شناسایی لیپوکالین مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز به عنوان یک بیومارکر جدید ادراری اولیه برای آسیب ایسکمیک کلیه

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

جایا میشرا، * کینگ ما، * آن پرادا، * مارک میتسنفس، * کامیار زاهدی، * جون یانگ، † جاناتان باراش، و پراساد دواراجان*

* نفرولوژی و فشار خون، مرکز پزشکی بیمارستان کودکان سینسیناتی، سینسیناتی، اوهایو؛ و † نفرولوژی، کالج پزشکان و جراحان، دانشگاه کلمبیا، نیویورک، نیویورک

خلاصه.

حادکلیهشکست (ARF) ثانویه به آسیب ایسکمیک یک مشکل شایع و بالقوه ویرانگر است. برای شناسایی ژن‌های کلیوی که خیلی زود پس از ایسکمی کلیوی القا می‌شوند، از یک استراتژی بازجویی گسترده رونوشت استفاده شد، که محصولات پروتئینی آن ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی جدید برای ARF عمل کنند. هفت ژن با تنظیم مثبت به اضافه - 10- برابر شناسایی شدند که اخیراً گزارش شده است که یکی از آنها (Cyr61) پس از ایسکمی کلیوی القا شده است. به طور غیرمنتظره ای، القای شش رونوشت دیگر به حوزه ARF بدیع بود. در این مطالعه، یکی از این ژن‌هایی که قبلاً شناسایی نشده بود، یعنی لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL) بیشتر مشخص شد، زیرا این یک پلی پپتید ترشح شده کوچک است که مقاوم به پروتئاز است و در نتیجه ممکن است به راحتی در ادرار شناسایی شود. دگرگونی مشخص سطح mRNA و پروتئین NGAL در موش اولیه پس از ایسکمیککلیهتایید شد. بیان پروتئین NGAL عمدتا در تکثیر سلول های توبول پروگزیمال آنتی ژن مثبت هسته ای، در یک توزیع سیتوپلاسمی نقطه ای که با نشانگرهای آندوزوم های دیررس هم زمان است، شناسایی شد. NGAL در اولین خروجی ادرار پس از ایسکمی در هر دو مدل موش و موش ARF به راحتی در ادرار تشخیص داده شد. ظهور NGAL در ادرار به دوز و مدت زمان مربوط بودکلیهایسکمی و قبل از ظهور سایر نشانگرهای ادراری مانند N-acetyl- -D-glucosaminidase و 2-microglobulin. منشا NGAL از سلول‌های توبول در سلول‌های توبول پروگزیمال انسانی کشت‌شده که در معرض آسیب ایسکمیک آزمایشگاهی قرار گرفته بودند، تأیید شد، جایی که mRNA NGAL به سرعت در سلول‌ها القا شد و پروتئین NGAL به راحتی در محیط کشت ظرف 1 ساعت پس از کاهش خفیف ATP قابل تشخیص بود. NGAL همچنین به راحتی در ادرار موش‌هایی که سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین داشتند، قابل تشخیص بود، که دوباره قبل از ظهور N-استیل- -D-گلوکوزامینیداز و 2-میکروگلوبولین بود. نتایج نشان می دهد که NGAL ممکن است نشانگر بیومارکر ادراری اولیه، حساس و غیر تهاجمی برای ایسکمیک و نفروتوکسیک باشد.کلیهصدمه.

گیاه سیستانچمی تواند آسیب کلیوی را درمان کند

اطلاعات بیشتری در مورد محصولات مربوط به Cistanche دریافت کنید

حادکلیهشکست(ARF) ثانویه به آسیب ایسکمیک یا نفروتوکسیک، یک مشکل شایع و بالقوه ویرانگر در نفرولوژی بالینی باقی می‌ماند و با وجود پیشرفت‌های قابل توجه در مراقبت‌های حمایتی، میزان مرگ و میر به طور مداوم بالا است (1-4). مطالعات پیشگام در طی چندین دهه نقش انقباض عروق مداوم، انسداد لوله، تغییرات ساختاری و متابولیکی سلولی و پاسخ التهابی را در پاتوژنز ARF روشن کرده است (4-7). اگرچه این مطالعات راه را برای رویکردهای درمانی موفق در مدل‌های حیوانی هموار کرده است، تلاش‌های تحقیقاتی ترجمه‌ای در انسان نتایج ناامیدکننده‌ای را به همراه داشته است (2-4). دلایل این امر ممکن است شامل پاسخ چندوجهی کلیه به ایسکمی و نفروتوکسین ها و کمبود نشانگرهای اولیه برای ARF با تاخیر در شروع درمان باشد (4-8).

تلاش برای کشف اولیه اساس مولکولی این تعداد بی شمارکلیهپاسخ‌ها با پیشرفت‌های اخیر در ژنومیک عملکردی تسهیل شده‌اند که ابزارهای جدیدی را برای تجزیه و تحلیل گسترده ژنوم فرآیندهای پیچیده بیولوژیکی مانند ARF ایسکمیک به دست آورده‌اند (8-11). روش‌های ریزآرایه cDNA پروفایل‌های بیانی موازی و کمی هزاران ژن را ارائه می‌کنند که وقتی با ابزارهای بیوانفورماتیک ترکیب می‌شوند می‌توانند ژن‌ها را در یک مسیر بیولوژیکی شناسایی کنند، عملکرد ژن‌های جدید را مشخص کنند و زیررده‌های بیماری را شناسایی کنند (9). با استفاده از این تکنیک غربالگری، ما زیرمجموعه ای از هفت ژن را شناسایی کرده ایم که بیان آنها در چند ساعت اول پس از ایسکمیک 0- برابر تنظیم می شود.کلیهصدمهدر مدل ماوس یکی از این رونوشت ها، پروتئین غنی از سیستئین 61 (Cyr61)، اخیراً تأیید شده است که توسط ایسکمی کلیوی القا می شود (8)، اما رفتار شش ژن دیگر که به طور متفاوت بیان می شوند، برای ادبیات ARF جدید است. در این مطالعه، ما تصمیم گرفتیم یکی از این ژن‌های ناشناخته قبلی، یعنی لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL) را مشخص کنیم، زیرا این یک پلی پپتید ترشح شده کوچک است که ممکن است در ادرار، به ویژه، به دلیل مقاوم بودن به پروتئاز، قابل تشخیص باشد. نتایج ما نشان می دهد که NGAL ممکن است نشانگر بیومارکر ادراری جدید برای ایسکمیک و نفروتوکسیک باشد.کلیهصدمه.

مواد و روش ها

مدل موش آسیب ایسکمی کلیه - خونرسانی مجدد

ما از مدل‌های موش تثبیت‌شده استفاده کردیم که در آن پیامدهای ساختاری و عملکردی دوره‌های کوتاهکلیهایسکمی قبلاً ثبت شده است (11-15). به طور خلاصه، موش‌های نر سوئیس وبستر (Taconic Farms، Germantown، NY) با وزن 25 تا 35 گرم با چرخه نور: تاریکی 12:12- ساعت نگهداری شدند و به آنها اجازه دسترسی آزاد به غذا و آب داده شد. حیوانات با پنتوباربیتال سدیم (5{13}} میلی‌گرم/کیلوگرم به صورت داخل صفاقی) بیهوش شدند و روی میز گرم‌کننده قرار گرفتند تا دمای رکتوم 37 درجه حفظ شود. از سه پروتکل جداگانه استفاده شد: (1) ایسکمی یک طرفه بدون ARF، (2) ایسکمی دو طرفه با ARF، و (3) ایسکمی خفیف تحت بالینی دو طرفه. برای آزمایش های ایسکمی یک طرفه، ساقه کلیه چپ با یک گیره عروقی بدون ضربه به مدت 45 دقیقه مسدود شد و در طی این مدت کلیه گرم و مرطوب نگه داشته شد. سپس گیره برداشته شد، کلیه برای برگشت جریان خون مشاهده شد و برش بخیه شد. به موش‌ها اجازه داده شد تا در یک قفس گرم شده بهبود یابند و جمع‌آوری ادرار به‌موقع انجام شد. پس از 0، 3، 12 یا 24 ساعت خونرسانی مجدد، حیوانات دوباره بیهوش شدند، حفره شکمی باز شد و خون از طریق سوراخ کردن ورید اجوف تحتانی برای اندازه گیری کراتینین سرم توسط کیت سنجش رنگ سنجی کمی گرفته شد (سیگما، سنت لوئیس، MO). موش ها کشته شدند، کلیه ها با پرفیوژن در محل با 4 درصد پارافورمالدئید در PBS تثبیت شدند و هر دو کلیه برداشت شدند (کلیه راست به عنوان کنترل برای هر حیوان عمل می کرد). حداقل سه حیوان جداگانه در هر یک از دوره های جریان مجدد مورد بررسی قرار گرفتند. نیمی از هر کلیه در نیتروژن مایع منجمد شد و تا پردازش بعدی در دمای 70 درجه نگهداری شد. یک نمونه در فرمالین تثبیت شد، پارافین جاسازی شد و برش (4 متر) انجام شد. مقاطع پارافینی با هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شد و از نظر بافت شناسی بررسی شد. کلیه های بسته شده تغییرات مورفولوژیکی مشخصه ناشی از آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد را نشان دادند، همانطور که قبلا توسط دیگران (12-14) و ما (11) منتشر شده بود. نیمه دیگر هر کلیه در ترکیب OCT (Tissue-Tek) تعبیه شد و بخش های منجمد (4 متر) برای ایمونوهیستوشیمی به دست آمد. برای ایسکمی دو طرفه با آزمایش‌های ARF، هر دو کلیه به مدت 30 دقیقه بسته شدند و در دوره‌های مختلف جریان مجدد همانطور که در بالا توضیح داده شد مورد بررسی قرار گرفتند. این گروه از هشت حیوان برای نشان دادن ARF بالینی طراحی شد و افزایش قابل توجهی در کراتینین سرم در 24 ساعت پس از آسیب نشان داد. برای آزمایش‌های ایسکمی تحت بالینی خفیف دو طرفه، هر دو کلیه فقط به مدت 5، 10 یا 20 دقیقه بسته شدند و در دوره‌های مختلف خونرسانی مجدد به شرح بالا مورد بررسی قرار گرفتند. این درجه خفیف آسیب برای شبیه سازی ایسکمی کلیوی تحت بالینی طراحی شده بود و موش های این گروه هیچ افزایشی در کراتینین سرم اندازه گیری شده در 24 ساعت پس از آسیب نشان ندادند.

مدل موش آسیب ایسکمی کلیوی- خونرسانی مجدد

ما از مدل های جوندگان به خوبی تثبیت شده استفاده کردیمکلیهآسیب ایسکمی خونرسانی مجدد (10). به طور خلاصه، موش‌های نر نژاد Sprague-Dawley با وزن 200 تا 250 گرم (Taconic Farms) با کتامین (150 گرم در گرم) و زایلازین (3 گرم در گرم) بیهوش شدند و به مدت 30 دقیقه تحت انسداد شریان کلیوی دو طرفه با گیره‌های میکروواسکولار قرار گرفتند. پروتکل ماوس جمع‌آوری ادرار زمان‌بندی‌شده در ساعت‌های 3، 6، 9، 12 و 24 خون‌رسانی مجدد به‌دست آمد و خون برای اندازه‌گیری کراتینین در زمان کشتن (24 ساعت) جمع‌آوری شد.

مدل موش آسیب کلیوی ناشی از سیس پلاتین

ما از مدل‌های موش تثبیت‌شده استفاده کردیم که در آن عواقب ساختاری و عملکردی تجویز سیس پلاتین قبلاً مستند شده است (16-18). به طور خلاصه، به موش ها یک تزریق داخل صفاقی سیس پلاتین (20 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) داده شد. این منجر به نکروز سلولی توبول و آپوپتوز و افزایش نیتروژن اوره خون در عرض 3 روز پس از تزریق سیس پلاتین می شود (16-18). حیوانات در قفس‌های متابولیک نگهداری می‌شدند و ادرار روزانه جمع‌آوری می‌شد.

جداسازی RNA

کل بافت کلیه موش (یا سلولهای توبول پروگزیمال انسانی کشت داده شده؛ به زیر مراجعه کنید) با یک ترس بافتی (Biospec Products, Racine, WI) مختل شدند. RNA کل از کلیه های کنترل و ایسکمیک با استفاده از کیت RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) جدا شد و با اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد.

رویه های ریزآرایه

توضیحات مفصلی از سخت افزار و رویه های ریزآرایه قبلاً منتشر شده است (11). به طور خلاصه، برای هر آزمایش، 1{14}} 0 گرم از RNA کلیوی کل موش خالص شده با رونویسی معکوس Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) در حضور Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway، NJ) برای کنترل و Cy{3}}dUTP برای نمونه‌های ایسکمیک. نمونه‌های cDNA با استفاده از فیلتر Microcon YM{4}} (میلیپور، مدیسون، WI) خالص شدند و به اسلایدهای ریزآرایه‌ای حاوی 8979 پروب موش تأیید شده با توالی منحصربه‌فرد هیبرید شدند (11). سه حیوان جداگانه برای هر یک از دوره‌های جریان مجدد مورد بررسی قرار گرفتند و حداقل دو آزمایش ریزآرایه مستقل برای هر یک از حیوانات انجام شد. اسلایدهای آرایه با استفاده از یک اسکنر ریزآرایه (GenePix 4000B؛ Axon Instruments، Foster City، CA) اسکن شدند تا تصاویر TIFF جداگانه برای فلورسانس Cy3 و Cy5 به دست آید. شدت سیگنال برای Cy3 و Cy5 برای ژن های فردی با استفاده از نرم افزار استخراج داده GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments) تعیین شد. کنترل کیفیت و تجزیه و تحلیل داده ها همانطور که قبلا توضیح داده شد تکمیل شد (11).

گیاه سیستانچ برای کلیه

رونویسی معکوس نیمه کمی - PCR

مقدار مساوی (1 به علاوه - گرم) از RNA کل از کلیه های موش کنترل و تجربی با رونویسی معکوس Superscript II (Life Technologies) در حضور هگزامرهای تصادفی طبق دستورالعمل سازنده رونویسی معکوس شد. PCR با استفاده از کیت (روش، ایندیاناپولیس، IN) و پرایمرهای زیر انجام شد: موش NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3'، موش NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG، انسان{7}' حس 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3'، و ضد حس انسانی NGAL 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. جفت آغازگر برای موش و انسان - اکتین و گلیسرآلدئید{15}} فسفات دهیدروژناز (GAPDH) از Clontech (La Jolla، CA) به دست آمد. واکنش‌های ساختگی فاقد cDNA به عنوان کنترل منفی عمل کردند. محصولات PCR با الکتروفورز ژل آگارز و سپس رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید آنالیز و با چگالی سنجی اندازه‌گیری شدند. تغییرات برابر در بیان mRNA NGAL در کلیه های ایسکمیک در مقابل کلیه های کنترل پس از عادی سازی برای تقویت -اکتین یا GAPDH بیان شد.

میکروسکوپی

برای تشخیص NGAL، مقاطع منجمد با {{0}}}.2 درصد Triton X-100 در PBS به مدت 10 دقیقه نفوذپذیر شدند، با سرم بز به مدت 1 ساعت مسدود شدند و با آنتی بادی اولیه به NGAL انکوبه شدند. رقت 1:500) به مدت 1 ساعت. اسلایدها سپس به مدت 30 دقیقه در تاریکی در معرض آنتی بادی‌های ثانویه کونژوگه شده با Cy5 (Amersham، Arlington Heights، IL) قرار گرفتند و با میکروسکوپ فلورسانس (Zeiss Axiophot) مجهز به فیلتر رودامین مشاهده شدند. برای محلی سازی همزمان NGAL با Rab11، مقاطع سریال ابتدا با آنتی بادی NGAL یا یک آنتی بادی مونوکلونال به Rab11 (رقت 1:500؛ آزمایشگاه های ترانسدوکشن)، سپس با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با Cy5 (برای NGAL) یا Cy3 (برای Rab11) انکوبه شدند. ) و به ترتیب با فیلترهای رودامین یا فلورسین تجسم می شود. برای محلی سازی همزمان NGAL با آنتی ژن هسته ای سلولی در حال تکثیر (PCNA)، بخش ها با آنتی بادی NGAL و یک آنتی بادی مونوکلونال به PCNA (رقت 1:500؛ Upstate) همزمان انکوبه شدند و با رنگ آمیزی ایمونوپرواکسیداز (سیستم رنگ آمیزی ایمونوکروز)، تشخیص داده شد. بیوتکنولوژی سانتا کروز). برای سنجش TUNEL، ما از کیت سنجش تکه تکه شدن DNA ApoAlert (Clontech) استفاده کردیم. مقاطع پارافین از طریق زایلن و گریدهای نزولی اتانول پارافین زدایی شدند، با 4 درصد فرمالدئید/PBS به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه تثبیت شدند، با پروتئیناز K در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه و 0.2 درصد Triton X{28}}/PBS به مدت 15 نفوذ پذیر شدند. دقیقه در دمای 4 درجه و با مخلوطی از نوکلئوتیدها و آنزیم TdT به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد. واکنش با 2 SSC خاتمه یافت، و مقاطع با PBS شسته شدند و با Crystal/mount (Biomed, Foster City, CA) سوار شدند. هسته آپوپتوز TUNEL مثبت با تجسم با میکروسکوپ فلورسانس تشخیص داده شد.

جمع آوری ادرار

موش‌ها یا موش‌ها در قفس‌های متابولیک (Nalgene، Rochester، NY) قرار گرفتند و ادرار قبل و هر ساعت بعد از دوطرفه جمع‌آوری شد.کلیهانسداد شریان نمونه‌های ادرار در 5000 گرم سانتریفیوژ شدند تا باقی‌مانده‌ها حذف شوند و مایع رویی با وسترن بلات آنالیز شد. کراتینین ادرار با کیت سنجش رنگ سنجی کمی (سیگما) اندازه گیری شد تا نمونه ها برای تعیین NGAL ادرار عادی شود. یک کیت سنجش رنگ سنجی برای تعیین N-استیل-D-گلوکوزامینیداز (NAG) در ادرار از Roche به دست آمد.

کشت سلولی

انسانکلیهسلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال (RPTEC) از Clonetics (سان دیگو، CA) به دست آمد. سلول ها در آن رشد کردندکلیهمحیط پایه سلول های اپیتلیال تکمیل شده باکلیویکمپلکس محیط رشد سلول های اپیتلیال (REGM) ({0}}.5 لیتر در میلی لیتر هیدروکورتیزون، 10 pg/ml hEGF، 0.5 - گرم در میلی لیتر اپی نفرین، 6.5 pg/ml تری یدوتیرونین، 10 پلاس - گرم در میلی لیتر ترانسفرین، 5 - گرم در میلی لیتر انسولین، 1 -گرم در میلی لیتر جنتامایسین سولفات، و 2 درصد FBS)، طبق توصیه سازنده.

کاهش خفیف ATP سلول های کشت شده

ما پروتکل های توصیف شده قبلی ایسکمی آزمایشگاهی را با کاهش ATP با مهارکننده های فسفوریلاسیون اکسیداتیو اصلاح کردیم (19،20). در روز دوم پس از تلاقی، سلول‌های RPTEC با 1 متر آنتی‌مایسین A (سیگما) برای دوره‌های زمانی مختلف تا 6 ساعت انکوبه شدند. ما قبلاً نشان داده‌ایم که این منجر به کاهش خفیف ATP برگشت‌پذیر جزئی و عدم از دست دادن زنده‌مانی سلولی در سایر انواع سلول‌های اپیتلیال کلیه کشت‌شده مانند سلول‌های MDCK (19) و 786-O (20) می‌شود. سطح ATP با استفاده از کیت سنجش مبتنی بر لوسیفراز (سیگما) کنترل شد و به عنوان درصدی از مقادیر کنترل بیان شد. سلول ها در نقاط زمانی مختلف کاهش ATP برداشت شدند و برای بیان mRNA NGAL با رونویسی معکوس-PCR (RT-PCR) و بیان پروتئین NGAL با تجزیه و تحلیل غربی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. ترشح NGAL در محیط کشت نیز کنترل شد.

سایر مواد و روشها

تمام مواد شیمیایی از سیگما خریداری شد مگر اینکه خلاف آن مشخص شده باشد. برای وسترن بلات، غلظت پروتئین با روش برادفورد (Bio-Rad، Hercules، CA) تعیین شد و مقادیر مساوی از پروتئین کل در هر خط بارگذاری شد. آنتی بادی مونوکلونال به- -توبولین (سیگما) در 1:10،000 رقت برای تأیید بارگیری پروتئین برابر، و یک آنتی بادی پلی کلونال به NGAL در 1:500 استفاده شد (21). آنتی بادی مونوکلونال به میکروگلوبولین در 1:500 (سیگما) استفاده شد. تشخیص ایمنی پروتئین های منتقل شده با استفاده از لومینسانس شیمیایی افزایش یافته (Amersham) به دست آمد.

نتایج

شناسایی مدل های حیوانی آسیب ایسکمی اولیه کلیه - پرفیوژن مجدد

ما از مدل‌های موش استفاده کردیم که در آن پیامدهای ساختاری و عملکردی دوره‌های کوتاه ایسکمی کلیوی مستند شده است (11-15). ویژگی‌های هیستوپاتولوژیک مشخصه آسیب ایسکمیک به آسانی در نمونه‌های خونرسانی مجدد {2} ساعت پس از ایسکمی یک طرفه (45 دقیقه) و دو طرفه (30 دقیقه) مشهود بود. این موارد شامل از بین رفتن غشاهای مرزی برس، اتساع لوله‌ای، اپیتلیوم لوله‌ای مسطح، ضایعات مجرا و نفوذهای بینابینی بود (شکل 1). ما حضور سلول‌های آپوپتوز را با استفاده از روش TUNEL ثبت کردیم. آپوپتوز عمدتاً در سلول‌های لوله‌ای دیستال و اندام صعودی حلقه هنله، هم در سلول‌های جدا شده در لومن و هم در سلول‌های متصل، موضعی بود. سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال گاه به گاه آپوپتوز بودند، اما گلومرول‌ها اساساً فاقد آپوپتوز بودند. هیچ سلول مثبت TUNEL در کلیه های کنترل یا در نمونه های ایسکمیک که در آن TdT حذف شده بود (نشان داده نشده) مشاهده نشد. تغییرات هیستولوژیک و آپوپتوز بالا در کلیه‌هایی که در معرض درجات خفیف‌تر ایسکمی بودند (5، 10 یا 20 دقیقه ایسکمی دوطرفه؛ نشان داده نشده) وجود نداشت. سطح کراتینین سرم منعکس کننده تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده بود. بنابراین، موش‌های مبتلا به ایسکمی کلیوی یک‌طرفه یا درجات خفیف ایسکمی دوطرفه تحت بالینی، سطوح کراتینین سرم را نشان دادند که از حیوانات کنترل قابل تشخیص نبود، در حالی که موش‌های مبتلا به ایسکمی دوطرفه به مدت 30 دقیقه افزایش قابل‌توجهی کراتینین سرم را نشان دادند (شکل 1).

شکل 1. خصوصیات مدل موش ایسکمیککلیهصدمه. پانل سمت چپ نتایج رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (بالا) و رنگ‌آمیزی TUNEL (پایین) بخش‌های کلیه موش‌های کنترل یا پس از 24 ساعت ایسکمی-پرفیوژن مجدد (IRI) را نشان می‌دهد. (راست) نتایج تعیین کراتینین سرم در موش های کنترل (Con)، پس از ایسکمی یک طرفه به مدت 45 دقیقه (U45)، یا پس از ایسکمی دو طرفه برای دوره های مختلف همانطور که نشان داده شده است. *P 0.05 در مقابل کنترل. اعداد درون میله ها تعدادی از حیوانات را نشان می دهد.

mRNA NGAL به طور قابل توجهی در کلیه پس از ایسکمیک اولیه القا می شود

با تجزیه و تحلیل ریزآرایه موش های با یک طرفهکلیهایسکمی، NGAL به طور مداوم القا می شود (3.2 به علاوه - 0.5- برابر، 11.1 به علاوه - 1.2- برابر، و 4.3 به علاوه {{1{{30} }}}.6-در 3، 12 و 24 ساعت خونرسانی مجدد) در کلیه ایسکمیک موش در مقایسه با کلیه های کنترل از همان حیوان (میانگین به علاوه - SD از سه حیوان در هر نقطه زمانی). این یافته با RT-PCR نیمه کمی، با استفاده از یک پروتکل عادی سازی با پلاس -اکتین و GAPDH تأیید شد. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، هیچ تغییر قابل توجهی در بیان mRNA پلاس -اکتین یا GAPDH در هیچ یک از دوره های خونرسانی مجدد مورد بررسی قرار نگرفت (11). با این حال، با استفاده از پرایمرهای مخصوص موش، ما افزایش قابل توجهی در بیان mRNA NGAL (4.1 به علاوه -0.5- برابر، 9 به علاوه -0.6-برابر، و 4.2 به علاوه شناسایی کردیم. 0.4-به ترتیب در 3، 12 و 24 ساعت خونرسانی مجدد، که مقادیر نشان دهنده میانگین به علاوه - SD از سه حیوان جداگانه است) برابر می شود. این نتایج در شکل 2 نشان داده شده است و با تغییرات آشکار شده توسط تجزیه و تحلیل رونوشت مطابقت دارد.

شکل 2. القای mRNA ژن لیپوکالین (NGAL) مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز کلیه موش پس از ایسکمی. (بالا) رونویسی معکوس-PCR (RT-PCR) با پرایمرهای اکتین و NGAL موش، با استفاده از RNA استخراج شده از کلیه موش های کنترل (C) یا پس از دوره های مختلف خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت). خط M شامل یک نردبان DNA 100-bp است. (پایین) افزایش برابری در بیان mRNA NGAL در نقاط زمانی مختلف از کنترل (CON). مقادیر به دست آمده توسط ریزآرایه (خط جامد) در مقابل RT-PCR (خط نقطه چین) میانگین SD از سه آزمایش در هر نقطه زمانی است.

پروتئین NGAL به طور قابل توجهی در لوله های پروگزیمال کلیه های ایسکمیک اولیه موش بیان می شود.

بعد از آن مشخص شد که آیا بیان پس از ایسکمیک پروتئین NGAL در کلیه با mRNA موازی است یا خیر. با تجزیه و تحلیل غربی، NGAL فقط به عنوان یک پپتید واکنش‌گر ایمنی 25- kD در کلیه‌های موش کنترل قابل تشخیص بود. هویت این باند به‌عنوان NGAL در مجموعه‌ای جداگانه از آزمایش‌ها مشخص شد، که در آن پیش‌انکوباسیون آنتی‌بادی اولیه با لیپوکالین موش نوترکیب به طور کامل این واکنش‌پذیری ایمنی را مسدود کرد (نشان داده نشده). در آزمایش‌های ایسکمی یک‌طرفه، بیان NGAL سه تا چهار برابر با سنجش تراکم در کلیه ایسکمیک از پنج حیوان جداگانه در عرض 3 ساعت پس از آسیب، همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، القا شد. . NGAL در این موش‌ها پس از 3 ساعت خون‌رسانی مجدد، سه برابر القا شد، در نمونه‌های 24- ساعت به 12- برابر رسید و در دوره بهبودی 72- ساعت به سطح نرمال کاهش یافت (شکل 3) .

شکل 3. القای پروتئین NGAL کلیه موش پس از ایسکمی یک طرفه یا دو طرفه. (بالا) وسترن بلات های نماینده با نمونه های کامل کلیه که از موش های کنترل (Con) یا پس از دوره های خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت ها)، که با آنتی بادی پلی کلونال علیه NGAL یا آنتی بادی مونوکلونال به توبولین (برای نشان دادن بار پروتئین برابر) بررسی شده است. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ قرار دارند. (پایین) افزایش برابری در بیان پروتئین NGAL در نقاط زمانی مختلف از کنترل (CON). مقادیر به دست آمده با تراکم سنجی میانگین SD از پنج حیوان برای ایسکمی یک طرفه و هشت حیوان برای ایسکمی دو طرفه است.

با استفاده از تکنیک‌های ایمونوهیستوشیمی، بعداً نشان دادیم که پروتئین NGAL به سختی در کلیه‌های موش کنترل قابل تشخیص است، اما به طور عمده در لوله‌های پروگزیمال در عرض 3 ساعت پس از ایسکمی، همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، تنظیم مثبت می‌شود. غشای مرزی، نسبت اندازه هسته به سلول و مورفولوژی سلولی. NGAL القا شده در یک توزیع سیتوپلاسمی نقطه‌گذاری در سلول‌های لوله پروگزیمال ظاهر شد، که یادآور پروتئین ترشح‌شده است. این الگوی بیان در هر دو مدل یک طرفه و دوطرفه آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد یکسان بود و به طور مداوم در هر حیوان مورد مطالعه مشهود بود. گلومرول ها فاقد بیان NGAL بودند و هیچ نوتروفیل بیان کننده NGAL مشهود نبود. از آنجایی که نشان داده شده است که NGAL در سلول های کلیوی تومور ویلمز کشت شده حداقل تا حدودی با اندوزوم ها هم محلی می شود (21)، توزیع NGAL و Rab11 (نشانگر آندوزوم های دیرباز بازیافت) را در بخش های سریال بررسی کردیم. تصاویر ادغام شده، هم محلی سازی قابل توجهی از NGAL با Rab11 را نشان داد (شکل 4). برای بررسی اهمیت عملکردی افزایش بیان NGAL پس از ایسکمی، بخش‌های کلیوی سریال را برای بیان NGAL، هسته‌های TUNEL مثبت، یا هسته‌های مثبت PCNA بررسی کردیم. در حالی که سلول‌های توبولی که بیش از حد NGAL را بیان می‌کنند، TUNEL مثبت نبودند (نشان داده نشده است)، یک هم‌محلی قابل‌توجهی از NGAL و PCNA در سلول‌های در حال تکثیر و بازسازی در دوره جریان مجدد 48- ساعت مشهود بود (شکل 4).

شکل 4. القای پروتئین NGAL کلیه موش پس از ایسکمی. (بالا) نتایج ایمونوهیستوشیمی نمایشی بر روی بخش‌های منجمد کلیه‌های موش به‌دست‌آمده از موش‌های کنترل یا پس از دوره‌های مختلف جریان مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت‌ها)، که با یک آنتی‌بادی پلی کلونال برای NGAL بررسی شده‌اند. G، گلومرول. پانل با برچسب HP یک بزرگنمایی 100 پلاس با قدرت بالا است و پانل های دیگر 20 هستند. (پایین) دو پانل سمت چپ یک لوله را پس از 3 ساعت خونرسانی مجدد نشان می دهد که NGAL (قرمز) یا Rab11 (سبز) را نشان می دهد. پانل سوم یک تصویر ادغام شده را نشان می دهد که نشان دهنده محلی سازی مشترک به رنگ زرد است. پانل در سمت راست، محل یابی همزمان NGAL با آنتی ژن هسته ای سلولی در حال تکثیر را در لوله ها پس از 48 ساعت جریان مجدد نشان می دهد.

پروتئین NGAL بلافاصله پس از القای ARF در موش به راحتی در ادرار تشخیص داده می شود.

بررسی اینکه آیا بیان پس از ایسکمیک پروتئین NGAL را می توان در ادرار تشخیص داد یا خیر، از اهمیت قابل توجهی برخوردار بود، در نتیجه کاربرد آن را به عنوان یک نشانگر زیستی غیرتهاجمی اولیه ایسکمیک نشان داد.کلیهصدمه. با استفاده از غلظت کراتینین ادرار برای یکسان سازی برای بارگیری نمونه، NGAL در ادرار قبل از ایسکمی وجود نداشت. در مقابل، NGAL به صورت یک نوار 25- کیلو دالتون ظرف 2 ساعت پس از آسیب (در اولین برون ده ادرار پس از ایسکمی) در همه حیوانات مورد بررسی (پنج با ایسکمی یک طرفه و هشت با ایسکمی دو طرفه) آشکار شد، همانطور که در نشان داده شده است. شکل 5. هویت این باند به عنوان NGAL در مجموعه‌ای از آزمایش‌های جداگانه مشخص شد، که در آن انکوباسیون آنتی‌بادی اولیه با لیپوکالین موش نوترکیب به طور کامل این واکنش‌پذیری ایمنی را مسدود کرد (نشان داده نشده). قابل توجه است، NGAL به راحتی در 1 لیتر ادرار فرآوری نشده توسط تجزیه و تحلیل غربی قابل تشخیص بود و برای کل مدت زمان مورد بررسی (24 ساعت خونرسانی مجدد) باقی ماند. سپس دفع NGAL ادراری را با نشانگرهای آسیب دیده قبلی مانند 2-میکروگلوبولین و NAG مقایسه کردیم. در حالی که NGAL ادرار در 2 ساعت پس از ایسکمی مشهود بود، میکروگلوبولین در همان نمونه های ادراری تنها پس از 12 ساعت ایسکمی یک طرفه و 8 ساعت از ایسکمی دو طرفه قابل تشخیص بود (شکل 5). به طور مشابه، دفع NAG ادراری تنها پس از 12 ساعت ایسکمی یک طرفه و 8 ساعت ایسکمی دوطرفه در مقایسه با حیوانات کنترل غیرسکمیک به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 5).

شکل 5. تشخیص زودهنگام پروتئین NGAL در ادرار در موش های مبتلا به ایسکمیک حادکلیهشکست (ARF). (بالا) وسترن بلات های نماینده نمونه های ادرار فرآوری نشده (1 تا 2 به اضافه - لیتر در هر خط، نرمال شده برای محتوای کراتینین) در دوره های خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت)، پس از یک طرفه یا دو طرفه به دست آمد.کلیهبستن شریان نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ نشان داده شده اند. لکه ها با NGAL (بالا) یا {{0}}میکروگلوبولین (بتا2-M؛ وسط) بررسی شدند. (پایین) N-acetyl--D-glucosaminidase (NAG) ادراری در دوره های مختلف خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شد، از پنج حیوان برای ایسکمی یک طرفه و هشت حیوان برای ایسکمی دوطرفه. مقادیر میانگین SD هستند. *P 0.05 در مقابل کنترل در هر نقطه زمانی، ANOVA.

پروتئین NGAL حتی پس از ایسکمی خفیف کلیه در موش به راحتی در ادرار تشخیص داده می شود.

برای تعیین حساسیت تشخیص NGAL ادراری در غیاب ARF آشکار، از پروتکل‌هایی استفاده کردیم که به موجب آن مجموعه‌های جداگانه‌ای از موش‌ها تنها به مدت 5، 10 یا 20 دقیقه دو طرفه قرار گرفتند.کلیهانسداد شریان این مطالعات برای ارزیابی دفع NGAL ادرار پس از ایسکمی کلیوی تحت بالینی خفیف طراحی شده‌اند. کراتینین سرم اندازه گیری شده پس از 24 ساعت پس از جریان مجدد در تمام این موش ها در محدوده طبیعی بود (شکل 1). جالب توجه است که NGAL به راحتی در 1 لیتر ادرار فرآوری نشده در این حیوانات تشخیص داده شد (شکل 6)، اگرچه ظاهر آن در مقایسه با حیوانات با ARF آشکار تا حدودی تاخیر داشت. بنابراین، در حالی که 30 دقیقه ایسکمی دوطرفه منجر به دفع NGAL ادراری در عرض 2 ساعت شد (شکل 5)، موش‌هایی که 20 یا 10 دقیقه ایسکمی دوطرفه داشتند، NGAL ادراری را بعد از 4 ساعت نشان دادند و آن‌هایی که 5 دقیقه ایسکمی داشتند، NGAL را تنها پس از 6 ساعت دفع کردند. شکل 6). بنابراین، ظهور NGAL در ادرار با دوز و طول مدت ایسکمی کلیوی ارتباط دارد.

پروتئین NGAL بلافاصله پس از القای ARF در موش ها به راحتی در ادرار تشخیص داده می شود.

شکل 6. تشخیص پروتئین NGAL در ادرار در موش های مبتلا به ایسکمی کلیوی تحت بالینی. وسترن بلات نماینده نمونه های ادرار فرآوری نشده (1 تا 2 لیتر در هر خط، نرمال شده برای محتوای کراتینین) در دوره های خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت)، پس از 5، 10 یا 20 دقیقه بستن دو طرفه شریان کلیوی به دست آمد. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ نشان داده شده اند. این حیوانات کراتینین طبیعی سرم را در 24 ساعت جریان مجدد نشان دادند.

از آنجا که بحث در مورد تفاوت گونه ها در پاسخ به انسداد شریان کلیوی وجود دارد (22)، ما در مرحله بعدی رفتار NGAL را در یک مدل حیوانی مختلف، یعنی یک مدل موش صحرایی تثبیت شده آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیوی، بررسی کردیم. با استفاده از غلظت کراتینین ادرار برای یکسان سازی برای بارگیری نمونه، NGAL در ادرار قبل از ایسکمی وجود نداشت. در مقابل، NGAL به‌عنوان یک پپتید واکنش‌گر ایمنی 25- kD در عرض 3 ساعت پس از آسیب (در اولین خروجی ادرار پس از ایسکمی) آشکار شد، همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است. در مقایسه، کراتینین سرم در این مدل از آسیب ایسکمیک تنها پس از 24 ساعت خونرسانی مجدد (نشان داده نشده) افزایش یافت. یک بار دیگر، NGAL در 1 لیتر ادرار فرآوری نشده قابل تشخیص بود و برای کل مدت بررسی (24 ساعت خونرسانی مجدد) باقی ماند.

شکل 7. تشخیص زودهنگام پروتئین NGAL در ادرار در موش های مبتلا به ARF ایسکمیک. وسترن بلات نماینده نمونه های ادرار فرآوری نشده (1 تا 2 لیتر در هر خط، نرمال شده برای محتوای کراتینین) در دوره های خونرسانی مجدد همانطور که نشان داده شده است (ساعت)، پس از 30 دقیقه بستن دو طرفه شریان کلیوی در موش صحرایی. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ نشان داده شده اند. این حیوانات افزایش قابل توجهی در کراتینین سرم در 24 ساعت جریان مجدد نشان دادند.

mRNA ژن NGAL در سلول های توبول پروگزیمال انسانی کشت شده پس از ایسکمی خفیف اولیه القا می شود

برای تأیید منشأ NGAL از سلول‌های توبول پروگزیمال ایسکمیک، ما پروتکل‌های ایسکمی آزمایشگاهی را که قبلاً شرح داده شده بود با کاهش ATP در سلول‌های توبول پروگزیمال انسانی (RPTEC) اصلاح کردیم. انکوباسیون 1- متر آنتی‌مایسین است که منجر به کاهش جزئی ATP به حدود 83 به علاوه 3 درصد کنترل در 1 ساعت، با کاهش تدریجی‌تر به حدود 75 به علاوه - 3 درصد کنترل تا 6 ساعت شد. میانگین-SD از چهار آزمایش). هیچ پیامد مورفولوژیکی این کاهش خفیف ATP قابل تشخیص نبود. mRNA NGAL فقط در سلول های در حال استراحت قابل تشخیص بود. با این حال، پس از کاهش نسبی ATP، القای سریع و وابسته به مدت mRNA NGAL توسط RT-PCR مشهود بود، همانطور که در شکل 8 نشان داده شده است.

پروتئین NGAL به راحتی در محیط پس از ایسکمی اولیه در شرایط آزمایشگاهی تشخیص داده می شود

سپس بیان پروتئین NGAL را در سلول‌های RPTEC و محیط کشت پس از کاهش خفیف ATP بررسی کردیم. پروتئین NGAL در سلول‌های RPTEC کنترل قابل تشخیص بود، و بیان آن پس از کاهش ATP به روشی وابسته به مدت افزایش یافت، همانطور که در شکل 8 نشان داده شده است. هیچ پروتئین واکنش‌پذیر NGAL در محیط کشت از سلول‌های کنترل یافت نشد، اما NGAL به راحتی در عرض 1 قابل تشخیص بود. ساعت کاهش خفیف ATP (شکل 8). افزایش بیشتر در فراوانی پروتئین NGAL مربوط به مدت زمان کاهش ATP بود. این نتایج نشان می دهد که پروتئین NGAL القا شده به سرعت در محیط ترشح می شود، مشابه ظاهر سریع NGAL در ادرار پس از ایسکمی کلیوی در داخل بدن.

شکل 8. القای mRNA NGAL پس از ایسکمی در شرایط آزمایشگاهی. (بالا) نماینده RT-PCR با پرایمرهای NGAL انسانی، با استفاده از RNA استخراج شده از سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال کلیه (RPTEC) پس از دوره های مختلف کاهش نسبی ATP همانطور که نشان داده شده است (ساعت). خط M شامل یک نردبان DNA 100-bp است. (وسط) افزایش برابری در بیان mRNA NGAL در مقاطع زمانی مختلف از شاهد ({3}})، برای بیان گلیسرآلدئید-3-فسفات دهیدروژناز نرمال شد. مقادیر نشان داده شده میانگین SD از سه آزمایش در هر نقطه زمانی هستند. (پایین) وسترن بلات نماینده با نمونه‌های RPTEC پس از دوره‌های مختلف کاهش نسبی ATP همانطور که نشان داده شده است (ساعت‌ها)، که از مقادیر مساوی گلوله‌های سلولی (Pel) یا محیط کشت (Sup) به دست آمده است که با آنتی‌بادی پلی کلونال به NGAL کاوش شده است. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ قرار دارند. شکل نشان دهنده سه آزمایش جداگانه است.

پروتئین NGAL پس از القای سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین، به راحتی در ادرار تشخیص داده می شود.

ما در مرحله بعد خواستیم تعیین کنیم که آیا NGAL ممکن است پس از سایر اشکال آسیب سلولی توبول در ادرار شناسایی شود یا خیر. در یک مدل موش ثابت شده از سمیت کلیوی سیس پلاتین، NGAL به راحتی در ادرار ظرف 1 روز از تجویز سیس پلاتین تشخیص داده شد (شکل 9). در مقابل، میکروگلوبولین ادراری به سختی بعد از 2 روز قابل تشخیص بود و تا روز 4 تا 5 بعد از سیس پلاتین قابل تشخیص نبود. به طور مشابه، افزایش دفع NAG ادراری تا روزهای 4 و 5 پس از تجویز سیس پلاتین مشهود نبود (شکل 9).

شکل 9. تشخیص زودهنگام پروتئین NGAL در ادرار در موش های مبتلا به آسیب ناشی از سیس پلاتین. (الف) وسترن بلات های نماینده نمونه های ادرار فرآوری نشده (1 تا 2 لیتر در هر خط، نرمال شده برای محتوای کراتینین) که در روزهای پس از تجویز سیس پلاتین نشان داده شده است، با آنتی بادی برای 2-میکروگلوبولین یا NGAL بررسی شده است. نشانگرهای وزن مولکولی در سمت چپ نشان داده شده اند. (ب) تعیین NAG ادرار در روزهای مختلف پس از تجویز سیس پلاتین (n 4). مقادیر میانگین به علاوه -SD هستند. *P 0.05 در مقابل روز 0.

بحث

ما از یک استراتژی بازجویی گسترده ترانسکریپتوم برای شناسایی ژن‌های کلیوی که در اوایل پس از ایسکمی کلیوی القا می‌شوند، استفاده کردیم، که محصولات پروتئینی آن ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی جدید برای ARF عمل کنند. ما هفت ژن را شناسایی کردیم که 10- برابر تنظیم شده‌اند، یکی از آنها (Cyr61) اخیراً گزارش شده است که پس از ایسکمی کلیوی القا شده است (8). غیرمنتظره، القای شش رونوشت دیگر به حوزه ARF بدیع بود. در این مطالعه، ما تصمیم گرفتیم یکی از این ژن‌های ناشناخته قبلی، یعنی NGAL را مشخص کنیم.

NGAL متعلق به ابرخانواده لیپوکالین‌های - 20 پروتئین‌های ترشحی مرتبط با ساختار است که تصور می‌شود لیگاندهای مختلفی را در یک کاسه گل بشکه‌ای منتقل می‌کنند (23). NGAL انسانی در ابتدا به عنوان یک پروتئین 25-kD شناسایی شد که به طور کووالانسی به ژلاتیناز از نوتروفیل های انسانی متصل شده است، جایی که نشان دهنده یکی از پروتئین های گرانول ثانویه نوتروفیل است (24،25). مطالعات شبیه سازی مولکولی نشان داده است که NGAL انسانی شبیه ژن 24p3 ​​موش است که برای اولین بار در کشت های اولیه کلیه های موش که تکثیر شده بودند شناسایی شد (26). NGAL در سایر بافت های انسانی از جمله کلیه، نای، ریه ها، معده و روده بزرگ در سطوح بسیار پایین بیان می شود (27). بیان NGAL به طور قابل توجهی در اپیتلیوم تحریک شده القا می شود. به عنوان مثال، در سلول‌های اپیتلیال کولون در نواحی التهابی یا نئوپلازی تنظیم مثبت می‌شود، اما در نواحی درگیر درگیر یا در ضایعات متاستاتیک وجود ندارد (28). غلظت NGAL در سرم بیماران مبتلا به عفونت های حاد باکتریایی (29)، خلط افراد مبتلا به آسم یا بیماری انسدادی مزمن ریه (30)، و مایع برونش از ریه آمفیزماتوز (31) افزایش می یابد. در همه این موارد، القای NGAL نتیجه برهمکنش بین سلول های التهابی و پوشش اپیتلیال است، با تنظیم مثبت بیان NGAL در نوتروفیل ها و اپیتلیوم مشهود است (28-32).

تنظیم دگرگونی NGAL در کلیه بالغ تاکنون شرح داده نشده است. چندین خط از شواهد جمع آوری شده از مطالعه ما نشان می دهد که القای NGAL شناسایی شده نشان دهنده یک پاسخ ذاتی جدید سلول های لوله پروگزیمال کلیه به آسیب ایسکمیک است و صرفاً از نوتروفیل های فعال مشتق نشده است. اول، پاسخ بسیار سریع است، با NGAL در ادرار در عرض 2 ساعت پس از آسیب ظاهر می شود (در اولین خروجی ادرار پس از انسداد شریان کلیوی)، و تجمع نوتروفیل کلیوی در این مدل از ARF ایسکمیک معمولاً برای اولین بار در 4 ساعت مشاهده می شود. پس از آسیب (33-35). دوم، الگوهای زمانی القای NGAL و تجمع نوتروفیل‌ها متفاوت هستند. بیان mRNA و پروتئین NGAL حداکثر در 12 ساعت جریان مجدد مشاهده شد، در حالی که تجمع نوتروفیل در 24 ساعت (33-35) به اوج خود می رسد، که در آن زمان بیان NGAL به طور قابل توجهی کاهش یافته است. سوم، هیچ نوتروفیل بیان کننده NGAL توسط ایمونوفلورسانس در نمونه های کلیه بررسی شده قابل تشخیص نبود (شکل 4). چهارمین و متقاعدکننده‌ترین، القای پروتئین و mRNA NGAL در سلول‌های توبول پروگزیمال انسان پس از ایسکمی آزمایشگاهی، با ترشح NGAL در محیط کشت ظرف 1 ساعت پس از تخلیه ATP، در سیستمی که در آن نوتروفیل‌ها مطلقاً وجود ندارند، ثبت شد. با این حال، مطالعات in vivo ما به ما اجازه نمی‌دهد که به طور کامل سهمی از نفوذ نوتروفیل‌های فعال در تنظیم دخیل مشاهده‌شده NGAL را حذف کنیم. در واقع، این امکان وجود دارد که تنظیم بالا NGAL در سلول های توبول کلیوی ممکن است با انتشار موضعی سایتوکین ها از نوتروفیل های به دام افتاده در میکروسیرکولاسیون در اوایل پس از آسیب ایسکمیک القا شود.

سیستانچ چیست؟ سیستانچمی تواند درمان کندکلیهصدمه

توضیح کافی برای القای NGAL توسط اپیتلیوم تحریک شده وجود ندارد، و اینکه آیا NGAL محافظ است یا نزدیک به آسیب یا حتی یک تماشاگر بی گناه است، هنوز مشخص نیست. شواهد اخیر نشان می دهد که حداقل در زیرمجموعه ای از انواع سلول، NGAL ممکن است یک مولکول پرواپوپتوز را نشان دهد (36-38). در رده سلولی لنفوسیتی pro-B موش، خروج سیتوکین منجر به القای مشخص NGAL و همچنین شروع آپوپتوز شد (36،37). NGAL همچنین با آپوپتوز در بافت های تولید مثلی مرتبط است. سلول های اپیتلیال غده پستانی درگیر و رحم سطوح بالایی از NGAL را بیان می کنند که از نظر زمانی با دوره حداکثر آپوپتوز همزمان است (38). این احتمال وجود دارد که NGAL با القای آپوپتوز زیرمجموعه ای از جمعیت های سلولی را تنظیم کند. اپیتلیوم تحریک شده ممکن است NGAL را برای القای آپوپتوز نوتروفیل های نفوذی تنظیم کند، در نتیجه به سلول های ساکن اجازه می دهد تا از آسیب های پاسخ التهابی جان سالم به در ببرند. از طرف دیگر، سلول های اپیتلیال ممکن است از این مکانیسم برای تنظیم مرگ خود استفاده کنند. با این حال، ذکر این نکته در مطالعات ما جالب است که القای NGAL پس از آسیب اولیه ایسکمی خونرسانی مجدد کلیوی، عمدتاً در سلول‌های توبول پروگزیمال رخ می‌دهد که هسته‌های TUNEL مثبت را نشان نمی‌دهند.

سایر مطالعات اخیر نشان داده اند که NGAL فنوتیپ اپیتلیال را افزایش می دهد. NGAL توسط جوانه نافذ حالب بیان می شود و با تحریک تبدیل سلول های مزانشیمی به اپیتلیوم کلیه باعث نفروژنز می شود (21). لیپوکالین دیگر، گلیکودلین، نشان داده شده است که وقتی در سلول های سرطان پستان انسان بیان می شود، یک فنوتیپ اپیتلیال را القا می کند (40). این یافته ها به ویژه مربوط به کلیه بالغ است، که در آن یکی از پاسخ های مستند به آسیب ایسکمیک، ظاهر قابل توجه سلول های اپیتلیال تمایز نیافته پوشاننده لوله های پروگزیمال است (41). یکی از جنبه های مهم بازسازی و ترمیم کلیه پس از آسیب ایسکمیک شامل کسب مجدد فنوتیپ اپیتلیال است، فرآیندی که چندین جنبه از رشد طبیعی را خلاصه می کند (42). این نشان می دهد که NGAL ممکن است توسط توبول آسیب دیده برای ایجاد اپیتلیال مجدد بیان شود. پشتیبانی از این مفهوم ناشی از شناسایی اخیر NGAL به عنوان یک پروتئین ناقل آهن است که مکمل ترانسفرین در طی نفروژنز است (21). به خوبی شناخته شده است که رساندن آهن به سلول ها برای رشد و نمو سلولی حیاتی است و احتمالاً برای بازسازی کلیه پس از ایسکمیک حیاتی است، همانطور که در طول انتوژن است. از آنجا که به نظر می رسد NGAL آهن را متصل و انتقال می دهد (21)، همچنین این احتمال وجود دارد که NGAL ممکن است به عنوان یک سینک برای آهنی باشد که از سلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال آسیب دیده دفع می شود. از آنجایی که NGAL می تواند توسط توبول پروگزیمال داخل سلولی شود (K. Mori and J. Barasch، مشاهدات منتشر نشده)، این پروتئین به طور بالقوه می تواند آهن را به سلول های زنده بازیافت کند. این ممکن است رشد و نمو را تحریک کند و همچنین آهن را که یک مولکول واکنشی است از محل آسیب بافتی حذف کند و در نتیجه سمیت سلولی ناشی از آهن را محدود کند. نتایج ما نشان می‌دهد که هم‌محلی‌سازی NGAL در سلول‌های توبول در حال بازسازی و تکثیر با PCNA مثبت، از این فرضیه حمایت بیشتری می‌کند.

یک پیامد اصلی از یافته های ما به احتمال اینکه NGAL یک بیومارکر ادراری جدید برای یک ایسکمیک باشد مربوط می شود.کلیهصدمهکه به طور مطلوب با سایر نشانگرهای زیستی که شرح داده شده است مقایسه می شود. شاید بهترین مثال مورد مطالعه، مولکول آسیب کلیه-1 (KIM-1)، یک مولکول چسبندگی فرضی در بازسازی کلیه باشد (43،44). در یک مدل موش آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد، KIM{6}} 24 تا 48 ساعت پس از توهین اولیه تنظیم شد و آن را به یک نشانگر مطمئن اما تا حدودی دیرهنگام آسیب سلولی لوله‌ای تبدیل کرد. مطالعات ظریف اخیر نشان داده است که KIM{9}} را می توان در بیوپسی کلیه و ادرار بیماران مبتلا به نکروز لوله ای حاد ایسکمیک تشخیص داد (45). با این حال، این تشخیص در بیماران مبتلا به آسیب کلیوی ایسکمیک تثبیت شده ثبت شد، و کاربرد اندازه‌گیری KIM{11}} ادراری برای تشخیص آسیب زودهنگام تحت بالینی تاکنون تأیید نشده است. در مثال اخیر دیگری، مشخص شد که Cyr61 یک پروتئین ترشح شده غنی از سیستئین است که 3 تا 6 ساعت پس از آسیب ایسکمیک کلیوی در ادرار قابل تشخیص است (8). با این حال، این تشخیص نیاز به یک مرحله خالص‌سازی بیوافینیتی با دانه‌های هپارین-سفاروز داشت، و حتی پس از چنین خالص‌سازی، چندین پپتید واکنش متقابل آشکار بود. در مقابل، مطالعه ما نشان می‌دهد که NGAL به‌راحتی و به‌سرعت به‌عنوان پپتیدهای واکنش‌گر ایمنی نسبتاً تمیز در وسترن بلات‌ها با کمتر از 1 لیتر از اولین خروجی ادرار پردازش‌نشده پس از ایسکمی کلیوی در موش‌ها و موش‌ها شناسایی شد. بعلاوه، NGAL ادراری حتی پس از ایسکمی کلیوی "subclinical" بسیار خفیف، علیرغم سطح کراتینین سرم طبیعی، مشهود بود. علاوه بر این، تشخیص NGAL ادراری بسیار قبل از ظهور نشانگرهای سنتی در ادرار، از جمله میکروگلوبولین 2- و NAG بود.

در نهایت، شایان ذکر است که NGAL در اوایل تجویز سیس پلاتین نیز در ادرار قابل تشخیص بود، در زمانی که سایر شاخص های مورفولوژیکی و بیوشیمیاییکلیهصدمهغایب بودند بنابراین، تنظیم مثبت و دفع ادراری NGAL ممکن است نشان دهنده پاسخ سریع سلول های توبول کلیوی به انواع توهین باشد، و تشخیص NGAL در ادرار ممکن است نشان دهنده یک ابزار بالینی غیرتهاجمی گسترده برای تشخیص زودهنگام آسیب سلول توبول باشد.

به طور خلاصه، داده‌های ما نشان می‌دهد که NGAL یک بیومارکر ادراری جدید، حساس و غیر تهاجمی برای ایسکمی کلیوی است. بررسی بیان NGAL در ادرار بیماران مبتلا به اشکال خفیف و اولیه ایسکمیک در کار ترجمه ای آینده مهم خواهد بود.کلیهصدمه. امید است که چنین تشخیص زودهنگام ممکن است پزشکان را قادر سازد تا اقدامات مداخله‌ای به موقع در ARF انجام دهند، وضعیتی که هنوز با پیش آگهی بدی همراه است که درمان‌های جدید برای آن به شدت مورد نیاز است. علاوه بر این، امید است که چنین تشخیص سریع و ساده ای از NGAL ادراری در بیماران مبتلا به ایسکمیک زیر بالینی ظریف انجام شود.کلیهصدمه(به عنوان مثال، پیوند کلیه مربوط به زندگی، جراحی عروق، حوادث قلبی عروقی) یا آسیب نفروتوکسیک تحت بالینی (به عنوان مثال، استفاده از مواد حاجب و آمینوگلیکوزیدها) به پزشک هشدار می دهد تا مانورهایی را با هدف جلوگیری از پیشرفت ARF آشکار انجام دهد.

قدردانی

این کار توسط کمک‌های مالی مؤسسه ملی بهداشت/موسسه ملی دیابت و بیماری‌های گوارشی و کلیوی به PD (DK53289, DK52612) و JB (DK55388 و DK58872) حمایت شد.

Cistanche tubulosaمی تواند درمان کندآسیب کلیوی

منابع
1. Thadani R، Pascual M، Bonventre JV: نارسایی حاد کلیه. N Engl J Med 334: 1448-1460، 1996
2. Star RA: درمان حادکلیهشکست. کلیه Int 54: 1817-1831، 1998
3. Liaño F, Pascual J: عوامل پیش بینی کننده و امتیازدهی. در: نارسایی حاد کلیه، ویرایش شده توسط Molitoris BA، و Finn WF، فیلادلفیا، WB Saunders، 2001، صفحات 507-518
4. Molitoris BA: انتقال به درمان در نارسایی حاد کلیه ایسکمیک. J Am Soc Nephrol 14: 265-267، 2003
5. Brady HR، Brenner BM، Clarkson MR، Lieberthal W: نارسایی حاد کلیه. در: کلیه، ویرایش ششم، ویرایش شده توسط Brenner BM، فیلادلفیا، WB Saunders، 2000، صفحات 1201-1262
6. Sutton TA، Molitoris BA: مکانیسم های آسیب سلولی در نارسایی حاد کلیه ایسکمیک. Semin Nephrol 18: 490-497، 1998
7. Sheridan AM، Bonventre JV: زیست شناسی سلولی و مکانیسم های مولکولی آسیب در حاد ایسکمیککلیهشکست. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327-334، 2000
8. Muramatsu Y، Tsujie M، Kohda Y، Pham B، Perantoni AO، Zhao H، Jo SK، Yuen PST، Craig L، Hu X، Star RA: تشخیص زودهنگام پروتئین غنی از سیستئین 61 (CYR61، CCN1) در ادرار به دنبال آسیب ایسکمی- خونرسانی مجدد کلیه کلیه Int 62: 1601-1610، 2002

9. Kurella M، Hsiao LL، Yishida T، Randall JD، Chow G، Sarang SS، Jensen RV، Gullans SR: تجزیه و تحلیل ریزآرایه DNA فرآیندهای بیولوژیکی پیچیده. J Am Soc Nephrol 12: 1072-1078، 2001

10. Yoshida T، Kurelia M، Beato F، Min H، Ingelfinger JR، Stears RL، Swinford RD، Gullans SR، Tang SS: نظارت بر تغییرات بیان ژن در ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه در موش صحرایی. کلیه Int 61: 1646-1654، 2002

11. Supavekin S، Zhanh W، Kucherlapati R، Kaskel FJ، Moore LC، Devarajan P: بیان ژن دیفرانسیل به دنبال ایسکمی/پرفیوژن مجدد کلیوی اولیه. کلیه Int 63: 1714-1724، 2003
12. Nogae S، Miyazaki M، Kobayashi N، Saito T، Abe K، Saito H، Nakane PK، Nakanishi Y، Koji T: القای آپوپتوز در مدل ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه موش: درگیری احتمالی Fas. J Am Soc Nephrol 9: 620-631، 1998
13. Daemen MARC، Van de Ven MWCM، Heineman E، Buurman WA: دخالت اینترلوکین درون زا-10 و فاکتور نکروز تومور در آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه. پیوند 67: 792-800، 1999
14. Kelly KJ، Plotkin Z، Dagher PC: مکمل گوانوزین آپوپتوز را کاهش می دهد و محافظت می کند.کلیهعملکرد در شرایط آسیب ایسکمیک J Clin Invest 108: 1291-1298، 2001
15. Burne NJ، Rabb H: سهم پاتوفیزیولوژیکی فوکوزیل ترانسفرازها در آسیب ایسکمی-خونرسانی مجدد کلیه. J Immunol 169: 2648-2652، 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Price PM: القای p21WAF1/CIP/SD1 در سلول های لوله کلیه بر روند حاد ناشی از سیس پلاتین تأثیر می گذارد.کلیهشکست. J Clin Invest 101: 777-782، 1998
17. Shiraishi F، Curtis LM، Truong L، Poss K، Visner GA، Madsen K، Nick HS، Agarwal A: فرسایش یا بیان ژن Heme oxygenase{1}} آپوپتوز توبولار کلیوی ناشی از سیس پلاتین را تعدیل می کند. Am J Physiol 278: F726–F736، 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF- واسطه بیان کموکاین و سیتوکین وکلیهصدمهدر سمیت کلیوی سیس پلاتین J Clin Invest 110: 835–842، 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: کاهش جزئی ATP باعث آپوپتوز با واسطه Fas و کاسپاز در سلول های MDCK می شود. Am J Physiol 276: F837–F846، 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: محصول ژن von Hippel-Lindau آپوپتوز سلول های کلیوی را از طریق مسیرهای وابسته به Bcl-2- مهار می کند. J Biol Chem 276: 40599–40605، 2001
21. Yang J، Goetz D، Li JY، Wand W، Mori K، Setlik D، Du T، ErdjumentBromage H، Tempst P، Strong R، Barasch J: یک مسیر تحویل آهن با واسطه یک لیپوکالین. Mol Cell 10: 1045-1056، 2002
22. Molitoris BA، Weinberg JM، Venkatachalam MA، Zager RA، Nath KA، Goligorsky MS: نارسایی حاد کلیه II. مدل های تجربی نارسایی حاد کلیه: ناقص اما ضروری است. Am J Physiol 278: F1–F12، 2000
23. Flower DR، North AC، Sansom CE: خانواده پروتئین لیپوکالین: نمای کلی ساختاری و توالی. Biochim Biophys Acta 1482: 9-24، 2000
24. Kjeldsen L، Cowland JB، Borregaard N: لیپوکالین مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز انسانی و پروتئین های همولوگ در موش و موش. Biochim Biophys Acta 1482: 272-283، 2000
25. Xu S، Venge P: لیپوکالین ها به عنوان نشانگرهای بیوشیمیایی بیماری. Biochim Biophys Acta 1482: 298-307، 2000
26. Hraba-Renevey S، Turler H، Kress M، Salomon C، Weil R: بیان القایی SV40- ژن 24p3 ​​موش شامل یک مکانیسم پس از رونویسی است. Oncogene 4: 601-608، 1989
27. Cowland JB، Borregaard N: خصوصیات مولکولی و الگوی بیان بافتی ژن برای لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل از انسان. Genomics 45: 17-23، 1997
28. Nielson BS، Borregaard N، Bundgaard JR، Timshel S، Sehested M، Kjeldsen L: القای سنتز NGAL در سلول های اپیتلیال نئوپلازی کولورکتال انسانی و بیماری های التهابی روده. روده 38: 414-420، 1996
29. Xu SY، Pauksen K، Venge P: اندازه‌گیری‌های سرمی لیپوکالین نوتروفیل انسانی (HNL) بین عفونت‌های حاد باکتریایی و ویروسی تمایز قائل می‌شوند. Scand J Clin Lab Invest 55: 125-131، 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: نشانگرهای فعال سازی گرانولوسیت در خلط القایی در مقایسه بین بیماری انسدادی مزمن ریه، آسم و افراد عادی. Am J Respir Crit Care Med 155: 449-453، 1997
31. Betsuyaky T، Nishimura M، Takeyabu K، Tanino M، Venge P، Xu S، Kawakami Y: پروتئین های گرانول نوتروفیل در مایع لاواژ برونکوآلوئولار از افراد مبتلا به آمفیزم تحت بالینی. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985-1991، 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: لیپوکالین نوتروفیل انسانی یک نشانگر منحصر به فرد التهاب نوتروفیل در کولیت اولسراتیو و پروکتیت است. روده 50: 501-506، 2002
33. Chiao H، Kohda Y، McLeroy P، Craig L، Housing I، Star RA: -هورمون محرک ملانوسیت در برابرکلیهصدمهپس از ایسکمی در موش و موش صحرایی. J Clin Invest 99: 1165–1172، 1997
34. Rabb H، Ramirez G، Saba SR، Reynolds D، Xu J، Flavell R، Antonia S: آسیب ایسکمیک-پرفیوژن مجدد کلیه در موش های دارای کمبود ال-سلکتین. Am J Physiol 271: F408–F13، 1996
35. Rabb H, Star R: پاسخ التهابی و پیامدهای آن در حادکلیهشکست. در: نارسایی حاد کلیه، ویرایش شده توسط Molitoris BA، و Finn WF، فیلادلفیا، WB Saunders، 2001، صفحات 89-100
36. Devireddy LR، Teodoro JG، Richard FA، Green MR: القای آپوپتوز توسط لیپوکالین ترشح شده که به صورت رونویسی با محرومیت IL{1}} تنظیم می شود. Science 293: 829-834، 2001
37. Persengiev SP، Devireddy LR، Green MR: مهار آپوپتوز توسط ATFx: نقش جدیدی برای عضوی از خانواده ATF/CREB از فاکتورهای رونویسی bZIP پستانداران. Genes Dev 16: 1806-1814، 2002
38. Ryon J، Bendickson L، Nilsen-Hamilton M: بیان بالا در بافت های تولید مثلی درگیر uterocalin/24p3، یک لیپوکالین و پروتئین فاز حاد. Biochem J 367: 271-277، 2002
39. در اثبات حذف شد.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: بیان گلیکودلین در سلول های سرطان سینه MCF{1} باعث تمایز به اپیتلیوم آسینار سازمان یافته می شود. Lab Invest 77: 565-573، 1997
41. Witzgall R، Brown D، Schwarz C، Bonventre JV: محلی سازی آنتی ژن هسته ای سلولی در حال تکثیر، ویمنتین، c-fos، و کلاسترین در کلیه پس از ایسکمیک: شواهدی برای پاسخ ژنتیکی ناهمگن در میان بخش های نفرون، و یک مجموعه بزرگ از میتوز. سلول های فعال و تمایز زدایی شده J Clin Invest 93: 2175-2188، 1994
42. Hammerman MR: خلاصه کردن فیلوژنی توسط انتوژن در نفرولوژی. کلیه Int 57: 742-755، 2000
43. Ichimura T، Bonventre JV، Bailly V، Wei H، Hession CA، Cate RL، Sanicola M: Kidney آسیب مولکول-1 (KIM{2}})، یک مولکول چسبندگی سلول اپیتلیال فرضی حاوی یک ایمونوگلوبولین جدید دامنه، در سلول های کلیه پس از آسیب تنظیم می شود. J Biol Chem 271: 4135-4142، 1998
44. Bailly V، Zhang Z، Meier W، Cate R، Sanicola M، Bonventre JV: ریختن مولکول آسیب کلیه-1، یک پروتئین چسبنده فرضی که در بازسازی کلیه نقش دارد. J Biol Chem 277: 39739– 39748، 2002
45. Han WK، Bailly V، Abichandani R، Thadani R، Bonventre JV: Kidney آسیب مولکول-1 (KIM{2}}): یک نشانگر زیستی جدید برای آسیب لوله پروگزیمال کلیه انسان. کلیه Int 62: 237-244، 2002