نانوزیم های تقلید کننده کاتالاز حساس به التهاب، آسیب حاد کلیه را از طریق معکوس کردن استرس اکسیداتیو موضعی کاهش می دهند Ⅱ

توزیع زیستی آنزیم PTC-M در موش IRI

توزیع زیستی PTC در موش IRI با بارگذاری رنگ فلورسنت IR780 به عنوان یک داروی مدل (PTC-IR780) مورد بررسی قرار گرفت. ما همچنین توزیع زیستی PC-IR780 و IR780 را به تنهایی مقایسه کردیم و مشاهده کردیم که همه گروه‌ها فلورسانس را در اندام‌های اصلی نشان دادند، اما PTC-IR780 برخلاف گروه PC-IR780 یا IR780 تجمع افزایش یافته‌ای را در کلیه نشان داد (پرونده اضافی 1: شکل S14 A ). ما همچنین نمایه توزیع زیستی PTC-IR780 را در موش‌های معمولی بررسی کردیم و دریافتیم که تجمع کبدی بالاتری را نشان می‌دهد که برای نانوذره پس از تزریق داخل وریدی رایج است اما در کلیه‌ها تجمع چندانی ندارد (فایل اضافی 1: شکل S15). بنابراین، نتیجه می گیریم که افزایش یافته استکلیهانباشتPTC عمدتاً توسط التهاب کلیه ایجاد می شود. ما در مطالعه خود نانو میسل های PTC را به گونه ای طراحی کردیم که در خون به گردش در می آیند و به تدریج در محل التهاب تجمع می یابند و پس از رسیدن به محل التهاب، PTC با وجود ROS تقویت شده بی ثبات می شود و IR780 بارگذاری می شود. آزاد می شود که برای مدت طولانی تری در کلیه باقی می ماند و منجر به افزایش فلورسانس می شود. تجمع کلیه در بین همه گروه ها با کمی کردن شدت فلورسانس ex-vivo مقایسه شد و مشاهده شد که PTC برتری را نشان داد.تجمع کلیهحتی اگر فلورسانس را در سایر ارگان های اصلی نشان دهد که در صورت تزریق سیستمیک اجتناب ناپذیر است (پرونده اضافی 1: شکل S14 B) همانطور که در شکل 6A نشان داده شده است، شدت فلورسانس قوی IR780 در کلیه ها از 6 ساعت پس از تزریق PTC مشاهده شد. -IR780. شدت فلورسانس اندام های اصلی در ترتیب کبد، ریه ها، طحال و کلیه ها بالا بود. شدت فلورسانس سایر اندام ها با گذشت زمان کاهش یافت، در حالی که شدت فلورسانس کلیه ها تا ساعت 48 نسبتاً ثابت باقی ماند. بنابراین،شدت فلورسانس کلیه هادر مقابل کبد تمایل به افزایش تدریجی در طول زمان داشت (شکل 6B). این می تواند با مطالعات قبلی که گزارش داده اند افزایش درالتهاب کلیهمی تواند منجر به افزایش نفوذپذیری عروق و در نتیجه افزایش تجمع NMs در کلیه ها شود [16]. توزیع زیستی بیشتر با بررسی محتوای منگنز در اندام‌های مختلف با استفاده از آنالیز طیف‌سنج جرمی پلاسمایی جفت القایی (ICP-MS) تأیید شد. همانطور که در شکل 6C نشان داده شده است، غلظت منگنز در هر دو کلیه در 6 ساعت پس از تزریق به اوج خود رسید و به تدریج تا 48 ساعت کاهش یافت. هنگام مقایسه غلظت منگنز بافتی با سایر اندام های اصلی، کلیه ها در هر نقطه زمانی به غلظت منگنز بافتی بالاتری نسبت به کبد، ریه ها و طحال رسیدند. برای تایید پاکسازی PTCM، تجزیه و تحلیل ICP-MS تمام اندام‌ها، مدفوع و ادرار را در پایان مطالعه انجام دادیم و پس از یک هفته مشاهده کردیم که بخش عمده‌ای از منگنز در روده و مدفوع نشان داده شده است. . مشاهده شد که کلیرانس منگنز در درجه اول یک مسیر کبدی صفراوی به جای کلیرانس کلیوی در پیش گرفت. ما فرض می کنیم که پس از انباشته شدن در کلیه، نانوذره Mn3O4 به یون منگنز تجزیه می شود که از پاکسازی کبدی صفراوی معمول منگنز پیروی می کند (پرونده اضافی 1: شکل S16)[17].

گیاهان ارگانیک برای بیماری کلیه

آنزیم PTC-M نشانگرهای آسیب کلیوی را کاهش می دهد و تغییرات مورفولوژیکی در کلیه موش IRI را کاهش می دهد.

در نهایت، ما یک آزمایش in vivo برای تعیین اثربخشی PTC-M برای کاهش آسیب کلیوی در IRI کلیه انجام دادیم. برای بررسی وضعیت کلی خسارت درکلیه های IRIما لیپوکالین مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز پلاسما (NGAL)، یک نشانگر شناخته شده آسیب لوله ای در AKI را اندازه گیری کردیم [18]. سطح NGAL پلاسما در گروه IRI به طور قابل توجهی بالاتر از گروه شم بود، اما با درمان PTC-M کاهش یافت (شکل 7B). ما رنگ آمیزی دوره ای اسید شیف (PAS) را انجام دادیمبخش های کلیهبرای بررسی تغییرات مورفولوژیکی (شکل 7C). بر خلاف موش های شم، تورم لوله های کلیوی و اتساع پر شده با مواد نکروز مشاهده شد. سلول های التهابی متورم فضاهای بینابینی در کلیه موش IRI مشاهده شد. این تغییرات با درمان PTC-M بهبود یافت. تورم لوله‌ای، مواد نکروزه در لوله‌ها و انفیلتراسیون سلولی التهابی در موش‌های IRI تحت درمان با PTC کاهش یافت. بر خلاف تغییرات در لوله ها، هیچ تفاوت مورفولوژیکی قابل توجهی در گلومرول ها در هر گروه مشاهده نشد.

PTC-M التهاب و آپوپتوز را در کلیه موش های IRI بهبود می بخشد

برای بررسی اینکه آیا PTC-M می‌تواند حرکت نوزاد ناشی از آسیب اکسیداتیو را کاهش دهد، سطح بیان پروتئین HO{1}} را با تجزیه و تحلیل وسترن بلات برای ارزیابی درجه استرس اکسیداتیو در کلیه‌های موش IRI بررسی کردیم. ما سطوح بیانی قابل توجهی HO{2}} را در کلیه موش‌های IRI پیدا کردیم که با درمان PTC-M کاهش یافت (شکل 8A). رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای HO{5}} بیانگر افزایش یافته آن در مزانژیوم گلومرول‌ها، فضاهای اطراف گلومرولی و فضای بینابینی اطراف لوله‌ای کلیه‌های موش IRI بود که در کلیه‌های موش تحت درمان با PTC-M کاهش یافت (شکل 8C). برای روشن کردن التهاب فعال در کلیه موش‌های IRI، سطوح رونوشت سیتوکین‌های پیش التهابی و مولکول‌های چسبندگی را با تجزیه و تحلیل کمی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (qPCR) بررسی کردیم (شکل 8B). سطوح بیان mRNA اینترلوکین (IL)، پروتئین جذب کننده شیمیایی مونوسیت (MCP){11}}، فاکتور نکروز تومور (TNF)-، مولکول چسبندگی داخل سلولی (ICAM){13}}، چسبندگی سلول های عروقی مولکول (VCAM{14}})، و فاکتور رشد تبدیل کننده (TGF) - به طور قابل توجهی در کلیه موش های IRI افزایش یافت و درمان با PTC-M این تغییرات را سرکوب کرد (شکل 8B). رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای F4/80، نشانگر ماکروفاژهای موش، افزایش بیان را در فضاهای پری گلومرولی و بینابینی کلیه‌های موش IRI نشان داد که با درمان PTC-M نیز کاهش یافت (شکل 8C). این داده ها نشان می دهد که PTC-M التهاب کلیه و استرس اکسیداتیو را در موش IRI سرکوب می کند.

برای ارزیابی میزان مرگ سلولی لوله‌های کلیوی در موش IRI، سطح بیان پروتئین پروتئین‌های آپوپتوز مورد ارزیابی قرار گرفت. ایمونوبلات افزایش نسبت Bax/Bcl{0}} و کاهش نسبت کاسپاز 3/کاسپاز 3 را در بافت کلیه موش IRI نشان داد که نشان می‌دهد آپوپتوز تشدید شده است (شکل 9A). این تغییرات در موش های تحت درمان با PTC-M مشاهده نشد. درمان PTC-M به طور قابل توجهی آبشارهای آپوپتوز را در کلیه موش های IRI ناشی از استرس اکسیداتیو کاهش داد. برای تعیین اینکه آیا PTC-M آپوپتوز با واسطه ROS را از طریق پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) مهار می کند یا خیر، ما تغییرات در مسیر سیگنالینگ MAPK را تخمین زدیم. ما آنالیز immunoblot را برای سطوح پروتئین مسیر MAPK و اشکال فسفریله (فعال شده) آنها انجام دادیم (شکل 9B). سطوح ERK، JNK، و P38 فسفریله در کلیه موش‌های IRI در مقایسه با موش‌های شم، که توسط PTC-M ضعیف شدند، افزایش یافت، اگرچه کاهش قابل‌توجهی در JNK فسفریله مشاهده نشد. رنگ آمیزی ترمینال دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز dUDP نیک اند (TUNEL) سلول های اپی تلیال لوله ای مثبت TUNEL بیشتری را در قشر کلیه موش های IRI در مقایسه با موش های شم نشان داد، در حالی که درمان PTC-M تعداد سلول های TUNEL مثبت را کاهش داد (شکل. 9C). نتایج نشان می‌دهد که PTC-M با تأثیر بر مسیر سیگنالینگ MAPK، آپوپتوز را در کلیه‌های موش IRI کاهش می‌دهد. این یافته‌ها در کلیه‌های موش IRI با نتایج در سلول‌های کلیه انسان تحریک‌شده با H2O مطابقت داشت و مکانیسم مشترک حفاظت کلیوی PTC-M را نشان می‌داد. رنگ‌آمیزی H&E بر روی اندام‌های اصلی جمع‌آوری‌شده از گروه‌های نرمال و تحت درمان با PTC-M انجام شد و هیچ تغییر بافت‌شناسی عمده‌ای که نشان‌دهنده آسیب باشد مشاهده نشد (پرونده اضافی 1: شکل S17).