کونژوگه های آنتی بادی محرک سیستم ایمنی باعث فعال شدن قوی میلوئید و ایمنی ضد تومور بادوام می شوند (قسمت 2)

برای کسب اطلاعات بیشتر لطفا تماس بگیریدdavid.wan@wecistanche.com

بحث:

نتایج ارائه شده در اینجا شواهد قانع کننده ای را ارائه می دهد که از ISACs به عنوان یک فناوری جدید برای ایمونوتراپی تومور پشتیبانی می کند. مدل‌سازی آزمایشگاهی ISACs توانایی آن‌ها را برای فعال کردن APCهای میلوئیدی اولیه انسانی به روشی وابسته به Fc R و TLR و افزایش ارائه متقابل آنتی‌ژن با استفاده از سیستم مدل OVA موش نشان داد. فعال شدن از طریق تنظیم مثبت مولکول CD40 نه تنها در شرایط آزمایشگاهی مشاهده شد، بلکه در APCهای میلوئیدی ساکن تومور در هر دو مدل تومور زنوگرافت و سیژنیک نیز مشاهده شد. یکی از یافته های قابل توجه این مطالعه این بود که اتصال کووالانسی یک آگونیست TLR به یک آنتی بادی مونوکلونال هدفمند تومور در قالب یک ISAC نتیجه تحریک ایمنی و اثربخشی کلی را که معمولاً با آگونیست های TLR پیش بینی می شود، تغییر داد. مقایسه تحویل موضعی تراستوزوماب همراه با T785 با تحویل سیستمیک T{6}}ISAC نشان داد که تنها ISAC در کاهش بار تومور موفق بود. تحویل موضعی مخلوط هیچ فایده ای در مدل زنوگرافت تومور HCC1954 با اثرات قابل مقایسه با تراستوزوماب به تنهایی نداشت. این یافته تأیید می کند که نه تنها تحویل موضعی، بلکه تحویل همزمان آنتی بادی و آگونیست TLR نیز برای اثربخشی درمانی مشاهده شده با ISAC ضروری است. داده‌های مکانیکی تولید شده در مدل بیگانه‌گرافت تومور HCC1954 نیاز in vivo برای تعامل Fc R و تعامل TLR را برای اثربخشی نشان داد، زیرا هر دو ISAC TLRnull-ISAC و Fc-غیرفعال در کنترل رشد تومور شکست خوردند. علاوه بر این، تجویز سیستمیک ISACs منجر به اثربخشی ضد تومور پایدار در مدل‌های تومور سیژنیک HER2 موش صحرایی و زنوگرافت‌های HER2 به علاوه سرطان پستان انسانی شد که به درمان با آنتی‌بادی غیر کونژوگه مقاوم بودند. HER2 به عنوان آنتی ژن هدف برای مطالعات in vivo پیش بالینی انتخاب شد زیرا درمان نئوادجوانت، کمکی و خط اول برای بیماران مبتلا به سرطان پستان به صورت موضعی پیشرفته یا متاستاتیک تحت سلطه آنتی بادی های هدفمند HER است که برای تحریک سیستم ایمنی طراحی نشده اند. سیستم و آنتی بادی های مسدود کننده بازدارنده سلول T تایید شده در این بیماران کمترین اثر را داشته است. این بیماران می توانند از ISAC هایی بهره مند شوند که عملکرد آنتی بادی های اصلی را حفظ کرده و پتانسیل تحریک ایمنی قابل توجهی را اضافه می کنند. مانند هر روش ایمنی درمانی، امکان تولید یا تشدید آنتی بادی های ضد دارو وجود دارد و در مورد ISAC، ممکن است در نهایت به ایمنی زایی آنتی بادی اصلی بستگی داشته باشد. این ارزیابی‌ها به بهترین وجه از نظر بالینی انجام می‌شوند و تراستوزوماب ممکن است برای بررسی مناسب باشد زیرا میزان ایمنی زایی گزارش شده هرسپتین در بیماران کمتر از 1 درصد است. داده‌های in vivo که نیاز به تحویل همزمان آنتی‌بادی و ادجوانت را نشان می‌دهد، بیشتر توسط کار در مورد جزئیات سیگنال‌دهی درون سلولی حاکم بر فعالیت ISAC از طریق سیگنال‌دهی همزمان Fc R و TLR پشتیبانی می‌شود. در حالی که مطالعات اضافی ممکن است دینامیک سیگنال دهی داخل سلولی ISAC را بیشتر روشن کند، مطالعاتی که در اینجا توضیح داده شده است مزایای سیگنال دهی بالقوه کونژوگه کردن یک آگونیست TLR به یک آنتی بادی را برجسته می کند، همانطور که معمولاً هنگامی مشاهده می شود که آنتی بادی ها در طول ایمنی محافظتی با پاتوژن ها درگیر می شوند. تجزیه و تحلیل سیگنال دهی درون سلولی مبتنی بر CyTOF در PBMCs انسانی برای ادامه استفاده شددرک و تمایز فعالیت مخلوط و ISAC. نتایج نشان داد یک امضای تقویت‌شده به دنبال تحریک ISAC در مقایسه با آنچه که توسط مخلوط اجزای منفرد ایجاد می‌شود، که بیشتر از پتانسیل افزایش فعالیت از طریق ترکیب شیمیایی آنتی‌بادی و آگونیست TLR پشتیبانی می‌کند. در حالی که نمی‌توان با استفاده از سلول‌های گزارشگر HEK293 قدرت خاص TLR7 و{1}}TLR ISAC را اندازه‌گیری کرد،فسفوریلاسیون IRF-7 ناشی از ISAC، آگونیسم فعال TLR7/8 را نشان می‌دهد، زیرا IRF{4}} به عنوان پایین دست سیگنال‌های هدایت‌شده TLR7 و TLR8 MyD88-30 شناخته می‌شود. داده‌ها نشان می‌دهند که ISAC نه تنها باعث افزایش سیگنال‌دهی مسیرهای متعارف مرتبط با مسیرهای TLR و Fc R می‌شود، بلکه آستانه فعال‌سازی دوتایی مورد نیاز برای تحریک فسفوریلاسیون پروتئین‌های سیگنال‌دهنده پایین‌دستی مانند پروتئین ریبوزومی S6، تنظیم‌کننده کلیدی ترجمه پروتئین در سلول را کاهش می‌دهد. نمرات DREMI بالا، به ویژه اندازه گیری شده استدر مونوسیت ها و همچنین در DCها، وابستگی شرطی قوی ناشی از تحریک با ISAC را که با مخلوط دیده نمی شود، پشتیبانی می کند. این پدیده ممکن استبا تغییرات درون سلولی در فراوانی، محلی‌سازی و/یا به‌کارگیری گیرنده‌های درون آندوزوم تسهیل می‌شود، اما تحقیقات بیشتری برای تایید مکانیسم دقیق مورد نیاز است. نکته مهم، تجزیه و تحلیل DREMI روابط سازگار با شرکای سیگنالینگ شناخته شده را در نتیجه تحریک ISAC شناسایی کرد. با بازدارندگی شناخته شده آننقش در سیگنال دهی متعارف NF-kB 49، کاهش وابستگی را مشاهده کردیم (یعنی امتیاز DREMI)بین pIRF7 و مهارکننده کاپا B (IκB) زمانی که سلول‌های میلوئیدی با ISAC تحریک شدند. در مجموع، این نتایج از یک پاسخ درون سلولی تقویت شده و پایدار از طریق مولکول های مسیر انتقال سیگنال مربوطه در پایین دست تحریک ISAC علاوه بر هم افزایی بین مسیرهای سیگنال دهی مربوط به TLR و Fc R پشتیبانی می کنند.

برای اطلاعات بیشتر در مورد Cistanche اینجا را کلیک کنید

نتایج ما نشان داد که برهمکنش‌های کاربردی Fc-Fc R برای فعال‌سازی APC‌های میلوئیدی با واسطه ISAC ضروری هستند. IgG1 Fc بومی، که دارای بالاترین میل ترکیبی برای Fc ​​Rs فعال کننده از ایزوتیپ های IgG طبیعی موجود است، نسبت به سایر ایزوتیپ های IgG با قرابت کمتر برای Fc ​​Rs فعال کننده برتر بود. افزایش بیشتر برهمکنش Fc-Fc R از طریق فوکوزیلاسیون باعث افزایش قدرت شد در حالی که کاهش برهمکنش Fc-Fc R از طریق گلیکوزیلاسیون باعث کاهش قدرت شد. همانطور که انتظار می رفت، سیگنال دهی Syk در پایین دست درگیری Fc R علاوه بر آگونیسم بعدی TLR برای ISAC ها برای برانگیختن حداکثر تحریک مورد نیاز بود. این یافته‌ها توسط مطالعات نشان‌دهنده افزایش چشمگیر تحریک میلوئید به دنبال تحریک همزمان با IgG متصل به صفحه و آگونیست TLR PAM3CSK 50 پشتیبانی می‌شوند. آنها همچنین نشان می‌دهند که اتصال عرضی Fc گسترده‌تر، روی سطح سلول هدف یا در محیط آزمایشگاهی صفحه‌ای. ، ممکن است رخ دهد یا شبکه های سیگنالینگ دیفرانسیل درگیر شوند، به دنبال تحریک ISAC بر خلاف مخلوط اجزا. ترجمه پلت فرم ISAC در داخل بدن برای اولین بار با رده های سلولی تومور HER2 انسانی در موش هایی که فاقد سلول های B، T و NK کاملاً کاربردی بودند، ارزیابی شد. قابل توجه تراستوزوماب ISAC به طور قابل توجهی موثرتر از تراستوزوماب در چندین تومور با سطوح مختلف بیان HER2 بود. علاوه بر این، داده ها وابستگی به هدف گیری تومور را برای اثرات ضد توموری ISAC نشان دادند، زیرا ایزوتیپ-ISAC قادر به القای پسرفت و پاکسازی تومور نبود. در حالی که مدل‌سازی آزمایشگاهی ضرورت فعالیت TLR و Fc R را برای فعال کردن قدرت ISAC نشان داد، چنین مدل‌هایی در اندازه‌گیری وابستگی به هدف‌گیری آنتی‌ژن ISAC موفق نبودند. هیچ تفاوتی بین ISACهای هدفمند و ایزوتیپ T در آزمایش‌های مبتنی بر پلیت با APCهای میلوئیدی انسان سالم که هم‌کشت شده بودند اندازه‌گیری نشد.با سلول های تومور (داده ها نشان داده نشده است).فقدان وابستگی به هدف اندازه‌گیری شده در شرایط آزمایشگاهی ممکن است به عوامل متعددی نسبت داده شود: APCهای میلوئیدی به دنبال کشت آزمایشگاهی Fc Rs را روی سطح سلول تنظیم می‌کنند، که ممکن است توانایی IgG محلول را برای اتصال به Fc R افزایش دهد و منجر به یک سیگنال تقویت شده از ایزوتیپ ISAC.علاوه بر این، فرهنگیانسیستم فاقد IgG درون زا و فاکتورهای سرمی اضافی موجود در داخل بدن است که ممکن است برای Fc ​​R در داخل بدن رقابت کند و اثرات مشاهده شده با ایزوتیپ ISAC را کاهش دهد.با این وجود، مدل‌های in vivo وابستگی ISAC به هدف‌گیری تومور را برای اثربخشی ضد تومور نشان دادند.ISACهای ایزوتیپ نه تنها تأثیر کمی بر رشد تومور در مطالعات اثربخشی نشان دادند، بلکه مشخص شد که تأثیری بر سطح ژنتیکی تومورها ندارند، همانطور که در مدل‌های تومور زنوگرافت و سیژنیک نشان داده شده است.علاوه بر نشان دادن اثربخشی وابسته به هدف در داخل بدن، T785-ISAC توسط حیوانات تحمل شد و حداقل کاهش وزن را القا کرد، و نشانه کمی از اثرات خارج از هدف و عوارض جانبی در موش نشان داد.این داده‌ها بیشتر از توانایی ISAC هدف‌گیرنده تومور به‌صورت سیستمیک برای سفر به تومور و القای یک پاسخ ضد تومور پیش التهابی موضعی حمایت می‌کنند.

اهمیت عملکردهای موثر با واسطه سلول میلوئید در مطالعات کاهش سلولی نشان داده شد، که در آن کاهش کلودرونات فاگوسیت ها توانایی ISAC را برای القای پاکسازی تومور از بین می برد.جالب توجه است، اگرچه تومورها در ابتدا پس از تخلیه سلول های مثبت Gr1 پسرفت کردند، تومورها متعاقبا رشد کردند.این پدیده ممکن است در نتیجه کاهش پیش سازهای فاگوسیتی مانند مونوسیت ها رخ داده باشد که ممکن است بعداً به سلول های فاگوسیتی عملکردی و بالغ تمایز یافته باشد.بینش‌های مولکولی و سلولی بیشتر بر روی کمی‌سازی سطوح mRNA و تغییرات پس از درمان ISAC به‌دست آمد.این داده‌ها بیشتر توسط ایمونوهیستوشیمی و همچنین کمی‌سازی پروتئین تأیید شدند، که نشان‌دهنده نفوذ سلول‌های میلوئیدی به داخل تومور است.با تولید یک سیتوکین TNF پیش التهابی و مواد شیمیایی جذب کننده میلوئیدی CCL2 (MCP{2}}) و CCL4 (Mip1b).

شکل 2: ISACS الگوهای سیگنال دهی متمایزی را در APCهای میلوئیدی ایجاد می کند. (ad) PBMC انسانی تازه ایزوله شده با 1 میکرومولار از rituximab-ISAC یا معادل هممولار مخلوط در حضور CD20 به علاوه سلول های تومور Toledo در 1:1 تحریک شد. نسبت به مدت 15 دقیقه (الف) نسبت قوس میانی ISAC نسبت به سیگنال دهی به دنبال تحریک مخلوط برای فسفوپروتئین های مختلف همانطور که توسط یک نقشه حرارتی نشان داده شده است، با زرد نشان دهنده سیگنال دهی افزایش یافته و آبی نشان دهنده کاهش سیگنال اندازه گیری شد. (ب) نمودارهای فلوسیتومتری نماینده برای pIRF7 و pRPS6 در مونوسیت ها و cDCها. (ج) تغییر برابری سیگنال دهی القا شده به عنوان نسبت آرکسینه نسبت به کنترل تحریک نشده محاسبه شد. فسفوریلاسیون IRF7 و ERK1/2 در مونوسیت ها و cDC ها به دنبال تحریک ISAC یا مخلوط اندازه گیری شد. داده ها از یک آزمایش با شش اهدا کننده (میانگین و SEM) است. *پ<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

گیرنده‌های CCL2 و CCL4، CCR2 و CCR5 به ترتیب بر روی مونوسیت‌ها و ماکروفاژها بیان می‌شوند، که نشان می‌دهد این نوع سلول‌ها می‌توانند برای تومورهای تحت درمان با ISAC استفاده شوند.علاوه بر این، mRNA ژن Cxcl9 و Cxcl11، که کموکاین‌های اختصاصی سلول T را کد می‌کنند و توسط DCها در TME بیان می‌شوند، با درمان ISAC تراستوزوماب (شکل تکمیلی 23) 52،53 نیز تنظیم شدند.تراستوزوماب ISAC با قدرت افزایش یافته، با استفاده از آگونیست CL264، در مدل‌های توموری که HER2 کمتری را بیان می‌کنند، اثربخشی بیشتری نشان داد.این مهم با توجه به اینکه بیمارانی که تومورهای آنها HER2 کم دارند، گزینه های درمانی محدودتری دارند و واجد شرایط تراستوزوماب یا سایر درمان های حاوی تراستوزوماب نیستند.کاهش وزن گذرا حدود 5-10 درصد و افزایش ترشح سیستمیک TNF در حیوانات تحت درمان با CL{1}}ایزوتیپ هدفمند و ایزوتیپ مشاهده شد که نشان دهنده اثرات احتمالی خارج از هدف علاوه بر ضد قوی است. فعالیت تومور مشاهده شد.داده‌های جمعی ارائه‌شده در مدل‌های پیوند زنوگرافت نشان می‌دهد که فاگوسیتوز با واسطه ISAC یک مکانیسم مؤثر برای از بین بردن تومورها است، اما این مکانیسم ممکن است به دنبال ارائه آنتی‌ژن نئوآنتی‌ژن‌های تومور به سلول‌های T در میزبان‌های دارای قابلیت ایمنی افزایش یابد.برای این منظور، توانایی ISACs برای ارتقای ایمنی ضد توموری در موش‌های نوع وحشی با ISACs anti-rHER2 در دو مختلف بررسی شد.rHER{0}} بیان کننده مدل‌های همزمان (MMC و CT26-rHER2). هر دو T785 و CL264 حاوی ISAC در مدل MMC syngeneic با توجه به بیان آنتی ژن بالای rHER2 مورد ارزیابی قرار گرفتند، زیرا هر دو ISAC با قدرت پایین تر و بالاتر با تراکم آنتی ژن بالا بر روی سلول تومور موثر هستند. هر دو ISACs rHER2 منجر به پاکسازی کامل تومور در حیواناتی شدند که دارای تومورهای بزرگ ({7}} mm3) در مدل MMC بودند، در حالی که آنتی بادی غیر کونژوگه نتوانست رشد تومور را کنترل کند. تجزیه و تحلیل سطوح رونوشت mRNA در مدل MMC تغییر چشمگیری را در تنظیم نشان دادبسیاری از ژن‌ها در 24 ساعت پس از درمان با rHER2 T785-ISAC مورد نظر نسبت به آنتی‌بادی rHER2 یا ایزوتیپ ISAC، از جمله در ژن‌های دخیل در زیست‌شناسی سلول‌های میلوئید، زیست‌شناسی TLR، و پاسخ‌های ایمنی تطبیقی. افزایش نفوذ سلول های بیان کننده CD11c- و F4/{7} توسط ایمونوهیستوشیمی، مشابه روندی که در مدل تومور زنوگرافت HCC1954 مشاهده شد، مشاهده شد. علاوه بر این، نفوذ سلول T CD8 توسط مشاهده شدایمونوهیستوشیمی، پشتیبانی از تولید یک پاسخ ایمنی تطبیقی ​​پس از درمان ISAC.

علاوه بر اهمیت فاگوسیت‌ها در مدل پیوند زنوگرافت، مطالعات کاهش در مدل تومور سیژنیک MMC وابستگی شدیدی به فاگوسیت‌ها نشان داد، زیرا تخلیه با استفاده از لیپوزوم‌های بارگذاری شده با کلودرونات، اثرات ضد توموری با واسطه ISAC را متوقف کرد. علاوه بر این، مطالعات syngeneic نقش مهمی را برای سلول های T در اثربخشی ISAC نشان داد. پاکسازی تومور مبتنی بر ISAC به شدت به فعالیت سلول های CD8 T وابسته بود، زیرا کاهش سلول های CD8 T اثر ضد تومور را مهار می کند. داده‌ها نشان می‌دهند که فعالیت سلول‌های T از طریق فعال‌سازی سلول‌های میلوئیدی تحریک‌شده با ISAC با واسطه TLR انجام می‌شود. چنین نیازی برای سلول‌های T، که احتمالاً مربوط به ارائه آنتی‌ژن‌های مرتبط با تومور توسط سلول‌های میلوئیدی تحریک‌شده با ISAC است، نشان می‌دهد که ISAC‌ها احتمالاً فعالیت ضد توموری خود را حداقل از طریق دو مکانیسم میانجی‌گری می‌کنند: فاگوسیتوز و ارائه آنتی‌ژن. در حالی که فاگوسیت ها پاسخ ضد توموری اولیه را به دنبال درمان ISAC ارائه می دهند، پرایم آنتی ژن سلول های T در نهایت پاکسازی تومور و اثرات بادوام اندازه گیری شده در مدل های کاملاً ایمنی را فراهم می کند. این ترکیب برای بیماران سرطانی بسیار مطلوب است زیرا درمان ISAC می‌تواند به ایمنی ضد توموری قوی و بادوام منجر شود. برای بررسی بیشتر اهمیت فعال‌سازی سلول‌های T با واسطه ISAC، موش‌ها پس از rHER2 CL از تومورهای CT{15}} rHER2 درمان شدند. 264-درمان ISAC پس از 30 روز از عاری بودن از تومور، با رده سلولی والدینی غیر rHER2 که CT26 را بیان می‌کند، دوباره به چالش کشیده شد. حیوانات درمان شده با rHER{24}}CT26 از چالش با CT26 محافظت شدند در حالی که حیوانات ساده تومور قادر به رد رشد تومور نبودند. علاوه بر این، برای نشان دادن اینکه محافظت خاص برای رده سلولی تومور CT26 است، 4T1 به طور همزمان در پهلوی طرف مقابل موش‌های والدینی که CT26 به چالش کشیده بودند کاشته شد. اگرچه تومورهای CT26 در موش‌های درمان شده با CT26 موفق به رشد نشدند، رشد تومور 4T1 بدون محدودیت بود و بنابراین شواهدی را ارائه می‌دهد که ایمنی آنتی ژن خاص و وابسته به پاسخ ایمنی تطبیقی ​​است. علاوه بر این، این مطالعات نشان می دهد که ISAC های هدفمند تومور، حافظه ایمونولوژیک را نه تنها نسبت به آنتی ژن تومور مورد هدف اولیه، بلکه برای آنتی ژن های غیر هدفمند نیز واسطه می کنند. این داده‌ها همچنین نشان می‌دهند که سلول‌های میلوئید ممکن است آنتی‌ژن‌های مرتبط با تومور را ارائه دهند که پاسخ‌های اضافی CTL را تحریک می‌کنند. پیامدهای این یافته ها نشان می دهد که، حتی اگر آنتی ژن تومور هدف متعاقباً کاهش یابد یا نتواند به ISAC متصل شود، حافظه ایمونولوژیک قبلاً فراخوانی شده است و قادر به حفظ یک پاسخ بادوام است. این پاسخ نیستمحدود به آنتی ژنی است که توسط ISAC مورد هدف قرار می گیرد، بلکه به آنتی ژن های اضافی، ناشناس، بیان شده توسط تومور نیز محدود می شود.در مجموع، این داده‌ها نشان می‌دهند که ISACها از نظر کیفی و کمی بیولوژی متمایز مربوط به فعال‌سازی سلولی و ارائه آنتی‌ژن، تکثیر سلول‌های T و ایمنی ضد تومور بادوام را برمی‌انگیزند.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 درصد بر اساس پروتئین بازیابی شده است. تجزیه و تحلیل SEC حداقل حضور کل را شناسایی کرد و DAR با تجزیه و تحلیل LC/MS تعیین شد. ISAC های خالص شده از طریق یک فیلتر استریل 0.2 میکرومتر فیلتر شدند و تا زمان استفاده در دمای -20 درجه نگهداری شدند. سلول های گزارشگر HEK Reporter AssayHEK293 که TLR7 انسانی یا TLR8 انسانی را بیان می کنند از Invivogen (hub-htlr7 یا hub-htlr8) خریداری شدند. و پروتکل های فروشنده برای انتشار و آزمایش سلولی دنبال شدند. به طور خلاصه، سلول‌ها تا 80-85 درصد تلاقی در 5 درصد CO2 در DMEM همراه با 10 درصد FBS، زئوسین و بلاستی‌سیدین رشد کردند. سپس سلول‌ها در 96-صفحه‌های مسطح چاهی با ابعاد 4×104 سلول/چاه با بستری حاوی محیط تشخیص HEK و مولکول‌های تحریک‌کننده ایمنی کاشته شدند. فعالیت با استفاده از صفحه‌خوان در طول موج 620-655 نانومتر اندازه‌گیری شد. پروتئین‌های گیرنده گاما Fc (FCGR) با برچسب‌گذاری Biacore از سیستم‌های تحقیق و توسعه (FCGR1 (CD64، cat# 1257-FC{23}) به‌دست آمدند. })، FCGR2A (CD32a، cat# 1257-FC-050)، FCGR2B (CD32b، cat# 1875-FC-050)، FCGR3A (CD16a، cat# {{34 }}FC{35}}. تجزیه و تحلیل اتصال بر روی دستگاه Biacore T200 در بافر HBS-EP plus (GE BR100669) با استفاده از تراشه CM5 (GE BR100530) حاوی آنتی بادی ضد HIS بی حرکت (کیت HIS Capture, GE 28995056) انجام شد. ریتوکسیماب یا ریتوکسیماب-ISAC روی سلول‌های جریانی حاوی FCGRs گرفته شده یا فقط آنتی‌بادی سطح مرجع آنتی‌هیس تزریق کرده‌اند. داده‌ها باضد سطح او و فقط تزریق بافر. از روش تیتراسیون جنبشی استفاده شد و سطوح بین چرخه ها با تزریق 10 میلی مولار گلیسین با pH 1.5 بازسازی شدند. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار ارزیابی Biacore T200 (V3.1) با استفاده از تناسب جنبشی (1:1) برای FCGR1 و FCGR3A (میانگین 6 اجرا) و میل حالت پایدار (1:1) برای FCGR2A و FCGR2B (میانگین 3 اجرا) برازش شدند. ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 درصد همانطور که توسط فلوسیتومتری بر اساس بیان CD14، CD16، CD11c و HLA-DR تعیین شد. آماده سازی سلول های توموری Toledo سلول های Toledo (ATCC) در محیط های توصیه شده توسط فروشنده کشت شدند و در تراکم سلولی توصیه شده توسط فروشنده (ATCC) نگهداری شدند. سلول‌ها از کشت خارج شدند، شسته شدند و در PBS با 2 درصد FBS و 2 میلی‌مولار EDTA در {9}}×106 سلول در میلی‌لیتر معلق شدند. در برخی موارد، سلول‌ها متعاقباً با 2 میکرومولار CFSE به مدت 2 دقیقه برچسب‌گذاری شدند و سپس یک‌بار با RPMI{13}} (Lonza) تکمیل‌شده با 10 درصد FBS (Atlanta Biologicals) و 100 U/mL Pen/Strep (Lonza) شسته شدند. سپس سلول ها در پارافورمالدئید 2 درصد تثبیت شدند و سه بار با PBS شسته شدند. مکمل با 10 درصد FBS (Atlanta Biologicals)، 1 میلی مولار سدیم پیروات (Lonza)، 100 میکرومولار اسیدهای آمینه غیر ضروری (Lonza) و 100 U/mL Pen/Strep (Lonza). برای آزمایش‌های کشت تومور و مونوسیت، مونوسیت‌ها با سلول‌های تومور آلوژنیک ثابت در نسبت 3 به 1 کشت داده شدند. سلول‌ها متعاقباً با عوامل تحریک‌کننده ایمنی یا کنترل برای 18-36 ساعت در دمای 37 درجه با 10 درصد CO2 انکوبه شدند. فعال سازی سلولی از طریق بیان سطح سلولی نشانگرهای فعال سازی و تولید سیتوکین اندازه گیری شد. سطوح بیان نشانگر سطحی با فلوسیتومتری با آنتی بادی‌های ضد CD40 (5C3، BD)، CD{38}} (IT2.2، BD)، HLA-DR (L243، BD) و CD16 (3G8، BD) اندازه‌گیری شد. CD14 (MΦP9، BD)، و CD123 (7G3، BD). PBMC ها توسط فلوسیتومتری با آنتی بادی ها علیه نشانگرهای فعال سازی فوق الذکر و همچنین نشانگرهای اصل و نسب CD19 (HIB19، BD)، CD56 (B159، BD)، CD3 (SK7، BD)، CD4 (OKT4، BioLegend)، CD8 (SK1، BD) و CD69 (FN50, BD). در همه موارد، مایع رویی کشت سلولی پس از انکوباسیون 18 یا {64} ساعت جمع‌آوری شد، و تولید سیتوکین با استفاده از کیت‌های آرایه مهره‌های سیتوکین (کیت سیتوکین التهابی انسانی، BD Biosciences) و ELISA (کیت TNF Human ELISA، eBios) اندازه‌گیری شد. Mass CytometryPBMCs از خون اهداکننده سالم جدا شد و با ISAC، مخلوطی از آنتی بادی و ادجوانت یا بدون محرک به مدت 5-15 دقیقه در دمای 37 درجه تحریک شد. بدنبال تحریک، سلولهابا افزودن 16 درصد PFA (علوم میکروسکوپ الکترونی) به غلظت نهایی 1.6 درصد تثبیت شدند و به مدت 1{4}} دقیقه در دمای اتاق (RT) انکوبه شدند. سلول های ثابت با محیط رنگ آمیزی سلولی (CSM؛ PBS با 0.5 درصد BSA و 0.02 درصد آزید سدیم (همه سیگما) شسته شدند و با استفاده از روش مبتنی بر پالادیوم همانطور که قبلاً توضیح داده شد بارکد شدند. نمونه های بارکد شده در یک ترکیب شدند. نمونه کامپوزیت برای رنگ آمیزی سطح

رنگ‌آمیزی سطحی با افزودن آنتی‌بادی‌ها (جدول تکمیلی 2) در CSM و انکوباسیون به مدت 3{{1{12}}}} دقیقه در RT انجام شد. طبق توصیه های سازنده، آنتی بادی های ضد انسانی یا به صورت کونژوگه (Fluidigm) یا کونژوگه با ایزوتوپ های فلزات سنگین با استفاده از کیت برچسب گذاری آنتی بادی MaxPar X8 (Fluidigm) خریداری شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی سطحی یک‌بار در CSM شسته و با MeOH به مدت 10 دقیقه روی یخ نفوذپذیر شدند. سلول های نفوذ پذیر دو بار با CSM شسته شدند و آنتی بادی علیه آنتی ژن های داخل سلولی به مدت 30 دقیقه در RT اضافه شد. سلول ها با CSM شسته شده و در نهایت در محلول intercalation (1.6 درصد PFA در PBS، 0.02 درصد ساپونین (Sigma) و 0.5 میکرومولار iridium-intercalator (Fluidigm)) در یک شب در دمای 4 درجه معلق شدند. قبل از جمع آوری داده ها، نمونه ها یک بار در CSM و دو بار در ddH2O شسته شدند. تمام نمونه‌ها از طریق یک صافی سلولی (Falcon) فیلتر شدند و مجدداً در 106×1 سلول در میلی‌لیتر در ddH2O همراه با 1x دانه‌های کالیبراسیون چهار عنصری EQ (Fluidigm) و داده‌های به‌دست‌آمده در یک سیتومتر جرمی CyTOF2 (Fluidigm) معلق شدند. پاسخ‌های سیگنالینگ با استفاده از پیاده‌سازی SPADE در سیتی‌بانک 29 مورد ارزیابی قرار گرفت. آنالیزها بر روی همه سلول‌ها (بدون نمونه‌برداری پایین)، انتخاب تعداد اعلام‌شده خوشه‌ها و استفاده از همه نشانگرهای سطح مربوطه اما بدون نشانگرهای درون سلولی برای خوشه‌بندی انجام شد. دودمان سلولی ایمنی بر اساس الگوهای بیان پروتئین سطحی با ابعاد بالا مشروح شد. تجزیه و تحلیل‌های آماری در R، یک محیط نرم‌افزار آماری منبع باز انجام شد. در هر زیر مجموعه سلولی، گروه درمانی و دهنده، میانگین تغییر برابری برای بیست نشانگر فسفو پروتئین زیر محاسبه شد: p-Src، p-STAT5، p-cMET، p-AKT، p-MAPKAPK2، p-SHP2، p. -SLP76، p-IRF-7، p-ZAP70/SYK، p-CREB، p-NFKB، p-PI3K، IKB (کل)، p-PLCG1، p-ERK1/2، p-p38، p -BTK/ITK، p-S6، p-STAT3، و p-JNK/SAPK. میانگین تغییر چین با تعداد کل سلول‌ها در هر خوشه، همانطور که به دنبال خوشه‌بندی SPADE تعریف شد، وزن شد. آزمون‌های t زوجی برای تخمین تفاوت در تغییر میانگین چین و آزمایش فرضیه صفر مبنی بر اینکه تفاوتی در میانگین تغییر برابری هر نشانگر در شرایط تیمار و کنترل وجود ندارد، انجام شد.

رویه آزمایشی مدل تومور Xenograft خطوط سلولی تومور از ATCC (NCI-N87، HCC1954 و COLO205) یا AddexBio (JIMT-1) خریداری شده و طبق دستورالعمل‌های سازنده رشد کرده‌اند. سلول ها هنگامی که با جدا شدن با Accutase (Stemcell) به 80-90 درصد تلاقی رسیدند، با PBS شسته شدند، مجدداً در 40 x 106 سلول / میلی لیتر در PBS معلق شدند و بیش از دو ساعت روی یخ قرار گرفتند. بلافاصله قبل از کاشت، سلول‌های معلق با حجم مساوی از Cultrex PathClear BME، نوع 3 (سیستم‌های تحقیق و توسعه) مخلوط شدند و 100 میکرولیتر از مخلوط (2 × 106 سلول) به‌صورت زیر جلدی در سمت راست در هفته 6-8- کاشته شد. موش های ماده پیر به شرح زیر: سلول های NCI-N87 و COLO205 در موش های NSG (آزمایشگاه جکسون)، سلول های HCC1954 و JIMT{18}} در ناک اوت دوگانه Rag2/IL2rg (Taconic) و HCC1954 (برای ارزیابی با) کاشته شدند. T{22}}ISAC) در NSG یا کاشته شدندموش های SCID/بژ (آزمایشگاه جکسون یا تاکونیک و انویگو). اندازه تومور دو بار در هفته ثبت شد و با استفاده از فرمول زیر تخمین زده شد: (طول x عرض2)/2. هنگامی که تومورها به mm3 به 50-100 رسید، معمولاً در عرض یک هفته پس از کاشت تومور، درمان‌ها آغاز شد. موش ها بر اساس اندازه تومور به گروه های درمانی قبل از درمان اولیه تقسیم شدند. تراستوزوماب (EirGenix؛ EG12014)، تراستوزوماب ISAC یا ایزوتیپ ISAC در PBS با 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد و با دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم به صورت داخل صفاقی هر پنج روز (Q5D) در مجموع شش دوز تجویز شد. موش هایی که تومور آنها بیش از 2000 میلی متر مکعب بود کشته شدند.

روش آزمایشی تخلیه سلولی HCC1954 و MMC برای تخلیه ماکروفاژها و سایر سلول‌های فاگوسیتی، موش‌های حامل تومور HCC1954 یا MMC از طریق تزریق داخل صفاقی دو روز قبل از درمان اولیه ISAC با لیپوزوم‌های کلودرونات یا لیپوزوم‌های کنترلی کاتولوآکاپ غیر حاوی کاتولوآکاپ منفی تحت درمان قرار گرفتند. CLD-8901) و سپس دو بار در هفته به مدت سه هفته درمان می شود. برای تخلیه نوتروفیل‌ها، موش‌ها با آنتی‌بادی‌های کاهش‌دهنده 1A8 تحت درمان قرار گرفتند تا فقط Ly6G به‌علاوه نوتروفیل‌ها (کاتالوگ BioXCell # BE0075-1) یا RB6-8C5 برای تخلیه سلول‌های Gr1 plus، که شامل Ly6G به‌علاوه نوتروفیل‌ها و Ly6C پلاس می‌شود. سلول‌ها (BioXCell Catalog # BE0075) یا کنترل‌های ایزوتیپ 2A3 و LTF{15}} (به ترتیب BioXCell Catalog # BE0089 و BE0090) دو روز قبل از درمان اولیه ISAC، سپس دو بار در هفته به مدت سه هفته تحت درمان قرار گرفتند. کاهش سلول ها در خون با فلوسیتومتری تایید شد (شکل تکمیلی 24). سیتوکین تومور و روش آنالیز mRNA تومورها همانطور که قبلا توضیح داده شد کاشته شدند و برای تجزیه و تحلیل در نقاط زمانی مشخص شده پس از درمان جمع آوری شدند. برای ایمونوهیستوشیمی و تجزیه و تحلیل mRNA، تومورها تقسیم شدند و mRNA با پانل پروفایل ایمنی پان سرطان موش NanoString تجزیه و تحلیل شد. تجزیه و تحلیل داده ها با نرم افزار تحلیل پیشرفته nSolver طبق توصیه های سازنده انجام شد. نمودارهای آتشفشان با بسته ggplot2 در R ترسیم شد. برای به دست آوردن لیزات تومور برای تجزیه و تحلیل سیتوکین، قطعات تومور در یک بافر از پیش ساخته شده (1 قرص مهارکننده پروتئاز پیرس (ترمو فیشر، کاتالوگ #A32965) محلول در 20 میلی لیتر T- نگهداری شدند. PER Tissue Protein Extraction Reagent, Thermo Fisher, Catalog #78510) در GentleMACS M Tubes (Miltenyi, Catalog #130-093-236) بلافاصله پس از کالبدگشایی. سپس نمونه‌های تومور با استفاده از GentleMACS Octo Dissociator جدا شدند. تمام نمونه ها به مدت 5 دقیقه در 300 گرم چرخانده شدند. سپس مواد رویی در لوله های میکروفیوژ جمع آوری شد و دوباره با میکروسانتریفیوژ چرخانده شدند. آنالیز سیتوکین بر روی سوپرناتانت توسط MSD انجام شد. ایمونوهیستوشیمی با استفاده از هماتوکسیلین و ائوزین برای شناسایی معماری بافت و همچنین برای نشانگرهای زیر که در مطالعات نشان داده شده است انجام شد: CD11c (CST Catalog #87585) و CD8 (CST Catalog #98941).

شکل 4: T{1}}ISAC ایمنی قوی ضد توموری را در مدل‌های پیوند تومور مقاوم به تراستوزوماب ایجاد می‌کند. موش‌های SCID/Beige یا NSG با رده سلولی HCC1954 کاشته شدند و زمانی که حجم تومور به 50 رسید، تصادفی شدند. - 75 میلی متر مکعب. (الف) موش‌ها یک‌بار با تزریق داخل صفاقی (IP) با 5 میلی‌گرم/کیلوگرم تراستوزوماب T{10}}ISAC یا تراستوزوماب، یا با دوز مولار با مخلوطی از تراستوزوماب و T785 به ISAC از طریق تزریق داخل توموری (IT) تحت درمان قرار گرفتند. داده‌ها از یک آزمایش با n=3-5 موش در هر گروه است. (ب) موش ها از طریق تزریق داخل صفاقی با mg/kg 5 تراستوزوماب، تراستوزوماب-ISAC، تحت درمان قرار گرفتند.rituximab یا rituximab-ISAC Q5DX6 (n= 5 موش در هر گروه). (ج) موش‌ها از طریق تزریق داخل صفاقی با 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم تراستوزوماب، تراستوزوماب T{5}}ISAC، تراستوزوماب N297A-ISAC، یا تراستوزوماب TLRnull-ISAC (تعداد=5 موش در هر گروه) تحت درمان قرار گرفتند. (د) سلول‌های تومور HCC1954 در موش‌های SCID/Beige کاشته شدند و سلول‌های مورد نظر قبل و در طول درمان با تراستوزوماب T{11}}ISAC (5 میلی‌گرم بر کیلوگرم، Q5DX3) با استفاده از آنتی‌بادی ضد Ly6G (کنترل IgG2a موش) تخلیه شدند. لیپوزوم های کلودرونات (لیپوزوم های کنترل به عنوان شاهد) یا آنتی بادی ضد Gr1 (کنترل IgG2b موش). داده ها از یک آزمایش با n{21}} موش در هر گروه است. (ه، و) موش‌های حذفی دوگانه NSG یا Rag2/IL2rg با رده سلولی JIMT{24}} کاشته شدند و زمانی که حجم تومور به 50 تا 75 میلی‌متر مکعب رسید، تصادفی شدند. موش‌ها متعاقباً با تیمارهای مشخص شده با دوز 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم به صورت داخل صفاقی با فرکانس (e) Q5DX6 تحت درمان قرار گرفتند.یا (f) Q5DX5 (n=3-6 موش در هر گروه). (bf) داده های نشان داده شده معرف حداقل دو آزمایش است. (gj) تومورهای HCC{5}} از گروه‌های موش در نقاط زمانی مشخص شده پس از درمان با دوز واحد 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم ISAC یا آنتی‌بادی‌های کنترل جمع‌آوری شدند. تومورها برای تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری، کمی سازی mRNA نانواسترینگ، یا برای ایمونوهیستوشیمی با فرمالین و پارافین تثبیت شدند. (ز) نمودارهای آتشفشانی تغییر log2 برابری بیان ژن را در تومورهای درمان شده در مقابل کنترل ایزوتیپ که توسط NanoString در 24 ساعت اندازه‌گیری شده‌اند نشان می‌دهند (n=5 موش در هر گروه). تغییرات با مقدار p تنظیم شده < 0.05="" به="" رنگ="" قرمز="" نشان="" داده="" شده="" است.="" (ح)="" نمرات="" امضای="" ژن="" توسط="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" برای="" تومورها="" که="" 24="" ساعت="" پس="" از="" درمان="" تجزیه="" و="" تحلیل="" شدند="" (n{16}}="" موش="" در="" هر="" گروه).="" (i)="" تجزیه="" و="" تحلیل="" فلوسیتومتری="" ترکیب="" سلولی="" تومور="" 24="" ساعت="" و="" 7="" روز="" پس="" از="" درمان="" (تعداد="" {19}}="" موش="" در="" هر="" گروه).="" داده="" ها="" نماینده="" حداقل="" 2="" آزمایش="" هستند.="" (j)="" تصاویر="" نماینده="" و="" همچنین="" تعیین="" کمیت="" f4/80="" و="" cd11c="" ihc="" تومورها="" 9="" روز="" پس="" از="" هر="" درمان="" مشخص="" شده="" برداشت="" شده="" است.="" میله="" های="" مقیاس="" 50="" میکرومتر="" هستند.="" (aj)="" داده="" ها="" به="" صورت="" میانگین="" با="" sem="" و="" آمار="" با="" *p="" نشان="" داده="" می=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

سلول های سیژنیک تومور مدل آزمایشی روش MMC از دکتر دیسیس (دانشگاه واشنگتن) به دست آمد و در RPMI 1640 حاوی 20 درصد FBS، 1 درصد پنی سیلین-استرپتومایسین و ال-گلوتامین در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 کشت داده شدند تا {{8} }} درصد همرو. سلول‌های CT26 (ATCC) ترانسفکت‌شده برای بیان پایدار پروتئین HER2 موش در RPMI 1640 همراه با 10 درصد FBS و 600 میکروگرم در میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک انتخابی G418 (Thermo) در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 تا زمانی که 80-90 درصد هم‌آهنگ شود، رشد کردند. هنگامی که به اندازه کافی همریز شدند، سلول ها با جدا شدن با Accutase (Stemcell) و شستشو با PBS برداشت شدند. سلول های برداشت شده مجدداً در 20 × 106 سلول در میلی لیتر (MMC) معلق شدند.یا 5 × 106 سلول در میلی لیتر (CT26-rHER2) در PBS و تا زمان استفاده در دمای 4 درجه /روی یخ نگهداری می شود. 100 میکرولیتراز سلول‌های معلق به‌صورت زیر جلدی در 6-8-FVB/N-TgN(MMTV- Erbb2)NK1Mul/Jmice یک هفته‌ای (مدل MMC، آزمایشگاه جکسون) یا موش ماده BALB/c (مدل CT26، آزمایشگاه جکسون) کاشته شد. . اندازه تومور دو بار اندازه‌گیری و ثبت شدیک هفته در طول مدت مطالعه حجم تومور با استفاده از فرمول زیر تخمین زده شد: (طول x عرض2)/2. هنگامی که تومورها به 200-500 mm3 (MMC) یا 50-100 mm3 (CT26-rHER2) رسیدند، معمولاً ظرف یک هفته پس از کاشت تومور، درمان‌ها آغاز می‌شد. موش ها بر اساس اندازه تومور به طور تصادفی در گروه های درمانی قبل از شروع اولیه قرار گرفتندرفتار. ضد rHER2 mAb (BioXCell؛ 7.16.4) یا anti-rHER{6}}ISAC به صورت داخل صفاقی (فرکانس همانطور که در افسانه های شکل نشان داده شده است) برای مدت زمان مطالعه تجویز شد.موش هایی که تومور آنها بیش از 2000 میلی متر مکعب بود کشته شدند. تخلیه سلول های T بررسی شددر حیواناتی که از آنتی بادی های تخریب کننده سلول CD4 (BioXCell؛ GK1.5) یا CD8 (BioXCell؛ YTS 169.4) استفاده می کنند. تخلیه قبل از کاشت تومور آغاز شد و با تجویز دو بار در هفته 200 میکروگرم در هر آنتی بادی ادامه یافت. برای چالش مجدد تومور، رده های سلولی CT26 و 4T1 در 5 در 106 سلول در هر خط تومور کاشته شدند، و موش های ساده تومور با هر دو رده سلولی به عنوان گروه کنترل به چالش کشیده شدند.

مواد تکمیلی برای مطالب تکمیلی به نسخه وب در PubMed Central مراجعه کنید. تشکر و قدردانی: نویسندگان مایلند از P. Basto، NE Reticker-Flynn، T. Prestwood و B. Mallet برای بحث مفیدشان تشکر کنند. همچنین از مرکز فلوسیتومتری مرکز خون استانفورد، به ویژه L. Tolentino، O. Choi، و N.Wu تشکر می کنیم. ما همچنین از دکتر مری ال. (نورا) دیسیس و دنیس سیسیل از دانشگاه واشنگتن که رده سلولی تومور MMC را ارائه کردند قدردانی می کنیم.

بودجه: SE Ackerman توسط بورسیه Stanford BioX Bowes حمایت شد.

مراجع: 1. دیویس تی ای و همکاران درمان آنتی بادی مونوکلونال ریتوکسیماب ضد CD20 در لنفوم غیر هوچکین: ایمنی و اثربخشی درمان مجدد J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi:10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642] 2. گریلو-لوپز ای جی و همکاران. ریتوکسیماب: اولین آنتی بادی مونوکلونال تایید شده برای درمان لنفوم. Curr Pharm Biotechnol 1، 1-9 (2000). [PubMed: 11467356] 3. لیزوت پی اچ و همکاران پروفایل چند پارامتری سرطان‌های ریه با سلول غیرکوچک، ایمونوفنوتیپ‌های متمایز را نشان می‌دهد. JCI Insight 1, e89014, doi:10.1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239] 4. اسپرانگر اس و همکاران تراکم آنتی ژن های ایمونوژن وجود یا عدم وجود ریزمحیط تومور ملتهب با سلول T را در ملانوما توضیح نمی دهد. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759– E7768, doi:10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020] 5. Beatty GL & Gladney WL مکانیسم های فرار ایمنی به عنوان راهنمای ایمونوتراپی سرطان. Clin Cancer Res 21, 687-692, doi:10.1158/{50}}.CCR{51}} (2015). [PubMed: 25501578]6. Fridman WH، صفحات F، Salutes-Fridman C & Galon J بافت ایمنی در تومورهای انسانی: تأثیر بر نتیجه بالینی. Nat Rev Cancer 12، 298-306، doi:10.1038/nrc3245 (2012). [PubMed: 22419253]

7. رویکرد Galon J & Bruni D برای درمان تومورهای ایمنی گرم، تغییر یافته و سرد با ایمنی درمانی ترکیبی. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi:10.1038/s41573-018-0007-y (2019). [PubMed: 30610226] 8. Gabrilovich DI، Ostrand-Rosenberg S & Bronte V تنظیم هماهنگ سلول های میلوئید توسط تومورها. Nat Rev Immunol 12، 253-268، doi:10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938] 9. حذف سلول های T Joyce JA و Fearon DT، امتیاز ایمنی و ریزمحیط تومور. Science 348, 74-80, doi:10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376] 10.Carmi Y et al. Akt و SHP{29}} نقاط بازرسی ذاتی DC برای ایمنی تومور هستند. JCI Insight 1, e89020, doi:10.1172/jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544] 11. Carmi Y و همکاران IgG آلوژنیک همراه با محرک های سلول دندریتیک باعث ایجاد ایمنی سلول های T ضد توموری می شود. Nature 521, 99–104, doi:10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063] 12. آلن بی ام و همکاران اختلال عملکرد سیستمیک و انعطاف پذیری ریزمحیط ایمنی در مدل های سرطانی Nat Med 26, 1125–1134, doi:10.1038/s{54}} (2020). [PubMed: 32451499] 13. ساگیو برفی اول و همکاران. ریشه کنی بدخیمی خود به خود با ایمونوتراپی موضعی. Sci Transl Med 10, doi:10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. اسپیتزر MH و همکاران. ایمنی سیستمیک برای ایمونوتراپی موثر سرطان مورد نیاز است. Cell 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070] 15. میلهم محمد ام.، ترزا مدینا آر جی، کرکوود جان ام.، بوچبیندر الیزابت، مهدی ایندرجیت، نیو جیاکسین، شاهین مونتاسر، وزن رایان، مارگولین کیم، لوک جیسون، موریس آرون، مائورو دیوید، کریگ آرتور ام.، ریباس آنتونی سی تی {77}}آگونیست گیرنده شبه توموری (TLR9)، CMP{80}}، در ترکیب با پمبرولیزوماب می‌تواند مقاومت در برابر مهار PD{81}} را در کارآزمایی فاز 1b در افراد مبتلا به ملانوم پیشرفته (جلسه سالانه AACR معکوس کند) 2018، 2018).16. Rook AH زیبایی آگونیست های TLR برای CTCL. Blood 119, 321-322, doi:10.1182/ blood{91}} (2012). [PubMed: 22247516] 17. سینگ ام و همکاران ایمنی موثر ذاتی و انطباقی ضد ملانوم از طریق فعال سازی موضعی TLR7/8. J Immunol 193، 4722-4731، doi:10.4049/J Immunol.1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG، Vasilakos JP، Tross D، Smirnov D و Klinman DM درمان ترکیبی با هدف قرار دادن گیرنده های 7، 8، و 9 تومورهای بزرگ را از بین می برد. J Immunother Cancer 2, 12, doi:10.1186/{115}} (2014). [PubMed: 24982761] 19. جورک ام و همکاران TLR7 یا TLR8 انسانی به طور مستقل به ترکیب ضد ویروسی R{121}} پاسخ می‌دهد. Nat Immunol 3, 499, doi:10.1038/ni{126}} (2002). [PubMed: 12032557] 20. Chattergoon MA و همکاران. HIV و HCV التهاب را در مونوسیت ها و ماکروفاژها از طریق گیرنده های Toll مانند آندوزومی بدون القای اینترفرون نوع 1 فعال می کنند. PLoS Pathog 10, e1004082, doi:10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318] 21. Eigenbrod T، Pelka K، Latz E، Kreikemeyer B و Dalpke AH TLR8 RNA باکتریایی را در مونوسیت‌های انسانی حس می‌کنند و نقش غیرضروری برای شناسایی استرپتوکوک پیوژنز ایفا می‌کنند. J Immunol 195، 1092-1099، doi:10.4049/J Immunol.1403173 (2015). [PubMed: 26101323] 22. متسون جی و همکاران یک رویکرد عملی برای اتصال عرضی Mol Biol Rep 17, 167-183 (1993). [PubMed: 8326953] 23. Gabay C، Ben-Bassat H، Schlesinger M & Laskov R جهش های سوماتیک و تغییرات درون کلونال در ژن های Vkappa بازآرایی رده های سلولی لنفوم B-غیر هوچکین. Eur J Haematol 63, 180-191, doi:10.1111/j.1600-0609.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273] 24. آلونسو MN و همکاران سلول های T(H)1، T(H)2 و T(H)17 به مونوسیت ها دستور می دهند تا به زیر مجموعه های سلولی دندریتیک تخصصی تمایز یابند. Blood 118, 3311-3320, doi:10.1182/blood{178}} (2011). [PubMed: 21813450] 25. کلارک اس آر و همکاران خصوصیات خط تراریخته TCR اختصاصی اوالبومین OT-I: عناصر MHC برای انتخاب مثبت و منفی. Immunol Cell Biol 78, 110-117, doi:10.1046/ j.{189}}.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410] 26. Zehn D، Lee SY و Bevan MJ کامل اما پاسخ سلول T به آنتی ژن با میل ترکیبی بسیار کم را محدود کرد. Nature 458, 211-214, doi:10.1038/nature07657 (2009). [PubMed: 19182777] 27. کوندراتووا ام و همکاران. یک نقشه شبکه سیگنالینگ چند مقیاسی از پاسخ ایمنی ذاتی در سرطان، نشانه‌های ناهمگونی سلولی را نشان می‌دهد. Nat Commun 10, 4808, doi:10.1038/s{210}}x (2019). [PubMed: 31641119]

28. Bendall SC et al. سیتومتری توده ای تک سلولی پاسخ های ایمنی و دارویی افتراقی در سراسر زنجیره خونساز انسان. Science 332, 687-696, doi:10.1126/science.1198704 (2011).[PubMed: 21551058]29. کیو پی و همکاران استخراج یک سلسله مراتب سلولی از داده های سیتومتری با ابعاد بالا با SPADE. Nat Biotechnol 29, 886-891, doi:10.1038/nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415] 30. Kawai T & Akira S TLR سیگنالینگ. Cell Death Differ 13, 816-825, doi:10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796] 31.Sanchez-Mejorada G & Rosales C انتقال سیگنال توسط گیرنده های Fc ​​ایمونوگلوبولین. J Leukoc Biol 63, 521-533 (1998). [PubMed: 9581795] 32. کریشناسوامی اس و همکاران زیست شناسی سیستم ها تجزیه و تحلیل مبتنی بر چگالی مشروط سیگنال دهی سلول T در داده های تک سلولی. Science 346, 1250689, doi:10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. کیفر اف و همکاران پروتئین Syk تیروزین کیناز برای سیگنال دهی گیرنده Fcgamma در ماکروفاژها و نوتروفیل ها ضروری است. Mol Cell Biol 18, 4209-4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. برازلمن اس و همکاران R406، یک مهارکننده تیروزین کیناز طحال خوراکی، سیگنال‌دهی گیرنده Fc را مسدود می‌کند و التهاب ناشی از کمپلکس ایمنی را کاهش می‌دهد. J Pharmacol Exp Ther 319, 998– 1008, doi:10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104] 35. برونز پی و همکاران ویژگی و تمایل گیرنده های Fcgamma انسانی و گونه های چند شکلی آنها برای زیر کلاس های IgG انسانی Blood 113, 3716-3725, doi:10.1182/blood{70}} (2009). [PubMed: 19018092] 36. Nimmerjahn F & Ravetch JV فعالیت زیر کلاس ایمونوگلوبولین g واگرا از طریق اتصال انتخابی گیرنده Fc. Science 310, 1510-1512, doi:10.1126/science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460]37. درمان آنتی بادی نوترکیب جفریس R: تأثیر گلیکوزیلاسیون بر مکانیسم های اثر. Trends Pharmacol Sci 30, 356-362, doi:10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968] 38. Tanji H، Ohio U، Shibata T، Miyake K و Shimizu T سازماندهی مجدد ساختاری گیرنده 8 دایمرهای شبه Toll ناشی از لیگاندهای آگونیست. Science 339, 1426-1429, doi:10.1126/ science.1229159 (2013). [PubMed: 23520111] 39. Shultz LD و همکاران. توسعه سلول‌های لنفوئیدی و میلوئیدی انسانی در موش‌های گاما تهی NOD/LtSz-گفت IL2R که با سلول‌های بنیادی خون‌ساز انسانی بسیج شده پیوند شده‌اند. J Immunol 174، 6477-6489، doi:10.4049/J Immunol.174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151] 40. Xia Z و همکاران پاسخ ایمنی ذاتی به کاشت سلول های فیبروبلاست مغز استخوان انسان در موش های CB17 SCID/بژ. J Cell Biochem 98، 966-980، doi:10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. تانر ام و همکاران خصوصیات یک رده سلولی جدید ایجاد شده از یک بیمار مبتلا به سرطان پستان مقاوم به هرسپتین. Mol Cancer Ther 3، 1585-1592 (2004). [PubMed: 15634652]42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L & Palacio-Vazquez I Mechanisms Behind the Resistance to Trastuzumab in HER{140}}به تقویت بیش از حد سرطان آی تی. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi:10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. لی جی و همکاران یک ترکیب دوپاراتوپیک HER{150}}هدف‌گیری آنتی‌بادی-دارو، رگرسیون تومور را در مدل‌های اولیه مقاوم به درمان هدفمند HER یا واجد شرایط آنها نیست{152}}. Cancer Cell 29, 117– 129, doi:10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S، Pagano JS & Barber GN IRF7: فعال‌سازی، تنظیم، اصلاح و عملکرد. Genes Immun 12، 399-414، doi:10.1038/gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. کائو کیو و همکاران F4/80 کلیه به همراه CD11c به علاوه فاگوسیت های تک هسته ای ویژگی های فنوتیپی و عملکردی ماکروفاژها را در سلامت و نفروپاتی آدریامایسین نشان می دهند. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi:10.1681/ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165]46. شنگ جی و همکاران یک زیرمجموعه مجزا از سلول‌های مشتق از مونوسیت در میان سلول‌های دندریتیک معمولی نوع 2 می‌توانند به‌طور مؤثری ارائه شوند. Cell Rep 21, 1203–1214, doi:10.1016/ j.celrep.2017.10.024 (2017). [PubMed: 29091760]

47. Knutson KL، Almand B، Dang Y & Disis ML Neu گونه های منفی آنتی ژن می توانند پس از درمان آنتی بادی اختصاصی neu در موش های تراریخته neu تولید شوند. Cancer Res 64, 1146-1151 (2004). [PubMed: 14871850]48. Moynihan KD و همکاران. ریشه کنی تومورهای بزرگ ایجاد شده در موش با ایمونوتراپی ترکیبی که پاسخ های ایمنی ذاتی و سازگار را درگیر می کند. Nat Med 22، 1402-1410، doi:10.1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706] 49. Siebenlist U, Franzoso G & Brown K ساختار، تنظیم و عملکرد NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 10, 405-455, doi:10.1146/annurev.cb.10.109.104.109) . [PubMed: 7888182]

شکل 6: CL{1} حاوی ISAC باعث پاکسازی تومور در محیط HER2 بیان کننده زنوگرافت و پاکسازی تومور با واسطه سلول T، حافظه ایمونولوژیک و گسترش اپی توپ در یک مدل تومور سیژنیک می شود. (الف) ساختارهای شیمیایی ادجوانت های T785 و CL264 که برای تولید ISAC استفاده می شوند. (ب) موش های NSG کاشته شده با رده سلولی تومور HCC1954 زمانی که حجم تومور به 50 تا 75 میلی متر مکعب رسید تصادفی شدند. موش‌ها یک بار از طریق تزریق داخل صفاقی 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم تراستوزوماب، تراستوزوماب T{11}}ISAC یا تراستوزوماب CL{12}}ISAC تحت درمان قرار گرفتند. تومورها 20 ساعت پس از تجویز برداشت شدند، به یک سوسپانسیون تک سلولی پردازش شدند و با فلوسیتومتری برای ارزیابی فعال شدن APCهای میلوئیدی نفوذگر تومور تجزیه و تحلیل شدند. (cd) موش‌های حذفی دوگانه NSG یا Rag2/IL2rg با رده سلولی تومور انسانی نشان‌داده‌شده کاشته شدند و زمانی که حجم تومور به 50-75mm3 (HCC1954) یا 75-150mm3 (JIMT{26}} رسید) تصادفی شدند. موش‌ها از طریق تزریق داخل صفاقی با 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم ریتوکسیماب، تراستوزوماب، تراستوزوماب T{28}}ISAC، تراستوزوماب CL{29}}ISAC یا ایزوتیپ مربوطه تحت درمان قرار گرفتند.ISACs، هر 5 روز برای مجموع 6 درمان. (ه) بیان rHER2 روی سلول‌های تومور CT{3}rHER2 در کشت قبل از کاشت (نقشه جریان چپ) و در تومورها نه روز پس از کاشت (نمودار جریان سمت راست) با فلوسیتومتری با آنتی‌بادی ضد rHER2 کونژوگه فلورسنت اندازه‌گیری شد. (قرمز) یا کنترل ایزوتیپ (آبی). (f) موش های Balb/c با رده سلولی تومور CT26-rHER2 کاشته شدند و زمانی که حجم تومور به 50 رسید تصادفی شدند.mm3. سپس موش ها از طریق تزریق داخل صفاقی با 10 میلی گرم بر کیلوگرم موش ضد موش تحت درمان قرار گرفتند.HER2 یا ضد موش HER2 CL{3}}ISAC هر 5 روز یکبار برای مجموع 6 درمان. داده های نشان داده شده از 1 آزمایش با 8 موش در هر بازو و نماینده 3 آزمایش است.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 روز پس از آخرین درمان آنها با رده های سلولی CT26 والدین (سمت چپ) و 4T1 (سمت راست)، با یا بدون تخلیه سلول های T CD4 و CD8 (n =3 هر کدام) به چالش کشیده شدند. موش‌های بدون تومور (n=6) که با رده‌های سلولی والدین CT26 و 4T1 به چالش کشیده شده بودند، به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. (ai) داده‌ها از آزمایش‌های فردی با 3-6 موش در هر بازو نشان داده می‌شوند و نماینده 1-4 آزمایش با حداقل 3 موش در هر بازو در هر آزمایش هستند. داده ها به صورت میانگین با SEM و آمار با *P نشان داده می شوند<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT و همکاران. گفتگوی متقابل FcgammaRIIa با TLRs، IL-1R، و IFNgammaR به طور انتخابی تولید سیتوکین را در سلول‌های میلوئید انسانی تعدیل می‌کند. Immunobiology 220, 193-199, doi:10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM، Thomas AA، Connolly MD، Reichner JS & Albina JE استفاده از آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی Ly6G برای تخلیه نوتروفیل ها در موش. J Leukoc Biol 83, 64-70, doi:10.1189/ jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993] 52. Broz ML و همکاران. تشریح محفظه میلوئید تومور سلول های نادر فعال کننده آنتی ژن را نشان می دهد که برای ایمنی سلول T حیاتی هستند. Cancer Cell 26, 938, doi:10.1016/ j.ccell.2014.11.010 (2014).53. سلول‌های دندریتیک Batf3 با تومور Spranger S، Dai D، Horton B و Gajewski TF برای قاچاق سلول‌های T Effector و درمان با سلول T مورد نیاز هستند. Cancer Cell 31, 711-723 e714, doi:10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER و همکاران بارکدینگ سلول برچسب جرمی مبتنی بر پالادیوم با طرح فیلتر دوتایی و الگوریتم دکانولوشن تک سلولی. Nat Protoc 10, 316–333, doi:10.1038/nprot.2015.020 (2015). [PubMed: 25612231]