در سیلیکون تجزیه و تحلیل پپتید زهر پارازیتوئید مگس سرکه شیوع موتیف کاتیون-قطبی-کاتیون در پروتئین های گره 2 را نشان می دهد

2.6. یک گیره CPC نیز در پپتید ضد میکروبی دروسومایسین وجود دارد

برخلاف LhKNOT، ساختار دروسومایسین شامل یک چین متفاوت با یک مارپیچ آلفا و یک ورقه بتا سه رشته ای پیچ خورده است که توسط سه پل دی سولفیدی تثبیت می شود [43]. این موتیف ساختاری، که "موتیف تثبیت شده با سیستئین" نامیده می شود، همچنین در سایر پروتئین های دفاع میزبان مانند حشره ضد باکتری دیفنسین A، سموم عقرب، تیونین های گیاهی و دفنسین های گیاهی ضد قارچی یافت می شود [43،44].

هلیکس یک پلی پپتید با فعالیت بیولوژیکی بالا است که می تواند سیستم ایمنی بدن انسان را فعال کرده و ایمنی انسان را تقویت کند و در نتیجه از بیماری های مختلف پیشگیری و درمان کند. مطالعات نشان داده است که هلیکس دارای اثر بهبود عملکرد سیستم ایمنی است، می تواند توانایی فاگوسیتیزی ماکروفاژها و فعالیت سلول های T را تا حد زیادی بهبود بخشد، مقاومت بدن را در برابر میکروارگانیسم های بیماری زا خارجی افزایش دهد، حساسیت بدن به محیط های نامطلوب را کاهش دهد و سلامت را ارتقا بخشد.

ایمنی برای سلامت انسان بسیار مهم است. می تواند به ما در مقاومت در برابر بیماری های مختلف، حفظ آمادگی جسمانی و افزایش مقاومت در برابر بیماری کمک کند. با این حال، مردم در محیطی پر از قرار گرفتن در معرض عوامل بیماری زا و آلودگی های محیطی زندگی می کنند و ایمنی به راحتی تحت تأثیر قرار می گیرد. بنابراین، تقویت ایمنی برای حفظ سلامت انسان بسیار ضروری است.

هلیکس به عنوان یک پپتید فعال طبیعی نه تنها می تواند سیستم ایمنی بدن را تنظیم کند و ایمنی را بهبود بخشد، بلکه نقش خوبی در پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی و اختلالات متابولیک، بهبود عملکرد کبد، کاهش چربی خون و قند خون و بهبود قدرت بدنی و ضد بیماری ایفا می کند. -توانایی خستگی از این رو -helix در زمینه های پزشکی، محصولات بهداشتی و آرایشی و بهداشتی به طور گسترده مورد استفاده قرار گرفته است، اثرات قابل توجهی به دست آورده است و به گرمی مورد استقبال قرار گرفته است.

به طور خلاصه، هلیکس ارتباط نزدیکی با ایمنی انسان دارد، می تواند ایمنی انسان را تحریک کند و نقش مهمی در تضمین سلامت و طول عمر انسان دارد. در زندگی و کار آینده، ما باید بطور فعال ایمنی را تقویت کنیم، عادات زندگی را بهبود بخشیم، ورزش و رژیم غذایی را به درستی تنظیم کنیم، استفاده از -helix را برای بهبود ایمنی در نظر بگیریم، و فعالانه‌تر با چالش‌ها و فرصت‌های آینده روبرو شویم. می توان دید که ما باید ایمنی را تقویت کنیم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد زیرا پلی ساکاریدهای موجود در سیستانچ می توانند پاسخ ایمنی سیستم ایمنی بدن انسان را تنظیم کنند، توانایی استرس سلول های ایمنی را بهبود بخشند و اثر باکتری کشی سلول های ایمنی را افزایش دهند.

روی مکمل cistanche deserticola کلیک کنید

با توجه به عملکرد ضد میکروبی شناخته شده دروسومایسین و "موتیف تثبیت شده با سیستئین" [43،44] مربوط به آن، ما امکان یک مبنای مشترک برای فعالیت ضد میکروبی و روابط ساختار-عملکرد مشترک با LhKNOT را برای درک بهتر اهمیت بالقوه این موتیف بررسی کردیم. در LhKNOT در زمینه دفاع میزبان.

علیرغم یک چین ساختاری کمی متفاوت، Drosomycin در RMSD 2.2A از LhKNOT و pB1 همپوشانی دارد (شکل 5A). هنگامی که آنالیز کلیپ CPC قبلی به دروسومایسین گسترش یافت، نتایج حضور موتیف کلیپ CPC را در دروسومایسین نیز نشان داد. موتیف کلیپ CPC در دروسومایسین (R{4}}S4-K38) در یک انحراف 2Å از پارامترهای موتیف قرار می‌گیرد (شکل 5B، جدول تکمیلی S5).

علاوه بر این، الکترواستاتیک سطحی دروسومایسین، تشکیل یک محفظه اتصال کاتیونی در گیره CPC فرضی را تایید کرد، همانطور که برای LhKNOT و سایر گره ها نیز مشاهده شد (شکل 5C، جدول تکمیلی S5).

این نتایج نشان می دهد که ممکن است شباهتی در نحوه عملکرد Drosomycin و LhKNOT وجود داشته باشد و بیوشیمی تعبیه شده در این موتیف ساختاری ممکن است عملکرد ضد میکروبی را در هر دو پپتید ایجاد کند.

شکل 5. (الف) انطباق LhKNOT (آبی)، پپتید التیام دهنده زخم Pereskia bleo (برنزه، pB1؛ کاکتوس؛ PDB: 5XBD) و دروسومایسین (سبز؛ دروسومایسین؛ مگس؛ PDB: 1MYN). (ب) فواصل اندازه‌گیری شده در PyMOL بین مراکز جرم باقی‌مانده‌های شرکت‌کننده (شبه اتم‌های خاکستری) در تعامل Drosomycin-heparin. فاصله ها در 2Å از محدوده مقدار موتیف کلیپ CPC قرار می گیرند. (C) الکترواستاتیک سطحی دروسومایسین (مگس؛ PDB: 1MYN)، که سطح اتصال با بار مثبت تشکیل شده توسط گیره CPC را نشان می دهد که هپارین در آن لنگر انداخته است. پتانسیل های الکترواستاتیک سطحی از 4-kT/e (قرمز) تا به اضافه 4 kT/e (آبی) درجه بندی رنگی می شوند.

3. بحث و گمان

عملکردهای بیوشیمیایی پروتئین ها توسط ساختار کلی آنها تسهیل می شود، که طبق گزارش ها 3 تا 10 برابر بیشتر از ساختارهای اولیه آنها محافظت شده است [45]. در نتیجه، هم‌ترازی‌های توالی اغلب در بررسی پتانسیل عملکردی پروتئین‌هایی مانند گره کوتاه می‌شوند، جایی که ساختارهای اولیه متنوع ممکن است روابط ساختار-عملکرد مشترک را مبهم کنند.

در روش‌های سیلیکو، تحلیل گسترده همبستگی‌های ساختار-عملکرد بالقوه برای چنین چین‌های جالبی را تسهیل می‌کند [46-50]. تجزیه و تحلیل دقیق ما از ساختار LhKNOT و همولوگ‌های ساختاری آن از این ایده پشتیبانی می‌کند که این پروتئین انگل دارای ویژگی‌های بارز پپتید گره‌دار با عملکرد در دفاع میزبان است: (الف) نزدیک‌ترین تطابق به LhKNOT پپتیدهای ضد میکروبی هستند. (ب) امضای Pfam LhKNOT آن را به عنوان "پپتید ضد قارچی" گره خورده با سیستئین توصیف می کند. و (ج) یک کلیپ CPC وجود دارد.

تجزیه و تحلیل یک پپتید login pB1 التیام دهنده زخم گره از کاکتوس برگدار Pereskia bleo در ابتدا وجود یک گیره CPC را نشان داد، یک امضای ساختاری حفظ شده از پروتئین های اتصال به هپارین [42]. این عملکردهای مرتبط با ایمنی و سیگنالینگ در بهبود زخم و سرطان دارد و به عنوان یک ضد انعقاد استفاده می شود [51].

GAG ها در سطوح سلولی حیوانی وجود دارند و به یک هدف فزاینده محبوب برای مطالعات مختلف از بالینی تا زیبایی تبدیل شده اند [52]. موتیف کلیپ CPC پروتئین های متصل به هپارین به عنوان حداقل موتیف مورد نیاز برای میل اتصال به هپارین در نظر گرفته می شود و با روابط فضایی خاص بین سه باقیمانده، دو کاتیونی (Arg/Lys) و یک قطبی (Asn، Gln، Ser، تعریف می شود. Thr، Tyr).

این موتیف گیره CPC با فواصل بین کربن های باقیمانده درگیر و همچنین فاصله بین مراکز جرم باقی مانده های درگیر تعریف می شود. پروتئین‌های متصل‌کننده به هپارین به‌طور بی‌رویه با دیگر سوبستراهای دارای بار منفی، به‌ویژه غشای سطحی میکروب‌ها، تعامل دارند [41].

در نتیجه، پروتئین های متصل به هپارین می توانند فعالیت ضد میکروبی را به درجات مختلفی از خود نشان دهند [53]. در حالی که مکانیسم های دقیق این پتانسیل ضد میکروبی به خوبی تعریف نشده است، فرض شده است که گیره CPC ممکن است این تعاملات پروتئین-میکروبی را تسهیل کند [41]. نقش‌های بالقوه جدید اتصال به هپارین در حال ظهور هستند، مانند مداخلات درمانی بالقوه برای آمیلوئیدوژنز [54]، بنابراین درک عوامل تعیین‌کننده ساختاری کلیپ CPC در پروتئین‌های متنوع ممکن است برای تعیین مکانیسم تعامل و اختلال آن کلیدی باشد.

یک سرنخ برای مکانیسم ضد میکروبی احتمالی برای LhKNOT از یافته‌های ما به دست می‌آید که گره سیستئین مهارکننده آن و سایر گره‌های مورد بررسی در اینجا دارای یک گیره CPC ذاتی در چین‌های خود هستند (جدول تکمیلی S5).

اشاره شده است که الزامات ساختاری و بیوفیزیکی برای توانایی پروتئین های متصل به هپارین برای برهمکنش با هپارین به طرز چشمگیری شبیه ویژگی های ساختاری بسیاری از AMP های شناخته شده است [53]. بنابراین، موتیف کلیپ CPC ممکن است با معیارهای هر دو این الزامات مطابقت داشته باشد [41].

کشف ما از این موتیف گیره CPC نه تنها در LhKNOT بلکه در 75 پروتئین گره مرتبط یا نامرتبط دیگر (جدول تکمیلی S5) نشان می دهد که این موتیف گیره CPC ممکن است یک ویژگی بسیار حفاظت شده پروتئین های گره باشد.

وقوع همزمان موتیف گیره CPC در ساختار گره سیستئین در پروتئین های متنوع نشان می دهد که موتیف گیره CPC خود ممکن است زیربنای عملکرد ضد میکروبی باشد. با این حال، از آنجایی که این موتیف ساختاری در گره های تهاجمی نیز شناسایی می شود (جدول تکمیلی S5)، ممکن است نقش کلی تری را از طریق این موتیف تعامل کلیپ CPC تعمیم یافته ایفا کند.

کشف یک موتیف گیره CPC در Drosomycin جالب است، زیرا مکانیسم احتمالی عمل این پپتید ضد قارچی را روشن می کند و از یک عملکرد ضد میکروبی احتمالی برای خود موتیف گیره CPC پشتیبانی می کند. مطالعات قبلی اهمیت باقیمانده‌های R6 و K38 دروسومایسین را که بخشی از موتیف گیره CPC آن (R6-S4-K38) هستند، برای پتانسیل ضد قارچی آن نشان داده‌اند. تغییرات این باقیمانده ها فعالیت ضد قارچی را کاهش می دهد [55]. تجزیه و تحلیل ساختاری ما از زنبور LhKNOT و شباهت‌های آن با مگس سرکه دروسومایسین، بینش‌های احتمالی را در مورد توانایی L. heterotoma برای سرکوب گسترده مسیر TollNF-κB در D. melanogaster و در عین حال موفقیت در میزبان‌های ضعیف‌شده سیستم ایمنی ارائه می‌دهد.

در غیاب یک مسیر ایمنی عملکرد Toll، و در نتیجه، بدون تولید دروسومایسین، لاروهای مگس سرکه اغلب می توانند در برابر پاتوژن های فرصت طلب تسلیم شوند [11،13،56]. فعالیت‌های ضد میکروبی احتمالی LhKNOT ممکن است از میزبان در برابر پاتوژن‌های میکروبی فرصت‌طلب در لارو میزبان آلوده به زنبور، آسیب‌دیده از سیستم ایمنی و شفیره‌های در حال توسعه دفاع کند. از طرف دیگر، مشابه دروسومایسین، LhKNOT می تواند آپوپتوز هموسیت را القا کند [57]. EVs هترواتوم L. پس از عفونت وارد هموسیت ها می شوند [58]، و فعالیت های آن ها در داخل EV ها کپسولاسیون را به خطر می اندازند [19،21].

نشان داده شده است که گیره CPC به طور بی رویه با GAG ها [41] مرتبط است، که با این وجود در حشرات از جمله مگس سرکه [59] همه جا وجود دارند. GAG های سولفات هپارین در مگس ها به عنوان گیرنده های فاکتور رشد عمل می کنند و در ایجاد و حفظ گرادیان های مورفوژنیک شرکت می کنند [60]. همچنین نشان داده شده است که گیره CPC به طور بی رویه با لیپوپلی ساکاریدها (LPS) مرتبط است [41]. LPS باکتریایی که اجزای اصلی سطح باکتری های گرم منفی است، محرک های بسیار قوی پاسخ ایمنی ذاتی در گونه های یوکاریوتی مختلف از جمله حشرات است [61]. GAG ها در مگس سرکه همچنین اتصال پروتئین C را کنترل می کنند، که یک عامل حدت تعیین کننده استرپتوکوک گروه B است [62].

بنابراین، ممکن است یک گیره CPC حاوی LhKNOT و Drosomycin (و احتمالاً سایر AMPهای مگس مانند Defensin [63]) بتواند سیگنال‌های ایمنی را تعدیل کند (و/یا به پروتئین‌های حدت پاتوژن متصل شود)، به طور مشابه بر پاتوژن/متازوئن باکتریایی تأثیر بگذارد. نتیجه انگل مطالعات قبلی نشان داده است که سه گره همولوگ (Alo-1، 2، 3) از سوسک هارلکین Acrocinus longimanus در برابر مخمر Candida glabrata [30] فعال هستند. علاوه بر این، یک پپتید کاندیداسیدی تشکیل دهنده منافذ، پساکوتئازین، به کاندیدا آلبیکنس حمله می کند [64]. در نهایت، یک قارچ بیماری‌زای زنگ گیاهی، معروف به Melampsora، یک پپتید گره‌دار را به عنوان عامل کاندید خود تولید می‌کند [65].

یافته‌های ما مبنی بر اینکه چندین پپتید گره‌دار ممکن است توسط زنبورهای انگلی بالغ مگس سرکه ترشح شود غیرمنتظره و جالب بود. در حالی که عملکرد آنها مشخص نیست، وجود احتمالی یک خانواده ژن گره نشان می دهد که مقداری افزونگی در عملکرد آنها وجود دارد که ممکن است با تاریخچه زندگی انگلی مرتبط باشد. کاوش چین ساختاری گره در گره های نامرتبط و هنوز کشف نشده ارزشمند خواهد بود. کار ما فهرست کوتاهی از باقیمانده‌های مهم برای فعالیت فیزیولوژیکی پیشنهادی برای بررسی پروتئین خانواده Knottin ارائه می‌کند. چنین اطلاعاتی را می توان در کشف و طراحی منطقی دارو برای بیماری های عفونی و درمان های مرتبط گنجاند.

4. روش ها

4.1. تجزیه و تحلیل توالی

اسکن‌های اولیه پایگاه‌داده توالی پروتئین غیر زائد (nr) NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein؛ در 4 آوریل 2018 مشاهده شد)، پایگاه‌داده توالی‌های Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa؛ قابل دسترسی در 16 آوریل 2018) [66]، و بانک اطلاعات پروتئین (PDB؛ https://www.rcsb.org؛ مشاهده شده در 5 ژوئیه 2018) [67] با توالی اسید آمینه تمام قد از پپتید گره اتم L. heteroatom (GAJC01011813.1) با استفاده از NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi؛ در تاریخ 16 مشاهده شد. آوریل 2018) [68] برای بازیابی توالی پروتئین مرتبط در سایر موجودات استفاده شد. همولوگ های راه دور با استفاده از BLAST تکرار شونده خاص موقعیت (PSI-BLAST؛ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi؛ دسترسی به 4 آوریل 2022) [69] و مدل های پنهان مارکوف (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer؛ مشاهده شده در 6 آوریل 2022) [70،71]. جستجوهای BLAST به اندازه کلمه 2 و ماتریس امتیازدهی BLOSUM45 تنظیم شدند، در حالی که پارامترهای پیش فرض برای HMMER استفاده شد.

برای شناسایی همولوگ های گره در گونه های Leptopilina و Ganaspis را انتخاب کنید. در پایگاه داده های پروتئینی قابل دسترسی نبود، جستجوهای هدفمند با استفاده از BLASTهای ترجمه شده در برابر مجموعه داده های ژنومی و رونویسی مورد استفاده قرار گرفت. برای شناسایی گره های L. heteroatom اضافی، رونوشت شکمی ماده L. heteroatom GAJC [72] و رونوشت های کل بدن از Ground GHUQ (دسترسی GenBank: GHUP00000000؛ TSA: Leptopilina heteroatom strain Lh14, transcriptome) Space GHUP (دسترسی GenBank: GHUQ00000000؛ TSA: Leptopilina heteroatom strain Lh14, transcriptome shotgun) با استفاده از tblastn جستجو شد (آستانه ارزش الکترونیکی روی 1 تنظیم شد، BLOSUM62، فیلتر پیچیدگی پایین فعال شد، فیلتر پوشش پرس و جو روی 20 تنظیم شد. ) در برابر LhKNOT.

رونوشت های زیر به طور مشابه برای شناسایی گره های L. boulardi جستجو شدند: رونوشت شکمی زن L. boulardi GAJA [72] و رونوشت های کل بدن از Ground GITC (GenBank Access: GITC00000000؛ TSA: Leptopilina boulardi strain Lb17، تفنگ شاتگان رونوشت)، Space GISX (دسترسی به بانک ژن: GISX00000000؛ TSA: سویه Leptopilina boulardi Lb17، تفنگ شاتگان رونوشت) و GGGI00000000 (شکم/سر زن) [73]. علاوه بر این، جستجوهای هدفمند برای Ganaspis spp. همولوگ انجام شد. برای G. hookeri، GAIW00000000 TSA: Ganaspis spp.

مجموعه داده G1 [74] با استفاده از پرس و جو LhKNOT جستجو شد (tblastn، آستانه ارزش الکترونیکی روی 1، BLOSUM45، فیلتر با پیچیدگی کم فعال، فیلتر پوشش پرس و جو روی 20 درصد تنظیم شد) جستجو شد. ابزار Expasy (web.expasy.org/translate/؛ قابل دسترسی در 9 دسامبر 2022) برای ترجمه این توالی های TSA استفاده شد [75]. توالی‌های پپتیدی پیش‌بینی‌شده به‌طور دستی بر اساس حضور موتیف سیستئین انتخاب شدند. برای G. brasiliensis، AUGUSTUS-based (http://bioinf.uni-greifswald.de/auguustus; دسترسی به 9 آوریل 2020) [76] پیش بینی های ژنی از توالی ژنومی نیمه مونتاژ شده (Gen-Bank: GCA{15} }.1) با استفاده از ماژول آموزشی ژنوم Nasonia vitripenis ساخته شد.

پروتئین‌های پیش‌بینی‌شده به‌دست‌آمده با استفاده از blastp (آستانه ارزش الکترونیکی روی ۱، فیلتر پیچیدگی کم فعال، فیلتر پوشش پرس و جو روی ۲۰ درصد تنظیم شده) در برابر LhKNOT جستجو شدند. ترازها و تجسم با استفاده از EBI's Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo؛ دسترسی به 9 دسامبر 2022) [77] برای تایید وجود موتیف گره و برای بررسی بیشتر انجام شد. دنباله ها

مجموعه‌ای از توالی‌های شناسایی‌شده با LhKNOT برای ایجاد یک هم‌ترازی توالی چندگانه با استفاده از T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee؛ در 9 دسامبر 2022 مشاهده شد) تراز شد [78] و با استفاده از آن تجسم شد. ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php؛ دسترسی به 9 دسامبر 2022) [79] برای شناسایی هر گونه باقیمانده و/یا موتیف(های) حفاظت شده در توالی های تراز شده.

4.2. تجزیه و تحلیل ساختار اولیه LhKNOT

دنباله LhKNOT همچنین توسط پایگاه داده تشخیص دامنه/موتیف پایگاه داده حفاظت شده دامنه (CDD؛ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml؛ دسترسی به 6 آوریل 2018) و Pfam ( pfam.xfam.org؛ قابل دسترسی در 6 آوریل 2018) برای شناسایی هر دامنه یا توالی امضا [80،81].

توالی بیشتر با استفاده از نرم افزار پیش بینی توالی سیگنال SignalP{{0}} تجزیه و تحلیل شد.0 (https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5 .0؛ مشاهده شده در 6 آوریل 2018) [82] و فوبیوس (https://www. ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias؛ مشاهده شده در 6 آوریل 2018) [83] برای شناسایی مکان دنباله سیگنال و امکان توصیف دقیق تر پپتید را فراهم می کند. پپتید بالغ 36 اسید آمینه (با دنباله سیگنال پیش بینی شده، باقی مانده 1-24، حذف شده) برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده شد.

ساختار ثانویه پپتید با استفاده از متا سرور Sympred پیش‌بینی شد (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww؛ در 6 آوریل 2018 مشاهده شد) [84] و برای تایید مطابقت آن با ثانویه مورد انتظار تجزیه و تحلیل شد. ساختار برای یک چین گره: یک قطعه آلفا-مارپیچ اولیه (توالی سیگنال پیش بینی شده) به دنبال سه رشته بتای ضد موازی.

4.3. پیش بینی و ارزیابی ساختار سوم LhKNOT و همولوگ های آن

The programs I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; دسترسی به 16 آوریل 2018) [85]، Modeller (https://salilab.org/modeller; مشاهده شده در 16 آوریل 2018) [{{7 }}]، و HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred؛ دسترسی به 6 آوریل 2018) [37] برای مدل سازی ساختار سوم LhKNOT استفاده شد. سه همولوگ ساختاری با چین‌های گره‌مانند Alo{12}} (PDB: 1Q3J) [30]، امگا آگاتوکسین-IVA (PDB: 1IVA) [28] و PAFP-S (PDB: 1DKC) [25] به عنوان نامزدهای برتر شناسایی شدند و به عنوان الگو در برنامه های ساخت مدل استفاده شدند.

مدل پیش‌بینی‌شده برای LhKNOT توسط Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d؛ مشاهده شده در 18 آوریل 2018) [39]، VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; قابل دسترسی در 18 آوریل 2018) [40]، و Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php؛ مشاهده شده در 18 آوریل 2018) [38]. ارزیابی پپتیدهای کوچک با ابزارهای ارزیابی استاندارد می تواند محدودیت هایی داشته باشد.

بنابراین، نمرات از ساختارهای سوم حل شده NMR و پپتیدهای مشتق شده از کریستالوگرافی با اندازه و شکل مشابه (PDB: 1Q3J، 1IVA، و 1DKC) برای تفسیر نمرات ارزیابی مدل‌های LhKNOT ما استفاده شد. مدل با رتبه برتر با استفاده از HHPred [37]، یک برنامه مدلسازی که از برنامه ساخت مدل اساسی، Modeller [86] با استفاده از رویکرد مدلسازی مقایسه ای مبتنی بر محدودیت استفاده می کند، ایجاد شد. علاوه بر این، ابزار KNOTER3D پایگاه داده KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php؛ دسترسی به 15 مه 2020) [36] برای ارزیابی ساختار ثالث مدل مورد استفاده قرار گرفت، که تاییدیه پذیرش LhKNOT از تا گره. تمام همولوگ های شناسایی شده بدون ساختار شناخته شده با استفاده از الگوی بالای شناسایی شده در HHPred [37] مدل سازی شدند.

4.4. شناسایی موتیف کلیپ CPC

انطباق مدل ساختاری LhKNOT با ساختارهای شناخته شده یک گیره CPC حاوی پپتید گره از کاکتوس Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] با استفاده از برنامه های Superpose (http://superpose.wishartlab.com؛ مشاهده شده در 12 سپتامبر 2). {11}}18) [87] و MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt؛ مشاهده شده در 12 سپتامبر 2018) [88] وجود یک موتیف CPC متصل به هپارین را پیشنهاد کردند. برای تأیید وجود کلیپ CPC در LhKNOT، تجزیه و تحلیل اتصال با استفاده از برنامه، ClusPro 2.0 (که پارامترهای خاص هپارین را به عنوان لیگاند ارائه می دهد؛ https://cluspro.org؛ در 2 مارس 2019 مشاهده شد) [89]، و تجزیه و تحلیل بعدی از سناریوهای اتصال پیش‌بینی‌شده در برنامه تجسم، PyMOL (https://pymol.org؛ دسترسی در 10 مارس 2019) [90] انجام شد.

تمام سناریوهای اتصال بالقوه برای شناسایی بقایای تشکیل دهنده موتیف کلیپ CPC با استفاده از مراحل زیر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تمام فعل و انفعالات قطبی بین LhKNOT و هپارین در PyMOL مشاهده شد و لیستی از باقی مانده های شرکت کننده وارد شد. پیش‌بینی‌هایی که حاوی برهم‌کنش‌های لازم کاتیون-قطبی-کاتیون بودند، سپس برای پایبندی به پارامتر موتیف کلیپ CPC با اندازه‌گیری فواصل بین کربن‌های آلفا باقی‌مانده‌های شرکت‌کننده و همچنین فواصل بین مرکز جرم باقی‌مانده‌های شرکت‌کننده مورد بررسی قرار گرفتند. ابزار جادوگر "Measurements" PyMOL برای اندازه‌گیری فواصل بین کربن‌های باقیمانده‌های شرکت‌کننده استفاده شد.

برای ارزیابی فواصل بین مراکز جرم، یک اسکریپت تولید شده توسط کاربر موجود در وب‌سایت Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_از_ جرم؛ قابل دسترسی در 15 مارس 2019) برای تولید شبه اتم ها در مرکز جرم زنجیره جانبی محاسبه شده استفاده شد. پلاگین APBS Electrostatics PyMOL [91] برای ارائه الکترواستاتیک سطح برای LhKNOT مدل شده استفاده شد. مراحل مشابهی برای شناسایی موتیف گیره CPC در هر یک از پروتئین های گره باقی مانده در جدول تکمیلی S5 انجام شد.

4.5. ارتباط LhKNOT با سایر GAG ها

برای ارزیابی اینکه آیا گیره CPC اتصال با GAG های اضافی را تسهیل می کند، اتصال بیشتر با اسید هیالورونیک (PDB: 1HYA) و کراتان سولفات (PDB: 1KES) انجام شد. در مورد اسید هیالورونیک، اتم های خارجی (O، Na) از فضای اطراف مولکول حذف شدند. از مدل کراتان سولفات به صورت فعلی استفاده شد. اتصال با استفاده از AutoDock انجام شد (https://autodock.scripps.edu؛ دسترسی به 7 آوریل 2020) [92]، و نتایج در PyMOL مشاهده شد. سپس نتایج به PDBSum (http://www.ebi.ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html؛ در 10 آوریل 2020 در دسترس قرار گرفت) [93] برای تولید Ligplots برای تأیید اتصال کلیپ GAG-CPC وارد شد. .

4.6. تجزیه و تحلیل اتصال پروتئین-هپارین برای کلیپ CPC جهش یافته در LhKNOT

برای بررسی اهمیت گیره CPC در اتصال به هپارین، مدل‌های جهش‌یافته LhKNOT با استفاده از ابزار جهش‌زایی PyMOL تولید شد و باقی‌مانده‌های کلیپ CPC را با آلانین جایگزین کرد. مدل‌ها به صورت تکه‌ای ایجاد شدند، ابتدا فقط R14، سپس R1 و R14، و در نهایت R14، R1 و S3 جایگزین شدند. اتصال هپارین تمام مدل‌ها با استفاده از ClusPro انجام شد و آنالیز همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد.

4.7. تجزیه و تحلیل اتصال پروتئین-هپارین در همولوگ های ساختاری و دروسومایسین

برای ارزیابی بیشتر حضور موتیف گیره CPC در خانواده پپتید گره، روش‌های قبلی بیشتر به (الف) همولوگ‌های ساختاری LhKNOT (PDB: 5XBD، 1Q3J، 1IVA، و 1DKC) گسترش یافتند [25،26،28،30 ]؛ (ب) مگس سرکه دروسومایسین (PDB: 1MYN) [43]، یک پپتید با فعالیت ضد قارچی شناخته شده. (ج) پروتئین های گره همولوگ مدل شده و (د) گره های نماینده از دسته های مختلف در پایگاه داده KNOTTIN. در نظر گرفته شد که اگر اندازه‌گیری‌ها در 3A پارامترهای کلیپ CPC قرار داشته باشند، به موتیف پایبند هستند تا امکان انعطاف پذیری ساختارهای حلقه پروتئین فراهم شود.

مواد تکمیلی:

اطلاعات پشتیبانی زیر را می توانید در https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1 دانلود کنید. جدول S1. همولوگ های LhKNOT را با استفاده از رویکردهای مختلف مبتنی بر توالی شناسایی کرد. جدول S2. همولوگ L. heterotoma فرضی LhKNOT. توالی ها از طریق tblastn از سه مجموعه داده رونویسی Lh14 شناسایی شدند (به روش ها برای شماره های الحاق مراجعه کنید).

رونوشت های گروه بندی شده توسط سلول های سایه دار پپتیدهای گره ای یکسان را رمزگذاری می کنند. اعداد الحاقی رونوشت نشان داده شده به صورت پررنگ دو پپتید مجزا را رمزگذاری می کنند. نتایج از جدول توضیحات موجود از نتایج انفجار NCBI بازیابی شد. جدول S3. همولوگ های گره ای L. boulardi فرضی LhKNOT. توالی‌ها از طریق tblastn از چهار مجموعه داده رونویسی L. boulardi شناسایی شدند (به روش‌ها برای شماره‌های الحاق مراجعه کنید). پپتیدهای گره یکسان مشتق شده از رونوشت های مختلف بر اساس رنگ گروه بندی می شوند. نتایج از جدول توضیحات از نتایج انفجار NCBI بازیابی شد. جدول S4.

توالی‌های گره‌دار احتمالی از گونه‌های Ganaspis، همولوگ به LhKNOT. توالی های G. hookeri با tblastn شناسایی شدند، در حالی که توالی های G. brasiliensis با یک انفجار شناسایی شدند. نتایج برای G. hookeri و G. brasiliensis از جدول توضیحات موجود در نتایج جستجوی NCBI بازیابی شد. توالی های سایه دار پپتیدهای یکسانی را رمزگذاری می کنند. جدول S5.

فهرستی از باقیمانده‌های اسید آمینه در گیره‌های CPC گره‌های شناخته‌شده، پپتیدهای گره‌دار مدل‌سازی‌شده، و دروسومایسین. اندازه‌گیری‌های فاصله (Å) آلفا کربن و مرکز جرم زنجیره جانبی (از طریق شبه اتم) باقی‌مانده‌های شرکت‌کننده نقوش کلیپ CPC شناسایی‌شده نشان داده شده‌اند. کلید: به علاوه گره های توهین آمیز شناخته شده (سموم)، Φ در مدل های سیلیکونی، * چین بدون گره، ± پپتید فرضی جایگزین، با رنگ سبز و زرد برجسته شده تا پپتیدهای ناشی از رونوشت یکسان مشخص شود. شکل S1: (الف) پروفایل ارزیابی وب سایت. امتیاز Z مدل به صورت یک نقطه سیاه در پس‌زمینه امتیاز Z از ساختارهای شناخته شده از PDB (سمت چپ) و تجسم مدل سه‌بعدی LhKNOT با باقی‌مانده‌های رنگی از آبی به قرمز به ترتیب افزایش نشان داده می‌شود. انرژی باقیمانده (سمت راست). (ب) نمایه ارزیابی را تأیید کنید. نمودار امتیازات متوسط ​​و خام 1D-3D را برای LhKNOT نشان می‌دهد و پانل در بالای لیست درصد باقی‌مانده‌هایی را که میانگین امتیازات 0}.2 یا بالاتر را کسب کرده‌اند، نشان می‌دهد.

یک مدل عبوری حداقل 80 درصد از باقیمانده های آن بالاتر از 0.2 است. (C) نمایه ارزیابی VoroMQA. امتیازهای جهانی VoroMQA در زمینه نمرات ساختار اشعه ایکس با کیفیت بالا (سمت چپ) و نمودار نمره محلی و نمره کلی برای LhKNOT (راست). شکل S2. Ligplot که برهمکنش های LhKNOT با کراتان سولفات را نشان می دهد (PDB: 1KES) شامل بقایای کلیپ CPC (R1-S3-R14) است. خطوط چین دار سبز برهمکنش پیوند هیدروژنی را نشان می دهد. شکل S3. Ligplot نشان‌دهنده تعامل LhKNOT با اسید هیالورونیک (PDB: 1HYA) شامل باقی‌مانده‌های گیره CPC (R{12}}S3-R14) است.

خطوط چین دار سبز برهمکنش پیوند هیدروژنی را نشان می دهد. شکل S4. (الف) Ligplot که برهمکنش‌های LhKNOT نوع وحشی را نشان می‌دهد که با هپارین از طریق گیره CPC اولیه (R1-S3-R14) در تعامل است. (B) Ligplot که برهمکنش‌های جهش یافته R14A LhKNOT را نشان می‌دهد که با هپارین از طریق یک گیره CPC ثانویه تعامل دارد (R1-S3-R30). خطوط چین دار سبز برهمکنش پیوند هیدروژنی را نشان می دهد. منابع [94-111] در مواد تکمیلی ذکر شده است.

مشارکت نویسنده:

مفهوم سازی، SS، SG، و JA. روش، JA، و SS. اعتبارسنجی، SS، SG، JA، JL، و LVC. تجزیه و تحلیل رسمی، JA، JL و LVC. تحقیق، JA، JL، و LVC. منابع، SS و SG. مدیریت داده، JA، JL، و LVC. نوشتن - آماده سازی پیش نویس اصلی، JA; نوشتن - بررسی و ویرایش، SS، SG، JA، JL و LVC. تجسم، JA، و JL. نظارت، SS و SG. مدیریت پروژه، SS و SG همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

منابع مالی:

این تحقیق هیچ بودجه ای دریافت نکرد.

بیانیه هیئت بررسی نهادی:

قابل اجرا نیست.

بیانیه رضایت آگاهانه:

قابل اجرا نیست.

بیانیه در دسترس بودن داده ها:

داده های ارائه شده در این مطالعه در مقاله و مواد تکمیلی موجود است.

قدردانی ها:

ما از Brian Wey برای کمک آنها در پیش بینی ژن G. brasiliensis و SA Tasnim Ahmed برای کمک او در قالب بندی ارقام سپاسگزاریم.

تضاد علاقه:

نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

منابع

1. Penczykowski، RM; Laine، AL; Koskella، B. درک اکولوژی و تکامل فعل و انفعالات میزبان-انگل در مقیاس. تکامل. Appl. 2015، 9، 37-52. [CrossRef] [PubMed]

2. Lambrechts، L. فلوس، اس. Koella، JC تعاملات تکاملی بین ژنوتیپ های میزبان و انگل. روند پارازیتول. 2006، 22، 12-16. [CrossRef]

3. Quicke، DL زنبورهای انگلی. Springer: Dordrecht، هلند، 1997.

4. پویریه، م. کولینت، دی. گاتی، جی. بینش در مورد عملکرد و تکامل زهر زنبور انگلی. Curr. نظر. Insect Sci. 2014، 6، 52-60. [CrossRef] [PubMed]

5. Kraaijeveld، AR; گادفری، HCJ تکامل مقاومت میزبان و مقاومت در برابر پارازیتوئید. Adv. پارازیتول 2009، 70، 257-280. [CrossRef] [PubMed]

6. برک، GR; Strand، MR تجزیه و تحلیل سیستماتیک یک زرادخانه انگلی زنبور. مول. Ecol. 2014، 23، 890-901. [CrossRef] [PubMed]

7. یان، ز. نیش، Q. وانگ، ال. لیو، جی. زو، ی. وانگ، اف. لی، اف. وارن، جی اچ. بله، جی. بینش ترکیب زهر و تکامل یک زنبور اندوپارازیتوئید با ترکیب آنالیزهای پروتئومی و ترانسکریپتومیک. علمی Rep. 2016, 6, 19604. [CrossRef]

8. لو، سی. دریسکل، AC؛ لیپس، جی. Buffington، ML بررسی جنس Leptopilina (Hymenoptera، Cynipoidea، Figitidae، Eucoilinae) از شرق ایالات متحده، شامل سه گونه تازه توصیف شده. J. Hymenoptera. Res. 2016، 53، 35-76. [CrossRef]

9. هیونر، ME; هاجنز، AD; رجوانی، ر. مورالس، جی. Govind، S. مهار مدل طبیعی مگس سرکه-پارازیتوئید برای ادغام ایمنی حشرات با ژنومیک عملکردی. Curr. نظر. Insect Sci. 2014، 6، 61-67. [CrossRef]

10. لی، ام جی; کالامرز، من; Paddibhatla، I. کوچک، سی. رجوانی، ر. Govind، S. عوامل ویروسی و استراتژی‌های گونه‌های Leptopilina: پاسخ‌های انتخابی در میزبان‌های مگس سرکه. Adv. پارازیتول 2009، 70، 123-145. [CrossRef]

11. بوچون، ن. سیلورمن، ن. Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - از شناخت میکروبی تا فیزیولوژی کل ارگانیسم. نات کشیش ایمونول. 2014، 14، 796-810. [CrossRef]

12. Govind، S. ایمنی ذاتی در مگس سرکه: پاتوژن ها و مسیرها. Insect Sci. 2008، 15، 29-43. [CrossRef]

13. کوناتیدیس، آی. Ligoxygakis، P. Drosophila به عنوان یک سیستم مدل برای باز کردن لایه‌های ایمنی ذاتی در برابر عفونت. Biol را باز کنید. 2012, 2, 120075. [CrossRef]

14. Schlenke, TA; مورالس، جی. گوویند، اس. Clark، AG استراتژی‌های عفونت متضاد در پارازیتوئیدهای زنبور عمومی و متخصص مگس سرکه. PLoS Pathog. 2007، 3، 1486-1501. [CrossRef]

15. کیو، ص. تابه، کامپیوتر; Govind، S. نقشی برای مسیر Toll/Cactus مگس سرکه در خونسازی لارو. توسعه 1998، 125، 1909-1920. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com