afزبان
صفحه اصلی / دانش / محتوای

دانش

اختلال اتوفاژی وابسته به ATG16L، فیبروز بینابینی کلیوی را در اختلال عملکرد مزمن پیوند کلیه از طریق القای EndMT توسط مسیر سیگنال NF-kB ترویج می کند.

Mar 18, 2022

زپینگ گی1,2†، چوانجیان سو1†زیجی وانگ 1†، مینگ ژنگ1، شوانگ فی1هائو چن1، لی سان1ژیجیان هان1، جون تائو1، شیائوبین جو1، هایوی یانگ1مین گو2*و رویون تان1*



مزمنکلیهاختلال عملکرد پیوند (CAD) توسط عوامل متعددی از جمله اسکلروز گلومرولی، التهاب، فیبروز بینابینی و آتروفی لوله ای (IF/TA) ایجاد می شود. با این حال، برجسته ترین عناصر ازCADIF/TA هستند. مطالعات ما تایید کرده اند که انتقال اندوتلیال-مزانشیمی (EndMT) منبع مهمی برای پیوند IF/TA است. مشخصه EndMT از بین رفتن نشانگر اندوتلیال و کسب فنوتیپ های مزانشیمی یا فیبروبلاستیک است. اتوفاژی یک مسیر تخریب درون سلولی است که توسط پروتئین های مرتبط با اتوفاژی تنظیم می شود و در بسیاری از شرایط فیبروتیک نقش حیاتی دارد. با این حال، آیا اتوفاژی به فیبروز کمک می کند یا خیرکلیهآلوگرافت و چگونگی ایجاد چنین مکانیسمی هنوز نامشخص است. ژن مشابه 16 مربوط به اتوفاژی (ATG16L) یک ژن حیاتی مرتبط با اتوفاژی (ARG) است که برای تشکیل اتوفاگوزوم ضروری است. در اینجا، ما ابتدا بافت‌های بیمار پیوند کلیه را از مجموعه داده‌های Gene Expression Omnibus (GEO) و 60 بیمار پیوندی از مرکز خود تجزیه و تحلیل کردیم. گیرندگان با عملکرد کلیه پایدار به عنوان یک غیرCADگروه و همه بیماران درCADگروه از نظر هیستوپاتولوژیک تشخیص داده شدCAD. نتایج نشان داد که ATG16L، به عنوان یک ARG تفاضلی مهم، کمتر درCADگروه در مقایسه با گروه غیر CAD. علاوه بر این، ما دریافتیم که اتوفاگوزوم ها و اتولیزوزوم های کمتری در کلیه های پیوندی وجود دارد.CADبیماران، و کاهش اتوفاژی یک عامل پیش آگهی ضعیف است. در شرایط آزمایشگاهی، متوجه شدیم که نابودی ATG16L روند EndMT را در انسان افزایش می دهد.کلیهسلول های اندوتلیال گلومرولی (HRGECs). در داخل بدن، تغییرات EndMT و شار اتوفاژیک سپس در موش تشخیص داده شدکلیهمدل های پیوند ازCAD. ما وقوع EndMT را نشان دادیم و نشان دادیم که فراوانی ATG16L با تغییر جریان اتوفاژیک پویا در طول مراحل مختلف پیوند کلیه همراه بود. از نظر مکانیکی، از بین بردن ATG16L، به ویژه در سلول های اندوتلیال، تخریب NF-kB را کاهش داد و سیتوکین های التهابی (IL{3}}b، IL{4}}، و TNF-a) را دفع کرد که می تواند EndMT را تسهیل کند. در نتیجه، شار اتوفاژیک وابسته به ATG16L ناشی از پیوند افزایش تلفات پیشرونده را در طول زمان نشان داد.

سیتوکین های التهابی ناشی از این فرآیند EndMT را ارتقا داده و در نتیجه منجر به پیشرفت می شودCAD. ATG16L به عنوان یک تنظیم کننده منفی EndMT و توسعه آن عمل کردکلیهفیبروز پیوند و اتوفاژی را می توان به عنوان یک هدف درمانی بالقوه برای اختلال عملکرد مزمن پیوند کلیه مورد بررسی قرار داد.

کلید واژه ها:اختلال مزمن پیوند کلیه, کلیهفیبروز بینابینی، ATG16L، اتوفاژی، EndMT، سیتوکین های التهابی

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

to relieve chronic renal graft dysfunction

مقدمه

کلیهپیوندیکی از درمان های بهینه برای بیماران اورمی است زیرا کیفیت زندگی آنها را به میزان قابل توجهی بهبود می بخشد (1). با این حال، تعداد نسبتاً بالایی از اختلال عملکرد آلوگرافت کلیه پس از پیوند به دلیل زوال پیشرونده مزمن عملکرد کلیه وجود دارد که یک عامل کلیدی بر بقای طولانی مدت کلیه های پیوندی است (2). اختلال عملکرد مزمن پیوند کلیه (CAD)، که قبلا به عنوان نفروپاتی آلوگرافت مزمن شناخته می شد، یک وضعیت چند عاملی مرتبط با فیبروز بینابینی پیشرونده کلیه است. عوامل مختلفی به از دست دادن عملکرد پیوند کلیه کمک می کنند، از جمله، اما نه محدود به، رد حاد و مزمن، ایسکمی و جریان خون مجدد التهابی و فرآیند بازسازی بافت، و سمیت کلیوی مرتبط با دارو (3).

CADاز نظر مورفولوژیکی با التهاب، فیبروز بینابینی پیشرونده و آتروفی لوله ای (IF/TA) و اسکلروز گلومرولی مشخص می شود (4). در میان آنها، IF/TA یک عامل کلیدی تعیین کننده عملکرد آلوگرافت کلیه است، اما مکانیسم هایی که توسط آن رخ می دهد هنوز ناشناخته است. عوامل متعددی برای کمک به نسبت بالای از دست دادن آلوگرافت کلیه شناسایی شده است. در مطالعه قبلی خود، ما همچنین تأیید کردیم که فرآیند پاتولوژیک اصلی CAD، پیوند کلیه IF/TA است که با رسوب بیش از حد ماتریکس خارج سلولی در بافت لوله‌ای و بینابینی کلیه پیوندی مشخص می‌شود (5). مطالعات تأیید کرده‌اند که کلاژن‌ها عمدتاً توسط میوفیبروبلاست‌ها ترشح می‌شوند و ترشح کلاژن منجر به ته‌نشینی ماتریکس خارج سلولی و متعاقباً پیوند کلیه IF/TA می‌شود. چهار سلول اصلی در تشکیل میوفیبروبلاست‌ها نقش دارند: سلول‌های اپیتلیال، سلول‌های اندوتلیال، فیبروبلاست‌های مشتق از مغز استخوان و پری‌سیت‌های میکروواسکولار (6، 7). آنها نقش مهمی در ترمیم و محافظت از یکپارچگی بافت کلیه دارند. در میان آنها، محرک‌های خارجی تمایز سلول‌های ذاتی کلیه مانند سلول‌های اپیتلیال را به میوفیبروبلاست‌ها، که می‌توانند یک ماتریکس خارج سلولی تولید کنند، ممکن می‌سازند. این فرآیند انتقال اپیتلیال به مزانشیمی (EMT) نامیده می شود. EMT معمولا شامل سه نوع است: (I) جنین زایی، (II) ترمیم بافت و فیبروز، (III) متاستاز (8). مطالعات متعددی برای روشن کردن مکانیسم‌های مولکولی و سلولی EMT نوع II در فیبروز اندام انجام شده است (9، 10)، با این حال، نقش EMT در فرآیندهای مختلف تولید فیبروبلاست اولیه در طول پیشرفت CAD هنوز قطعی نیست.

cistanche is good for choric kidney disease

با پیوند کلیه، به دلیل موقعیت فیزیکی اندوتلیوم آلوگرافت که آن را به یک هدف اولیه برای آسیب آلوگرافت تبدیل می کند، همیشه احتمال آسیب به ماکرو و ریز عروق آلوگرافت افزایش می یابد (11). آلوگرافت ها به عنوان اهداف بالقوه برای پاسخ ایمنی با واسطه تعداد زیادی از سیتوکین های التهابی سرم عمل می کنند. مطالعات نشان داد که بسیاری از سیتوکین های التهابی درگیر هستندCADفرآیند (12) و سلول‌های اندوتلیال در محل‌های آلوگرافت کلیه نه تنها در التهاب شرکت می‌کنند، بلکه تنظیم‌کننده‌ی التهاب نیز هستند (11). تحقیقات قبلی ما نشان داد که TNF-a بیشتر در آن بیان می شودCADگروه نسبت به گروه غیر CAD. TNF-a همچنین فرآیند EMT را در سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال انسان (HK2) تسهیل می‌کند (13). با توجه به تماس نزدیک بین سلول های اندوتلیال و خون، سلول های التهابی در گردش و سیتوکین ها ابتدا به اندوتلیوم آلوگرافت حمله می کنند. تحریک مزمن از سیتوکین های التهابی منجر به اختلال در ساختار سلولی و محیط داخلی سلول های اندوتلیال می شود که منجر به آسیب اندوتلیال می شود. مطالعات نوظهور نشان می دهد که آسیب اندوتلیال به رسوب ماتریکس خارج سلولی کمک می کند و نقش کلیدی در بیماری های فیبروز اندام ایفا می کند. اخیراً، انتقال اندوتلیال به مزانشیمی (EndMT) به عنوان علت اصلی آسیب اندوتلیال در نظر گرفته شده و باعث پیشرفت IF/TA در طول بیماری فیبروز کلیوی می شود (5، 9). EndMT یک نوع متمایز از EMT است. با سلول هایی مشخص می شود که به تدریج نشانگرهای اندوتلیال مانند CD31 و CD34 را از دست می دهند و فنوتیپ مزانشیمی یا میوفیبروبلاستیک مانند اکتین ماهیچه ای صاف (a-SMA)، کلاژن I و فیبرونکتین (FN) را به دست می آورند. مکانیسم نظارتی برای EndMT همچنان یک موضوع پیچیده است. وقوع EndMT می تواند تحت تأثیر عوامل زیادی مانند استرس اکسیداتیو، هیپوکسیک و آسیب های مختلف باشد (14، 15). اما تقریباً همه این عوامل تنظیمی در نهایت در یک عمل مستقیم، که سیتوکین های التهابی است، گرد هم می آیند. در مطالعات قبلی ما نشان دادیم که EndMT یک عامل مهم در پاتوژنز IF/TA و CAD از طریق مسیرهای سیگنالینگ TGF-b/Smad بود (5). علاوه بر این، هنوز سایر محققان پیشنهاد کردند که بیان TGF-b توسط TNF-a تنظیم شده است (16). بنابراین، سیتوکین های التهابی مانند TNF-a نیز ممکن است یک عامل بیماریزای مهم در آسیب اندوتلیال عروقی باشد که پیشرفت CAD را مشخص می کند. اگرچه عوامل اولیه EndMT در ریزمحیط های مختلف متفاوت بود، اما نتیجه نهایی یکسان بود. از این رو، فرضیه این که باید یک مکانیسم تنظیمی مرکزی در تولید سایتوکاین‌های التهابی و پیشرفت EndMT وجود داشته باشد، کافی است.

اتوفاژی یک مسیر سلولی است که مسئول تخریب پروتئین و اندامک است (17). فرآیند اتوفاژی به نام شار اتوفاژیک نیز شناخته می شود و قدرت این فرآیند اغلب نشان دهنده میزان فعال شدن اتوفاژی است. اتوفاژی در فرآیندهای پاتوفیزیولوژیک کلیوی مختلف از جمله گلومرولواسکلروز، نفروپاتی دیابتی و بیماری کلیه کیستیک دخیل است (18). برخی از مطالعات گزارش کردند که اتوفاژی یک فرآیند محافظ سلولی است. یک دفاع کلاسیک برای این پیش‌فرض در موش‌هایی با حذف ATG5 در لوله‌های پروگزیمال دیده می‌شود که در آن حذف باعث افزایش فیبروز کلیوی شدیدتر به دلیل اختلال اتوفاژی می‌شود (19). مطالعات دیگر همچنین نشان داده‌اند که سلول‌های اپیتلیال لوله پروگزیمال ATG5 آسیب حاد کلیه را در مراحل اولیه تشدید می‌کند، اما پیشرفت فیبروز کلیه را در روند بهبود یا ترمیم کاهش می‌دهد (20). با این حال، تعامل خاص بین اتوفاژی و EMT یا EndMT در بیماری فیبروز هنوز بحث برانگیز است. چندین مطالعه پیشنهاد کردند که مهار اتوفاژی می‌تواند با تأثیر بر تلاقی نابجای اپیتلیال-فیبروبلاست در فیبروز ریوی ایدیوپاتیک، EMT و فیبروز را القا کند (21). دیگران نشان دادند که راپامایسین از طریق فعال شدن اتوفاژی در طول پیری زودرس، EndMT را تقویت می کند (22). ژن ATG16L عمدتاً شامل ATG16L1 و ATG16L2 است. ATG16L2 همو- و هترو-الیگومریزه با ATG16L1. اما ATG16L2 ارتباط کمتری با اتوفاژی دارد (23). ATG16L1 به عنوان یک ژن مرتبط با اتوفاژی مهم شناخته شده است، تشکیل اتوفاگوزوم را در غشای پلاسمایی ترویج می کند و نقش مهمی در شکل لیپید شده LC3 ایفا می کند (23). در اینجا، ATG16L1 در مجموع به عنوان ATG16L نامیده می شود. به عنوان یک عامل کلیدی در اتوفاژی، یک بار ATG16L گزارش شد که با پاتوژنز چندین بیماری التهابی مرتبط است. به عنوان مثال، جهش ATG16L یک استعداد قوی برای ایجاد بیماری کرون ایجاد می کند (24). با این حال، مکانیسم عمل ATG16L و اتوفاژی هنوز در یک رویکرد هدفمند مانند مدیریت و پیش آگهی پیوند کلیه به خوبی مورد مطالعه قرار نگرفته است. بنابراین نقش پویای شار اتوفاژیک و اتوفاژی وابسته به ATG16L باید تمرکز تحقیقات برای درمان‌های بالقوه در پیشرفت CAD باشد.

در این مطالعه، نقش بالقوه اتوفاژی وابسته به ATG16L در پیشرفت CAD را بررسی کردیم. ما نشان دادیم که از دست دادن ATG16L و اتوفاژی با وقوع EndMT در بیماران CAD بالینی و موش‌های پیوند کلیه مرتبط است. سپس دریافتیم که سطوح EndMT و فیبروز بینابینی آلوگرافت کلیه پس از تغییر فعالیت اتوفاژی با از بین بردن ژن ATG16L افزایش یافت. علاوه بر این، مکانیسم‌های زمینه‌ای بالقوه نیز توسط توالی‌یابی RNA مورد بررسی قرار گرفت، ما دریافتیم که اختلال ATG16L به فعال‌سازی مسیر فاکتور هسته‌ای-kB (NF-kB) و ترشح سیتوکین‌های التهابی کمک می‌کند و سپس پیشرفت EndMT را ارتقا می‌دهد.


cistanche-kidcistanche can treat acute renal failure

مواد و روش ها

بیانیه اخلاق

پروتکل های این مطالعه مطابق با اعلامیه هلسینکی و استانبول بود. مطالعات انسانی توسط کمیته اخلاق محلی اولین بیمارستان وابسته دانشگاه پزشکی نانجینگ (ID: IACUC-2010020) مورد بررسی و مجوز قرار گرفت. رضایت آگاهانه از کلیه گیرندگان پیوند و همچنین بیماران نفرکتومی که در این تحقیق وارد شدند، اخذ شد.

مطالعات مربوط به موش‌ها توسط کمیته اخلاق محلی اولین بیمارستان وابسته دانشگاه پزشکی نانجینگ (ID: IACUC-2010020) مورد بررسی قرار گرفت و مجاز شد. رضایت کتبی آگاهانه توسط مالکان برای مشارکت حیوانات خود در این تحقیق داده می شود.

TABLE 1 | Baseline characteristics of the CAD and non-CAD groups.

مجموعه نمونه

Sixty of adults who had received living or deceased donor kidney transplants started to be followed up from January 2010 to December 2017 at First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Patients with serum creatinine level consistently < 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least 12 months after kidney transplantation and no other complications such as episodes of significant rejection, drug toxicity injury, and infection were assigned to the non-CAD group. Patients in the CAD group were defined as elevated serum creatinine greater than or equal to 141.46 mmol/L (1.6 mg/dl) for at least three months, and they were diagnosed by two independent pathology experts combined with biopsy results, laboratory indexes, and imaging features. Adjacent normal kidney tissues were obtained from regions outside the tumor margin (>5 سانتی متر) در بیماران با عمل نفرکتومی رادیکال. نمونه خون پس از رضایت آگاهانه بیماران گرفته شد. مرحله خاص را می توان در مطالعات قبلی ما اشاره کرد (5). ویژگی های پایه بیماران در گروه CAD و گروه غیر CAD همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است.


مدل موش ها و حیوانات

موش های صحرایی نر بالغ F344 و Lewis (وزن 250 ± 10.3 گرم) از آزمایشگاه های رودخانه چارلز (پکن، چین) به دست آمدند و از دستورالعمل های کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در دانشگاه پزشکی نانجینگ پیروی کردند. حیوانات مطابق با هنجارهای دانشگاه پزشکی نانجینگ و دستورالعمل های منتشر شده توسط مؤسسه ملی بهداشت ایالات متحده اداره شدند.

همه این حیوانات پیوند کلیه چپ ارتوتوپی را تجربه کردند. موش‌های لوئیس به‌عنوان گیرنده و اهداکنندگان سیژنیک (گروه Syn)، موش‌های F344 به‌عنوان اهداکننده آلوژنیک (گروه Allo) استفاده شدند. کلیه راست به طور همزمان برداشته شد. میانگین زمان ایسکمی سرد کمتر از 20 دقیقه و ایسکمی گرم کمتر از 35 دقیقه بود. سیکلوسپورین A (5 mg/kg، QD، IP؛ Neoral، Novartis، سوئیس) به مدت 14 روز برای جلوگیری از رد حاد استفاده شد.


درمان دارویی و برداشت بافت

کلیه‌های پیوندی از موش‌ها در هفته‌های 4، 8، 12 و 16 پس از جراحی برداشت شدند. نمونه های بافت آلوگرافت کلیوی تثبیت شده با فرمالین (10 درصد فرمالین خنثی) با پارافین برای رنگ آمیزی بافت شناسی و IHC/IF به دست آمد. کلیه باقیمانده در یخچال های 80- درجه برای تشخیص RNA و پروتئین ذخیره می شود.

سنجش رنگ آمیزی تریکروم HE و Masson

پروتکل‌های رنگ‌آمیزی HE و Masson trichrome را می‌توان در مطالعات قبلی ما اشاره کرد (5). برای شناسایی شدت CAD و وسعت ناحیه فیبروتیک، ناحیه فیبروز آلوگرافت کلیه با رنگ آمیزی تری کروم ماسون اندازه گیری شد. برای هر برش، پنج میدان بینایی تصادفی زیر میکروسکوپ × 400 انتخاب شد. ناحیه مثبت برای تری کروم ماسون توسط دو آسیب شناس که نسبت به طرح آزمایشی کور شده بودند با استفاده از Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD) اندازه گیری شد.

سنجش رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی

بافت های کلیه تثبیت شده با فرمالین به بخش های پارافینی به ضخامت 3 میلی متر بریده شدند. فرآیند پارافینیزاسیون، هیدراته شدن و بازیابی آنتی ژن مطابق با مطالعات قبلی ما بود (5). آنتی بادی ها [anti-ATG16L (1:100؛ Abcam، ایالات متحده)، anti-a-SMA (1:200؛ Abcam، ایالات متحده)، ضد فیبرونکتین (1:100؛ Abcam، ایالات متحده آمریکا) و anti-CD31 (1:100؛ CST، ایالات متحده)] پس از مسدود شدن بخشها با 10 درصد سرم طبیعی الاغ، یک شبه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. مراحل بعدی نیز همانطور که قبلاً توضیح داده شد با IgG ضد موش/خرگوش بز بیوتینیله (0.5 میلی گرم در میلی لیتر) انجام شد.

Abcam) و سوبسترای 3-آمینو-9-اتیل کاربازول یا 3،3'

دی آمینو بنزیدین (Vector Laboratories، Burlingame، CA). اسلایدهای رنگ آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ Nikon Eclipse 80i مجهز به دوربین دیجیتال (DS-Ri1، نیکون، شانگهای، چین) عکسبرداری شدند.


سنجش رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس غیرمستقیم

پس از تثبیت با محلول فرمالدئید 4 درصد، مقاطع آلوگرافت کلیه و برش های سلولی با 0.1 درصد Triton X{3}} به مدت 1 ساعت نفوذ کردند، سپس با سرم 5 درصد بز به مدت 1 ساعت مسدود شدند. پس از آن، برش‌ها و برش‌های سلولی با ضد NF-kB p65 (1:200؛ Abcam، ایالات متحده) در دمای 4 درجه یک شبه انکوبه شدند. شرایط جوجه کشی آنتی بادی ثانویه Dapi می تواند به مطالعات قبلی ما مراجعه کند (5). اسلایدها با میکروسکوپ فلورسانس نیکون اکلیپس 80i (DS-Ri1، نیکون، شانگهای، چین) مشاهده شدند.

تشخیص شار اتوفاژیک

AAV-mRFP-GFP-LC3 (هانبیو، شانگهای، چین) 14 روز قبل از پیوند به صورت استریوتاکتیک به کلیه چپ موش های لوئیس (3 میلی لیتر) تزریق شد. کلیه در 4، 8، 12، 16 هفته پس از پیوند برداشته شد و با 4 درصد پارافورمالدئید به مدت 24 ساعت ثابت شد. اسلایدهای (30 میلی متر) با میکروسکوپ فلورسانس نیکون اکلیپس 80i (DS-Ri1، نیکون، شانگهای، چین) مشاهده شدند. لکه های زرد نشان دهنده اتوفاگوزوم ها و لکه های قرمز نشان دهنده اتولیزوزوم ها هستند. هنگامی که سیگنال قرمز قوی تر از سیگنال زرد است، شار اتوفاژیک فعال می شود. هنگامی که سیگنال‌های زرد بیشتر از سیگنال‌های قرمز نشان‌دهنده جریان اتوفاژیک است، مختل می‌شود.


میکروسکوپ الکترونی

نمونه ها با گلوتارآلدئید سرد یخی (3 درصد در بافر کاکودیلات 0.1 M، pH 7.4) تثبیت شدند و توسط مرکز مرکزی (سرویس، ووهان، چین) پردازش شدند. مشاهده بر روی میکروسکوپ الکترونی عبوری JEOL JEM{6}} انجام شد.

تشخیص عملکرد کلیه

ما از کیت سنجش کراتینین QuantiChrom و کیت سنجش اوره QuantiChrom (Jiancheng، پکن، چین) برای تشخیص غلظت کراتینین خون و نیتروژن اوره موش طبق دستورالعمل سازنده استفاده کردیم.

تشخیص پروتئین اوریا

نمونه‌های ادرار 24 ساعته با استفاده از قفس‌های متابولیک جمع‌آوری شد و دفع پروتئین ادرار با کیت تجاری (Mlbio، شانگهای، چین) مطابق دستورالعمل سازنده آزمایش شد.

ارزیابی زمان واقعی PCR

به طور خلاصه، RNA کل از HRGECs با استفاده از کیت های استخراج RNA (TIANGEN، پکن، چین) خالص شد. cDNA (cDNA) همانطور که قبلا توضیح داده شد سنتز شد (5). بیان ژن با روش Real-time PCR (Vazyme) و سیستم DNA Engine Opticon 2 (BioRad Laboratories, Hercules, CA) اندازه گیری شد. توالی پرایمر به شرح زیر توصیف شد:

IL-1 b: 5′- TTCCTGTTGTCTACACCAATGC-3′ (F) 5′-CGGGCTTTTAAGTGAGTAGGAGA-3′ (R);

IL{0}}: 5′-TCTCTCCGCAAGAGACTTCCA-3′ (F)

5′- ATACTGGTCTGTTGTGGGTGG-3′ (R)؛

TNF-a: 5'- CCCTCTCTTATCAGCCCTCTG-3' (F) 5'- GAGGACCTGGGAGTAGATGAG -3' (R)؛

اکتین: 5′- TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′ (F) 5′- CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′ (R)؛


وسترن بلات و روش الیزا

به طور خلاصه، پروتئین‌ها از سلول‌ها و بافت‌ها در بافر RIPA (Thermo ScientificTM, Chelmsford, MA, USA) حاوی کوکتل‌های مهارکننده فسفاتاز و پروتئاز (Sigma, St Louis, MO, USA) استخراج شدند. پروتئین ها (20 میلی گرم) به دنبال SDS-PAGE به یک غشای PVDF (Millipore، IPVH00010، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) منتقل شدند. لام ها در محلول مسدود کننده (شیر بدون چربی 5 درصد) به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند و سپس غشای PVDF با آنتی بادی اولیه بدون شستشو در یک اتاق سرد یک شبه انکوبه شد. پس از آن، فرآیند شستشوی غشای PVDF توسط بافر سالین توئین بافر تریس (TBST)، انکوبه شده توسط آنتی بادی ثانویه، قرص ECL و در معرض قرار گرفتن با مطالعات قبلی ما مطابقت داشت (5). آنتی بادی های اولیه به شرح زیر فهرست شدند: anti-GAPDH (1:1000؛ CST، ایالات متحده آمریکا)، anti-CD31 (1:1000؛ CST، ایالات متحده)، anti-a-SMA (1:1000).

Abcam، ایالات متحده)، آنتی فیبرونکتین (1:1000؛ BD Biosciences، ایالات متحده)،

anti-LC3 (1:1000؛ CST، ایالات متحده)، anti-ATG16L (1:1000؛ CST، ایالات متحده)،

anti-NF-kB p65 (1:1000؛ CST، ایالات متحده آمریکا)، anti-Phospho-NF-kB p65 (1:1000؛ CST، ایالات متحده). کمی سازی با اندازه گیری شدت سیگنال ها با کمک نرم افزار تحلیل تصویر NIH انجام شد. MAP1LC3 با استفاده از کیت ELISA (ml000829، Mlbio، چین) طبق دستورالعمل سازنده شناسایی شد.


کشت سلولی، درمان، و انتقال shRNA

سلول های اندوتلیال گلومرولی کلیه انسان (HRGECs) در محیط سلول اندوتلیال (ECM، ScienCell Research Laboratories Carlsbad، CA، USA) حاوی 5 درصد سرم جنین گاوی کشت داده شدند. راه اندازی تجهیزات HRGEC های کشت انکوباتور CO2 در یک فضای مرطوب حاوی 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه. سلول‌های اندوتلیال در یک محیط بدون سرم به مدت یک شب نگهداری شدند و سپس با IL-1b، IL{7}} و TNF-a برای ساعات مختلف یا غلظت‌های مختلف تیمار شدند.

Knockdown پایدار ATG16L و بیان بیش از حد ATG16L- HRGEC با استفاده از لنتی ویروس (جیکای، شانگهای، چین) ساخته شد. HRGECها ابتدا با لیپوفکتامین 2000 ترانسفکت شدند، سپس با 1.5 میلی‌لیتر ویروس ATG16L shRNA یا 2.0 میلی‌لیتر ویروس ATG16L با بیان بیش از حد بر اساس پروتکل سازنده ترانسفکت شدند. سپس سلول های اندوتلیال به ECM حاوی 2.0 میلی لیتر پلی برن تبدیل شدند و به مدت 6 ساعت دیگر انکوبه شدند. ما میزان آلودگی ویروس ها را با میکروسکوپ فلورسانس Nikon Eclipse 80i (DS-Ri1، نیکون، شانگهای، چین) شناسایی کردیم. پورومایسین (2 میکروگرم در میلی لیتر؛ Gibco، Thermo Fisher Scientific) برای انتخاب سلول های آلوده به ویروس پایدار استفاده شد. پس از آن، HRGECs برای آزمایش های بیشتر جمع آوری شد.

تحلیل آماری

GraphPad Prism 5.{1}} (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شد. نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) از حداقل سه آزمایش مستقل بیان شد. مقایسه بین و درون گروه های متعدد با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون Student-Newman-Keuls انجام شد. مقادیر P از<0.05 were="" considered="">


نتایج

تغییرات هیستومورفولوژی و آسیب شناسی در بافت کلیه از بیماران غیر CAD و CAD

در این مطالعه، بررسی بافت‌شناسی با هماتوکسیلین-ائوزین (HE) و رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون، آلوگرافت کلیوی IF/TA را در بافت‌های بیماران CAD (n=4) در مقایسه با بیماران پیوند کلیه با عملکرد کلیوی پایدار از مرکز ما نشان داد. گروه غیر CAD، n=4) (شکل 1A، B). مجموعه نمونه از مواد و روش ها و جدول 1 اطلاعات گروه بندی دقیق برای ویژگی های اصلی را شرح می دهد. رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) نمونه‌های بیوپسی کلیه انسان بیان بالاتری از a-SMA و فیبرونکتین (FN) و بیان کمتری از CD31 را در گروه CAD نشان داد (شکل‌های 1C-H). CD31 یک پروتئین نشانگر سلول‌های اندوتلیال است و سلول‌های اندوتلیال ویژگی CD31 خود را از دست دادند اما ویژگی‌های مزانشیمی مانند a-SMA، FN را هنگامی که EndMT رخ می‌دهد به دست آوردند. این نتایج نشان داد که بیان نشانگرهای EndMT به طور قابل توجهی در گروه‌های CAD در مقایسه با گروه غیرCAD بالاتر بود.

ATG16L بعد از پیوند کلیه افزایش یافت، اما ATG16L در بیماران CAD در مقایسه با بیماران غیر CAD کاهش یافت

RNA-seq و داده های بالینی از 25 نمونه CAD و 21 نمونه بافت بیوپسی کلیه بیماران غیر CAD از GSE9493 دانلود شد. اطلاعات بیماران در پایگاه داده در مؤسسه تحقیقات بیومدیکال Novartis در سوئیس ثبت شد و برای هیستوپاتولوژی پردازش شد. تشخیص بافت شناسی و طبقه بندی بیوپسی بر اساس معیارهای Banff '05. اطلاعات دموگرافیک و بالینی در پایگاه داده GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE9493) ارائه شده است. نمودار شماتیک جریان تحلیل ها همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است. 1463 ژن افتراقی معنی‌دار با P-value استخراج شد<0.05. using="" the="" criteria="" for="" [log2="" fold="" change="" (log2fc)]=""> 1, we selected 92 up-regulated and 115 down-regulated differential genes from the CAD group compared to the non-CAD group (Figure 2B). Then we searched genes associated with autophagy in the GeneCards database. A total of 149 ARGs with a relevance score >7 نفر انتخاب شدند. 14 ARG در ARG بیماران CAD و غیر CAD وجود داشت. در میان آنها، ما دریافتیم که ATG16L که بالاترین امتیاز مربوط به ژن را دریافت کرد، در نمونه‌های CAD کاهش یافت (شکل 2C).

به منظور اجتناب از اثر دسته ای و تفاوت های جمعیتی، ما یک سری آزمایش را با استفاده از نمونه های انسانی از مرکز خود انجام دادیم تا نتایج پایگاه داده عمومی را تأیید کنیم. در مجموعه اول، ما بخش هایی از نمونه های کلیوی طبیعی، غیر CAD و CAD را با آنتی بادی ضد ATG16L رنگ آمیزی کردیم و نشان دادیم که بیان ATG16L در بیماران CAD در مقایسه با گروه غیر CAD به طور قابل توجهی کاهش یافته است (شکل 2E). . همین نتیجه توسط روش وسترن بلات (WB) بدست آمد. افزایش FN نشان دهنده تشدید سطح فیبروز کلیه های پیوندی و یکی از شاخص های CAD است. تمایل WB ATG16L با نتایج تأیید رنگ IHC ما مطابقت داشت و با نتایج در GEO (شکل 2D) سازگار بود. این نشان داد که بیان ATG16L در عوض با پیشرفت CAD کاهش می یابد. هنگام انجام تحلیل همبستگی پیرسون، متوجه شدیم که ATG16L یک همبستگی منفی قوی در الگوی بیان پروتئین‌های a-SMA، FN و همبستگی مثبت با بیان CD31 دارد. 'r' مقدار همبستگی پیرسون را نشان می دهد و مقادیر P نشان دهنده اهمیت همبستگی است (شکل 2F-I).

FIGURE 1 | Pathological and morphological changes in kidney tissues from the non-CAD and CAD patients. (A) Representative kidney sections from the non-CAD and CAD patients were stained with HE and Masson trichrome (×100, scale bar: 50 mm, ×200, scale bar: 20 mm). (B) Semi-quantitative analyses of the degree of fibrosis in 4 non-CAD patients' and 4 clinical CAD patients' kidney sections stained with Masson trichrome were performed. Each patient selected 5 different sites of transplanted kidney. (***P< 0.001, CAD vs. the non-CAD group, Student t test). (C, E, G) Distributions and expressions of FN, a-SMA and CD31 in the CAD and non-CAD group were assessed by IHC staining assays (×400, scale bar: 10 mm). (D, F, H) Percentage of the relative abundance of proteins were presented as the mean ± SD values of five independent experiments. Representative images of the kidney tissues of the non-CAD group (n = 4) and CAD group (n = 4) were shown. Each patient selected 5 different sites of transplanted kidney. (***P < 0.001, CAD vs. the non-CAD group, Student t test).

اتوفاژی در بیماران CAD کاهش یافت و کاهش MAP1LC3 پیش آگهی ضعیف را در بیماران CAD پیش بینی کرد.

در آزمایش قبلی، تعدادی ARG که اتوفاژی را تنظیم می‌کنند، از پایگاه داده GEO شناسایی شدند. در میان آنها، ATG16L در مرحله اولیه اتوفاژی درگیر است، ما در مورد احتمال اینکه اتوفاژی می تواند در CAD نقش داشته باشد، حدس می زنیم. برای بررسی سطوح اتوفاژی در بافت‌های آلوگرافت کلیه انسان، ابتدا واکوئل‌های اتوفاژیک کمتری را در گروه CAD از طریق میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)، در مقایسه با گروه غیر CAD (شکل‌های 3A, B) یافتیم. علاوه بر استاندارد طلایی TEM برای نظارت بر اتوفاژی، کاهش سطوح SQSTM1 و افزایش بیان LC{4}}II منعکس کننده افزایش اتوفاژی است. روندهای مشابه سطح بیان پروتئین LC3-I (غیر لیپیداسیون LC3)، LC{8}}II (لیپیداسیون LC3)، و SQSTM1 در گروه CAD با سنجش WB همانطور که در شکل‌ها نشان داده شده است تأیید شد. 3C, D. P62/SQSTM1 (SQSTM1) یک گیرنده اتوفاژی انتخابی است و توسط اتوفاژی تجزیه می شود. اتوفاگوزوم ها با لیپیداسیون شکل سیتوزولی LC3 و تشکیل LC{16}}II مرتبط هستند. بنابراین، نتایج WB همچنین نشان داد که اتوفاژی رخ می دهد.

برخی مطالعات نشان داده اند که ARG در سرم بیماران پیوند کلیه تفاوت هایی دارد. سطح سرمی LC3 احتمالاً شاخص پیش آگهی مرتبط با شدت بیماری بود (25، 26). برای بررسی بیشتر نقش اتوفاژی در روند CAD، غلظت LC3 سرم 30 بیمار غیر CAD و 30 بیمار CAD را با روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) بررسی کردیم. اطلاعات دموگرافیک که ویژگی های اساسی بیماران را ارائه می دهد در جدول 1 آمده است. توزیع تعداد مورد، جنس بیمار، سن بیمار، آنتی بادی های واکنشگر پانل (PRA)، رژیم سرکوب کننده سیستم ایمنی، عملکرد کلیه گروه های غیر CAD و CAD همانطور که نشان داده شده است. در جدول 1. جنس، سن و PRA تفاوت عمده ای نشان ندادند. تفاوت معنی داری در کراتینین سرم و نیتروژن اوره خون (BUN) بین دو گروه وجود داشت. سپس سعی شد ارزش پیش آگهی اتوفاژی در بیماران CAD تعیین شود. از طریق نتایج ELISA سرم، ما دریافتیم که بیان LC3 در گروه CAD کمتر بود. همچنین یک CAD پیشرونده و کاهش همزمان در سطح LC3 وجود داشت (شکل 3E). علاوه بر این، ما LC3 را به دو گروه بیان بالا و کم بر اساس تحلیل بقای میانه تقسیم کردیم، نتایج نشان داد که گروه بیان کم LC3 زمان اختلال عملکرد آلوگرافت کوتاه‌تری داشت (شکل 3F). به طور کلی، ما حدس زدیم که کمبود اتوفاژی ارتباط قابل توجهی با پیشرفت CAD دارد.

FIGURE 2 | ATG16L expressions in CAD and the non-CAD patients. (A) The diagram of the dataset recruitment workflow (B) Volcano plot of differential gene expression analysis between non-CAD (n=21) and CAD (n=25) kidney tissues from GEO profiles (GSE9493) (C) Heatmap indicating the differential expressions of the 20 selected ARGs. Expression values were presented in red and green to indicate expression upregulation and downregulation, respectively. (D) Representative western blot assay results of the protein expressions of ATG16L and FN in normal, non-CAD and CAD patient kidney tissues from our center. (E) Representative IHC images of ATG16L expressions in normal, non-CAD and CAD tissue (n=4) (×100, ×200, scale bar: 25 mm)

کاهش ATG16L کاهش اتوفاژی و ارتقاء پیشرفت EndMT

برای تعیین اینکه آیا ATG16L در تغییر اتوفاژی دخیل است، ما ابتدا HRGEC ها را با RNA سنجاق سر کوتاه ATG16L (shRNA) ترانسفکت کردیم. از TEM برای نشان دادن مستقیم تشکیل واکوئل های اتوفاژیک استفاده شد و ما دریافتیم که واکوئل های اتوفاژیک کمتری در سلول های ترانسفکت شده ATG16L shRNA در مقایسه با آنهایی که با کرامبل shNC ترانسفکت شده اند وجود دارد (شکل های 4A, B). هم بیان پروتئین ATG16L و هم فعالیت اتوفاژی نیز در از بین بردن گروه ATG16L در مقایسه با گروه shNC کاهش یافت (شکل 4C).

سپس نقش اتوفاژی وابسته به ATG16L در پیشرفت EndMT مورد بررسی قرار گرفت. HRGEC ها با ATG16L shRNA یا shNC ترانسفکت شدند. شکل 4D نشان داد که ترانسفکشن shRNA ATG16L می تواند به طور قابل توجهی عبارات FN و a-SMA را تسهیل کند و بیان CD31 را در مقایسه با HRGEC های ترانسفکت شده با shNC تقلا کند. در مقابل، هنگامی که ATG16L در HRGEC ها بیش از حد بیان شد، پیشرفت EndMT به طور قابل توجهی ارتقاء نمی یابد (شکل 4E). نتایج رنگ‌آمیزی IHC نیز روند WB را برای عبارات CD31 و a-SMA در HRGEC تأیید کرد (شکل 4F).

تغییرات فیبروز بینابینی کلیوی، پروتئین ادرار، عملکرد کلیه و افزایش وابسته به زمان EndMT در مدل رد مزمن موش صحرایی

در مرحله بعد، ما تغییرات فیبروز بینابینی کلیه، پروتئین ادرار، عملکرد کلیه و EndMT را در داخل بدن بررسی کردیم. مدل‌های رد مزمن پیوند کلیه موش با پیوند کلیه از موش‌های F344 به موش‌های لوئیس ایجاد شد. آلوگرافت کلیه در هفته های 8، 12 و 16 پس از پیوند کلیه گرفته شد. رنگ‌آمیزی HE و رنگ‌آمیزی ماسون درجات مختلفی از انفیلتراسیون سلول‌های التهابی، گلومرولواسکلروز، آتروفی لوله‌ای و فیبروز بینابینی را پس از پیوند کلیه نشان داد. نتایج رنگ‌آمیزی ماسون همچنین مقدار زیادی از رشته‌های کلاژن آبی رنگ شده در بینابینی گلومرولی و کلیوی را در هفته‌های 8، 12، 16 پس از پیوند کلیه در مقایسه با گروه syn نشان داد (شکل‌های 5A-C). به منظور آزمایش عملکرد کلیه موش‌ها با پیوند آلوژنیک، کلیه‌های راست بومی در طول پیوند کلیه خارج شدند. چهار هفته پس از برداشتن کلیه راست، پروتئین ادرار 24 ساعته و عملکرد کلیه از جمله کراتینین سرم و BUN تا زمان مرگ به تدریج در همه گروه ها بدتر شد (شکل 5D). نتایج سنجش IHC بیان‌های بالای FN و a-SMA را نشان داد در حالی که بیان CD31 در همه گروه‌ها در 16 هفته کاهش یافت (شکل 5E). سنجش وسترن بلات، نتایج سنجش ایمونوهیستوشیمی را تایید کرد و نشان داد که پیشرفت EndMT با افزایش زمان پس از پیوند کلیه تشدید می‌شود (شکل 5F).

FIGURE 3 | Autophagy, MAP1LC3 expression and prognosis relationship in CAD patients. (A) Representative TEM images of autophagic vacuoles (red double arrow) were shown in glomerulus cells from normal, non-CAD and CAD patients (n=4) (scale bar: 10 mm and 500 mm).

پیوند کلیه، اتوفاژی را فعال کرد اما شار اتوفاژیک را مختل کرد در مرحله آخر مدل موش رد مزمن

LC3، که یک نشانگر تعریف شده برای اتوفاژی در نظر گرفته می شود، برای تشکیل اتوفاگوزوم و فعال سازی شار اتوفاژیک حیاتی است. ویروس مرتبط با آدنو (AAV) -mRFP-GFP-LC3 به صورت استریوتاکتیکی به آلوگرافت کلیه موش در داخل بدن تزریق شد. ما یک مدل mRFP-GFP-LC3 به منظور نظارت بر فعالیت اتوفاژیک در پیوند کلیه ایجاد می کنیم. AAV-mRFP-GFP-LC3 معمولاً برای نظارت بر شار اتوفاژیک در داخل بدن استفاده می شود. سیگنال GFP نسبت به mRFP حساسیت بیشتری به شرایط اسیدی لومن لیزوزومی دارد. بنابراین، اتوفاگوزوم‌ها فلورسانس زرد را به‌دلیل هم‌مکانی فلورسانس GFP و mRFP نشان دادند و اتولیزوزوم‌ها فلورسانس قرمز را نشان دادند. افزایش فلورسانس قرمز نشان دهنده تجمع اتولیزوزوم ها و فعال شدن اتوفاژی در کلیه است. مناطق مثبت فلورسانس قرمز به طور قابل توجهی در هفته های 4، 8، 12 و 16 در گروه آلو در مقایسه با گروه syn افزایش یافت. با این حال، نقطه قرمز پس از رسیدن به اوج در هفته های 8 و 12 به سرعت ضعیف شد. تغییرات در سطح اتوفاژی عمدتاً در رگ‌های کوچک گلومرولی و محیطی مشاهده شد تا در لوله‌های دیستال یا مجرای جمع‌آوری (شکل‌های 6A, B). این نتایج نشان داد که اتوفاژی در مراحل اولیه پیوند کلیه فعال شد اما در مراحل پایانی فعال نشد و پاکسازی اتوفاگوزوم پس از حدود 8 هفته مختل شد. سنجش ایمونوهیستوشیمی نشان داد که بیان ATG16L در 8 هفته بیشتر از 16 هفته بود (شکل 6C). نتایج وسترن بلات همچنین نشان داد که سطوح LC{26}}II و ATG16L در 8 هفته به اوج خود رسید و سپس به تدریج تا هفته 16 در کلیه های آلوگرافت موش پس از پیوند کاهش یافت (شکل 6D).

FIGURE 4 | Effects on autophagy and progression of EndMT in HRGECs after knockdown of ATG16L. (A) Representative TEM images of autophagic vacuoles (red arrow) were shown in shNC group and shATG16L group (n=5) (scale bar: 10 mm, 2 mm and 500 mm).

مسیر NF-kB پس از از بین رفتن بیان ATG16L EndMT فعال و تبلیغ شد

با توجه به ارتباط بین کاهش ATG16L و EndMT در یک مدل رد مزمن موش صحرایی و بیماری CAD، ما فرض کردیم که از دست دادن ATG16L می تواند مستقیماً به پیشرفت EndMT منجر شود. برای بررسی بیشتر مکانیسم بالقوه ای که توسط آن این پیشرفت رخ می دهد، ما ابتدا توالی یابی کل رونوشت (RNA-seq) را در HRGEC با ShNC یا ShATG16L انجام دادیم. در مجموع 453 ژن دیفرانسیل (DEGs) بین دو گروه به دست آمد. در میان آنها، 358 درجه درجه حرارت بالا تنظیم شد و 95 درجه پایین تنظیم شدند (شکل 7A). سپس 20 مسیر به طور قابل توجهی با غنی سازی KEGG انتخاب شد. ما دریافتیم که مسیر NF-kB یکی از مسیرهایی است که به طور قابل توجهی فعال شده است (شکل 7B). دگرگونی ژن های مسیر NF-kB نیز با تجزیه و تحلیل غنی سازی مجموعه ژن (GSEA) تایید شد (شکل 7C).

NF-kB یکی از فاکتورهای رونویسی حیاتی برای مسیرهای سیگنالینگ التهابی است و NF-kB با فعال شدن از سیتوپلاسم به هسته منتقل می شود. به منظور تأیید فعال‌سازی NF-kB و جابه‌جایی هسته‌ای، سنجش رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس را با استفاده از آنتی‌بادی ضد p65 انجام دادیم و متوجه شدیم که p65 و رنگ هسته‌ای کلوکالیزه شده‌اند که نشان‌دهنده جابه‌جایی هسته‌ای است (شکل 7D). علاوه بر این، ما دریافتیم که QNZ، یک مهارکننده مسیر سیگنالینگ NF-kB، به طور قابل توجهی بیان NF-kB را در هسته مهار می‌کند و بیان پروتئین‌های مرتبط با EndMT ناشی از شکست ATG16L را معکوس می‌کند (شکل 7E).

سنجش WB همچنین برای تأیید مکانیسم خاص فعال‌سازی مسیر NF-kB انجام شد. ما اندازه‌گیری p65 (کل NF-kB) و p-p65 (NF-kB فسفریله) را در HRGEC شناسایی کردیم. نتایج WB نشان داد که سطح p65 در گروه ShATG16L در مقایسه با گروه ShNC افزایش یافته بود، در حالی که p-p65 روند افزایشی مشابهی را دنبال کرد (شکل 7F). افزایش سطح p-p65 در HRGEC ها پس از کوبیدن ATG16L با افزایش بیان پروتئین کل p65 همراه بود که احتمالاً تأثیر اضافی بر بیان p65 در HRGEC ها را منعکس می کرد. برای تشخیص اینکه آیا تثبیت NF-kB به دلیل کاهش تخریب یا افزایش سنتز است، مهارکننده سنتز پروتئین سیکلوهگزیماید (CHX) به سلول ها اضافه شد تا سنتز پروتئین را مهار کند و سطح پروتئین NF-kB مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج وسترن بلات نشان داد که بیان مداوم پروتئین p65 در حضور CHX وجود دارد (شکل 7G). در همین حال، سطوح mRNA NF-kB هنوز به طور قابل توجهی توسط ShATG16L تغییر نکرده است. داده های کمی برای سطوح mRNA NF-kB به صورت گرافیکی در شکل 7H نشان داده شده است. این نشان می‌دهد که انتقال هسته‌ای NF-kB به دلیل کاهش تخریب است، نه افزایش سنتز پس از نابودی ATG16L در HRGEC. برای تأیید بیشتر بیان NF-kB در بافت انسانی، ما یک روش رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس را بر روی بافت‌های آلوگرافت کلیوی انسانی انجام دادیم و سطح بیان p65 افزایش قابل‌توجهی در آلوگرافت‌های کلیوی بیمار CAD پیدا کردیم (شکل 7I, J).

FIGURE 5 | Changes of renal interstitial fibrosis, urine protein, renal function and EndMT in chronic rejection rat model. (A) Representative images of HE and Masson's trichrome staining from kidney tissues of syn and allo groups (scale bar: 25 mm).

ترشح سیتوکین‌های ناشی از فعال‌سازی مسیر NF-kB، از جمله IL-1b، IL-6 و TNF-a می‌توانند پیشرفت EndMT را در HRGECs تحریک کنند.

سیگنالینگ NF-kB یک تنظیم کننده اصلی پاسخ التهابی است. سپس عوامل محلول مسئول EndMT ناشی از shATG16L را توسط RT-PCR بررسی کردیم. در میان چندین سایتوکاین که به نقص اتوفاژی و پاسخ التهابی مربوط می‌شوند، IL{4}b، IL{5}} و TNF-a، عوامل التهابی معمولی پایین‌دستی ناشی از مسیر NF-kB، به‌طور قابل‌توجهی بودند. در مقایسه با HRGEC های ترانسفکت شده با shNC در طول اختلال در فعالیت اتوفاژی افزایش می یابد (شکل 8A). این با یافته های قبلی ما در مورد عوامل التهابی مانند TNF-a و افزایش سرم موش با رد مزمن مطابقت دارد (27).

برای بررسی پاتوژنز EndMT تحریک شده توسط IL{{0}}b، IL-6 و TNF-a، ما HRGEC ها را با غلظت های مختلف IL-1b ({{{{ 7}}~20 نانوگرم در میلی لیتر)، IL{6}} (0~200 نانوگرم در میلی لیتر) و


TNF-a ({0}}~20 نانوگرم در میلی لیتر) به مدت 24 ساعت. همه IL-1b، IL-6 و TNF-a می‌توانند سطح پروتئین FN و a-SMA را با کاهش وابسته به دوز نشانگرهای سلول‌های اندوتلیال CD31 به طور همزمان تنظیم کنند. این اثرات زمانی به اوج خود رسید که HRGEC ها به ترتیب با 10 نانوگرم در میلی لیتر IL-1b، 200 نانوگرم در میلی لیتر IL{11}} یا 10 نانوگرم در میلی لیتر TNF-a درمان شدند (شکل 8B). آزمایش‌های وابستگی زمانی نیز برای تأیید عبارات مرتبط EndMT انجام شد. همانطور که در شکل 8B نشان داده شده است، درمان IL{15}}b، IL-6 یا TNF-a به مدت 0 تا 48 ساعت می تواند به طور قابل ملاحظه ای عبارات FN و a-SMA را القا کند و منجر به از دست دادن CD31 در HRGEC ها شود. زمان تحریک افزایش می یابد برای آزمایش اثرات IL-1b، IL-6، و TNF-a بر روی EndMT، درمان Anakinra، Tocilizumab و Infliximab هنگام از بین بردن ATG16L آغاز شد. آناکینرا آنتاگونیست گیرنده اینترلوکین{26}} (IL{27}}R) است. توسیلیزوماب یک آنتی بادی خنثی کننده IL-6R است که مانع از اتصال IL-6 به IL{30}}R می‌شود. Infliximab یک آنتی بادی IgG1 مونوکلونال است که به طور خاص به TNF-a متصل می شود و یک مهارکننده TNF-a است که با موفقیت در مدیریت بیماری التهابی روده استفاده شده است. نتایج WB نشان داد که Anakinra و Infliximab می توانند EndMT را بارزتر کاهش دهند (شکل 8C). این نتایج نشان داد که از دست دادن ATG16L نه تنها باعث کاهش فعالیت اتوفاژی می شود، بلکه ترشح سایتوکاین های التهابی IL{36}}b، IL{37}} و TNF-a را با سرکوب تخریب p65 برای فعال کردن NF- افزایش می دهد. مسیر کیلوبایت (شکل 8D).

FIGURE 6 | Changes of autophagy activity in chronic rejection rat models. (A) Representative images of cortical kidney sections obtained from syn and different periods after kidney transplanted rats injected with AAV-mRFP-GFP-LC3.

بحث

در این مطالعه حاضر، ما نشان دادیم که پیوند کلیه شار اتوفاژیک را مختل می کند، که با افزایش پاسخ التهابی، EndMT و شدت فیبروز بینابینی آلوگرافت کلیوی همراه بود. اگرچه فعالیت اتوفاژیک به طور موقت در مراحل اولیه پیوند آلوگرافت افزایش یافت، اما به دلیل از دست دادن ATG16L به تدریج کاهش یافت. اتوفاژی وابسته به ATG16L، به عنوان یک فرآیند محافظ سلولی، می تواند فیبروز بینابینی کلیه پیوندی را از طریق تنظیم EndMT ناشی از IL{3}}b، IL{4}} و TNF-a کاهش دهد. تا جایی که ما می دانیم، این اولین مطالعه ای است که نقش و تغییر پویای شار اتوفاژیک در پیوند کلیه را روشن می کند. در این مطالعه، ما همچنین جزئیات پاتوفیزیولوژیک مولکولی را بررسی کردیم که در روشی که در آن اختلال شار اتوفاژیک منجر به EndMT و فیبروز بینابینی آلوگرافت کلیه می شود، بررسی شد.

FIGURE 7 | NF-kB pathway activation and effect on EndMT in HRGECs after knockdown of ATG16L (A) The RNA sequencing results of differential genes in HRGECs transfected with shNC or shATG16L were plotted by volcano plot.

اگرچه بسیاری از انواع تحقیقات گزارش کرده اند که اتوفاژی در شکل گیری و پیشرفت فیبروز بینابینی کلیوی دخیل است، ARGها به طور جامع برای بررسی ارزش بالینی آنها در پیشرفت رد مزمن پیوند کلیه تجزیه و تحلیل نشده اند. صدها پروتئین با فرآیند اتوفاژی مرتبط هستند. با توجه به اهمیت اتوفاژی در پیوند کلیه، منطقی است که حدس بزنیم که ARG ها در پیش بینی پیش آگهی و اهداف درمانی بسیار نویدبخش هستند. به منظور کشف فاکتورهای پاتوژنتیک اصلی CAD، ما بیان mRNA 149 ARG را در گروه GSE9493 بررسی کردیم و 14 ARG را که بیشتر با اتوفاژی بین بیماران CAD و غیر CAD مرتبط بودند، به طور قاطع تجزیه و تحلیل کردیم. در میان ARGهای تنظیم‌شده در گروه CAD، ژن‌های تنظیم‌کننده منفی اتوفاژی، مانند Raptor و MAPK3 (28، 29)، در گروه CAD کاهش یافتند. از سوی دیگر، ATG16L به عنوان یک ARG با تنظیم بالا، داربستی برای لیپیداسیون LC3 با محلی سازی پویا در غشاهای منبع احتمالی و ترویج تشکیل واکوئل اتوفاژیک بود (30). با این حال، برخی از مطالعات نشان داده اند که ATG16L برای ازدیاد طول غشای جداسازی مورد نیاز نیست (23). از این رو، ارتباط بین نقش مستقل یا وابسته به اتوفاژی ATG16L و EndMT مورد مطالعه قرار گرفت.

برای بررسی ارتباط بین ATG16L، اتوفاژی، و EndMT در کلیه‌های پیوندی، ما ATG16L را توسط shRNA در HRGECs نابود کردیم. یافته‌های ما نشان داد که shATG16L می‌تواند سطوح اتوفاژی را کاهش داده و EndMT را القا کند. به طور مشابه، تحقیقات in vivo و نمونه‌های بالینی نیز نشان دادند که فعال شدن ATG16L و شار اتوفاژیک در مراحل اولیه پیوند کلیه، شار اتوفاژیک در محدوده دینامیکی با افزایش تغییرات فیبروتیک کاهش می‌یابد. می توان نتیجه گرفت که دلیل پیشرفت EndMT احتمالاً به دلیل کاهش شار اتوفاژیک است و اتوفاژی وابسته به ATG16L نقش محافظتی در پیشرفت EndMT و فیبروز بینابینی پیوند کلیه دارد. با این حال، برخی از یافته‌ها نشان داد که اتوفاژی ناشی از راپامایسین منجر به فعال‌سازی EndMT در HCAEC‌ها در شرایط بدون اکسیژن می‌شود (22). به نظر می رسد که اینها با نتایج ما متفاوت است. ما در نظر داریم که نقش اتوفاژی ممکن است در انواع مختلف سلول متفاوت باشد. این می تواند به بافت سلولی و عوامل نظارتی بالادست وابسته باشد. با توجه به اینکه اتوفاژی وابسته به ATG16L وسیله ای برای محافظت از خود در هنگام بروز EndMT در CAD است، تعیین مکانیسم خاص EndMT ناشی از shATG16L معنادار است.

FIGURE 8 | Cytokines induced by NF-kB pathway activation and effects on progression of EndMT in HRGECs. (A) The graphs of the results of mRNA abundance of IL-1b, IL-6 or TNF‐a after knocking down ATG16L with or without QNZ. (n = 5, ***P < 0.001, **P < 0.01, vs. the shNC group, Student t test.) (B) Representative western blotting results of the expressions of FN, CD31, a-SMA and GAPDH in HRGECs after IL-1b, IL-6 or TNF-a treatment for different times or dosage. (n=5) (C) Representative western blot results of FN, CD31, a-SMA and GAPDH expressions treated with or without Anakinra, Tocilizumab and Infliximab in HRGECs transfected with shATG16L or not. (n=5) (D) A model is proposed to illustrate the mechanisms involved in EndMT induced by loss of ATG16L in the pathogenesis of CAD and transplanted renal interstitial fibrosis.

ما توالی یابی نسل بعدی را از گروه ATG16L knockdown و گروه کنترل در HRGEC انجام دادیم. مسیرهای KEGG و تجزیه و تحلیل GSEA نشان داد که مسیر NF-kB یکی از غنی‌ترین مسیرها بود. NF-kB به طور معمول به IkB متصل می شود که NF-kB را در سیتوپلاسم تثبیت می کند. هنگامی که مسیر NF-kB فعال می شود، هترودایمر NF-kB p65 به هسته منتقل می شود و به پروموتر خاص آن متصل می شود (31). یکی از مسیرهای متعارف (کلاسیک) برای انتقال هسته ای NF-kB، فسفوریلاسیون p65 است. با این حال، افزایش تعداد مسیرهای غیر متعارف در بیماری های مختلف گزارش شده است. همچنین گزارش شده است که اتوفاژی انتخابی با واسطه p62/SQSTM سرکوب شده می‌تواند تخریب لیزوزومی مسیر NF-kB را کاهش دهد (32)، نقص اتوفاژی همچنین به دلیل بیان پایدار SQSTM1 منجر به فعال‌سازی NF-kB می‌شود، که به نوبه خود باعث افزایش تومورزایی در مدل های موش (33). در مطالعه ما، افزایش سطح پروتئین p65 و p-p65 را مشاهده کردیم در حالی که سطوح mRNA بدون تغییر بود. در حضور یک مهارکننده سنتز پروتئین CHX، تجمع پروتئین p65 در مقایسه با عدم وجود مهارکننده همچنان ادامه دارد. بنابراین، ما حدس زدیم که فعال سازی NF-kB ناشی از نابودی ATG16L ناشی از کاهش تخریب پروتئین است و این فرآیند ممکن است سرکوب تخریب وابسته به اتوفاژیک باشد.

التهاب ها به شدت با پیامدهای مهم پیوند کلیه در سطوح بالینی و درمانی مرتبط هستند (34). NF-kB p65 مهمترین عامل رونویسی در تنظیم فاکتورهای التهابی سلولی است. در این مطالعه، ما همچنین دریافتیم که ATG16L باعث افزایش سیتوکین IL-1b، IL-6 و TNF-a از طریق مسیر NF-kB می‌شود. این یافته و سایر یافته‌ها با بسیاری از مطالعات دیگر مانند مطالعاتی که به این نتیجه رسیدند که از دست دادن ATG16L باعث افزایش تولید IL{10}b ناشی از اندوتوکسین می‌شود (35) و TNFAIP3/A20 به ATG16L1 متصل می‌شود تا پاسخ اتوفاژیک NF-kB را کنترل کند. فعال سازی (36). علاوه بر این، نقش سایتوکین های التهابی در EndMT در برخی از مطالعات قبلی گزارش شده است. با این وجود، این احتمال وجود دارد که این سیتوکین های التهابی بسته به آسیب شناسی زمینه ای و سطوح محیطی آن نقش متنوعی ایفا کنند. در یک مدل موش چاقی ناشی از رژیم غذایی، کمبود اتوفاژی اندوتلیال باعث القای IL{19}} EndMT وابسته (37) شد. در بیماری کلسیفیکاسیون عروقی، IL{21}b و TNF-a EndMT را در سلول های اندوتلیال اولیه آئورت انسان القا کردند (38). نتایج ما IL-1b، IL{25}} و TNF-a را به عنوان سیتوکین های التهابی EndMT در محیط های پاتولوژیک CAD غربال و شناسایی کرد. در ادامه، روابط متقابل بین از دست دادن ATG16L و سایتوکاین‌های التهابی برای تأکید بر اهداف درمانی احتمالی برای کنترل از دست دادن ATG16L در پیشرفت CAD مورد بررسی قرار گرفت.

تحقیق ما محدودیت های متعددی دارد. اعتبار سنجی فعلی اثرات ATG16L بر EndMT و پیشرفت فیبروز فقط در یک مدل رده سلولی حذفی انجام شد، پیچیدگی تغییرات اتوفاژی در داخل بدن و در توسعه CAD به سختی قابل تقلید است و بر نیاز به موش‌های حذفی شرطی ATG16L اندوتلیال تأکید می‌کند. . ما مدل پیوند کلیه موش ATG16L را برای مطالعه مکانیسم بیشتر ایجاد خواهیم کرد. نتایج ما نشان داد که از دست دادن ATG16L و اتوفاژی EndMT را ترویج می‌کند، QNZ فعال‌سازی NF-kB را مهار می‌کند و IL{5}}b، آنتی‌بادی مونوکلونال با گیرنده‌های خاص مخالفت می‌کند و در نتیجه فرآیند فیبروتیک آلوگرافت را کند می‌کند، اما نمی‌تواند به طور کامل انجام شود. این نتیجه را معکوس کند. اینکه آیا مکانیسم های دیگر نقش مشابهی را ایفا می کنند ناشناخته باقی مانده است. علاوه بر این، علاوه بر سلول های اندوتلیال، منبع میوفیبروبلاست ها از سلول های مختلفی از جمله اپیتلیال، فیبروبلاست ها و پری سیت ها تشکیل شده است (39). اینکه آیا از دست دادن ATG16L و کمبود اتوفاژی بر این سلول ها تأثیر می گذارد یا خیر هنوز قطعی نیست.

در نتیجه، مطالعات فعلی ثابت کردند که از بین بردن ATG16L برای اختلال در شار اتوفاژیک و تشکیل EndMT ناشی از IL-1b، IL{2}} و TNF-a در پیشرفت فیبروز بینابینی کلیوی پیوندی حیاتی است. . این تابع توسط NF-kB کاهش تخریب و فعال شدن مسیر واسطه شد. به طور خلاصه، نتایج مطالعه ما بینش جدیدی را در مورد رابطه دینامیکی شار اتوفاژیک و EndMT ارائه می دهد. جلوگیری از از دست دادن ATG16L و مهار شار اتوفاژی می تواند گزینه جدیدی برای درمان و پیشگیری از پیشرفت فیبروز بینابینی کلیه و CAD در گیرندگان پیوند کلیه باشد.

Cistanche to treat kidney disease

ساقه سیستانچ از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید


بیانیه در دسترس بودن داده ها

داده های خام حمایت کننده از نتیجه گیری این مقاله توسط نویسندگان، بدون رزرو بی مورد در دسترس قرار خواهد گرفت.

بیانیه اخلاق

مطالعات مربوط به شرکت کنندگان انسانی توسط کمیته اخلاق محلی اولین بیمارستان وابسته دانشگاه پزشکی نانجینگ بررسی و تایید شد. بیماران/شرکت کنندگان رضایت کتبی آگاهانه خود را برای شرکت در این مطالعه ارائه کردند. مطالعه حیوانی توسط کمیته اخلاق محلی اولین بیمارستان وابسته دانشگاه پزشکی نانجینگ بررسی و تایید شد. رضایت کتبی آگاهانه از مالکان برای شرکت حیوانات آنها در این مطالعه اخذ شد.

مشارکت های نویسنده

RT و MG بر این پروژه نظارت و تصور کردند. ZG، CS و ZW بیشتر آزمایش‌ها را طراحی و اجرا کردند. MZ و SF نمونه های موش را جمع آوری کردند. LS، HC، ZH، JT، XJ، و HY داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. ZG و ZW ارقام را ایجاد کردند. ZG و RT مقاله را پیش نویس و اصلاح کردند. همه نویسندگان به مقاله کمک کردند و نسخه ارسال شده را تایید کردند.


منابع مالی

این کار توسط بنیاد ملی علوم طبیعی چین پشتیبانی شده است [شماره های کمک مالی 82070769، 81870512، 81770751، 81570676، 81470981، 81100532].


منابع

1. Carney EF. پیوند: مزیت بقای پذیرش کلیه اهداکننده متوفی دیابتی. Nat Rev Nephrol (2017) 13(8):444. DOI: 10.1038/nrneph.2017.88

2. الحسینی ع، عقیل ع، رامیرز ج، ساوایا ب، راجاگوپالان ن، باز م، و همکاران. نتیجه پیوند کلیه در پیوند اعضای جامد اولیه، تکراری و کلیه پس از غیرکلیوی: تجزیه و تحلیل سال 15- پایگاه داده اخیر UNOS. پیوند کلین (2017) 31 (11). DOI: 10.1111/ctr.13108

3. Schinstock CA، Stegall M، Cosio F. بینش های جدید در مورد رد مزمن با واسطه آنتی بادی و پیشرفت آن به گلومرولوپاتی پیوند. Curr Opin Nephrol Hypertens (2014) 23 (6): 611-8. doi: 10.1097/MNH. 0000000000000070

4. گلدبرگ RJ، Weng FL، Kandula P. اختلال حاد و مزمن آلوگرافت در گیرندگان پیوند کلیه. Med Clin North Am (2016) 100 (3): 487-503. doi: 10.1016/j.mcna.2016.01.002

5. وانگ زی، هان زی، تائو جی، وانگ جی، لیو ایکس، ژو دبلیو و همکاران. نقش انتقال اندوتلیال به مزانشیمی ناشی از TGF-beta1 در فیبروز بینابینی کلیه پیوندی. J Cell Mol Med (2017) 21 (10): 2359-69. doi: 10.1111/ jump.13157

6. An C، Jia L، Wen J، Wang Y. هدف قرار دادن فیبروبلاست های مشتق از مغز استخوان برای فیبروز کلیه. Adv Exp Med Biol (2019) 1165:305–22. doi: 10.1007/{8}}

7. Cruz-Solbes AS، Youker K. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی (EMT) و انتقال اندوتلیال به مزانشیمی (EndMT): نقش و پیامدها در فیبروز کلیه. نتایج Probl Cell Differ (2017) 60:345-72. doi: 10.1007/{8}}

8. Yang J، Antin P، Berx G، Blanpain C، Brabletz T، Bronner M، و همکاران. دستورالعمل ها و تعاریف برای تحقیق در مورد انتقال اپیتلیال - مزانشیمی Nat Rev Mol Cell Biol (2020) 21 (6): 341-52. doi: 10.1038/s41580-020-0237-9

9. Zeisberg EM، Potenta SE، Sugimoto H، Zeisberg M، Kalluri R. فیبروبلاست ها در فیبروز کلیه از طریق انتقال اندوتلیال به مزانشیمی ظاهر می شوند. J Am Soc Nephrol (2008) 19(12):2282-7. doi: 10.1681/ASN.2008050513

10. دی گرگوریو جی، روبوفو آی، اسپالتا اس، جیامبوزی جی، دی یولیس وی، تونیاتو ای، و همکاران. انتقال اپیتلیال به مزانشیمی به عنوان یک هدف درمانی احتمالی در اختلالات فیبروتیک Front Cell Dev Biol (2020) 8:607483. doi: 10.3389/ fell.2020.607483

11. کاردینال اچ، دیود ام، هبرت ام جی. اختلال عملکرد اندوتلیال در پیوند کلیه Front Immunol (2018) 9:1130. DOI: 10.3389/fimmu.2018. 01130

12. Zhao Y، Cooper DKC، Wang H، Chen P، He C، Cai Z، و همکاران. نقش پاتولوژیک بالقوه سیتوکین های پیش التهابی (IL{2}}، TNF-α، و IL{4}}) در پیوند خارجی. Xenotransplantation (2019) 26(3):e12502. doi: 10.1111/Xen.12502

13. Zhao C، Xu Z، Wang Z، Suo C، Tao J، Han Z، و همکاران. نقش فاکتور نکروز تومور آلفا در انتقال اپیتلیال به مزانشیمی در سلول‌های کلیه پیوندی در گیرندگان مبتلا به اختلال عملکرد مزمن آلوگرافت. ژن (2018) 642:483-90. DOI: 10.1016/j.gene.2017.11.059

14. Zhang B، Niu W، Dong HY، Liu ML، Luo Y، Li ZC. هیپوکسی باعث انتقال مزانشیمی اندوتلیال در بازسازی عروق ریوی می شود. Int J Mol Med (2018) 42 (1): 270–8. doi: 10.3892/ijmm.2018.3584

15. Li J، Zhang Q، Ren C، Wu X، Zhang Y، Bai X، و همکاران. اولتراسوند پالسی با شدت کم از انتقال اندوتلیال-مزانشیمی ناشی از استرس اکسیداتیو در سلول های اندوتلیال آئورت انسان جلوگیری می کند. Cell Physiol Biochem (2018) 45 (4): 1350-65. doi: 10.1159/000487561

16. Guan Q، Nguan CY، Du C. بیان فاکتور رشد تبدیل کننده-بتا1 آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد کلیه را محدود می کند. پیوند (2{11}}10) 89(11):1320– 7. doi: 10.1097/TP.0b013e3181d8e9dc

17. لوین بی، کرومر جی. عملکردهای بیولوژیکی ژنهای اتوفاژی: دیدگاه بیماری. Cell (2019) 176 (1-2): 11–42. DOI: 10.1016/j.cell.2018.09.048

18. De Rechter S، Decuypere JP، Ivanova E، Van den Heuvel LP، De Smedt H،

Levtchenko E، و همکاران. اتوفاژی در بیماری های کلیوی Pediatr Nephrol (2016) 31 (5): 737-52. doi: 10.1007/s00467-015-3134-2

19. Li H، Peng X، Wang Y، Cao S، Xiong L، Fan J، و همکاران. کمبود اتوفاژی با واسطه Atg در لوله های پروگزیمال باعث توقف چرخه سلولی G2/M و فیبروز کلیه می شود. اتوفاژی (2016) 12(9):1472-86. doi: 10.1080/ 15548627.2016.1190071

Baisantry A، Bhayana S، Rong S، Ermeling E، Wrede C، Hermann J، و همکاران. اتوفاژی باعث ایجاد تغییرات پیشانی در بخش های S3 لوله پروگزیمال می شود. J Am Soc Nephrol (2016) 27 (6): 1609-16. doi: 10.1681/ASN.2014111059


شما نیز ممکن است دوست داشته باشید