوکز خارج سلولی مختلف، کنترل اسمزی (مانیتول)، و تزریق مهارکننده متابولیک. گلوکز بالا (G) باعث افزایش تولید ATP گلیکولیتیک (glycoATP) و (H) کاهش شاخص نرخ ATP (نرخ تولید ATP میتوکندری/نرخ تولید glycoATP) شد که نشان‌دهنده تغییر به فنوتیپ گلیکولیتیک‌تر است. داده ها با استفاده از آزمون تعقیبی (B و C) 2-way ANOVA یا (E-H) 1-way ANOVA به علاوه Bonferroni مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تمام داده های نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار هستند. AU واحدهای دلخواه را نشان می دهد. FDR، نرخ کشف نادرست؛ و TCA، اسید تری کربوکسیلیک. *پ<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

فنوتیپ گلیکولیتیک تر (و کمتر اکسیداتیو) در پاسخ به گلوکز بالا (20 میلی مول در لیتر) در BMDM های موش تایید شد که نشان دهنده افزایش سرعت اسیدی شدن خارج سلولی، افزایش تولید ATP گلیکولیتیک ({1}} برابر؛ P<0.01), decreased ATP rate index (by 56%; P<0.05; Figure 1E–1H), and increased glucose consumption and lactate production (P<0.001; Figure Ia and Ib in the Data Supplement). Cultured BMDMs also increased succinate levels in response to high extracellular glucose in both unstimulated (2.5-fold, P<0.05) and M1-stimulated states (1.9-fold; P<0.001; Figure Ic in the Data Supplement).

این افزایش در نرخ گلیکولیتیک توسط بازدارنده دی کلرواستات گلیکولیز جلوگیری شد (شکل Ia و Ib در ضمیمه داده).

در BMDM ها، گلوکز بالا هر دو باعث افزایش بیان M{0}}همراه IL-6 پیش التهابی شد (2.7- برابر؛ P<0.001; Figure 2A) and suppressed M2-associated Ym1 (70%; P<0.001) and Fizz1 (42%; P<0.001) expression (Figures 2C and 2D). These bidirectional changes in gene expression were restored in the presence of dichloro-acetate (Figure 2A–2D) and 2-deoxy-d-glucose (Figure IIa–IId in the Data Supplement), together indicating that the proinflammatory effects of high extracellular glucose were mediated through changes in glycolysis and were not merely the result of nonspecific changes to overall metabolic activity.

شکل 2. گلوکز بالا بیان و عملکرد ژن ماکروفاژ را تغییر می دهد. M1 (لیپوپلی ساکارید [LPS] به اضافه اینترفرون [IFN-] تحریک شده) ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان (BMDM) (A) Il{4}} و (B) بیان ژن در حضور یا عدم حضور دی کلرواستات (DCA) است. M2 (اینترلوکین{6}} تحریک شده) بیان ژن BMDM (C) Ym1 و (D) Fizz1. A تا D، داده‌های کمی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به بیان B2m نرمال می‌شوند. n{10}} تا 10. E, کمیت تصویری چسبندگی مونوسیت موش به سلول‌های اندوتلیال (n{12}}). F، کمی سازی تصویر جذب لیپوپروتئین با چگالی کم استیله شده توسط BMDMs، نرمال شده توسط تعداد سلول در هر تصویر. تصاویر چسبندگی استاتیک (G) از مونوسیت‌های موش نشان‌دار شده با PKH{14}به سلول‌های اندوتلیال و (H) Oil Red O (ORO)– و تصاویر سلول‌های فوم رنگ‌آمیزی شده با DAPI. همه داده ها (A-H) به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده می شوند. (A–D) 1-way ANOVA یا (E و F) 2-way ANOVA با تجزیه و تحلیل post hoc Bonferroni. هر نقطه نشان دهنده یک حیوان جداگانه است (میانگین 4 تصویر برای چسبندگی استاتیک و تشکیل سلول های کف). AU واحدهای دلخواه را نشان می دهد. NS بی اهمیت است. *پ<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

با توجه به اثرات آن بر تحریک التهاب، ما سپس آزمایش کردیم که آیا گلوکز خارج سلولی بالا باعث تغییر عملکرد مونوسیت و ماکروفاژ مرتبط با آتروژنز می شود یا خیر. 38،39 گلوکز بالا باعث افزایش چسبندگی مونوسیت موش به سلول های اندوتلیال فعال می شود (2.{3}} برابر؛ P.<0.001; Figure 2E and 2G) and promoted BMDM uptake of modified LDL to form foam cells (4.1-fold [and 2.7-fold when M1 stimulated]; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H). The effects on monocyte adhesion were negated entirely by inhibition of glycolysis with dichloroacetate (P<0.001; Figure 2E and 2G) and 2-deoxy-glucose (P<0.001; Figure IIe in the Data Supplement), whereas foam cell formation, was decreased by 30% (and by 42% when M1-stimulated; P<0.001 for both; Figure 2F and 2H).

سلول های مشتق شده از BM از موش های دیابتی ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی را نشان می دهند

ما در مرحله بعد از یک مدل دیابت موش برای آزمایش اینکه آیا تغییرات پیش التهابی مداوم ناشی از هیپرگلیسمی در ماکروفاژها، حتی پس از عادی سازی گلوکز، ایجاد شده است یا خیر، استفاده کردیم. ما BM را از موش‌های کنترل غیر دیابتی و همسان با سن و از موش‌های دیابتی سیژنیک دریافت کردیم که در آنها هیپرگلیسمی توسط استرپتوزوتوسین ایجاد شده بود و به مدت 6 هفته در داخل بدن حفظ شده بود (شکل IIIa-IIId در ضمیمه داده). سلول ها تحت گلوکز فیزیولوژیکی به BMDMs تمایز داده شدند (5 میلی مول در لیتر؛ شکل 3A). پس از تحریک، BMDM با منشا موش دیابتی بیان ژن M1-Il{7}} را افزایش داد (4.{{9} برابر؛ P<0.0001; Figure 3B) and, with IL-4 treatment, decreased M2-associated Ym1 expression (by 75%; P=0.0003) and Fizz1 (by 70%; P=0.0326; Figure 3D and 3E). RNA-seq analysis of control and diabetic BMDMs revealed clear delineation based on gene expression profiles, which was further accentuated by LPS and IFN-γ stimulation (Figure 3F). Indeed, when expression levels of a panel of 39 previously identified M1- and M2-associated genes were examined,9 BMDMs from control and diabetic origin showed clear segregation after LPS+IFN-γ stimulation (Figure 3G).

شکل 3. ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان (BMDM) از موش های دیابتی حافظه هیپرگلیسمی را در بیان ژن نشان می دهند. A، شماتیک پروتکل BMDM دیابتی و کنترل (n=10-12). تجزیه و تحلیل بیان ژن M1 (B) Il-6 (P<0.0001) and (C) is. M2 (D) Ym1 (P=0.0003) and (E) Fizz1 (P=0.0326) gene expression. B through E, All quantitative polymerase chain reaction data are normalized to B2m expression and analyzed by the unpaired t-test. F, Principal component (PC) analysis of all control and diabetic BMDM RNA sequencing (RNA-seq) transcript reads (n=6); percent indicates sample variability. G, Unsupervised hierarchical clustering shows marked segregation of 39 previously identified M1 and M2 macrophage marker genes in lipopolysaccharide (LPS)+interferon-γ (IFN-γ)–stimulated BMDMs from diabetic or control origin (RNA-seq analysis). IL indicates interleukin.

علاوه بر این، چسبندگی به اندوتلیوم فعال افزایش یافته است (6.{1} برابر؛ P<0.05; and by 9.4-fold when LPS-stimulated; P<0.001; Figure 4A and 4C) and enhanced modified LDL uptake and foam cell formation (LPS stimulated, 1.6-fold; P<0.01; Figure 4B and 4D). This array of persistently heightened responses was indicative of hyperglycemia-induced trained immunity.

شکل 4. ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان (BMDMs) از موش های دیابتی، علی رغم نرمال شدن گلوکز، عملکردهای تغییر یافته ای را نشان می دهند. BMDM ها از موش های دیابتی در 5 میلی مول در لیتر (n{2}}-8) تمایز یافتند. A، کمیت تصویری چسبندگی BMDM به سلول های اندوتلیال (n=8). B، کمی سازی تصویر جذب لیپوپروتئین با چگالی کم استیله شده توسط BMDMs، نرمال شده توسط تعداد سلول در هر تصویر. نماینده (C) تصاویر چسبندگی استاتیک از BMDM های فلورسنت (PKH67) به سلول های اندوتلیال و (D) Oil Red O (ORO) – و تصاویر سلول فوم رنگ آمیزی شده با DAPI. همه داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده‌اند و هر نقطه نشان‌دهنده یک حیوان جداگانه است (میانگین 4 تصویر برای چسبندگی استاتیک و تشکیل سلول‌های فوم). داده ها با استفاده از آناليز واريانس راهي و آزمون تعقيبي بونفروني مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. IFN- نشان دهنده اینترفرون است. و LPS، لیپوپلی ساکارید. *پ<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی باعث آترواسکلروز می شود

بنابراین، برای آزمایش اهمیت عملکردی ایمنی آموزش‌دیده ناشی از هیپرگلیسمی در آترواسکلروز، BM را از موش‌های اهداکننده دیابتی کنترل نرموگلیسمی یا استرپتوزوتوسین (گلوکز خون، 6.9±33.9 میلی‌مول در لیتر) به آترواسکلروز - L-Normoglycre پیوند زدیم. - موش های دریافت کننده (شکل 5A). در هر مورد، موش‌های اهداکننده برای GFP تحت کنترل پروموتر CD68 انسانی تراریخته بودند. پیوند مؤثر و معادل با آنالیز فلوسایتومتری PBMCs نشان داده شد، که حضور CD45 به‌علاوه GFP به علاوه سلول‌های CD11b یا Ly6C را تأیید کرد. شکل IVa و IVb در ضمیمه داده). پس از 12 هفته رژیم غذایی نوع غربی، هیچ تفاوتی در اندازه‌گیری چربی خون (شکل IVc و IVd در مکمل داده) یا زیر مجموعه‌های لکوسیتی که توسط فلوسیتومتری ارزیابی شد (شکل IVe در مکمل داده) وجود نداشت.

موش هایی که BM دیابتی دریافت کرده بودند، به طور قابل توجهی افزایش آترواسکلروز را نشان دادند، با اکثریت آنها بیش از بیشترین بار آترواسکلروز در گیرنده های غیر دیابتی (مناطق پلاک میانه، 44461 میکرومتر مربع [محدوده بین چارکی، 18368-59597 میکرومتر مربع، 18368-59597 میکرومتر مربع] در مقابل 7 میکرومتر 27-5219] ؛ Mann-Whitney, P{11}}.036). این موش‌ها همچنین افزایش محتوای ماکروفاژی پلاک‌ها را نشان دادند (P{13}}.052؛ شکل V در مکمل داده)، ناحیه هسته نکروزه غنی از چربی (2.{17}} برابر، P{18). }}.0076؛ شکل VIa در مکمل داده)، و نسبت هسته نکروزه غنی از چربی (2.{22}} برابر، P=0.046؛ شکل VIb در ضمیمه داده)، اما بدون تفاوت در محتوای کلاژن (درصد پلاک؛ شکل VIc و VId در مکمل داده) یا سلول های ماهیچه صاف (درصد پلاک؛ شکل VIe و VIf در مکمل داده).

ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی در HSC ها به دلیل تغییرات در متابولیسم منجر به برنامه ریزی مجدد اپی ژنتیکی می شود.

با توجه به اثبات این موضوع که BM موش‌های هیپرگلیسمی باعث افزایش آترواسکلروز می‌شود، همراه با بیان ژن پیش‌التهابی پایدار و پاسخ‌های عملکردی موجود در BMDM در شرایط آزمایشگاهی، ما استدلال کردیم که این حافظه مظهر ایمنی آموزش‌دیده در سلول‌های مشتق شده از BM است. ایمنی آموزش دیده با تغییراتی در متابولیسم سلولی همراه بوده است که باعث ایجاد علائم اپی ژنتیکی طولانی مدت با تغییر کروماتین مانند H3K4me3 و H3K27ac می شود. سلول های B، سلول های کشنده طبیعی، سلول های دندریتیک، مونوسیت ها، گرانولوسیت ها، سلول های اریتروئید: CD3-، CD4-، B220-، Ter119، Gr1- کشت شده در شرایط گلوکز خارج سلولی بالا نیز افزایش جذب گلوکز و تولید لاکتات را نشان دادند که نشان دهنده گلیکولیز نامنظم است. (پ<0.001; Figure VIIa–VIId in the Data Supplement), and both H3K4me3 and H3K27ac modifications were increased (Figure VIIIa–VIIIf in the Data Supplement). In the case of H3K4me3 (but not H3K27Ac), this effect was negated with dichloroacetate inhibition (Figure VIIIa, VIIIc, and VIIId in the Data Supplement). These chromatin marks were also consistently increased in HSCs from diabetic mice compared with control HSCs and remained heightened after differentiation into BMDMs using physiological glucose levels (5 mmol/L; Figure VIIIb, VIIIe, and VIIIf in the Data Supplement).

در پلاک‌های ریشه آئورت، نسبت هسته‌های مرتبط با ماکروفاژ که برای H3K4me3 مثبت رنگ‌آمیزی شده بودند، در موش‌هایی که BM از اهداکنندگان دیابتی دریافت کرده بودند، بیشتر بود (1.{5}} برابر، P.<0.05) compared with control donors (Figure 5E and 5F), which is in line with the corresponding analysis of BMDM in vitro experiments (Figure VIIIb and VIIIe in the Data Supplement). These data point to a direct causal link between increased glycolytic rate and the development of hyperglycemia-induced trained immunity. In addition to metabolic mediators,17,18 recent work has implicated the inflammatory cytokine IL-1β in the development of trained immunity.42 This is particularly relevant because IL-1β has been identified in diabetes43 as an important driver of atherosclerosis and in obesity in which adipose tissue macrophage-produced IL-1β induces the proliferation of BM progenitors.44,45 Therefore, we hypothesized that IL-1β and hyperglycemia may work synergistically to induce atherosclerosis-relevant epigenetic changes that alter chromatin structure. To interrogate chromatin accessibility, we performed an assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) on HSCs from diabetic or control mice, both with and without IL-1β stimulation28 (sample processing summarized in Excel File V in the Data Supplement). HSCs from a diabetic origin showed differential chromatin profiles (summarized in Excel File VI in the Data Supplement) in response to IL-1β exposure, with 530 differential peaks (FDR ≤0.1) of which 50% exhibited increased accessibility in diabetic cells. 

شکل 5. مغز استخوان دیابتی (BM) علیرغم نرمال سازی طولانی مدت گلوکز، آترواسکلروز را تحریک می کند. الف، شماتیک آزمایش پیوند BM. B، تجزیه و تحلیل فلوسایتومتری جمعیت لکوسیت محیطی در موش پس از 12 هفته پیوند مغز استخوان. C، تصاویر ریشه آئورت نماینده از موشهای Ldlr-/- که اهداکننده دیابتی یا اهداکننده کنترل CD{2}} GFP BM را دریافت کرده بودند. رنگ آمیزی ماسون تریکروم (سمت چپ) و رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس برای ماکروفاژهای مشتق شده از پیوند BM (سبز نشان‌دهنده پروتئین فلورسنت سبز [GFP]) یا همه ماکروفاژها (قرمز نشان‌دهنده گالکتین-3 [GAL3]). کمیت تصویر (D) حجم پلاک (P{5}}.036). داده‌ها به‌عنوان میانگین ± انحراف معیار، با استفاده از روش ANOVA با آزمون تعقیبی بونفرونی (B)، یا میانه± دامنه بین‌چارکی، تجزیه و تحلیل شده با آزمون من ویتنی U (D). کنترل n=6، دیابتی n=9. E، تصاویر ریشه آئورت نماینده از موش های Ldlr-/- که پیوند BM دیابتی یا کنترل را دریافت کرده بودند. F، کمی سازی درصد هسته های رنگ آمیزی شده مثبت برای H3K4me3 یا H3K27ac در ناحیه مثبت ماکروفاژ GAL3. هر نقطه داده نشان دهنده یک حیوان است (میانگین، 6 بخش؛ n= 7 تا 10). به عنوان میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است. تجزیه و تحلیل ANOVA یک طرفه. BMDM نشان دهنده ماکروفاژهای مشتق از BM است. HSC، سلول های بنیادی خونساز. IFN-، اینترفرون-؛ و LPS، لیپوپلی ساکارید. *پ<0.05.

برای بررسی ارتباط بیولوژیکی این مجموعه از مناطق ژنومی غیرکدکننده (با تاکید بر عملکرد فرضی تنظیم‌کننده سیس)، مناطق کروماتین با افزایش دسترسی در سلول‌های دیابتی به 2 نزدیک‌ترین ژن (در 1{7}}{{) اختصاص داده شد. 11}}0 kb) و با ابزار غنی‌سازی مناطق ژنومی حاشیه‌نویسی تجزیه و تحلیل شد. این تجزیه و تحلیل مسیر، افزایش چندین مسیر مرتبط با التهاب، از جمله فعال‌سازی لکوسیت (3.{6}} برابر؛ FDR، 0.0005) را نشان داد. و ژن‌های مرتبط با تحمل LPS در ماکروفاژها (2.{10} برابر؛ FDR، 0.0009). برای درک اینکه آیا گلوکز بالا در انزوا نیز می‌تواند باعث اصلاح کروماتین شود، از ATAC-seq برای بررسی HSCهای موش‌های کنترل و دیابتی در غیاب تحریک IL{14}} استفاده کردیم. HSCهای تحریک نشده 357 پیک دیفرانسیل (FDR کمتر یا مساوی 0.2) را نشان دادند که از این تعداد 51 درصد در مقایسه با گروه شاهد، دسترسی بیشتری به سلول‌های منشأ دیابتی داشتند، که اکثر آنها در مناطق اینترونیک (48 درصد) یا بین ژنی (21 درصد) بودند.

با توجه به این یافته ها در HSCs، ما در مرحله بعدی قابلیت دسترسی کروماتین و بیان ژن را در BMDM های مشتق شده آنها بررسی کردیم. ما ATAC-seq و RNA-seq را بر روی BMDM های موش های کنترل و دیابتی تحت شرایط تحریک نشده یا تحریک نشده (LPS به علاوه IFN-) انجام دادیم. BMDM های موش های دیابتی قابلیت دسترسی متفاوت کروماتین را تحت شرایط تحریک نشده با 1047 ناحیه افتراقی نشان دادند (FDR<0.05; Figure 6A) but only 40 differentially open regions (FDR <0.05) after stimulation (Figure 6B). In contrast, unstimulated BMDMs from diabetic mice differentially express 632 genes (324 upregulated expression and 308 downregulated expression; Excel File II in the Data Supplement) compared with unstimulated control BMDMs, but this increases to 1348 genes (802 increased and 546 decreased; Excel File III in the Data Supplement) on stimulation (FDR <0.05; fold change >1.5). در مجموع، داده‌های ATAC-seq و RNAseq نشان می‌دهند که دیابت ماکروفاژها را برای پاسخ اغراق‌آمیز به محرک‌های پیش‌التهابی آماده می‌کند.

شکل 6. دیابت سطوح H3K4me3 و H3K27ac و دسترسی کروماتین را تغییر می دهد. نمودار MA از همه روش‌ها برای کروماتین توالی‌یابی کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز در (A) ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان (BMDMs) تحریک‌نشده یا (B) تحریک‌شده، که در آن قله‌ها با قابلیت دسترسی متفاوت (نرخ کشف نادرست) می‌خواند.<0.05, fold change >1.5) با رنگ صورتی برجسته شده اند (1047 تحریک نشده، 40 تحریک شده، n=6). C، مناطق متغیر H3K4me3 و H3K27ac با تعیین توالی ایمونوپسیت کروماتین در سلول‌های بنیادی خونساز (HSCs) و BMDM از موش‌های کنترل در مقابل موش‌های دیابتی (n{10}} در هر گروه) تعیین شد. D، هیستوگرام میانگین پوشش H3K27ac و K3K4me3 در HSCs، BMDM های تحریک نشده، و BMDM های تحریک شده پیش التهابی (لیپوپلی ساکارید [LPS] به علاوه اینترفرون [IFN]) در مکان های شروع رونویسی± 1 کیلو بایت ژن های کد کننده پروتئین نزدیک به مناطق افزایش یافته است. دسترسی در BMDM های تحریک نشده (در مقابل کنترل ها؛ n=405) و مقایسه با سطوح پس زمینه در مناطق انتخاب نشده.

We further undertook an unbiased examination of the relationship between differential gene expression and altered chromatin accessibility in the diabetic BMDMs. We annotated the nearest or overlapping gene for each region of differentially accessible chromatin in BMDMs (M0 state) from diabetic mice versus controls. For genes within this set that were also DE (cutoff FDR, 0.1; log fold change >0.5 برای هر کدام)، ما تغییر برابری را برای پیک ATAC-seq دیفرانسیل در مقابل تغییر برابری برای DE مقایسه کردیم. با بررسی به عنوان متغیرهای پیوسته، همبستگی قوی بین تغییرات کروماتین و بیان ژن های نزدیک وجود داشت (R{3}}.65; P.<1×10−6).

Furthermore, to ascertain the nature of diabetes-induced chromatin modifications, we undertook ChIPseq in HSCs and BMDMs from control versus diabetic mice (n=6 per group). Diabetic HSCs and BMDMs were distinguishable from control samples based on the quantification of both H3K27ac and H3K4me3 histone modifications (Figure 6C), and we confirmed these results by Western blot analysis (Figure VIII in the Data Supplement). To integrate the ChIP-seq and ATACseq data, we examined the distribution of H3K4me3 and H3K27ac histone modifications in the regions of open chromatin that were identified by ATACseq in unstimulated diabetic BMDMs. A majority of these regions were identified as enhancers, located >1 کیلوبایت از سایت‌های شروع رونویسی مشروح. ما بر روی ژن‌های نزدیک به این تقویت‌کننده‌ها تمرکز کردیم، زیرا نواحی پروموتور ژن آن‌ها (محل شروع رونویسی ± 1 کیلوبایت) محتمل‌ترین اهداف نظارتی را نشان می‌دهند. ATAC-seq 405 ناحیه کروماتین باز متفاوت را شناسایی کرده بود (P<0.05) in BMDMs derived from diabetic mice versus control mice under basal conditions. In the HSCs from diabetic mice, there was a marked increase in promoter-associated H3K27ac compared with control HSCs (Figure 6D). 

شکل 6. دیابت سطوح H3K4me3 و H3K27ac و دسترسی کروماتین را تغییر می دهد. نمودار MA از همه روش‌ها برای کروماتین توالی‌یابی کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز در (A) ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان (BMDMs) تحریک‌نشده یا (B) تحریک‌شده، که در آن قله‌ها با قابلیت دسترسی متفاوت (نرخ کشف نادرست) می‌خواند.<0.05, fold change >1.5) با رنگ صورتی برجسته شده اند (1047 تحریک نشده، 40 تحریک شده، n=6). C، مناطق متغیر H3K4me3 و H3K27ac با تعیین توالی ایمونوپسیت کروماتین در سلول‌های بنیادی خونساز (HSCs) و BMDM از موش‌های کنترل در مقابل موش‌های دیابتی (n{10}} در هر گروه) تعیین شد. D، هیستوگرام میانگین پوشش H3K27ac و K3K4me3 در HSCs، BMDM های تحریک نشده، و BMDM های تحریک شده پیش التهابی (لیپوپلی ساکارید [LPS] به علاوه اینترفرون [IFN]) در مکان های شروع رونویسی± 1 کیلو بایت ژن های کد کننده پروتئین نزدیک به مناطق افزایش یافته است. دسترسی در BMDM های تحریک نشده (در مقابل کنترل ها؛ n=405) و مقایسه با سطوح پس زمینه در مناطق انتخاب نشده.

این تفاوت ها در BMDM ها کاهش یافت (شکل 6D)، تا حدی به دلیل افزایش H3K27ac در سلول های منشا غیر دیابتی پس از تمایز. با این حال، علامت H3K4me3 در این پروموترها در HSC افزایش یافت، با تفاوت‌های قابل شناسایی در ماکروفاژهای تمایز یافته، از جمله پس از تحریک سیتوکین (شکل 6D). این الگوی علائم H3K27ac گذرا و H3K4me3 پایدار با یافته های ما در هر دو کشت بافت (شکل VIII در مکمل داده) و ایمونوهیستوشیمی در ماکروفاژهای پلاک موش (شکل 5E و 5F) مطابقت دارد.

مناطق کروماتین باز متفاوت شناسایی شده توسط ATAC-seq به طور قابل توجهی با تغییرات در رونویسی ژن های نزدیک مرتبط بود. علاوه بر این، کمی تفاوت در دسترسی کروماتین (دیابت در مقابل کنترل) و مقایسه مستقیم با تغییر در سطوح بیان mRNA ژن نزدیک به همبستگی بالایی داشت (R{1}}.5؛ P{3}}.2e). -15؛ شکل 7A). برای بررسی این اثرات در مکان‌های ژنومی مربوطه، داده‌های ATAC-seq، H3K4me3 Chip-seq، و H3K27ac ChiP-seq را در محرک‌های 2 ژن که قبلاً در ایمنی آموزش‌دیده ناشی از گلیکولیز دخیل بودند و با محصولاتی که در التهاب ایجاد می‌کنند ترکیب کردیم (Il -6) و متابولیسم گلوکز (Hk1). این ژن‌ها مناطقی از کروماتین قابل دسترسی را در مکان‌های شروع رونویسی با پیک‌های مرتبط H3K4me3 و H3K27ac در این مکان‌های ژنومی نشان دادند (شکل 7B).

برای به دست آوردن بینشی در مورد عوامل رونویسی که ممکن است به عنوان واسطه‌های این الگوی ایمنی آموزش‌دیده ناشی از هیپرگلیسمی دخیل باشند، آنالیز غنی‌سازی موتیف 33 بر روی مناطق کروماتین با افزایش دسترسی در شرایط دیابتی انجام شد. نقوش فاکتور رونویسی غنی‌شده به‌طور قابل‌توجهی شامل RUNX1 (FDR، 0.0001)، که قبلاً با حافظه ایمونولوژیک مرتبط بوده است، 46 و همچنین PU.1 (FDR, 0.04) و اتصال به CCCTC فاکتور (FDR، 1.8×10-7؛ شکل 8A). با دخیل کردن فاکتور رونویسی RUNX147 بر اساس دسترسی به موتیف‌های اتصال، بررسی کردیم که آیا ژن‌های هدف RUNX1 به طور قابل‌توجهی در بین ژن‌های DE در LPS به علاوه BMDM‌های تحریک‌شده با IFN وجود دارند یا خیر. این تجزیه و تحلیل 95 ژن از 1348 ژن DE را به عنوان اهداف RUNX1 شناسایی کرد (P<0.05; odds ratio, 1.3; RUNX1 binding site P<0.05; Figure 8B and full differential gene list with RUNX1 target genes marked in Excel File VII in the Data Supplement), confirming its relevance in these disease-modifying cells. To test for RUNX1 involvement in human disease, we interrogated the gene expression of macrophages obtained from carotid atherosclerotic plaques of patients with or without diabetes (Excel File I in the Data Supplement). LCM was used to isolate macrophages from human carotid atherosclerosis plaques in patients undergoing clinically driven endarterectomy. Figure 8C shows the DE genes between diabetic and nondiabetic plaque macrophages (FDR <0.2) and highlights in red the RUNX1-associated genes (further detailed in Figure IX in the Data Supplement). RUNX1 target genes were significantly overrepresented among the DE genes, even more so when target binding sites were more stringently restricted: At a binding site P<0.05, 12 of 106 DE genes were among the 1251 RUNX1 targets (P=0.03; odds ratio, 2.0). These target genes include diabetes-induced DE of atherosclerosis-relevant genes such as Traf3ip3 (log fold change, 0.56; FDR, 0.02),48 Crnkl1 (log fold change, 0.63; FDR, 0.04),49 and Pla2g5 (log fold change, 0.16; FDR, 0.1).50

برای تعیین اینکه آیا پروفایل عملکردی ماکروفاژ پلاک انسانی با ماکروفاژهای موش مطابقت دارد یا خیر، ما آن را با مجموعه ای از 39 ژن M1 و M2 با بیانی که در BMDM های تحریک شده از موش های دیابتی در مقابل کنترل اندازه گیری شده بود مقایسه کردیم (شکل 3G). اینها با تغییر لگاریتم مثبت یا منفی (دیابتی در مقابل کنترل) خلاصه شدند و با تغییرات معادل در ماکروفاژهای پلاک انسانی بیماران مبتلا به دیابت نوع 2 (در مقابل کنترل) مقایسه شدند. آزمایش دقیق فیشر رابطه معنی‌داری را بین BMDM موش و مجموعه داده‌های ماکروفاژ پلاک انسانی برای ژن‌های تنظیم‌شده یا کاهش‌دهنده در افراد دیابتی نسبت به افراد کنترل نشان داد (0155/0=0؛ نسبت شانس، 83/6).

Having shown a hyperglycemia-induced trained immunity phenotype in mouse HSCs and BMDMs and confirmed shared transcriptional features with macrophages from human plaques, we hypothesized that circulating human blood cells from patients with diabetes might also show evidence of priming. We obtained PBMCs from patients with type 2 diabetes and control subjects without diabetes matched for age and body mass index (Figure X in the Data Supplement). After isolation, PBMCs were restored to normal glucose conditions (5 mmol/L) in tissue culture for 24 hours. Comparing transcriptomes in basal conditions and after stimulation with LPS+IFN-γ, we found that the cells derived from patients with diabetes showed DE of >3000 ژن در مقایسه با گروه کنترل غیر دیابتی همسان. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن ژن‌های تغییریافته، غنی‌سازی مثبتی را در PBMC‌های دیابتی تحریک‌شده (در مقایسه با گروه‌های کنترل) برای مسیرهای مشخصه نشان داد، از جمله پاسخ التهابی (70×10-5.70 × IL) و سیگنال‌دهی JAK STAT3 IL{5}. P{7}}.0221)، و مسیرهای Reactome، از جمله گونه‌های فعال اکسیژن و تولید گونه‌های فعال نیتروژن (P{9}}.0049)، سیگنالینگ IL-/IL- (P{13}}.0110) , and Toll-like receptor 1/2 cascade (P{18}}.0033). این مسیرها نشان می‌دهند که این سلول‌های محیطی نیز ویژگی‌های پرایمینگ مشابهی را نشان می‌دهند که ما در BMDM‌های موش‌های دیابتی گزارش می‌کنیم (شکل 3G).

در نهایت، برای بررسی بیشتر نقش علت احتمالی RUNX1 در پاسخ‌های ایمنی تمرین‌شده ناشی از هیپرگلیسمی، BMDM‌هایی که قبلاً در سطح فیزیولوژیکی یا گلوکز بالا متمایز شده بودند به گلوکز 5 میلی‌مول در لیتر بازگردانده شدند و سپس در غیاب یا حضور RUNX دارویی تحریک شدند. 1-بازدارنده خاص Ro5-333551 (شکل 8D). سلول‌های تمایز یافته در گلوکز بالا افزایش بیان Il-6 را نشان دادند (2- برابر، P<0.001) and Il-1β (2.1-fold, P<0.001), despite normalization of glucose levels (Figure 8E and 8F and Figure XIb and XIc n the Data Supplement). Ro5-3335 normalized heightened Il-6 and Il-1β expression in a dose-dependent manner (Figure 8E and 8F), with the starting effective dose (0.5 µmol/L) being equal to the Ro5-3335 IC50 value.52

شکل 8. نقش ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی RUNX1. 3 موتیف فاکتور رونویسی برتر شناسایی شده در سنجشی برای تعیین توالی کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز (ATAC-seq) در مقایسه با سلول های بنیادی خونساز کنترل نشده (HSCs; n{{6) به اوج های غنی شده متفاوت (A) HSC دیابتی تحریک نشده (n=3) می رسد. }}). خوشه‌بندی سلسله مراتبی بدون نظارت ژن‌های بیان شده متفاوت از تجزیه و تحلیل توالی RNA (RNA-seq) ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان (BMDM) دیابتی (n=6) ​​یا شاهد (n=6) تحریک شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) به علاوه اینترفرون (IFN-). خوشه‌بندی سلسله مراتبی بدون نظارت از ژن‌های بیان‌شده متفاوت از (C) دیابتی (n=8) یا شاهد (n{13}}) نمونه‌های ماکروفاژ پلاک کاروتید انسانی میکرودیسکسی‌شده را با لیزر ضبط می‌کند. B و C، ژنهای هدف فاکتور رونویسی 1 (Runx1) مربوط به Runt (RUNX1) (P<0.05 stringency) are highlighted in red to the left of the heat map. Wild-type (WT) BM was differentiated into BMDMs in physiological (5 mmol/L) or high (20 mmol/L) glucose, rested for 2 days in 5 mmol/L glucose, and then stimulated in 5 mmol/L glucose±varying concentrations of Ro5-3335, (D) as illustrated. M1 gene expression of (E) Il-6 and (F) Il-1β assessed by quantitative polymerase chain reaction; data normalized to B2m expression. Data displayed as mean±SD, 2-way ANOVA with Bonferroni post hoc. Sample n=5 individual animals. FC indicates fold change. *P<0.05; ***P<0.001.

بحث

نرخ بالای عوارض قلبی عروقی در بیماران مبتلا به دیابت علیرغم کنترل شدید گلوکز ادامه دارد.52 در اینجا، ما شواهدی ارائه می کنیم که قند خون بالا باعث ایجاد ایمنی تمرین شده در HSCs و ماکروفاژها می شود و این امر به طور قابل توجهی آترواسکلروز را تشدید می کند. ما نشان می‌دهیم که هیپرگلیسمی با هدایت گلیکولیز هوازی، تغییرات مداومی را در HSCهای BM ایجاد می‌کند، که منجر به الگوهای خاصی از دسترسی کروماتین می‌شود، با شواهدی برای یک حالت پرایمینگ پیش التهابی که در ماکروفاژهای متمایز باقی می‌ماند. یافته‌های ما عوامل رونویسی، به‌ویژه RUNX1 را به‌عنوان واسطه‌های ایمنی آموزش‌دیده دخیل می‌دانند. مهار دارویی RUNX1 این تظاهرات ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی را در شرایط آزمایشگاهی حذف کرد.

تغییرات در متابولیسم سلولی می تواند باعث ایجاد ایمنی تمرین شده شود، اصطلاحی که به حافظه ایمنی ذاتی اشاره می کند که می تواند پس از تحریک مختصر با محصولات میکروبی یا مواد آتروژنیک درون زا، از جمله LDL اکسید شده و لیپوپروتئین (a) ایجاد شود. یکی از اجزای دیواره سلولی کاندیدا آلبیکنس، از طریق فعال شدن مسیر دکتین-1–Akt–mTOR–HIF-1 انجام می‌شود که باعث تغییر از فسفوریلاسیون اکسیداتیو به گلیکولیز هوازی (اثر واربرگ) می‌شود. 18 در واقع، چندین متابولیت حاصل از گلیکولیز و چرخه اسید تری کربوکسیلیک به عنوان کوفاکتور برای آنزیم های اصلاح کننده هیستون عمل می کنند که به نوبه خود دسترسی کروماتین را تعیین می کنند. به عنوان مثال، هیستون استیل ترانسفراز و داستیلازها به استیل-CoA و NAD پلاس نیاز دارند، در حالی که دمیلازهایی مانند Tet و JmjC از کتوگلوتارات به عنوان یک کوفاکتور استفاده می کنند. اخیراً، تنظیم متابولیک بیان ژن التهابی ماکروفاژ مستقیماً با اصلاح هیستون مرتبط شده است. استیلاسیون ناشی از افزایش سطح لاکتات.55

ارتباط مستقیم بین متابولیسم گلوکز و تغییرات اپی ژنتیکی، همراه با مشاهدات حاکی از حافظه هیپرگلیسمی در بیماران مبتلا به دیابت، ما را به این فرضیه سوق داد که خود هایپرگلیسمی ممکن است تغییراتی در متابولیسم سلولی ایجاد کند و منجر به حافظه ایمنی ذاتی در دیابت شود. در مورد گلوکان، افزایش گلیکولیز هوازی در ماکروفاژها منجر به افزایش تری متیلاسیون هیستون 3 Lys4 (H3K4me3) و استیلاسیون هیستون 3 Lys27 (H3K27ac) شد. هر دوی این نشانگرهای اصلاح کروماتین در زمینه گلیکولیز ناشی از گلوکز بالا افزایش یافتند. همانطور که در اینجا و در مطالعات قبلی نشان داده شد، غنی‌سازی H3K4me3 بر روی محرک‌های ژن‌های مرتبط با التهاب (به عنوان مثال، Il-6) و متابولیسم گلوکز (به عنوان مثال، Hk1) وجود داشت. گزارش شده است که فومارات به عنوان آنتاگونیست هیستون و DNA دمیلازها عمل می کند، و مطابق با این، ما همچنین دریافتیم که متابولیت های چرخه اسید تری کربوکسیلیک سوکسینات و مالات در سلول های هیپرگلیسمی افزایش می یابد.

Metropolis و همکاران 20 نشان دادند که در زمینه ایمنی ذاتی ناشی از گلوکان در اجداد سلول های میلوئیدی، سیتوکین ها می توانند ایمنی آموزش دیده را واسطه کنند. به طور خاص، مهار IL-1 با آناکینرا آنتاگونیست گیرنده، ایمنی آموزش دیده ناشی از گلوکان را مهار کرد. همچنین نشان داده شده است که رژیم غذایی غربی برنامه‌ریزی مجدد اپی ژنتیکی را در سلول‌های پیش‌ساز BM القا می‌کند، که منجر به یک ایمنی تمرین‌شده با واسطه التهاب می‌شود، که مسیرهای سیگنالی IL{5}} را در ایمنی آموزش‌دیده دخیل می‌کند. در دیابت، ما بررسی کردیم که آیا IL{9}} اثرات گلوکز بالا را در ایجاد ایمنی آموزش دیده افزایش می دهد یا خیر. اگرچه دیابت به تنهایی تأثیراتی را بر دسترسی کروماتین نشان داد (با تجزیه و تحلیل موتیف که شامل PU.1، RUNX1 و فاکتور اتصال CCCTC بود)، اثرات IL{12}}، در زمینه سلول‌هایی که توسط دیابت آغاز شده بودند، حتی بارزتر بود. و ERG، ZNF263 [پروتئین انگشت روی 263]، و RUNX1 دخیل است). این یک رابطه سلسله مراتبی را نشان می‌دهد که در آن ماکروفاژها توسط هیپرگلیسمی آغاز شده‌اند، اما در پاسخ به یک محرک دوم، تغییرات شدیدتری نشان می‌دهند.43 در واقع، به خوبی شناخته شده است که تغییرات در حالت‌های کروماتین در پروموترها می‌تواند زمینه ساز برهمکنش‌های عملکردی پیچیده بین محرک‌های مختلف فعال کننده ماکروفاژ باشد. به عنوان مثال، اگرچه IFN- قادر به فعال کردن بسیاری از ژن های القایی با LPS نیست، می تواند استیلاسیون هیستون و بازسازی کروماتین را در پروموتورهای آنها القا کند، در نتیجه سلول را برای فعال سازی آینده در پاسخ به LPS آماده می کند.

تجزیه و تحلیل موتیف در سایت‌های کروماتین باز، غنی‌سازی را در سایت‌های اتصال RUNX1 شناسایی کرد. از منظر عملکردی، RUNX1 برای تولید و نگهداری HSCها و تمایز دودمان‌های مختلف مورد نیاز است.58 در مونوسیت‌ها و ماکروفاژها، RUNX1 با PU.1 (همچنین در اینجا نقش دارد) برای تنظیم فاکتور محرک کلنی ماکروفاژ (فاکتور تحریک کننده کلنی) همکاری می‌کند. -1) گیرنده، که برای بقا، تمایز، و گسترش ماکروفاژها ضروری است. از ارتباط با اثرات حافظه عملکردی که ما در چسبندگی مونوسیت مشاهده کردیم، RUNX1 همچنین یک کنترل کننده مهم تعاملات مونوسیت-اندوتلیوم از طریق تنظیم آنتی ژن مرتبط با عملکرد لنفوسیت 1/CD11a.31 در نهایت، التهاب با واسطه گیرنده Toll مانند 4 و بیان بیش از حد RUNX1 تولید IL-6 و IL{20}} ناشی از گیرنده Toll مانند 4 را افزایش می‌دهد. RUNX1 به زیرواحد p50 فاکتور هسته‌ای-kB متصل می‌شود و به‌عنوان یک فعال‌کننده رونویسی هم‌افزایی می‌کند.60 روی هم، شواهدی برای همگرایی قوی عملکرد RUNX1 در ماکروفاژها به سمت تنظیم فرآیندهایی وجود دارد که در آتروژنز مهم هستند.

بنابراین، ما ژن‌های تحت کنترل احتمالی RUNX1 را با پروفایل‌های رونویسی سلول‌های مشتق‌شده از BMDM‌های موش و در ماکروفاژها از یک انسان مرتبط در محیط in vivo ارجاع دادیم. ماکروفاژهای پلاک آترواسکلروتیک انسانی و BMDMها، در حضور دیابت، ژن‌های تنظیم‌شده DE RUNX1-، از جمله چندین ژن که قبلاً با التهاب و تصلب شرایین مرتبط بودند، نشان دادند. ماکروفاژهای انسانی مشتق از دیابت که به مدت 6 روز در شرایط آزمایشگاهی کشت شده اند، پرایمینگ پیش التهابی را حفظ می کنند و هنگامی که با LPS و IFN یا فاکتور نکروز تومور تحریک می شوند، به یک فنوتیپ پیش التهابی هیپرپلاریزه می شوند.

جالب توجه است که برخی از این ژن‌های هدف RUNX1 بیان بیشتری را در ماکروفاژهای پلاک بیماران مبتلا به دیابت، یعنی CRNKL1 و PLA2G5 نشان می‌دهند، در حالی که برخی دیگر، مانند ZNF32 (پروتئین انگشت روی 32) و NUP214 (نوکلئوپورین 214)، بیان کمتری را در بیماران دیابتی نسبت به غیردیابتی نشان می‌دهند. ماکروفاژهای پلاکی اگرچه این ممکن است ظاهراً متناقض به نظر برسد، اما نشان داده شده است که RUNX1 هم بیان ژن را تقویت می کند و هم به عنوان یک سرکوب کننده رونویسی عمل می کند. کروماتین می تواند به هویت نتاج سلولی کمک کند. به عنوان مثال، اختلال در تعامل RUNX1 در طول میتوز منجر به انتقال اپیتلیال به مزانشیمی می شود.64 مهار دارویی RUNX1 با Ro، بیان ژن التهابی تغییر یافته مرتبط با ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی را در شرایط آزمایشگاهی عادی کرد. مداخله هدفمند علیه RUNX1 شواهد بیشتری از دخالت RUNX1 در اثرات پایین دست ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی در ماکروفاژها فراهم می کند.

القای ایمنی تمرین‌شده ناشی از هیپرگلیسمی در ماکروفاژهای محیطی به تنهایی می‌تواند باعث پیشرفت بیماری شود، اما با توجه به اثرات طولانی‌مدت ایمنی تمرین‌شده و طول عمر نسبتاً کوتاه سلول‌های میلوئید محیطی، ما استدلال کردیم که ایمنی تمرین‌شده نیز احتمالاً القا شده است. در سطح HSCs، همانطور که اخیراً برای -گلوکان و رژیم غذایی نوع غربی نشان داده شده است. 20 اگرچه مطالعات قبلی معمولاً تغییرات اپی ژنتیکی در ایمنی تمرین‌شده را به یک فنوتیپ آزمایشگاهی (مثلاً تولید سیتوکین) مرتبط می‌کنند، ما نشان می‌دهیم که چگونه ایمنی به طور مستقیم آموزش دیده است. باعث پیشرفت آترواسکلروز، یک آسیب شناسی مهم با یک جزء التهابی جدایی ناپذیر می شود. پیوند BM از موش های دیابتی به موش های مستعد آترواسکلروز طبیعی دارای اثرات مشخصی بر پیشرفت ضایعه بود و با افزایش هسته نکروزه غنی از چربی همراه بود، مطابق با شکل تهاجمی آترواسکلروز دیده شده در دیابت در انسان.

این مطالعه حول بررسی اثرات گلوکز/هیپرگلیسمی بالا ساخته شده است. برای اینکه بتوانیم اثرات بلندمدت هیپرگلیسمی، ویژگی‌های اصلی دیابت را مشخص کنیم، از مدل موش استرپتوزوتوسین دیابت به جای مدل موش دیابت نوع 2 استفاده کردیم، که ممکن است ویژگی‌های ظریف‌تری از آن سندروم را در خود جای داده باشد، اما به طور موثری آن را مخدوش می‌کند. مطالعات در مورد اثرات گلوکز تفاوت های مادی مهمی بین دیابت نوع 1 و نوع 2 وجود دارد. با این حال، هیپرگلیسمی در تشخیص آن‌ها مشترک است، خطر قلبی عروقی را در هرکدام به دنبال دارد، و برای سال‌ها هدف اصلی درمان‌ها و نظارت بر هر دو نوع دیابت بوده است. ما انتظار داریم که ایمنی آموزش دیده ناشی از هیپرگلیسمی که در اینجا گزارش شده است، در آینده به تفصیل توضیح داده شود تا تعدیل خاص تری در مورد بسیاری از تأثیرات بالقوه دیگر (مثلاً قند رژیم غذایی، 66 الگوی افزایش گلوکز، 67 هیپرلیپیدمی همزمان) در نظر گرفته شود.

یافته های ما پیامدهای مهمی برای مدیریت عوارض آترواسکلروتیک دیابت دارند. مهم‌ترین ویژگی‌های پروآتروژنیک سلول‌های میلوئیدی و پیش‌سازهای BM پس از عادی‌سازی گلوکز خون باقی می‌مانند. این ممکن است به توضیح عدم کارایی درمان‌های مرسوم کمک کند و اساساً رویکرد مدیریت خطر عروقی و عوارض دیابت را به چالش بکشد. شناسایی محرک های متابولیک و تغییرات اپی ژنتیکی خاص نیز اهداف درمانی جدید بالقوه را توصیه می کند.

اطلاعات مقاله

دریافت شده در 27 فوریه 2020؛ پذیرش در 23 ژوئن 2021.

وابستگی ها

بخش پزشکی قلب و عروق، گروه پزشکی رادکلیف، دانشگاه آکسفورد، انگلستان (LE، NA، ATB، JB، JTC، MA، KZ، RA، TJC، MJC، KMC، RC، RPC). مرکز تحقیقات CeMM برای پزشکی مولکولی آکادمی علوم اتریش، وین، اتریش (TK, AFR, CB). بخش شیمی فیزیولوژیکی II، گروه بیوشیمی پزشکی و بیوفیزیک، موسسه کارولینسکا، استکهلم، سوئد (HG-A.، CEW). گروه پزشکی تنفسی و آلرژی (HG-A.، CEW) و گروه پزشکی (H7) (JL، MR)، بیمارستان دانشگاه کارولینسکا، استکهلم، سوئد. موسسه روماتولوژی کندی، دانشگاه آکسفورد، انگلستان (ALC، TEK، IAU). موسسه هوش مصنوعی و پشتیبانی تصمیم، مرکز آمار پزشکی، انفورماتیک، و سیستم های هوشمند، دانشگاه پزشکی وین، اتریش (CB). Bioinfo، Plantagenet، ON، کانادا (MEL). گروه پزشکی داخلی، مرکز پزشکی دانشگاه رادبود، نایمگن، هلند (NPR.، MGN). گروه ژنومیک و تنظیم ایمنی، موسسه زندگی و علوم پزشکی (LIMES)، دانشگاه بن، آلمان (MGN).

نویسندگان از لیزا هدر، ماریا دا لوز سوزا فیاهلو و توماس میلن برای کمک‌شان تشکر می‌کنند. RPC، NA، و LE مطالعه را تصور کردند. LE تمام آزمایش‌های آزمایشگاهی، تجزیه و تحلیل بیان ژن و بلات ایمنی را انجام داد. MA به مطالعات در نمونه های انسانی کمک کرد. CEW و HG-A. متابولومیک مبتنی بر طیف سنجی جرمی انجام داد. JTC کار LCM ماکروفاژ انسانی و آماده سازی آرایه را انجام داد. LE آزمایش‌های Bioanalyser Seahorse را تحت هدایت JB و نظارت MJCALC انجام داد و تجزیه و تحلیل مرتب‌سازی سلولی را انجام داد. LE نمونه های RNA-seq را تهیه کرد. LE نمونه های ATAC-seq را تحت هدایت TEK و نظارت IAU تهیه کرد. NA تمام آماده سازی سلول های توالی یابی تراشه را انجام داد. توالی یابی توسط TK و AFR تحت نظارت CB انجام شد. MEL و ATB توالی‌بندی داده‌ها، نرمال‌سازی و کنترل کیفیت را با LE انجام تجزیه و تحلیل پایین‌دستی انجام دادند. MEL و ATB تجزیه و تحلیل داده های آرایه و توالی را انجام دادند. KZ، RA، و RC تحقیقات حیوانی را رهبری کردند. LE، NA، TJC، NPR و MGN در طراحی و اجرای آزمایشی شرکت کردند. RPC، LE، NA و MEL نسخه خطی را آماده کردند. همه نویسندگان مقاله را خوانده و تایید کردند.

منابع تامین مالی

این کار توسط مرکز تحقیقات عالی بنیاد قلب بریتانیا (RE/13/1/30181)، کمک مالی پروژه بنیاد قلب بریتانیا (دکتر اکبر و چودوری: PG/18/53/33895)، موسسه ملی تحقیقات سلامت پشتیبانی شده است. مرکز تحقیقات بیومدیکال آکسفورد، کنسرسیوم سه جانبه ایمونومتابولیسم – بنیاد نوو نوردیسک (اعطای NNF15CC0018486؛ دکترهای چودری، اودالوا، رایدن، چانون و ویللاک)، التهاب مرتبط با متابولیت در دیابت-بیماری جدید ، اعطا 0064142؛ دکترهای چودری، اودالوا، رایدن، و چانون) و 4-سال دکترای بنیاد قلب بریتانیا. دانشجویی و دوریس فیلد تراست (دکتر ادگار). گروه ژنومیکس با توان عملیاتی بالا در مرکز ولکام تراست برای ژنتیک انسانی توسط مرجع کمک مالی Wellcome Trust 090532/Z/09/Z و کمک مالی MRC Hub G0900747 91070 تامین مالی شد. مرکز توالی یابی زیست پزشکی در مرکز تحقیقات CeMM برای پزشکی مولکولی آکادمی علوم اتریش در وین اتریش. دکتر Riksen و Netea از برنامه تحقیقاتی و نوآوری افق 2020 اتحادیه اروپا تحت توافقنامه کمک مالی 667837 کمک مالی دریافت کردند. دکتر Netea توسط یک گرانت تثبیت کننده ERC (شماره 310372) و سازمان هلند برای تحقیقات علمی حمایت شد.

افشاگری ها

هیچ یک.

مواد تکمیلی

شکل های مکمل داده I–XI

مکمل داده فایل های اکسل I–VII

منابع

1. انجمن دیابت آمریکا. بیماری های قلبی عروقی و مدیریت خطر. مراقبت از دیابت. 2015؛ 38: S49–S57. doi: 10.2337/dc15-S011

2. Nathan DM، Cleary PA، Backlund JY، Genuth SM، Lachin JM، Orchard TJ، Raskin P، Zinman B; گروه مطالعاتی کنترل و عوارض دیابت / اپیدمیولوژی مداخلات و عوارض دیابت (DCCT/EDIC). درمان شدید دیابت و بیماری های قلبی عروقی در بیماران مبتلا به دیابت نوع 1. N Engl J Med. 2005؛ 353: 2643-2653. doi: 10.1056/NEJMoa052187

3. Nathan DM، Genuth S، Lachin J، Cleary P، Crofford O، Davis M، Rand L، Siebert C، گروه تحقیقاتی کارآزمایی کنترل و عوارض دیابت. تاثیر درمان فشرده دیابت بر ایجاد و پیشرفت عوارض طولانی مدت دیابت وابسته به انسولین. N Engl J Med. 1993؛ 329:977-986. doi: 10.1056/NEJM199309303291401

4. ACCORD، Gerstein HC، Miller ME، Genuth S، Ismail-Beigi F، Buse JB، Goff DC Jr، Probstfield JL، Cushman WC، Ginsberg HN، Bigger JT، و همکاران. اثرات طولانی مدت کاهش شدید گلوکز بر پیامدهای قلبی عروقی N Engl J Med. 2011؛ ​​364:818-828. doi: 10.1056/NEJMoa1006524

5. Zinman B, Wanner C, Lachin JM, Fitchett D, Bluhmki E, Hantel S, Mattheus M, Devins T, Johansen OE, Woerle HJ, et al; محققین نتیجه EMPA-REG. امپاگلیفلوزین، پیامدهای قلبی عروقی و مرگ و میر در دیابت نوع 2. N Engl J Med. 2015؛ 373: 2117-2128. doi: 10.1056/NEJMoa1504720

6. Newman JD، Vani AK، Aleman JO، Weintraub HS، Berger JS، Schwartzbard AZ. چشم انداز در حال تغییر درمان دیابت برای کاهش خطر قلبی عروقی: بررسی پیشرفته JACC. جی ام کول کاردیول. 2018؛ 72: 1856– 1869. doi: 10.1016/j.jacc.2018.07.071

7. چالمرز جی، کوپر ME. UKPDS و اثر میراث. N Engl J Med. 2008؛ 359:1618-1620. doi: 10.1056/NEJMe0807625

8. مور کی جی، شیدی اف جی، فیشر EA. ماکروفاژها در آترواسکلروز: تعادل پویا Nat Rev Immunol. 2013؛ 13:709-721. doi: 10.1038/nri3520

9. مارتینز FO، گوردون اس. پارادایم M1 و M2 فعال سازی ماکروفاژها: زمان برای ارزیابی مجدد. F1000Prime Rep. 2014; 6:13. doi: 10.12703/P6-13

10. Parathath S، Grauer L، Huang LS، Sanson M، Distel E، Goldberg IJ، Fisher EA. دیابت در طول رگرسیون پلاک آترواسکلروتیک در موش بر ماکروفاژها تأثیر منفی می گذارد. دیابت. 2011؛ ​​60: 1759-1769. doi: 10.2337/db10-0778

11. Shanmugam N، Reddy MA، Guha M، Natarajan R. بیان ژن های سیتوکین و کموکاین پیش التهابی ناشی از گلوکز در سلول های مونوسیتی. دیابت. 2003؛ 52: 1256-1264. doi: 10.2337/diabetes.52.5.1256

12. اونیل لس آنجلس، پیرس ای جی. ایمونومتابولیسم بر عملکرد سلول های دندریتیک و ماکروفاژها نظارت می کند. J Exp Med. 2016؛ 213:15-23. doi: 10.1084/jem.20151570

13. Vats D، Mukundan L، Odegaard JI، Zhang L، Smith KL، Morel CR، Wagner RA، Greaves DR، Murray PJ، Chawla A. متابولیسم اکسیداتیو و PGC-1بتا التهاب ناشی از ماکروفاژ را کاهش می‌دهند. سلول متاب. 2006؛ 4:13– 24. doi: 10.1016/j.cmet.2006.05.011

14. Tannahill GM، Curtis AM، Adamik J، Palsson-McDermott EM، McGettrick AF، Goel G، Frezza C، Bernard NJ، Kelly B، Foley NH، و همکاران. سوکسینات یک سیگنال التهابی است که IL-1 را از طریق HIF-1 القا می‌کند. طبیعت. 2013؛ 496:238-242. doi: 10.1038/nature11986

15. Renner K، Singer K، Koehl GE، Geissler EK، Peter K، Siska PJ، Kreutz M. علائم متابولیک تومور و سلول های ایمنی در ریزمحیط تومور. جلو ایمونول. 2017؛ 8:248. doi: 10.3389/fimmu.2017.00248

16. Stienstra R، Netea-Maier RT، Riksen NP، Joosten LAB، Netea MG. برنامه ریزی مجدد خاص و پیچیده متابولیسم سلولی در سلول های میلوئیدی در طی پاسخ های ایمنی ذاتی سلول متاب. 2017؛ 26:142-156. doi: 10.1016/j.cmet.2017.06.001

17. Bekkering S, Arts RJW, Novakovic B, Kourtzelis I, Van der Heijden CDCC, Li Y, Popa CD, Ter Horst R, van Tuijl J, Netea-Maier RT, et al. القای متابولیک ایمنی تمرین شده از طریق مسیر موالونات. سلول. 2018؛ 172:135-146.e9. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.025

18. Cheng SC، Quintin J، Cramer RA، Shepardson KM، Saeed S، Kumar V، Giamarellos-Bourboulis EJ، Martens JH، Rao NA، Aghajanirefah A، و همکاران. گلیکولیز هوازی با واسطه mTOR و HIF{3}}به عنوان پایه متابولیکی برای ایمنی تمرین‌شده. علوم پایه. 2014; 345:1250684. doi: 10.1126/ science.1250684

19. Donohoe DR، Bultman SJ. متابولواپی ژنتیک: روابط متقابل بین متابولیسم انرژی و کنترل اپی ژنتیکی بیان ژن. J Cell Physiol. 2012؛ 227: 3169-3177. doi: 10.1002/jcp.24054

20. Mitroulis I, Ruppova K, Wang B, Chen LS, Grzybek M, Grinenko T, Eugster A, Troullinaki M, Palladini A, Kourtzelis I, et al. تعدیل پیش سازهای میلوپوئیز جزء جدایی ناپذیر ایمنی آموزش دیده است. سلول. 2018؛ 172:147- 161.e12. doi: 10.1016/j.cell.2017.11.03421. Choudhury RP، Rong JX، Trogan E، Elmalem VI، Dansky HM، Breslow JL، Witztum JL، Fallon JT، Fisher EA. لیپوپروتئین های با چگالی بالا پیشرفت آترواسکلروز را به تعویق می اندازند و ضایعات را بدون سرکوب شاخص های التهاب یا اکسیداسیون بازسازی می کنند. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004؛ 24: 1904-1909. doi: 10.1161/01.ATV.0000142808.34602.25

22. Feig JE, Vengrenyuk Y, Reiser V, Wu C, Statnikov A, Aliferis CF, Garabedian MJ, Fisher EA, Puig O. رگرسیون آترواسکلروز با تغییرات گسترده در رونوشت ماکروفاژ پلاک مشخص می شود. PLoS One. 2012؛ 7: e39790. doi: 10.1371/journal.pone.0039790

23. Trogan E، Choudhury RP، Dansky HM، Rong JX، Breslow JL، Fisher EA. تجزیه و تحلیل میکرودیسکشن با لیزر بیان ژن در ماکروفاژها از ضایعات آترواسکلروتیک موش‌های دارای کمبود آپولیپوپروتئین E. Proc Natl Acad Sci USA. 2002؛ 99: 2234-2239. doi: 10.1073/pnas.042683999

24. Huber W، Carey VJ، Gentleman R، Anders S، Carlson M، Carvalho BS، Bravo HC، Davis S، Gatto L، Girke T، و همکاران. تنظیم تجزیه و تحلیل ژنومی با توان بالا با Bioconductor. روش‌های Nat 2015؛ 12:115-121. doi: 10.1038/nmeth.3252

25. Dunning MJ، Smith ML، Ritchie ME، Tavaré S. Beadarray: کلاس‌ها و روش‌های R برای داده‌های مبتنی بر مهره Illumina. بیوانفورماتیک. 2007؛ 23:2183– 2184. doi: 10.1093/bioinformatics/btm311

26. Ritchie ME، Phipson B، Wu D، Hu Y، Law CW، Shi W، Smyth GK. تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل لیما برای توالی یابی RNA و مطالعات ریزآرایه. Nucleic Acids Res. 2015؛ 43: e47. doi: 10.1093/nar/gkv007

27. Kamleh MA، Snowden SG، Grapov D، Blackburn GJ، Watson DG، Xu N، Ståhle M، Wheelock CE. متابولومیک LC-MS بیماران پسوریازیس نشان دهنده افزایش وابسته به شدت بیماری در اسیدهای آمینه در گردش است که با درمان ضد TNF بهبود می یابد. J Proteome Res. 2015؛ 14:557-566. doi: 10.1021/pr500782g

28. Buenrostro JD، Wu B، Chang HY، Greenleaf WJ. ATAC-seq: روشی برای سنجش قابلیت دسترسی کروماتین در کل ژنوم. Curr Protoc Mol Biol. 2015؛ 109:21.29.1–21.29.9. doi: 10.1002/0471142727.mb2129s109

29. Zhang Y، Liu T، Meyer CA، Eeckhoute J، Johnson DS، Bernstein BE، Nusbaum C، Myers RM، Brown M، Li W، و همکاران. تجزیه و تحلیل مبتنی بر مدل از ChIPSeq (MACS). ژنوم بیول. 2008؛ 9: R137. doi: 10.1186/gb-2008-9-9-r137

30. Ross-Innes CS, Stark R, Teschendorff AE, Holmes KA, Ali HR, Dunning MJ, Brown GD, Gojis O, Ellis IO, Green AR, et al. اتصال متفاوت گیرنده استروژن با نتایج بالینی در سرطان پستان مرتبط است. طبیعت. 2012؛ 481:389-393. doi: 10.1038/nature10730

31. Puig-Kröger A, Sanchez-Elsner T, Ruiz N, Andreu EJ, Prosper F, Jensen UB, Gil J, Erickson P, Drabkin H, Groner Y, et al. فاکتورهای RUNX/AML و C/EBP بیان اینتگرین CD11a را در سلول‌های میلوئیدی از طریق عناصر تنظیمی همپوشانی تنظیم می‌کنند. خون 2003؛ 102:3252-3261. doi: 10.1182/ blood{10}}

32. McLean CY، Bristor D، Hiller M، Clarke SL، Schaar BT، Lowe CB، Wenger AM، Bejerano G. GREAT تفسیر عملکردی مناطق سیس تنظیمی را بهبود می بخشد. Nat Biotechnol. 2010؛ 28:495-501. doi: 10.1038/not.1630

33. Machanick P، Bailey TL. MEME-ChIP: تجزیه و تحلیل موتیف مجموعه داده های DNA بزرگ. بیوانفورماتیک. 2011؛ ​​27:1696-1697. doi: 10.1093/bioinformatics/btr189

34. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, ​​Chaisson M, Gingeras TR. STAR: تراز کننده فوق سریع جهانی RNA-seq. بیوانفورماتیک. 2013؛ 29:15-21. doi: 10.1093/bioinformatics/bts635

35. مک کارتی دی جی، چن ای، اسمیت جی کی. تجزیه و تحلیل بیان دیفرانسیل آزمایش‌های چند عاملی RNA-Seq در مورد تنوع بیولوژیکی Nucleic Acids Res. 2012؛ 40: 4288-4297. doi: 10.1093/nar/gks042

36. Kolde R. نقشه حرارتی زیبا. 2015. مشاهده شده در 24 ژوئن 2021. https://rdrr.io/ can/heatmap/

37. Freemerman AJ، Johnson AR، Sacks GN، Milner JJ، Kirk EL، Troester MA، Macintyre AN، Goraksha-Hicks P، Rathmell JC، Makowski L. برنامه ریزی مجدد متابولیک ماکروفاژها: انتقال دهنده گلوکز 1 (GLUT1) - متابولیسم درایوهای گلوکز با واسطه یک فنوتیپ پیش التهابی جی بیول شیمی. 2014؛ 289: 7884-7896. doi: 10.1074/jbc.M113.522037

38. Herbin O، Regelmann AG، Ramkhelawon B، Weinstein EG، Moore KJ، Alexandropoulos K. چسبندگی مونوسیت و جذب پلاک در طول توسعه آترواسکلروز توسط پروتئین آداپتور ChatH/SHEP1 تنظیم می شود. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016؛ 36: 1791-1801. doi: 10.1161/ATVBAHA.116.308014

39. Luo Y، Duan H، Qian Y، Feng L، Wu Z، Wang F، Feng J، Yang D، Qin Z، Yan X. CD146 ماکروفاژیک تشکیل سلول های کف و حفظ آن را در طول تصلب شرایین ترویج می کند. Cell Res. 2017؛ 27:352-372. doi: 10.1038/cr.2017.8

40. اقبال ای جی، مک نیل ای، کاپلوس تی اس، ریگان-کومیتو دی، نورمن اس، برد اس، اسمارت ان، ماچمر دی، استیلیانو ای، مک شین اچ، و همکاران. موش‌های تراریخته GFP پروموتر CD68 انسانی امکان تجزیه و تحلیل تمایز مونوسیت به ماکروفاژ را در داخل بدن فراهم می‌کنند. خون 2014؛ 124: e33–e44. doi: 10.1182/blood{11}}

41. Arts RJW، Carvalho A، La Rocca C، Palma C، Rodrigues F، Silvestre R، Kleinnijenhuis J، Lachmandas E، Gonçalves LG، Belinha A، و همکاران. مسیرهای ایمونومتابولیک در ایمنی آموزش دیده ناشی از BCG Cell Rep. 2016؛ 17:2562-2571. doi: 10.1016/j.celrep.2016.11.011

42. Moorlag SJCFM، Röring RJ، Joosten LAB، Netea MG. نقش خانواده اینترلوکین-1 در ایمنی آموزش دیده. Immunol Rev. 2018؛ 281:28-39. doi: 10.1111/or.12617

43. هردر سی، Dalmas E، Böni-Schnetzler M، Donath MY. مسیر IL{2}} در دیابت نوع 2 و عوارض قلبی عروقی. Trends Endocrinol Metab. 2015؛ 26:551-563. doi: 10.1016/j.tem.2015.08.001

44. Engelbertsen D، Rattik S، Wigren M، Vallejo J، Marinkovic G، Schiopu A، Björkbacka H، Nilsson J، Bengtsson E. IL-1R و سیگنالینگ MyD88 در سلول های CD4 به علاوه T باعث ارتقای ایمنی Th17 و تصلب شرایین می شود. . Cardiovasc Res. 2018؛ 114:180-187. doi: 10.1093/cvr/cvx196

45. Nagareddy PR، Kraakman M، Masters SL، Stirzaker RA، Gorman DJ، Grant RW، Dragoljevic D، Hong ES، Abdel-Latif A، Smyth SS، و همکاران. ماکروفاژهای بافت چربی باعث ایجاد میلوپوئز و مونوسیتوز در چاقی می شوند. سلول متاب. 2014؛ 19:821-835. doi: 10.1016/j.cmet.2014.03.029

46. ​​Bevington SL، Cauchy P، Piper J، برتراند E، Lalli N، Jarvis RC، Gilding LN، Ott S، Bonifer C، Cockerill PN. پرایمینگ کروماتین القایی با ایجاد حافظه ایمونولوژیک در سلول های T مرتبط است. EMBO J. 2016؛ 35:515-535. doi: 10.15252/bj.201592534

47. Buske FA, Bodén M, Bauer DC, Bailey TL. اختصاص نقش به موتیف های تنظیم کننده DNA با استفاده از ژنومیک مقایسه ای بیوانفورماتیک. 2010؛ 26: 860–866. doi: 10.1093/bioinformatics/btq049

48. Puig O, Yuan J, Stepaniants S, Zieba R, Zycband E, Morris M, Coulter S, Yu X, Menke J, Woods J, et al. یک امضای بیان ژن که پلاک آترواسکلروتیک انسانی را بر اساس وضعیت التهاب نسبی طبقه بندی می کند. Circ Cardiovasc Genet. 2011؛ ​​4:595-604. doi: 10.1161/CIRCGENETICS.111.960773

49. Turner RJ, Bushnell CD, Register TC, Sharp FR. همبستگی وابسته به جنسیت ضخامت انتیما مدیا کاروتید با بیان ژن در خون Transl Stroke Res. 2011؛ ​​2:171-178. doi: 10.1007/s12975-011-0066-4

50. Webb NR، Bostrom MA، Szilvassy SJ، Van der Westhuyzen DR، Daugherty A، de Beer FC. فسفولیپاز ترشحی A2 گروه IIA بیان شده با ماکروفاژها، تشکیل ضایعات آترواسکلروتیک را در موش‌های فاقد گیرنده LDL افزایش می‌دهد. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003؛ 23:263-268. doi: 10.1161/01.atv.0000051701.90972.e5

51. Cunningham L, Finckbeiner S, Hyde RK, Southall N, Marugan J, Yedavalli VR, Dehdashti SJ, Reinhold WC, Alemu L, Zhao L, et al. شناسایی بنزودیازپین Ro5-3335 به عنوان یک مهارکننده لوسمی CBF از طریق صفحه نمایش کمی با توان بالا در برابر تعامل RUNX1-CBF. Proc Natl Acad Sci USA. 2012؛ 109: 14592-14597. doi: 10.1073/pnas.1200037109

52. Reaven PD، Emanuele NV، Wiitala WL، Bahn GD، Reda DJ، McCarren M، Duckworth WC، Hayward RA; محققین VADT کنترل شدید گلوکز در بیماران مبتلا به دیابت نوع 2: 15- سال پیگیری. N Engl J Med. 2019؛ 380: 2215–2224. doi: 10.1056/NEJMoa1806802

53. Arts RJ، Joosten LA، Netea MG. مدارهای ایمونومتابولیک در ایمنی آموزش دیده سمین ایمونول. 2016؛ 28:425-430. doi: 10.1016/j.smim.2016.09.00254. کوئینتین جی، سعید اس، مارتنز JHA، جیمارلوس-بوربولیس ای جی، Ifrim DC، Logie C، Jacobs L، Jansen T، Kullberg BJ، Wijmenga C، و همکاران. عفونت کاندیدا آلبیکنس از طریق برنامه ریزی مجدد عملکردی مونوسیت ها در برابر عفونت مجدد محافظت می کند. میکروب میزبان سلولی 2012؛ 12:223-232. doi: 10.1016/j. com.2012.06.006

55. Zhang D، Tang Z، Huang H، Zhou G، Cui C، Weng Y، Liu W، Kim S، Lee S، Perez-Neut M، و همکاران. تنظیم متابولیک بیان ژن با استیلاسیون هیستون طبیعت. 2019؛ 574:575-580. doi: 10.1038/s41586-019-1678-1

56. Christ A, Günther P, Lauterbach MAR, Duewell P, Biswas D, Pelka K, Scholz CJ, Oosting M, Haendler K, Baßler K, et al. رژیم غذایی غربی برنامه ریزی مجدد سیستم ایمنی ذاتی وابسته به NLRP را تحریک می کند. سلول. 2018؛ 172:162-175.e14. doi: 10.1016/j.cell.2017.12.013

57. Glass CK، Natoli G. کنترل مولکولی فعال سازی و پرایمینگ در ماکروفاژها. نات ایمونول. 2016؛ 17:26-33. doi: 10.1038/ni.3306

58. Voon DC، Hor YT، Ito Y. کمپلکس RUNX: فراتر از خونسازی به ایمنی می رسد. ایمونولوژی. 2015؛ 146:523-536. doi: 10.1111/imm.12535

59. Himes SR، Cronau S، Mulford C، Hume DA. فاکتور رونویسی Runx1 رشد و بقای ماکروفاژها را وابسته و مستقل از CSF-1-کنترل می‌کند. انکوژن. 2005؛ 24:5278-5286. doi: 10.1038/SJ. onc.1208657

60. Zhang S، Yu M، Guo Q، Li R، Li G، Tan S، Li X، Wei Y، Wu M. Annexin A2 به اندوزوم ها متصل می شود و به طور منفی پاسخ های التهابی TLR4- را از طریق TRAM- تنظیم می کند. مسیر TRIF. Sci Rep. 2015؛ 5:15859. doi: 10.1038/srep15859

61. Alrdahe S، Al Sadoun H، Torbica T، McKenzie EA، Bowling FL، Boulton AJM، Mace KA. اختلال در رشد و فنوتیپ ماکروفاژها در ماکروفاژهای انسان دیابتی را می توان با انتقال پروتئین Hoxa3 نجات داد. PLoS One. 2019؛ 14:e0223980. doi: 10.1371/journal.pone.0223980

62. Durst KL، Hiebert SW. نقش اعضای خانواده RUNX در سرکوب رونویسی و خاموش کردن ژن انکوژن. 2004؛ 23:4220-4224. doi: 10.1038/sj.onc.1207122

63. Amann JM، Nip J، Strom DK، Lutterbach B، Harada H، Lenny N، Downing JR، Meyers S، Hiebert SW. ETO، هدف t(8;21) در لوسمی حاد، تماس های مشخصی با هیستون داستیلازهای متعدد ایجاد می کند و mSin3A را از طریق دامنه الیگومریزاسیون آن متصل می کند. Mol Cell Biol. 2001؛ 21: 6470-6483. doi: 10.1128/MCB.21.19.{12}}.2001

64. رز JT، Moskovitz E، Boyd JR، Gordon JA، Bouffard NA، Fritz AJ، Illendula A، Bushweller JH، Lian JB، Stein JL، و همکاران. مهار کمپلکس فاکتور رونویسی RUNX1-CBF هویت سلول های اپیتلیال پستانی را به خطر می اندازد: فنوتیپی که به طور بالقوه با نشانک گذاری ژن میتوزی تثبیت می شود. انکوتارگت. 2020؛ 11:2512-2530. doi: 10.18632/oncotarget.27637

65. Moreno PR، Murcia AM، Palacios IF، Leon MN، Bernardi VH، Fuster V، Fallon JT. ترکیب کرونر و انفیلتراسیون ماکروفاژها در نمونه های آترکتومی بیماران مبتلا به دیابت. جریان. 2000؛ 102:2180- 2184. doi: 10.1161/01.cir.102.18.2180

66. Perazza LR, Mitchell PL, Jensen BAH, Daniel N, Boyer M, Varin TV, Bouchareb R, Nachbar RT, Bouchard M, Blais M, et al. ساکارز غذایی در موش‌های LDLr-/-ApoB100/100، التهاب متابولیک و بیماری‌های قلبی عروقی آترواسکلروتیک را بیشتر از چربی رژیم غذایی القا می‌کند. آترواسکلروز. 2020؛ 304:9-21. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2020.05.002

67. Flynn MC، Kraakman MJ، Tikellis C، Lee MKS، Hanssen NMJ، Kammoun HL، Pickering RJ، Dragoljevic D، Al-Sharea A، Barrett TJ، و همکاران. هیپرگلیسمی متناوب گذرا با ترویج میلوپوئز، آترواسکلروز را تسریع می کند. Circ Res. 2020؛ 127:877-892. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.120. 316653

لارنس ادگار، DPhil*; نوید اکبر، دکتری *; Adam T. Braithwaite، Ph.D. توماس کراوسگروبر، دکتری؛ Héctor Gallart-Ayala، Ph.D. جید بیلی، DPhil; Alastair L. Corbin، DPhil; Tariq E. Khoyratty, DPhil; جاشوا تی. چای، DPhil; محمد الخلیل، DPhil; آندره F. Rendeiro، Ph.D. کلمن زیبرنا، DPhil; ریتو آریا، MRes; توماس جی. کیهیل، DPhil; کریستف باک، دکترا. Jurga Laurencikiene، Ph.D. Mark J. Crabtree، Ph.D. Madeleine E. Lemieux, Ph.D. Niels P. Riksen، MD، Ph.D. Mihai G. Netea، MD، Ph.D. Craig E. Wheelock، Ph.D. کیت ام. چانون، MD; Mikael Rydén، MD، Ph.D. ایرینا آ. اودالوا، دکترا. ریکاردو کارنیسر، Ph.D. Robin P. Choudhury, DM.

For more information:1950477648nn@gmail.com