ارزیابی در شرایط آزمایشگاهی واکنش نوری و سمیت نوری آنتی اکسیدان های طبیعی پلی فنول

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای دانستن بیشتر

خلاصه:پلی فنول ها خانواده بزرگی از ترکیبات طبیعی هستند که به دلیل خواص مفید آنتی اکسیدانی و ضد التهابی و توانایی آنها در جلوگیری از استرس اکسیداتیو ناشی از اشعه ماوراء بنفش به طور گسترده در محصولات آرایشی و بهداشتی استفاده می شود. از آنجایی که این ترکیبات دارای کروموفور هستند و مستقیماً روی پوست اعمال می شوند، می توانند با نور خورشید واکنش دهند و اثرات فوتوتوکسیک داشته باشند. اطلاعات علمی موجود در مورد پتانسیل فوتوتوکسیک این ترکیبات طبیعی کمیاب است و بنابراین هدف از این مطالعه ارزیابی نور واکنش و سمیت نوری پنج فنلی بود.آنتی اکسیدان هابا استفاده مستند در محصولات آرایشی و بهداشتی. یک سنجش استاندارد ROS برای غربالگری واکنش نوری آنتی اکسیدان های طبیعی فنولی کافئیک اسید، فرولیک اسید، اسید p-کوماریک، 3،{2}}دی هیدروکسی فنیل استیک اسید (DOPAC) و روتین مورد تایید قرار گرفت. پتانسیل فوتوتوکسیسیته با استفاده از رده سلولی کراتینوسیت انسانی (HaCaT)، بر اساس تست سمیت نوری جذب قرمز خنثی 3T3 تعیین شد. اگرچه همهآنتی اکسیدان های فنلی را مورد مطالعه قرار دادجذب اشعه UV/Vis در محدوده 290 تا 700 نانومتر، تنها DOPAC قادر به تولید اکسیژن منفرد بود. تولید گونه های اکسیژن فعال یک واکنش شیمیایی در مراحل اولیه به عنوان بخشی از مکانیسم سمیت نوری است. با این حال، هیچ یک از ترکیبات مورد مطالعه باعث کاهش زنده ماندن کراتینوسیت ها پس از تابش نشد، و به این نتیجه رسید که آنها پتانسیل فوتوتوکسیک ندارند. داده‌های به‌دست‌آمده با این کار نشان می‌دهد که این ترکیبات در صورت ترکیب در محصولات آرایشی بی‌خطر هستند.

کلید واژه ها:ایمنی عکس؛ واکنش نوری؛ سمیت نوری؛ پلی فنول ها؛آنتی اکسیدان های فنولی طبیعی; گونه های اکسیژن واکنش پذیر؛ کراتینوسیت ها؛ مراقبت از پوست؛ محصولات آرایشی و بهداشتی

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

مقدمه 

پلی فنول ها (PPs) یکی از پرتعدادترین و گسترده ترین گروه های محصولات طبیعی در قلمرو گیاهی را تشکیل می دهند. ساختار شیمیایی PP ها با حضور یک یا چند گروه هیدروکسیل فنلی، متصل به یک یا چند سیستم حلقه بنزن مشخص می شود [1]. پلی فنول‌ها انواع مختلفی از فعالیت‌های بیولوژیکی مفید را در انسان از خود نشان می‌دهند، از جمله عملکرد ضد ویروسی، ضد باکتریایی، ضد سرطان‌زایی، محافظت از کبد، ضد التهابی و آنتی‌اکسیدانی [2-5].به عنوان آنتی اکسیدانپلی فنل ها ممکن است از ترکیبات سلولی در برابر اثرات مخرب اکسیداتیو گونه های فعال اکسیژن (ROS) مانند اکسیژن منفرد، سوپراکسید و رادیکال های هیدروکسیل محافظت کنند و خطر ابتلا به چندین بیماری مرتبط با استرس اکسیداتیو را محدود کنند [6،7]. با توجه به خواص شیمیایی خود، PP ها قادر به حذف ROS و یون های فلزات واسطه مانند آهن و مس هستند که توجه صنعت آرایشی و بهداشتی را برای استفاده از آنها در فرمولاسیون های مراقبت از پوست جلب کرده است [8-10]. قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش (UV) یکی از عوامل اصلی ایجاد سرطان پوست است و سلول های پوست ممکن است به طور مستقیم توسط اشعه ماوراء بنفش یا به طور غیرمستقیم توسط تولید بیش از حد ROS با واسطه UV آسیب ببینند [11]. مطالعات تجربی و اپیدمیولوژیک نشان داده اند که پلی فنول ها از طریق مسیرهای متعدد از پوست در برابر اثرات نامطلوب اشعه ماوراء بنفش محافظت می کنند [12]. بنابراین، چندین ترکیب متعلق به این خانواده در حال حاضر به عنوان مواد تشکیل دهنده در تعدادی از محصولات آرایشی تجاری موجود در بازار استفاده می شود [13]. افزایش تقاضای مصرف کنندگان برای لوازم آرایشی طبیعی، صنعت را ترغیب کرد تا فرمولاسیون هایی را با استفاده از عصاره های طبیعی با مواد فعال مانند پلی فنول ها به عنوان راه حلی امیدوارکننده و موثر برای مراقبت از پوست توسعه دهد [13]. با این حال، کروموفورهای موجود در ساختار پلی‌فنل‌ها توانایی جذب پرتوهای UV/Vis را دارند و تحت واکنش‌های شیمیایی قرار می‌گیرند که منجر به مجموعه‌ای از رویدادها می‌شود که ممکن است منجر به واکنش‌های فوتوتوکسیک شود [14]. سمیت نوری به عنوان یک پاسخ سمی تعریف می شود که توسط مواد شیمیایی واکنش دهنده نوری به صورت موضعی یا سیستمیک پس از قرار گرفتن بدن در معرض نور محیطی ایجاد می شود [15]. ترکیبات دارویی فعال و مواد کمکی برای تجویز سیستمیک، فرمول‌های بالینی برای کاربرد موضعی، تکه‌های پوستی و غیره، پتانسیل فوتوتوکسیک دارند و می‌توانند واکنش‌های فوتوتوکسیک قابل‌توجهی ایجاد کنند. در نتیجه، آژانس‌های نظارتی، FDA ایالات متحده، EU EMA و ICH، دستورالعمل‌های ایمنی عکس را ارائه می‌کنند، روش‌های آزمایش و استراتژی‌های ارزیابی را معرفی می‌کنند [15-17]. ارزیابی ایمنی محصولات آرایشی و بهداشتی طبق قوانین اتحادیه اروپا اجباری است [18]. ارزیابی ایمنی مورد نیاز شامل مطالعات سم شناسی مرتبط بر روی مواد آرایشی، از جمله ارزیابی سمیت ناشی از عکس [18] است. از آنجایی که آزمایش روی حیوانات برای محصولات آرایشی ممنوع شده است، تعدادی از آزمایش‌های ایمنی عکس در شرایط آزمایشگاهی در طول سال‌های گذشته پیشنهاد شده‌اند، از جمله آنالیز طیف UV، تست سمیت نوری جذب قرمز خنثی 3T3 (3T3 NRU PT)، و گونه‌های اکسیژن فعال. سنجش ROS) [18-20]. سنجش ROS برای ارزیابی واکنش نوری داروها طراحی شده است، که اصل آن نظارت بر واکنش‌های فتوشیمیایی در مواد شیمیایی آزمایش شده در معرض نور خورشید شبیه‌سازی شده است [19،20]. از طریق این واکنش‌های فتوشیمیایی، ROS، مانند آنیون سوپراکسید و اکسیژن منفرد، می‌توانند تولید شوند و این فرآیندهای فتوشیمیایی می‌توانند محرکی برای سمیت نوری ناشی از دارو باشند [19،20]. سطوح بالای ROS می تواند از طریق آسیب به DNA، لیپیدها و پروتئین ها توسط استرس اکسیداتیو باعث سمیت سلولی شود.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlروش in vitro 3T3 NRU-PT از خط سلولی فیبروبلاست موش Balb/c 3T3 و جذب قرمز خنثی به عنوان نقطه پایانی سمیت سلولی استفاده می کند. سپس سمیت نوری با کاهش نسبی زنده ماندن سلول‌هایی که در حضور و غیاب نور شبیه‌سازی نور خورشید در معرض ماده شیمیایی آزمایش قرار می‌گیرند، تعیین می‌شود. مطالعات گزارش شده در ادبیات به این نتیجه رسیدند که این آزمایش بیش از حد حساس است، به اشتباه خطرات ایمنی عکس حیوان و انسان را پیش‌بینی می‌کند و در مقایسه با نتایج in vivo منجر به تعداد بالایی از موارد مثبت کاذب می‌شود [21-23]. با توجه به این محدودیت، اصلاح روش 3T3 NRU-PT توسط گروه ما بر اساس استفاده از رده سلولی کراتینوسیت انسانی (HaCaT) [24] پیشنهاد شد. از آنجایی که این روش از سلول‌های کراتینوسیت انسانی استفاده می‌کند، مدل واقعی‌تری را نشان می‌دهد، با توجه به اینکه این سلول‌ها فراوان‌ترین نوع سلول‌های موجود در لایه خارجی پوست هستند، جایی که ترکیبات موضعی اعمال می‌شوند و در معرض تابش نور خورشید قرار می‌گیرند [24]. هدف از مطالعه حاضر تخمین پتانسیل سمیت ناشی از عکس پلی فنل های طبیعی p-کوماریک اسید، کافئیک اسید، 3،{16}}دی هیدروکسی فنیل استیک اسید (DOPAC)، اسید فرولیک و روتین بود (شکل 1). که قبلاً به عنوان مواد آرایشی مورد استفاده قرار می گیرند یا به دلیل خواص شیمیایی و آنتی اکسیدانی جالب آنها مورد توجه قرار می گیرند [25-27]. یک سنجش ROS برای ارزیابی ایمنی عکس اکتشافی ترکیبات تأیید و اجرا شد، و سمیت سلولی و سمیت نوری آنها با استفاده از یک رده سلولی کراتینوسیت انسانی (HaCaT) ارزیابی شد.

2. نتایج و بحث 

ملاحظات اولیه برای ارزیابی پتانسیل واکنش نوری این است که آیا یک ترکیب فوتون‌ها را در هر طول موجی بین 290 تا 700 نانومتر جذب می‌کند یا خیر. ترکیبی که دارای ضریب خاموشی مولی (MEC) بیشتر از 1000 L mol-1 cm-1 در هر طول موجی بین 290 و 700 نانومتر است، به اندازه کافی واکنش نوری در نظر گرفته می‌شود که منجر به سمیت نوری مستقیم شود [15]. طیف جذب اسیدهای کافئیک، p-کوماریک و فرولیک، DOPAC و روتین در DMSO در نور مرئی UV در شکل 2 نشان داده شده است. همه ترکیبات در محدوده طیفی 200 تا 700 نانومتر، با حداکثر طول موج یا بالاتر از 290 نانومتر و با MEC معمولاً بیشتر از 4000 L mol-1 cm-1 (جدول 1). پلی فنول ها ترکیبات بیولوژیکی حاوی سیستم های کونژوگه π با گروه های هیدروکسیل فنلی هستند. انتقال های الکترونیکی اوربیتال های مولکولی نوع π مسئول طیف مرئی UV این گروه از ترکیبات هستند [28]

تمام ترکیبات آزمایش شده MEC بالاتر از 1000 L mol-1 cm-1 ارائه کردند، که به این معنی است که همه ترکیبات فوتوتوکسیک ممکن هستند که ارزش مطالعه را دارند [15]. قبل از انجام سنجش ROS، شبیه‌ساز خورشیدی مورد ارزیابی قرار گرفت و شرایط تجربی بهینه‌سازی شد تا اطمینان حاصل شود که مقادیر اندازه‌گیری شده اکسیژن منفرد (SO) و آنیون سوپراکسید (SA) نزدیک به موارد ذکر شده در ادبیات است [29]. بهینه‌سازی سنجش تولید ROS با استفاده از کنترل‌های مثبت و منفی انجام شد و یک مطالعه امکان‌سنجی با استفاده از مواد شیمیایی مرجع انجام شد. تحت شرایط آزمایشی مورد استفاده، همه مواد آزمایش شده در مطالعه امکان سنجی معیارهای پذیرش را برآورده کردند که مقادیری برای SO و SA در محدوده مقادیر مجاز می‌دهد [29].

سنجش ROS برای ترکیبات پلی فنلی انجام شد، و ظرفیت مواد مورد آزمایش برای تولید ROS، در غلظت 200 میکرومولار، در جدول 2 نشان داده شده است. جدول 2. نتایج برای ترکیبات آزمایش شده با استفاده از روش ROS به دست آمد.

نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که به استثنای DOPAC، همه ترکیبات را می‌توان به عنوان غیر نور فعال طبقه‌بندی کرد. اگرچه این مواد جذب نور مرئی با اشعه ماوراء بنفش و MEC بالاتر از 10 00 L mol-1 cm-1 نشان دادند، اما تحت شرایط آزمایش شده ROS تولید نکردند، چه گونه های SO یا SA. با کمال تعجب، DOPAC قادر به القای تولید گونه‌های SO بود و بنابراین، به‌عنوان واکنش‌گر نوری طبقه‌بندی شد، علی‌رغم اینکه این ترکیب دارای کمترین مقدار MEC در محدوده قابل مشاهده UV در بین تمام ترکیبات مورد مطالعه است. مطالعات بیشتری برای درک نتایج به‌دست‌آمده برای DOPAC مورد نیاز است، که ممکن است در آینده نزدیک برای ایجاد ارتباط بین ساختار شیمیایی یک ترکیب و توانایی آن در واکنش‌پذیری نوری مهم باشد. سمیت سلولی DMSO مورد استفاده برای ارزیابی اثرات فوتوتوکسیک، در حضور و غیاب تابش، پس از 1 ساعت قرار گرفتن در معرض مورد ارزیابی قرار گرفت. برای صفحه بدون تابش، DMSO تفاوت آماری معنی داری را نسبت به کنترل منفی نشان نداد. با این حال، برای صفحه تابش شده، تفاوت معنی‌داری بین 1 درصد DMSO و شاهد حلال نسبت به کنترل‌های منفی وجود داشت (0001/0p<)، که="" استفاده="" از="" کنترل="" حلال="" را="" در="" تمام="" آزمایش‌ها="" برای="" تضمین="" تفاوت="" در="" زنده‌مانی="" سلول="" توجیه="" می‌کند.="" فقط="" به="" ترکیبات="" مورد="" مطالعه="" نسبت="" داده="" شدند.="" برای="" اطمینان="" از="" امکان="" سنجی="" سنجش="" سمیت="" نوری="" با="" استفاده="" از="" رده="" سلولی="" کراتینوسیت="" انسانی="" (hacat)،="" 5-متوکسی="" پسورالن،="" کلرپرومازین="" هیدروکلراید="" و="" کینین="" به="" عنوان="" کنترل="" مثبت="" و="" اسید="" استیل="" سالیسیلیک،="" هگزا="" کلروفن="" و="" سدیم="" لوریل="" سولفات="" به="" عنوان="" شاهد="" منفی="" مورد="" آزمایش="" قرار="" گرفتند.="" [24].="" نتایج="" به‌دست‌آمده="" از="" سنجش="" فوتوتوکسیسیته="" برای="" مقایسه="" زنده‌مانی="" سلول‌های="" hacat،="" تابش‌شده="" و="" بدون="" تابش،="" در="" حضور="" ترکیبات="" (پلی)="" فنولی="" آزمایش‌شده="" در="" شکل="" 3="" نشان="" داده="" شده="" است.="" محدوده="" غلظت‌های="" مواد="" شیمیایی="" آزمایش‌شده="" در="" حضور="" نشان="" داده="" شده="" است.="" (irr="" به="" علاوه)="" و="" عدم="" وجود="" (irr-)="" نور="" در="" آزمایش‌های="" محدوده‌یابی="" دوز،="" با="" در="" نظر="" گرفتن="" حداکثر="" غلظت="" 1000="" میکرومولار="" تعیین="" شد.="" یک="" سری="" رقت="" هندسی="" استفاده="" شد="" و="" در="" صورت="" لزوم="" به="" عنوان="" تابعی="" از="" واکنش="" غلظت="" در="" حضور="" و="" عدم="" حضور="" تابش="" تنظیم="" شد.="" در="" محدوده="" غلظت="" آزمایش="" شده="" (12.5؛="" 31.25؛="" 62.5؛="" 125؛="" 250؛="" 500="" و="" 1000="" میکرومولار)="" هیچ="" یک="" از="" مواد="" آزمایشی="" باعث="" کاهش="" 50="" درصدی="" در="" زنده="" ماندن="" سلول="" نشدند،="" بنابراین،="" محاسبه="" مقادیر="" ic50="" و="" pif="" مربوطه="" ممکن="" نبود.="" .="" در="" مقابل،="" ممکن="" است="" افزایش="" وابسته="" به="" دوز="" در="" زنده="" ماندن="" سلول‌های="" تحت="" تابش="" در="" حضور="" مواد="" مورد="" آزمایش="" مشاهده="" شود،="" که="" احتمالاً="" به="" دلیل="" اثرات="" محافظت="" نوری="" این="" آنتی‌اکسیدان‌ها="" در="" برابر="" آسیب="" اکسیداتیو="" ناشی="" از="" تابش="" است="" که="" منجر="" به="" درصد="" بالاتری="" می‌شود.="" سلول="" های="" زنده="" در="" مقایسه="" با="" شاهد="" (سلول="" های="" تحت="" تابش="" درمان="" نشده).="" در="" ادبیات="" توضیح="" داده="" شده="" است="" که="" اشعه="" ماوراء="" بنفش="" منجر="" به="" تولید="" ros،="" تولید="" بیش="" از="" حد="" اکسید="" نیتریک="" و="" کاهش="" دفاع="" آنتی="" اکسیدانی="" در="" کراتینوسیت="" ها="" می="" شود="" [30].="" به="" این="" دلایل،="" پلی="" فنل‌های="" با="" قابلیت="" آنتی‌اکسیدانی="" به‌عنوان="" عوامل="" محافظ="" نور="" مورد="" مطالعه="" قرار="" گرفته‌اند.="" اگرچه="" اکثر="" مطالعات="" بر="" روی="" ظرفیت="" محافظت="" نوری="" پلی="" فنل="" ها="" متمرکز="" بودند،="" اما="" پتانسیل="" فوتوتوکسیک="" آنها="" را="" مطالعه="" نکردند.="" مطالعات="" قبلی="" توانایی="" اسیدهای="" کافئیک،="" فرولیک="" و="" p-کوماریک="" را="" برای="" حذف="" ros="" و="" گونه‌های="" نیتروژن="" فعال="" (rns)="" تایید="" کرده‌اند.="" علاوه="" بر="" این،="" محافظت="" در="" برابر="" اثرات="" مضر="" اشعه="" ماوراء="" بنفش="" نیز="" در="" داخل="" بدن="" یا="" سلول="" های="" پوستی="" برای="" این="" سه="" ترکیب="" فنلی="" ایجاد="" شد="" [31-34].="" این="" داده="" ها="" ممکن="" است="" افزایش="" درصد="" سلول="" های="" زنده="" را="" در="" هنگام="" قرار="" گرفتن="" در="" معرض="" تابش="" در="" حضور="" ترکیبات="" مورد="" مطالعه="" توضیح="" دهد.="" روتین،="" مانند="" اسیدهای="" کافئیک،="" فرولیک،="" و="" p-کوماریک="" در="" آزمایش="" تولید="" ros="" منفی="" بود="" و="" باعث="" ایجاد="" سمیت="" نوری="" در="" رده="" سلولی="" hacat="" نشد.="" برخی="" از="" اطلاعات="" متناقض="" در="" ادبیات="" در="" مورد="" پتانسیل="" فوتوتوکسیک="" روتین="" وجود="" دارد،="" بنابراین="" نتایج="" به="" دست="" آمده="" مورد="" توجه="" قرار="" می="" گیرد.="" ارزیابی="" پتانسیل="" فوتوتوکسیک="" با="" استفاده="" از="" سیستم="" سلولی="" کراتینوسیت="" (hacat)،="" نشان="" داد="" که="" روتین="" دارای="" سمیت="" نوری="" است="" [35].="" در="" مقابل،="" با="" استفاده="" از="" یک="" مجموعه="" تجربی="" که="" از="" الکتروفورز="" مویرگی="" با="" تشخیص="" الکتروشیمیایی="" و="" uv="" برای="" آزمایش="" سمیت="" نوری="" عصاره‌ها="" و="" اجزای="" گیاهی="" از="" نظر="" مصرف="" اکسیژن="" و="" تولید="" گونه‌های="" اکسیژن="" فعال="" پس="" از="" تابش="" نور="" مرئی="" استفاده="" می‌کند،="" می‌توان="" نتیجه="" گرفت="" که="" روتین="" نه="" فوتوتوکسیک="" [36]،="" که="" با="" نتایج="" به‌دست‌آمده="" در="" این="" کار="" مطابقت="" داشت،="" جایی="" که="" روتین="" واکنش="" نوری="" را="" نشان="" نمی‌داد،="" زیرا="" so="" یا="" sa="" را="" در="" سنجش="" تولید="" ros="" ایجاد="" نکرد.="" از="" سوی="" دیگر،="" در="" این="" کار="" همچنین="" نشان="" داده="" شد="" که="" روتین="" به="" خودی="" خود="" هیچ="" پتانسیل="" فتوتوکسیک="" در="" رده="" سلولی="" hacat="" ارائه="" نمی="" دهد.="" این="" یافته="" های="" متناقض="" اهمیت="" استفاده="" از="" شرایط="" تست="" استاندارد="" و="" همچنین="" استفاده="" از="" منبع="" نور="" مناسب="" را="" برای="" جلوگیری="" از="" نتایج="" گمراه="" کننده="" نشان="" می="" دهد.="" جالب="" توجه="" است،="" و="" با="" وجود="" شباهت="" ساختاری="" بین="" dopac="" و="" سایر="" pp="" های="" مورد="" مطالعه،="" dopac="" so="" را="" در="" روش="" تولید="" ros="" تولید="" کرد="" و="" به="" عنوان="" واکنش="" دهنده="" نوری="" طبقه="" بندی="" شد.="" با="" این="" حال،="" هنگامی="" که="" در="" رده="" سلولی="" hacat="" آزمایش="" شد،="" dopac="" غیرفتوتوکسیک="" است.="" از="" نتایج="" به‌دست‌آمده،="" به="" نظر="" می‌رسد="" که="" dopac="" واکنش="" نوری="" است="" اما="" فوتوتوکسیک="" نیست،="" بنابراین="" انتظار="" نمی‌رود="" که="" واکنش‌های="" فوتوتوکسیک="" پس="" از="" کاربرد="" موضعی="" این="" ترکیب="" رخ="">

3. مواد و روشها

3.1. معرف ها

3،4-اسید دی هیدروکسی فنیل استیک (DOPAC)، اسید کافئیک، اسید ترانسفرولیک، اسید p-کوماریک، روتین، کلرپرومازین هیدروکلراید، دی سدیم هیدروژن فسفات دودکاهیدرات، سدیم فسفات مونوبازیک مونوهیدرات، دی اکسید قرمز خنثی (NR)، و (DMSO) از سیگما آلدریچ (مادرید، اسپانیا) خریداری شد. کینین هیدروکلراید، بنزوکائین، دیکلوفناک و اریترومایسین از Acofarma (مادرید، اسپانیا) خریداری شد. رده سلولی کراتینوسیت انسانی (HaCaT) جاودانه شده از خدمات خطوط سلولی (CLS) (Eppelheim، آلمان) به دست آمد. محیط Eagle Modified Dulbecco (DMEM) با 4.5 گرم در لیتر D-گلوکز، ال-گلوتامین، 25 میلی مولار HEPES، و DMEM با 4.5 گرم در لیتر D-گلوکز، L گلوتامین، 25 میلی مولار HEPES بدون فنل قرمز، Dulbecco's Phos Buffered Phos (DPBS)، سرم جنین گاو (FBS)، و تریپسین EDTA از Gibco Life Technologies (والتهام، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. اتانول توسط آگا (لیسبون، پرتغال) تامین می شد. N، N-Dimethyl{14}}نیتروگوانیدین (RNO)، ایمیدازول، و نیترو بلو تترازولیوم (NBT) از Alfa Aesar (Kandel، آلمان) خریداری شد.

3.2. جذب طیفی 

طیف جذب هر ترکیب مورد مطالعه در محدوده 290 تا 700 نانومتر، بر اساس دستورالعمل تست OECD 101، با استفاده از اسپکتروفتومتر Jasco V650 UV/VIS تعیین شد [37]. مواد به منظور به دست آوردن غلظت نهایی 10 میکروگرم بر میلی لیتر در DMSO حل شدند و طیف جذب با استفاده از کووت های کوارتز شفاف UV (طول مسیر=10 میلی متر) اندازه گیری شد. هر طیف برای جذب پایه ویژه حلال تصحیح شد. ضرایب خاموشی مولی (MEC) با استفاده از بالاترین پیک جذب از 290 تا 700 نانومتر محاسبه شد [15].

3.3. سنجش واکنش گونه های اکسیژن (ROS). 

پروتکل سنجش ROS ایجاد شد، و مطالعات اعتبار سنجی طبق رویه توصیف شده در ادبیات [19،29] انجام شد. محلول‌های استوک تمام مواد مورد آزمایش در غلظت 10 میلی‌مولار در DMSO تهیه و در همان روز و در محافظت از نور استفاده شد. به طور خلاصه، تولید اکسیژن منفرد (SO) با اندازه‌گیری اسپکتروفتومتری سفیدکننده p-nitrosodimethylaniline (RNO) در 440 نانومتر با استفاده از ایمیدازول به‌عنوان گیرنده انتخابی اکسیژن منفرد شناسایی شد. نمونه‌های حاوی ماده شیمیایی آزمایش شده (200 میکرومولار)، RNO (50 میکرومولار)، و ایمیدازول (50 میکرومولار) در بافر فسفات سدیم 20 میلی‌مولار (PB، pH 7.4)، در یک لوله قرار داده و با یک میکسر گردابی مخلوط و تحت فراصوت قرار گرفتند. محافظت از نور، به مدت 10 دقیقه. مخلوط به یک سلول شیشه ای کوارتز هلما با کارایی بالا منتقل شد و قبل از قرار گرفتن در معرض نور از نظر بارش در زیر میکروسکوپ بررسی شد. سپس نمونه ها با استفاده از شبیه ساز خورشیدی ترموستاتیک Fitoclima S600PL (Aralab، پرتغال)، مجهز به هشت لامپ Repti Glo (20 W) UV-Vis، به مدت 90 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد تحت تابش قرار گرفتند. پس از تابش، جذب دوباره در 440 نانومتر خوانده شد. تولید آنیون سوپراکسید (SA) با مشاهده کاهش تترازولیوم نیتروبلو (NBT) به مونوفورمازن (NBT plus)، که تشکیل آن را می توان به روش اسپکتروفتومتری در 560 نانومتر بررسی کرد، شناسایی شد. نمونه های حاوی ترکیبات آزمایش شده (200 میکرومولار) و NBT (50 میکرومولار) در 20 میلی مولار NaPB تحت تابش قرار گرفتند و کاهش NBT با افزایش جذب در 560 نانومتر به همان روشی که برای تعیین SO اندازه‌گیری شد. آزمایش ها در سه تکرار انجام شد. از آنجایی که شبیه ساز خورشیدی مورد استفاده با مدل های پیشنهادی متفاوت بود، لازم بود شرایط تابش تایید شود. یک سنجش ROS برای اطمینان از اینکه شرایط تابش معیارهای توصیه شده را با استفاده از کنترل های مثبت (کینین) و منفی (سولیسوبنزون) و ترکیبات شیمیایی مرجع برآورده می کند، انجام شد [29]. با توجه به نتیجه (میانگین تعیین‌های سه‌گانه) از سنجش ROS، ترکیبات پلی‌فنولی آزمایش‌شده به عنوان مواد واکنش‌گر نوری طبقه‌بندی شدند که مقدار SO 25 یا بیشتر و/یا مقدار SA 20 یا بیشتر اندازه‌گیری شد. به نوبه خود، زمانی که مقادیر کمتر از 25 برای SO و کمتر از 20 برای SA ثبت شد، به عنوان یک ماده غیر نور فعال تعیین شد [29].

3.4. کشت سلولی 

سلول های HaCaT در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر مرطوب 95 درصد هوا و 5 درصد CO2 در انکوباتور در DMEM با 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی بیوتیک نگهداری شدند. با استفاده از میکروسکوپ معکوس، تلاقی سلولی مشاهده شد و اگر سلول‌ها به 80-7 درصد رسیدند، برای جلوگیری از مرگ سلولی، کشت زیر کشت انجام شد. بدین منظور محیط کشت آسپیره شد و سلول ها با DPBS شسته و 2 میلی لیتر تریپسین 25/0 درصد به آن اضافه شد و به مدت 7 تا 8 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر CO2 5 درصد انکوبه شد. پس از جدا شدن سلول ها، یک محیط تازه برای جلوگیری از عمل تریپسین اضافه شد. برای شمارش سلولی، 10 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی در یک محفظه Neubauer قرار داده شد که در آن سلول ها شمارش شدند. سپس سوسپانسیون سلولی به دست آمده با محیط کشت سلولی تازه به فلاسک های جدید تقسیم شد. برای انجماد سلولی از DMSO (5 درصد حجمی) به عنوان نگهدارنده برای جلوگیری از تشکیل کریستال در مرحله ذخیره سازی استفاده شد. به منظور تعیین زمان لازم برای تکثیر سلول ها، 106×1 سلول در پنج فلاسک 75 سانتی متر مربع کاشته و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر 5 درصد CO2 انکوبه شدند تا به چسبندگی کامل برسند. سپس سلول های هر فلاسک در زمان های مختلف شمارش شد. نتایج به صورت نموداری نشان دهنده تعداد سلول در مقابل زمان رسم شد که از آن زمان دو برابر شدن با استفاده از تحلیل رگرسیون خطی محاسبه شد. زمان دوبرابر شدن محاسبه‌شده به‌دست‌آمده 20.43 ساعت بود که با مقادیر گزارش‌شده در ادبیات مطابقت دارد، بنابراین تأیید می‌کند که سلول‌های مورد استفاده در شرایط رشد طبیعی هستند [38]. 3.5. سنجش سمیت نوری برای مطالعه سمیت نوری، یک پروتکل قبلی که در آزمایشگاه ما اجرا شده بود، دنبال شد [24]. ارتفاع لامپ UVA/UVB Osram (240V E27) به منظور تابش سلول‌ها با دوز تابش UVA 1.7 mW/cm2 (رادیومتر Cosmedico، UVM{38}})، طبق دستورالعمل OECD تنظیم شد [23] . در طول تابش (10 دقیقه)، صفحات داخل یک گیرنده استایروفوم حاوی یک سیستم خنک‌کننده آب نگهداری می‌شوند و دما در طول فرآیند کنترل می‌شود. به طور خلاصه، برای انجام سنجش جذب NR، سلول‌های HaCaT (2 × 104 سلول در چاه) کاشته شدند و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در اتمسفر 5 درصد CO2 به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. پس از آن، محیط خارج شد، غلظت های مختلف مواد آزمایش اضافه شد و سلول ها در شرایط یکسان به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. یک صفحه در تاریکی نگه داشته شد در حالی که صفحه دیگر به مدت 10 دقیقه با دمای 29-32 درجه سانتیگراد تحت تابش قرار گرفت. پس از آن، محیط سلولی با DMEM تازه بدون فنل قرمز جایگزین شد و به مدت 18 تا 22 ساعت انکوبه شد. پس از این دوره انکوباسیون، سلول های هر دو صفحه با DPBS شسته شدند و DMEM کامل حاوی 50 میکروگرم در میلی لیتر NR به هر چاهک اضافه شد و به مدت 3 ساعت انکوبه شد. پس از انکوباسیون با NR، محلول NR حذف شد و یک محلول دفع کننده NR (50 درصد اتانول: 1 درصد اسید استیک: 49 درصد آب مقطر) برای استخراج رنگ NR از سلول ها اضافه شد. برای روش خواندن، جذب در 540 نانومتر اندازه‌گیری شد. در داخل هر صفحه، کنترل DMSO مورد آزمایش قرار گرفت. داده های زنده ماندن سلولی به دست آمده از هر صفحه به عنوان نسبت جذب سلول های تیمار شده به سلول های کنترل حلال بیان شد و بیشتر برای تخمین مقادیر IC50 با استفاده از تحلیل رگرسیون خطی استفاده شد. مقدار Photo-Iritation-Factor (PIF) برای هر ماده آزمایشی به عنوان نسبت بین مقدار IC50 سلول های تابیده شده (Irr plus) در مقابل مقدار IC50 سلول های بدون تابش (Irr-) محاسبه شد. طبق دستورالعمل OECD، یک شاخص PIF کمتر از 2 عدم وجود اثر سمیت نوری را پیش‌بینی می‌کند، یک شاخص PIF بین 2 تا 5 یک اثر فوتوتوکسیک احتمالی را پیش‌بینی می‌کند، و PIF بالاتر از 5 یک اثر فوتوتوکسیک را پیش‌بینی می‌کند [23]. ترکیبات آزمایش شده در محدوده غلظت مورد بررسی قرار گرفتند: 12.5. 31.25; 62.5; 125; 250; 500 و 1000 میکرومولار. 3.6. تجزیه و تحلیل آماری همه داده ها به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد (SD) از حداقل سه آزمایش مستقل در سه تکرار ارائه شده است. برای تایید نرمال بودن و همگنی واریانس، از آزمون نرمال بودن همه‌گیر D'Agostino-Pearson و سپس از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی دانت (مقایسه با سلول‌های کنترل منفی با حلال) استفاده شد. انجام شد. نمودارها با نرم افزار GraphPadPrism برای ویندوز (نسخه 6.0، GraphPad Software, Inc. (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) تولید شدند.

4. نتیجه گیری

در این مطالعه، از روش گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر (ROS) و یک سنجش سمیت نوری جذب قرمز خنثی 3T3 (3T3 NRU-PT) برای بررسی رفتار آنتی‌اکسیدان‌های فنولی طبیعی هنگام قرار گرفتن در معرض تشعشعات مشابه نور خورشید به منظور بررسی واکنش نوری و سمیت نوری آنها استفاده شد. پتانسیل. نتایج به‌دست‌آمده به این نتیجه رسید که، اگرچه اسیدهای روتین و کافئیک، p کوماریک و فرولیک تابش نور مرئی UV را جذب می‌کنند و MEC بالاتر از 1000 L mol-1cm-1 را ارائه می‌کنند، اما به عنوان غیر نور فعال طبقه‌بندی می‌شوند. علاوه بر این، این ترکیبات هنگام آزمایش با استفاده از رده سلولی HaCaT، سمیت نوری را القا نکردند. داده های یافت شده نشان می دهد کهاین آنتی اکسیدان هاانتظار نمی رود که به خودی خود باعث سمیت نوری شوند و بنابراین می توان آنها را برای استفاده در فرمولاسیون های آرایشی بی خطر در نظر گرفت. از سوی دیگر، هنگامی که در حضور این آنتی‌اکسیدان‌ها یک اثر محافظتی نوری ممکن را آشکار می‌کرد، می‌توان افزایش زنده‌مانی سلول را در معرض تشعشع مشاهده کرد که می‌تواند مطالعه برای حمایت از استفاده از آنها به عنوان عوامل محافظت کننده نوری ممکن در فرمولاسیون‌های آرایشی جالب باشد. در مورد DOPAC، این ترکیب به نور واکنش نشان داد، اگرچه هیچ سمیت نوری در سنجش جذب قرمز خنثی 3T3 مشاهده نشد. با این حال، مطالعات بیشتری باید برای درک مکانیسم های پشت واکنش نوری DOPAC، اطمینان از ایمنی عکس آن، و همچنین برای درک نقش و رابطه بین ساختار شیمیایی و پتانسیل یک ترکیب برای واکنش نوری انجام شود. مشارکت های نویسنده: تحلیل رسمی، کارشناسی; Writing—Original Draft Preparation, BA; مفهوم سازی IFA، HC، و JG: منابع، IFA، HC، JMSL، و JG. نوشتن — بررسی و ویرایش، IFA، HC، JMSL، و JG. نظارت، IFA، HC، و JG. تامین مالی، IFA، HC، JMSL، و JG همه نویسندگان نسخه منتشر شده این مقاله را خوانده و با آن موافقت کرده اند. بودجه: این تحقیق هیچ بودجه خارجی دریافت نکرده است. بیانیه هیئت بررسی موسسه: قابل اجرا نیست. بیانیه رضایت آگاهانه: قابل اجرا نیست. داده ها بیانیه در دسترس بودن: تمام داده های ارائه شده در این مطالعه در مقاله موجود است. تشکر و قدردانی: این کار توسط بودجه ملی از FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia، IP، در محدوده پروژه UIDP/04378/2020، UIDB تامین می شود. /04378/2020 واحد تحقیقاتی در علوم زیستی مولکولی کاربردی-UCIBIO و پروژه LA/P/0140/2020 موسسه AssociateLaboratory for Health and Bioeconomy-i4HB و UIDB/00081/2020 با کمک مالی FCT/DACTE. تضاد منافع: نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند. در دسترس بودن نمونه: قابل اجرا نیست.

منابع

1. Zillich، OV; شوایگرت-وایز، U. آیزنر، پی. Kerscher, M. Polyphenols به عنوان مواد موثره برای محصولات آرایشی و بهداشتی. بین المللی J. Cosmet. علمی 2015، 37، 455-464. [CrossRef]
2. Jelena، CH; جورجیو، آر. جاستینا، جی. ندا، م.-د. ناتاسا، اس. آرتور، بی. Giuseppe, G. اثرات مفید پلی فنول ها بر بیماری های مزمن و پیری. در پلی فنول ها: خواص، بازیابی و کاربردها. گالاناکیس، سی ام، اد. انتشارات وودهد: کیدلینگتون، بریتانیا، 2018; صص 69-102.
3. کوری، اچ. پاسارلی، اس. ستو، جی. تمز، م. Mattei, J. نقش پلی فنول ها در سلامت انسان و سیستم های غذایی: یک بررسی کوچک. جلو. Nutr. 2018، 5، 87. [CrossRef]
4. فراگا، سی جی; کرافت، KD; کندی، DO; Tomás-Barberán، FA اثرات پلی فنل ها و سایر مواد فعال زیستی بر سلامت انسان. عملکرد غذا 2019، 10، 514–528. [CrossRef]
5. برتلی، ا. بیاگی، م. کورسینی، ام. بائینی، جی. کاپلوچی، جی. میرالدی، ای. پلی فنول ها: از تئوری تا عمل. Foods 2021, 10, 2595. [CrossRef]
6. چن، ک. لو، پی. Beeraka، NM; سوکوچوا، OA; Madunapantula، SV; لیو، جی. سینلنیکوف، من؛ نیکولنکو، وی. Bulygin، KV; میخالوا، ال.ام. و همکاران جهش‌های میتوکندری و میتواپی ژنتیک: تمرکز بر تنظیم پاسخ‌های ناشی از استرس اکسیداتیو در سرطان پستان. سمین. سرطان بیول. 2020. [CrossRef] [PubMed]

7. فورمن، اچ ج. ژانگ، H. هدف قرار دادن استرس اکسیداتیو در بیماری: وعده و محدودیت های درمان آنتی اکسیدانی. نات. Rev. Drug Discov. 2021، 20، 689. [CrossRef] [PubMed]
8. Boo, YC آیا ترکیبات فنولی گیاهی می توانند از پوست در برابر ذرات معلق در هوا محافظت کنند؟ آنتی اکسیدان ها 2019، 8، 379. [CrossRef]
9. جسومانی، وی. دو، اچ. پی، پی. اسلم، م. Huang, N. مطالعه مقایسه ای بر روی فعالیت محافظت از پوست عصاره غنی از پلی فنل و عصاره غنی از پلی ساکارید از Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [CrossRef] [PubMed]
10. صراف، س. Kaur، CD Phytoconstituents به عنوان فرمولاسیون آرایشی جدید محافظ نور. Pharmacogn. Rev. 2010, 4, 1-11. [CrossRef]