تاثیر دریافت پروتئین کم بارداری بر بیان میکروRNA کلیه جنینی و در سلول های پیش ساز نفرون جنین پسر

edmund.chen@wecistanche.com

مقدمه

کمبود مواد مغذی ممکن است منجر به تغییرات سیگنالی در مسیرهای محوری در طول مراحل مختلف رشد جنین شود که ممکن است باعث اختلالات غیرقابل برگشت اندام و سیستم در بزرگسالی شود [1]. برنامه‌ریزی جنین به هرگونه توهین در طول رشد اشاره دارد که اثرات طولانی‌مدتی بر ساختار یا عملکرد ارگانیسم ایجاد می‌کند [2]. اختلال در برنامه ریزی جنین منجر به وزن کم هنگام تولد، نفرون های کمتر و افزایش خطر ابتلا به بیماری های قلبی و عروقی می شود.کلیهاختلالات در بزرگسالی [3-6]. مطالعات سایر نویسندگان و ما نشان داده است که وزن کمتر هنگام تولد، 28 درصد نفرون کمتر، کاهش یافته استکلیهدفع نمک مزمننارسایی کلیهو فشار خون شریانی در مصرف پروتئین کم بارداری (LP) در مقایسه با فرزندان دریافت پروتئین استاندارد (NP) در بزرگسالی [3-7]. نفروژنز شامل کنترل دقیق بیان ژن، سنتز پروتئین و بازسازی بافت است. مطالعات نشان داده اند که تعداد نفرون ها توسط فعل و انفعالات بین جوانه حالب (UB) و سلول های پیش ساز متانفروس مزانشیم (MM) تعیین می شود [8-10]. سیگنال های MM باعث رشد تحریک شده توسط UB و انشعاب سیستم لوله می شود. به نوبه خود، تکثیر و تمایز MM، که یک کلاهک مزانشیمی (CM) را تشکیل می دهد، توسط انتهای UB واسطه می شود [11].

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

علاقه جدی به نقش تغییرات اپی ژنتیک، در مورد اثرات طولانی مدت استرس دوران بارداری، بر رشد جنین وجود دارد [12]. MicroRNA ها (miRNAs) RNA های کوچک غیر کدکننده ای با طول تقریبی 22 نوکلئوتید کدگذاری شده توسط ژنوم هستند و نقش اساسی در تنظیم پس از رونویسی بیان ژن هدف دارند [13-16]. miRNA ها بیان ژن را پس از رونویسی با تنظیم ترجمه mRNA یا ثبات در سیتوپلاسم کنترل می کنند [17، 18]. مطالعات عملکردی نشان می دهد که miRNA ها در فرآیندهای بیولوژیکی حیاتی در طول توسعه و در فیزیولوژی سلولی نقش دارند [13، 16]. تغییرات در بیان آنها در چندین آسیب شناسی مشاهده شده است [16، 19]. بنابراین، خصوصیات miRNA ها به درک تنظیم ژن و تکثیر سلولی، تمایز و آپوپتوز کمک کرده و اختلالات پاتوفیزیولوژیکی را توضیح می دهد.کلیهاختلالات [20-22]. مطالعات گزارش کرده اند که در طولکلیهmiRNA های انتوژنی برای توسعه نفرون ضروری هستند [23-26]. علاوه بر این، بیان ناکافی برخی از miR NAs در سلول‌های پیش‌ساز MM، تکثیر سلولی را کاهش می‌دهد و در نتیجه تمایز اولیه و در نتیجه، تعداد نفرون‌ها را کاهش می‌دهد [27، 28]. این پدیده با افزایش آپوپتوز و بیان بالای Bim در سلول های پیش ساز مشخص می شود [27]. بنابراین، miRNA ها تعادل بین آپوپتوز و تکثیر این سلول های اولیه متانفریک را تعدیل می کنند [29].

ما فرض کردیم که تغییرات اپی ژنتیکی ناشناخته و پروفایل بیان miRNA مرتبط هستندکلیهاختلالات رشدی در فرزندان محدود به پروتئین مادر بنابراین، هدف ما ارزیابی الگوهای miRNA و پیش‌بینی بیان ژن در جنین بودکلیهدر 17 روز بارداری (17-DG) فرزندان نر با پروتئین محدود شده برای شناسایی مسیرهای مولکولی و اختلالات دخیل درکلیهتکثیر و تمایز سلولی در طولکلیهتوسعه.

کلید واژه ها:نارسایی کلیه؛ لوله های کلیوی؛ اختلالات کلیوی؛ رشد کلیه؛ کلیه

مواد و روش

حیوانات و رژیم های غذاییآزمایش‌ها همانطور که قبلاً به تفصیل توضیح داده شد [5، 6] روی موش‌های صحرایی ماده و نر همسان با سن و برادر و خواهر و برادر موش‌های صحرایی Wistar HanUnib (250-3{9}} گرم) انجام شد که از یک انبار پرورشی عرضه‌شده توسط CEMIB/UNICAMP نشأت می‌گرفت. , Campinas, SP, برزیل. محیط و مسکن شرایط مناسبی را برای مدیریت سلامت و رفاه آنها در طی مراحل آزمایشی ارائه کرد. بلافاصله پس از از شیر گرفتن در سن سه هفتگی، حیوانات تحت دمای کنترل شده (25 درجه سانتیگراد) و شرایط نوری (07:00:00:00) با دسترسی آزاد به آب لوله کشی و غذای استاندارد جوندگان آزمایشگاهی (Purina Nuvital) نگهداری شدند. , Curitiba, PR, برزیل: محتوای Na plus: 135 ± 3μEq/g؛ محتوای K plus: 293±5μEq/g)، به مدت 12 هفته قبل از پرورش. کمیته اخلاق سازمانی در مورد استفاده از حیوانات در دانشگاه ایالتی سائوپائولو (#446-CEUA/UNESP) پروتکل آزمایشی را تأیید کرد، و دستورالعمل‌های کلی ایجاد شده توسط کالج برزیلی آزمایش‌های حیوانات در طول تحقیق دنبال شد. روز اول بارداری به عنوان روزی تعیین شد که در آن اسمیر واژینال اسپرم را نشان داد. سپس، سدها به طور آزاد در تمام طول بارداری روی یک غذای آزمایشگاهی جوندگان با محتوای پروتئین استاندارد [NP, n=36] (17 درصد پروتئین) یا محتوای پروتئین کم [LP, n=51 نگهداری شدند. ] (6 درصد پروتئین). NP و LP مصرف غذای مادر روزانه تعیین شد (متعاقباً برای وزن بدن نرمال شد)، و وزن بدن سدها به صورت هفتگی در هر دو گروه ثبت شد. در روز 17 بارداری ({24}}DG)، سدها با کتامین (75 میلی گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی گرم بر کیلوگرم) بیهوش شدند و رحم در معرض دید قرار گرفت. جنین ها خارج شدند و بلافاصله با سر بریدن کشته شدند. جنین ها وزن شده و دم و اندام ها برای تعیین جنسیت جمع آوری شد. متانفروس برای توالی یابی نسل بعدی (NGS)، RT-qPCR، و آنالیزهای ایمونوهیستوشیمی جمع آوری شد.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

تعیین جنسیتمطالعه حاضر فقط در فرزندان نر 17-DG انجام شد و تعیین جنسیت توسط آنالیز توالی Sry PCR معمولی (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) انجام شد. DNA به روش لیز آنزیمی با پروتئیناز K و فنل کلروفرم استخراج شد. برای واکنش، Master Mix Colorless—Promega با شرایط دوچرخه‌سواری سازنده استفاده شد. فناوری‌های DNA یکپارچه (IDT) توالی‌های زیر آغازگر را سنتز کرد: جلو: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA{4}}'معکوس: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.

استخراج RNA کلRNA از NP (n=4) و LP (n=4) کل استخراج شد.کلیه هابا استفاده از معرف تریزول (Invitrogen)، طبق دستورالعمل های مشخص شده توسط سازنده. مقدار کل RNA با جذب در 260 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر nanoVue (GE Healthcare، USA) تعیین شد. یکپارچگی RNA با به دست آوردن یک عدد یکپارچگی RNA - RIN > 8 با Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies، آلمان) تضمین شد [30].

miRNA-Seq و تجزیه و تحلیل داده هاتوالی یابی بر روی پلت فرم MiSeq (Illumina) انجام شد. این پروتکل از دستورالعمل های سازنده موجود در آن پیروی می کردبه طور خلاصه، توالی یابی شامل ساخت کتابخانه است و از RNA کل 1ug استفاده شد. در این مرحله، آداپتورهای 3 و 5 به هم متصل می شوند. پس از بستن آداپتورها، یک واکنش رونویسی معکوس برای ایجاد cDNA انجام شد. سپس با یک واکنش استاندارد PCR، که از پرایمرهای حاوی یک شاخص توالی برای شناسایی نمونه استفاده می‌کند، تقویت شد - این کتابخانه cDNA که برای جداسازی miRNA در معرض الکتروفورز ژل آگارز قرار می‌گیرد. پس از کمی سازی، غلظت کتابخانه با استفاده از 10 نانومولار Tris-HCl، pH 8.5 به 2 نانومولار نرمال شد و توالی یابی رونوشت توسط MiSeq Reagent Kit v2 (50 چرخه) انجام شد.

تجزیه و تحلیل داده ها با همکاری تائو چن، Ph.D. از بخش سم شناسی ژنتیک و مولکولی، مرکز ملی تحقیقات سم شناسی، جفرسون، AR، ایالات متحده آمریکا. داده های توالی نسل بعدی (NGS) miRNA ها در قالب FASTA تولید و به BaseSpace.com (Illumina، ایالات متحده آمریکا) وارد شدند. کیفیت داده ها با استفاده از نرم افزار فراخوانی پایه CASAVA که توسط سازنده (Illumina) توسعه یافته است، ارزیابی شد. تجزیه و تحلیل ها توسط BaseSpace miRNA Analysis (از دانشگاه تورینو، کانادا) و نقشه برداری توالی miRNA های مختلف توسط Small RNA (Illumina، ایالات متحده آمریکا) برای ژنوم موش انجام شد. مطالعه miRNA با بیان متفاوت با استفاده از نرم افزار Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity، ایالات متحده آمریکا) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

اعتبار سنجی بیان miRNAچهار فرزند نر از نوزادان مختلف در هر گروه برای miRNA مورد استفاده قرار گرفتند (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ تجزیه و تحلیل عبارت 4}}p، -181a-5p، -181c-3p، و -199a-5p). به طور خلاصه، با استفاده از کیت رونویسی معکوس TaqMan1 Micro RNA، طبق دستورالعمل سازنده، 450 نانوگرم RNA معکوس، بدون پیش تقویت، رونویسی معکوس شد. DNA مکمل (cDNA) با استفاده از TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies، USA) با TaqMan1 Universal PCR Master Mix، No AmpErase1 UNG (2x) بر روی StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) طبق دستورالعمل سازنده تکثیر شد. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از بیان ژن نسبی ارزیابی شده با استفاده از روش کمی سازی مقایسه ای انجام شد (Pfaffl، 2001). بر اساس تجزیه و تحلیل پایداری، از snRNA U6 و scaRNA U87 به عنوان ژن مرجع استفاده شد. تمام کمی سازی های نسبی با استفاده از نرم افزار DataAssist نسخه 3.0 با استفاده از روش ΔΔCT مورد ارزیابی قرار گرفت. داده‌های miRNA بر اساس دستورالعمل‌های MIQE [31] تولید شده‌اند.

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

RT-qPCR ژن‌های هدف پیش‌بینی‌شدهبرای سنتز cDNA، کیت رونویسی معکوس cDNA با ظرفیت بالا (Life Technologies، ایالات متحده آمریکا) استفاده شد. واکنش‌های RT-qPCR برای Bax، Bim، کاسپاز-3، کلاژن 1، GDNF، PCNA، TGF -1، Bcl-2، Bcl-6، c-Myc، c ژن -ret، cyclin A، Map2k2، PRDM1، Six{11}}، Ki{12}}، MTOR، -catenin، ZEB1، ZEB2، NOTCH1 و IGF1 توسط SYBR Green Master Mix (Life Technologies، USA) انجام شد. ) ارائه شده توسط IDT1 Integrated DNA Technologies (جدول 1). واکنش ها در حجم کلی 20 میکرولیتر با استفاده از 2 میکرولیتر cDNA (رقیق شده 1:30)، 10 میکرولیتر SYBER Green Master Mix (Life Technologies، ایالات متحده آمریکا) و 4 میکرولیتر از هر پرایمر خاص (5 نانومولار) انجام شد. تقویت و تشخیص با استفاده از سیستم PCR Real-Time StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM) انجام شد. مقادیر Ct با استفاده از روش ΔΔCt با داده های متانفروس فرزندان نرمال شده با GAPDH به عنوان یک ژن مرجع به مقادیر بیان نسبی تبدیل شد [32].

ایمونوهیستوشیمی،جنین (n {0}} در هر گروه) خارج شد و بلافاصله در 4 درصد پارافورمالدئید (0.1M فسفات، pH 7.4) ثابت شد. مواد خشک شده، دیافانیز شده و در پاراپلاس گنجانده شدند و بلوک ها به بخش هایی با ضخامت 5- میکرومتر بریده شدند. بخش های بافت شناسی پارافین زدایی شدند و برای ایمونوفلورسانس و ایمونوپروکسیداز پردازش شدند. بخش ها بودند

با محلول مسدود کننده (8 درصد سرم جنین گاوی، 2.5 درصد آلبومین گاوی و 2 درصد پودر شیر بدون چربی در PBS) انکوبه شد. سپس با آنتی بادی اولیه (آنتی شش-2) رقیق شده در PBS حاوی 1 درصد شیر بدون چربی یک شب در یخچال قرار دهید. پس از شستشو با PBS، بخش ها با یک آنتی بادی ثانویه خاص، کونژوگه به ​​فلوروفور Alexa 488، رقیق شده در همان بافر، حاوی 1 درصد شیر به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. پس از شستشوهای متوالی با PBS، اسلایدها با ورقه های پوششی با استفاده از محیط مونتاژ فلورسنت Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) سوار شدند. فلورسانس در نمونه با میکروسکوپ کانفوکال لیزری تشخیص داده شد. تصاویر با استفاده از سیستم Focus Imagecorder Plus به دست آمده است. برای پروتئین‌های c-Myc، Ki{11}}، Bcl-2، TGF -1، - catenin، ZEB1، ZEB2، Caspase 3 شکافته شده، سیکلین A و WT1، ایمونوهیستوشیمی انجام شد. اسلایدها هیدراته شدند و پس از شستشو در PBS pH 7.2 به مدت 5 دقیقه، بازیابی آنتی ژن با بافر سیترات pH 6 انجام شد.{23}} به مدت 25 دقیقه در زودپز. لام ها در PBS شسته شدند. سپس بلوک پراکسیداز درون زا با پراکسید هیدروژن و متانول به مدت 10 دقیقه در تاریکی انجام شد. مقاطع در PBS شسته شدند. سپس مسدود کردن اتصال غیر اختصاصی دنبال شد و لام ها با محلول مسدود کننده (5 درصد شیر خشک بدون چربی، در PBS) به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. بخش ها با آنتی بادی اولیه (جدول 2)، رقیق شده در 1 درصد BSA یک شبه در یخچال انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، مقاطع به مدت 2 ساعت در دمای اتاق در معرض آنتی بادی ثانویه اختصاصی قرار گرفتند. لام ها با PBS شسته شدند. برش ها با DAB (3،3'- دی آمینوبنزیدین تترا هیدروکلراید، سیگما - آلدریچ CO1، ایالات متحده آمریکا) آشکار شدند. پس از شستشوی پی در پی در آب جاری، اسلایدها با هماتوکسیلین ضد رنگ آمیزی شدند، آبگیری شدند و با استفاده از Entellan1 با پوششی نصب شدند. تصاویر با استفاده از فتومیکروسکوپ (Olympus BX51) یا زایس LSM 780-NLO confocal روی میکروسکوپ Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG، آلمان) از مؤسسه ملی علم و فناوری در فوتونیک کاربردی در سلول به دست آمدند. زیست شناسی (INFABIC) در دانشگاه دولتی کامپیناس.

کمی سازی مورفولوژیپارافین 5 میکرومترکلیهمقاطع با استفاده از نرم افزار CellSens Dimension از یک فوتومیکروسکوپ (Olympus BX51) آنالیز شدند. اینکلیهبرش‌ها برای تعیین ناحیه نفروژنیک، پروتئین CM و UB و تعداد سلول، هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شده در 17- جنین DG LP (n=5) در مقایسه با فرزندان NP همسان با سن (n {{4}) مشاهده شد. }}) از مادران مختلف. ما تمام CM و UB از هر متانفروس تجزیه و تحلیل شده (4NP و 4LP از مادران مختلف) را اندازه‌گیری کردیم و تجزیه و تحلیل آماری با آزمون t انجام شد و مقادیر به صورت میانگین ± SD بیان شد. p�0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA، برای تجزیه و تحلیل آماری و ساخت شکل استفاده شد.

تحلیل آماریاز آزمون t استفاده شد و مقادیر به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) بیان شد. P�0.05 معنی دار در نظر گرفته شد. برای تجزیه و تحلیل آماری و ساخت شکل از نرم افزار GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA) استفاده شد.

نتایج

بیان miRNA ها توسط miRNA-Seqبرای درک تغییرات microRNA مرتبط با پروتئین کم مادرکلیهدر برنامه نویسی، بیان یک تحلیل پروفایل miRNA جهانی را انجام دادیم. 44 miRNA های تنظیم نشده شناسایی شد (05/0p< {{1})="" که="" از="" این="" تعداد="" 19="" و="" 25="" mirna="" به="" ترتیب="" بالا="" یا="" پایین="" تنظیم="" شده="" بودند="" (جدول="" 3).="" mirna="" های="" بیان="" شده="" برتر="" و="" عملکردها،="" مسیرها="" و="" شبکه="" های="" آنها="" با="" استفاده="" از="" نرم="" افزار="" ingenuity="" شناسایی="" شدند="" (جدول="">

اعتبار سنجی بیان miRNAدر حیوانات گروه LP، اجازه دهید-7a-5p، miR-181a-5p، miR-181c-3p تنظیم شوند، در حالی که miR-127-3p، miR-144-3p، و miR-199a-5p نسبت به حیوانات NP تنزل یافته بودند. نتایج با مقایسه هر دو گروه تفاوتی در بیان miR نشان نمی‌دهند (شکل 1). جدول 5 مقادیر به دست آمده توسط توالی یابی miRNA ها با داده های اعتبارسنجی RT-qPCR را نشان می دهد. اگرچه تفاوت بیان miRNA قابل توجهی در LP نسبت به فرزندان NP مشاهده شد، تغییر برابری (FC) miRNA های تایید شده مشابه هر دو تکنیک بود.

اهداف ژن miRNA

ژن های بیان اهداف پیش بینی شده از miRNA های مختلف مانند Six{0}}، Bcl-2، PRDM1، cyclin A، PCNA، GDNF، کلاژن 1، کاسپاز 3 و Bim در LP تفاوت معنی داری با NP نداشت. جنین با این حال، بیان ژن Bax، TGF -1 Bcl-6، c-ret، Map2k2، Ki{10}}، mTOR، -catenin، ZEB1، ZEB2 و IGF1 در {{15} تنظیم مثبت شد. }}گروه DG LP در مقایسه با گروه کنترل همسان سنی. برعکس، c-Myc و NOTHC1 در فرزندان محدود شده با پروتئین مادری کاهش یافتند (شکل 2).

توده بدن جنین و مورفومتری متانفروس17-توده بدن DG LP با فرزندان NP همسان با سن تفاوتی نداشت. با این حال، مزانشیم متانفروس LP نسبت به گروه NP 7.6 درصد کاهش سطح و 29 درصد کاهش در ضخامت قشر را نشان داد (شکل 3).ایمونوهیستوشیمیدر مطالعه حاضر، جنین LP کاهش قابل توجهی (حدود 69 درصد) از فلورسانس شش{1} کلاهک نسبت به فرزندان NP نشان داد (شکل 4).

تجزیه و تحلیل شش{0}} ایمونوپروکسیداز کاهش تعداد سلول (14 درصد) را در LP CM از همراه با 28 درصد کاهش Six{3}} پلاس نسبت به ناحیه کلاهک در مقایسه با فرزندان NP نشان داد (شکل 4). مطالعه حاضر همچنین درصد کاهش قابل توجهی از سلول‌های رنگ‌آمیزی شده C-Myc و UB (کمتر 14 درصد) در LP نسبت به فرزندان NP را نشان داد (شکل 4). علاوه بر این، درصد ناحیه نشان‌دار Ki{8}} در CM در LP در مقایسه با جنین NP 48 درصد کمتر بود، در حالی که واکنش‌پذیری Bcl{10}} و کاسپاز شکافته{11}} تفاوتی با هر دو گروه نداشت (شکل‌ها). 5 و 6). مطالعه حاضر همچنین درصد کاهش قابل توجهی از سلول‌های رنگ‌آمیزی شده C-Myc و UB (کمتر 14 درصد) در LP نسبت به فرزندان NP را نشان داد (شکل 4). علاوه بر این، درصد ناحیه نشان‌دار Ki{17}} در CM در LP در مقایسه با جنین NP 48 درصد کمتر بود، در حالی که واکنش‌پذیری Bcl{19}} و کاسپاز شکافته-3 با هر دو گروه تفاوتی نداشت (شکل‌ها). 5 و 6). از سوی دیگر، در LP، مناطق نشاندار شده با CM و UB-catenin به ترتیب 154 و 85 درصد در مقایسه با موجود در فرزندان NP افزایش یافته است (شکل 7). در همان زمان، توزیع رنگپذیری mTOR نیز در LP CM (139 درصد) و UB (104 درصد) نسبت به جنین NP، به طور قابل توجهی منطقه وسیع تری را اشغال کرد (شکل 7). در فرزندان LP، TGF -1 در رنگ‌آمیزی سلول‌های UBS افزایش یافت (حدود 30 درصد)، در حالی که در CM، سلول‌های رنگ‌آمیزی شده مربوط به گروه NP تفاوتی نداشتند (شکل 8). رنگ آمیزی متانفروس ZEB1، واقع در سلول های هسته CM، 30 درصد LP را در مقایسه با جنین NP افزایش داد (شکل 8). به طور همزمان، ایمونوفلورسانس ZEB2، اگرچه در ساختارهای متانفروس کامل وجود دارد، در هر دو گروه آزمایشی مشابه بود (شکل 8). مطالعه حاضر، با در نظر گرفتن بیان و پروتئین‌های miRNA و mRNA

بحث

دانش در مورد مکانیسم های سلولی و مولکولی نفروژنز افزایش یافته است [33-37]. با این حال، بسیاری از عوامل نظارتی و مسیرهای سیگنال دهی درگیر هستندکلیهآنتوژنز نامشخص است [38]. miRNA ها نقش مهمی در تنظیم بیان ژن ایفا می کنندکلیهتوسعه [25، 39-41]. با توجه به دانش ما، تجزیه و تحلیل بیان miRNA و mRNA در دریافت LP مادر 17-سلول‌های مزانشیم مردانه DG انجام نشده است. ما یک مکانیسم مولکولی جدید را پیشنهاد می‌کنیم که در مهار نفروژنز اولیه نقش دارد و منجر به کاهش تعداد نفرون‌ها می‌شود. ما از NGS برای ارزیابی بیان miRNA استفاده کردیم و متوجه شدیم که 19 miRNA در 17-DG LP در مقایسه با NP metanephros به بالا-و ۲۵ مورد کاهش یافته است. در میان 10 miRNA های تنظیم نشده، ما 7 miRNA را با اهداف بیولوژیکی درگیر در تکثیر، تمایز و آپوپتوز سلولی انتخاب کردیم. هر دو تجزیه و تحلیل داده‌های miRNA-Seq و TaqMan تغییرات ثابت و خاصی را در بیان miRNA در حیوانات LP نسبت به حیوانات همسان NP کنترل نشان دادند.

خانواده miR-181 از چهار عضو بسیار حفاظت شده تشکیل شده است، یعنی miR-181a، miR-181b، miR-181c، و miR-181d [ 42]. در سلول‌های نئوپلاستیک، miR{6}a به‌عنوان سرکوب‌کننده تومور عمل می‌کند، تکثیر سلولی و مهاجرت را مهار می‌کند و آپوپتوز سلولی را القا می‌کند [43]. این مطالعه افزایش بیان miR-181a-5p را در 17-DG LP نسبت به فرزندان NP همسان با سن نشان داد. اگرچه بیان mRNA کاسپاز بدون تغییر بود، افزایش دو برابری نسبت mRNA Bax/Bcl{13}} در LP در مقایسه با فرزندان NP، افزایش آپوپتوز در CM را نشان می‌دهد، که نشان می‌دهد آپوپتوز پس از رونویسی تنظیم می‌شود. مطالعات نشان داده اند که خانواده BCL باعث آزادسازی سیتوکروم از میتوکندری می شود و سپس از فعال شدن Casp3 جلوگیری می کند و در نتیجه آپوپتوز سلولی را مهار می کند [44]. لی و همکاران از یک مدل آسیب حاد ریه استفاده کرد تا نشان دهد که بیان بیش از حد miR{17}}a با کاهش سطح پروتئین Bcl{18}} مرتبط است. برعکس، یک مهار{19}}می‌آر، سطوح Bcl{20}} را افزایش داد [45]. این مطالعه نتایج Lv و همکارانش را تایید کرد که نشان دادند miR{22}}c بیان شش-2 و تکثیر سلولی را بطور منفی تنظیم می‌کند، موازی با از دست دادن فنوتیپ سلول‌های مزانشیمی در طولکلیهتوسعه در LP 17-فرزندان DG [25].

شیانگ و همکاران نشان داد که افزایش بیان miR{0}} را سرکوب می کندکلیهتکثیر کارسینوم، که منجر به یک فاز G2/M کوتاهتر می شود. علاوه بر این، شیانگ و همکاران. نشان داد که بیان بیش از حد miR{1}} بیان ژن mTOR و پروتئین را مهار می کند [46]. نایلند و همکاران نشان داد که افزایش سیگنال‌دهی mTOR برای تعیین تعداد نفرون‌ها در جنین‌هایی که مادرانشان در معرض محدودیت مواد مغذی قرار داشتند، حیاتی است [47]. هدف پستانداران مجتمع راپامایسین 1 (mTORC1) برای رشد جنین ضروری است. با این حال، چگونگی تنظیم تعادل بین رشد و اتوفاژی در شرایط فیزیولوژیکی و استرس محیطی این مجموعه ناشناخته باقی مانده است [48]. بنابراین، سیگنال‌دهی mTOR ممکن است در پاسخ‌های سلولی در حیواناتی که در طول بارداری در معرض مصرف LP هستند، دخیل باشد. در ادراک، القاء و خاتمه اتوفاژی؛ و در پاسخ به در دسترس بودن مواد مغذی درون سلولی [46]. به طور فرضی، در طول محدودیت شدید پروتئین، کاهش بیان miR{8}}p ممکن است با افزایش بیان mTOR، تقریباً 139 درصد و 104 درصد در سلول‌های CM و UB، برای جبران از دست دادن نفرون‌ها در { 11}} فرزندان DG LP Chen et al. miR{12}} را به عنوان یک تنظیم کننده جدید پیری سلول از طریق Bcl{13}} [49] تعریف کرد. پان و همکاران گزارش داد که بیان کمتر miR{15}} با افزایش تکثیر سلولی در سلول های کبد ارتباط دارد [50]. این مطالعه کاهش تکثیر سلولی و کاهش قابل توجه سلول‌های دارای برچسب مثبت Ki{17}} را در CM حیوانات محدود شده با پروتئین نشان داد. علاوه بر این، کاهش ناحیه نفروژنیک و تکثیر در نتاج LP مشاهده شد که با نتایج Menendez-Castro و همکاران مطابقت داشت. در 8.4 درصد نتاج محدود پروتئین [51، 52]. بنابراین، افزایش بیان mRNA Ki{25}} و Bcl{26}، همراه با کاهش بیان miR{27}}p در 17-کلاهک DG LP می‌تواند با مکانیسم‌های ضد تنظیمی برای حفظ مرتبط باشد. افزایش.

سان و همکاران نشان داد که بیان بیش از حد miR-199a-5p تکثیر سلول‌های کیستیک را کاهش می‌دهد و علاوه بر کنترل چرخه سلولی، آپوپتوز را القا می‌کند [53]. در این مطالعه، بیان miR-199a{4}}p در 17-DG LP با افزایش رونویسی Ki-67، یک نشانگر تکثیر سلولی، و Map2k2 کاهش می‌یابد. با کاهش واکنش Ki-67 در LP 17-DG metanephros مرتبط است. بنابراین، سوء تغذیه حاملگی تمایز را از طریق مکانیسم پس از رونویسی ترویج می کند. قابل‌توجه، نتایج ما نقش سرکوب‌کننده هوموباکس 1 (ZEB1) را نشان می‌دهد که یک محرک EMT است که پرتوانی سلول‌های بنیادی را در طول تمایز سلول‌های بنیادی جنینی حفظ می‌کند. کاتنین به عنوان فعال کننده رونویسی هسته ای ZEB1 و در نتیجه بیان ZEB1 شناخته شده است [34]. مسیر سیگنالینگ TGF، یکی از بهترین مسیرهای مطالعه شده، می تواند EMT را در طول رشد جنینی القا کند. چندین لیگاند مانند TGF برای رشد جنینی مورد نیاز است. با این حال، تمام اثرات با واسطه TGF بر EMT به ZEB1/2 بستگی ندارد، سلول های حذفی می توانند بیان ژن های مزانشیمی فیبرونکتین و N-cadherin را القا کنند. با این حال، E-cadherin دیگر تنظیم نمی شود و فیبرهای اکتین نیز تشکیل می شوند [54]. کارنر و همکاران گزارش داد که در طولکلیهتوسعه، Wnt9b/ -catenin

مسیر سیگنالینگ، که در UB و CM بیان می شود، هم برای تجدید و هم تمایز سلول های پیش ساز نفرون مورد نیاز است، که برای تشکیل نفرون ها در طول جنین زایی ضروری است [55]. مسیر Wnt9b/-catenin حفظ شده به صورت تکاملی نقش مهمی در رشد اندام‌ها، بافت‌ها و ترمیم آسیب در موجودات چند سلولی دارد. یک مطالعه نشان داد که c-Myc یک هدف رونویسی از -catenin است که تکثیر و تمایز را تنظیم می کند.کلیهاپیتلیوم لوله ای [56]. بیان کاتنین در سطح ژن و پروتئین طی دوره های مورد مطالعه افزایش یافتکلیهرشد در جنین 17-DG LP. پان و همکاران گزارش داد که Myc با -catenin برای ترویج تجدید سلول های پیش ساز نفرون همکاری می کند [10]. در اینجا در مقایسه با فرزندان NP همسان با سن، LP بیان c-Myc کمتری را نشان داد. بنابراین، این حیوانات ممکن است ذخیره کمتری از سلول‌های تجدیدپذیر لازم برای تکثیر و بقا داشته باشند و ممکن است تعداد کمتر نفرون‌ها را در مدل LP منعکس کنند. علاوه بر این،

مسیرهای سیگنال Wnt/ -catenin و Notch ممکن است تنظیم بیان Six-2 را هماهنگ کرده و در کاهش بیان Six-2 در سلول های پیش ساز نفرون نقش دارند. مطالعات نشان داده‌اند که سطوح پایین -catenin ممکن است برای حفظ بیان شش{4}} و سلول‌های پیش‌ساز CM در حالت تمایز نیافته مورد نیاز باشد. علاوه بر این، سطوح بالا کاتنین سرنوشت سلول پیش ساز نفرون را تعیین می کند [57، 58]. بنابراین، ما فرض می‌کنیم که کاهش سیگنال‌دهی cMyc و Notch، همراه با افزایش بیان -catenin، کاهش بیان Six-2 به میزان 28 درصد در فرزندان DG LP و با تمایز اولیه سلول‌های CM و کاهش سلول‌های بنیادی مرتبط است. عدد نفرون در بزرگسالی علاوه بر این، داده‌های ما ممکن است نشان دهد که در سلول‌های MM فرزندان LP، افزایش بیان Let{-5p و -catenin و کاهش سیگنال Notch ممکن است c-Myc، Six{16}} را تعدیل کند، و بیان Ki{17}}، که منجر به کاهش خود نوسازی سلول های پیش ساز می شود. تخلیه سلول های پیش ساز باقی مانده CM منجر به کاهش تعداد نفرون و ایجاد فشار خون شریانی وکلیهاختلالات در بزرگسالی (شکل 10). مطابق با نتایج Boivin و همکاران، نتایج ما نشان می دهد که افزایش CM-catenin رشد UB و نفروژنز را مختل می کند [59]. مطالعات نشان داده اند که فاکتور نوروتروفیک مشتق از فاکتور رشد (GDNF)، یک تنظیم کننده حیاتی رشد UB، از طریق گیرنده تیروزین کیناز c-Ret و گیرنده کمکی Gfra1 سیگنال می دهد [60، 61]. در فرزندان 17-DG LP، قابل توجه است

افزایش در mRNA کد کننده گیرنده c-ret از نظر تئوری منجر به افزایش رشد UB می شود. با این حال، در این مطالعه، بیان GDNF بدون تغییر بود، که نشان می‌دهد با وجود افزایش mRNA cRet، انشعاب UB کاهش یافته است. پیش از این، ما شاهد کاهش 28.3 درصدی در شاخه‌های جوانه حالب بعد از 14.5 روز محدودیت پروتئین بارداری [4] بودیم که می‌توانست با کاهش 28 درصدی در برچسب‌گذاری شش{7}} سلول‌های MM، علیرغم عدم تغییر در GDNF همراه باشد. رونویسی -کاتنین احتمالاً با گیرنده c-ret تعامل می کند و به هسته سلول UB منتقل می شود، بیان TGF -1 را در سلول های اپیتلیال ترویج می کند، انشعاب UB را مهار می کند و باعث تمایز زودرس سلول های پیش ساز CM می شود، همانطور که در {{11} فرزندان DG LP [62-64]. بنابراین، GDNF ممکن است در واسطه سیگنال های مزانشیمی به جوانه حالب ضروری نباشد. با این حال، مکانیسم هنوز روشن است. در واقع، ما نشان داده‌ایم که MM از فرزندان 17-DG LP افزایش خاصی در بیان Let-7 miRNA نشان داد که منجر به اختلال قابل توجهی شد.کلیهتوسعه، در نتیجه نقش تعدیل کننده این ژن ها در زمان بندی رشد نفروژنز را تایید می کند [65].

در مطالعات اولیه فاکتور رشد شبه انسولین (IGF)، نقش غالب IGF{1}} و -2 در رشد جنین با شواهد فراوان، اما عمدتاً غیرمستقیم، روشن شد. مشخص شد که IGFها به عنوان فاکتورهای تکثیر و تمایز در سلول های کشت شده جنین و جنین های قبل از لانه گزینی عمل می کنند. علاوه بر این، IGF ها توسط سلول های کشت شده جنینی و ریزنمونه ها در شرایط آزمایشگاهی ترشح می شوند [66]. فاکتورهای رشد، از جمله IGF، می توانند باعث انتقال جزئی یا کامل اپیتلیال- مزانشیمی شوند. فعال شدن مسیرهای IGF با القای بیان ZEB1 منجر به تنظیم مثبت EMT می شود [67]. اگرچه چندین عامل رشد نامزد در آن دخیل هستندکلیهتوسعه، اینکه آیا آنها در نفروژنز نقش دارند ناشناخته است. فاکتورهای رشد مختلف ممکن است در زمان های مختلف مورد نیاز باشد. برخی از عوامل رشد ممکن است در این زمینه اضافی باشند. در طول رشد جنینی، دورهای متوالی EMT و MET برای تمایز انواع سلول های تخصصی و ایجاد یک ساختار سه بعدی مورد نیاز است. در این مطالعه، تبدیل‌پذیری مزانشیمی-اپیتلیال برای حفظ انعطاف‌پذیری سلول پیدا شد، که نشان‌دهنده وجود یک سیستم بسیار القاپذیر در شرایط LP برای جنین است. بیان خانواده Let-7 miRNA به طور گسترده در بافت های مختلف جنین مورد مطالعه قرار گرفته است. افزایش بیان Let{3}} miRNA مربوط به کاهش تکثیر و افزایش زودهنگام تمایز سلولی MM و در نتیجه کاهش تعداد نفرون است [27، 15، 68-71]. بیان بالاتر Let{8}} در ارگانیسم های بالاتر در طول آخرین مرحله جنین زایی مغزی در جوندگان نشان داده شده است [72، 73]. ناگالاکشمی و همکاران نشان داد که بیان miRNA Let{11}} سرنوشت سلول های اپیتلیال UB را از پیش ساز به حالت متمایز تغییر داد [71]. در مقابل، یرمالوویچ و همکاران. نشان داد که بیان بیش از حد Lin28b، یک پروتئین متصل به RNA، با miRNA های سرکوبگر Let{15}} مرتبط است. اگرچه lin28 و Let{17}} تنظیم‌کننده‌های شناخته شده زمان‌بندی انتوژنیک در بی‌مهرگان هستند، نقش آنها در رشد اندام پستانداران شناخته نشده است [65]. در این مطالعه، افزایش بیان Let{19}a{20}} miRNA در جنین LP می‌تواند با کاهش تکثیر سلول‌های CM همراه باشد و نفروژنز را نسبت به گروه NP به خطر بیندازد. بنابراین، ما فرض می کنیم که سرکوب تکثیر سلولی CM و توقف اولیه نفروژنز ناشی از افزایش میرنا Let{21}} ممکن است به طور مستقیم یا غیرمستقیم از طریق کاهش موقت بیان Lin28b در 17-DG LP رخ دهد. این اثر ممکن است به طور قابل توجهی مختل شودکلیهتوسعه در 17-DG LP، تأیید می‌کند که این ژن زمان‌بندی رشد را در طول نفروژنز تنظیم می‌کند. در این مطالعه، افزایش بیان Let{1}a-5p miRNA همزمان با کاهش بیان c-Myc است. Myc در تکثیر، رشد، آپوپتوز و تمایز سلولی در طول زمان نقش داردکلیهاندام زایی [74-76]. در فرزندان LP 17-DG، بیان ژن MM c-Myc کاهش یافت، و ناحیه رنگپذیری CM c-Myc در مقایسه با فرزندان NP 14 درصد کوچکتر بود. به طور همزمان، کاهش 14 درصدی در تعداد سلول‌های CM برای کاهش 48 درصد ایمنی‌پذیری Ki-67 در LP نسبت به فرزندان NP مشاهده شد. به طور مداوم، مطالعات نشان داده اند که c-Myc نقش مهمی در مرحله نهایی انشعاب UB و در تحریک تکثیر سلول های پیش ساز CM ایفا می کند [74].

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

کاهش سطح در سلول های بنیادی، حفظ آنها در حالت تمایز نیافته. با این حال، در این مطالعه، بیان قوی Let{0}a-5p miRNA در CM بیان c-Myc را کاهش داد، در نتیجه تکثیر سلول های پیش ساز و تمایز سلولی اولیه در LP 17-DG را کاهش داد. فرزندان (شکل 10). مطالعات در موردکلیه هاموش‌های تراریخته c-Myc کاهش همزمان سلول‌های CM ایمنی مثبت c-Myc و S-ix را نشان دادند که با کاهش تکثیر سلول‌های بنیادی همراه بود [74]. این مطالعه کاهش قابل توجه (28 درصد) در شش-2 سلول مثبت را نشان می‌دهدکلیهنشانگر سلول های بنیادی، مانند کاهش مشاهده شده در تعداد نفرون، در CM فرزندان 17-DG LP در مقایسه با فرزندان NP. در سال 2009، فوگلگرن و همکاران. نشان داد که بیان ژن شش-2 در طول انتوژنز جنین زمانی که با کاهش تعداد نفرون، فشار خون بالا و مزمن همراه باشد، کاهش می‌یابد.نارسایی کلیه[77]. بنابراین، کاهش بیان ژن Six-2 در سلول های پیش ساز CM نشان دهنده سرکوب تمایز ناشی از سیگنال در طولکلیهتوسعه در فرزندان 17-DG LP. با این وجود، افزونگی باید با احتیاط مورد استفاده قرار گیرد - نقص‌های ظریف در نفروژنز ممکن است با تجزیه و تحلیل دقیق‌تر یا تحت شرایط مختلف آشکار شود. سطوح mRNA IGF1 در طول دوره اولیه توسعه متانفریک بالاترین بود، با رونوشت هایی که در سراسر MM شناسایی شدند، در حالی که سطوح آنها در طول توسعه بیشتر کاهش یافت. با این حال، در طولکلیهجنین زایی، تعادل ظریف بین فاکتورهای رشد تسهیل کننده نفرون (IGF1) و عوامل رشد بازدارنده (TGF -1) انشعاب UB را تنظیم می کند.

نتیجه

اگرچه چندین نویسنده نفروژنز را مطالعه کرده اند [34، 37، 78]، اطلاعات کمی در مورد مکانیسم هایی که تعداد نفرون ها را تعیین می کنند، وجود دارد. این مطالعه نشان می‌دهد که بسیاری از miRNA‌ها، mRNA‌ها و پروتئین‌های سلول پیش‌ساز MM در فرزندان 17-DG LP تغییر می‌یابند که منجر به کاهش تکثیر و تمایز اولیه سلولی می‌شود (شکل 11). این تعادل ظریف بین تجدید و تمایز پیش ساز نفرون ضروری استکلیهتوسعه زیرا عدم دستیابی به تعداد کافی نفرون یک عامل خطر برای مزمن استکلیهبی نظمی