تجزیه و تحلیل یکپارچه Omics مسیرهای مرتبط با التهاب میکروواسکولار را در بیوپسی آلوگرافت کلیه آشکار می کند

edmund.chen@wecistanche.com

در پیوند اعضای جامد، microRNA ها (miRNAs) به عنوان بازیگران کلیدی در تنظیم عملکرد سلول های آلوگرافت در پاسخ به آسیب ظاهر شده اند. برای به دست آوردن بینشی در مورد نقش miRNA ها در رد با واسطه آنتی بادی، یک فنوتیپ رد که از نظر بافت شناسی توسط التهاب میکروواسکولار تعریف می شود،کلیه بیوپسی های آلوگرافت در معرض miRNA و همچنین پروفایل RNA پیام رسان (mRNA) قرار گرفتند. با استفاده از یک فرآیند انتخاب چند مرحله ای منحصر به فرد مخصوص مطالعه BIOMARGIN (همگروهی کشف، N=86؛ گروه انتخاب، N=99؛ کوهورت اعتبار سنجی، N=298)، شش miRNA با بیان متفاوت به طور پیوسته شناسایی شدند: miR-139-5p (پایین) و miR{4}}p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (بالا). سطح بیان آنها به تدریج با شدت التهاب میکروواسکولار همبستگی داشت. ویژگی سلولی ژن‌های هدف miRNA با ادغام اهداف mRNA درون vivo آنها با توالی‌یابی RNA تک سلولی از یک گروه بیوپسی آلوگرافت مستقل مورد بررسی قرار گرفت. بیان miR{11}} مشتق از اندوتلیال با بیان ژن‌های مرتبط با MHC همبستگی منفی داشت. در مقابل، بیان بیش از حد miR{14}} مشتق از اپیتلیال به شدت با هموستاز الکترولیت های کلیه تخریب شده و مسیرهای مربوط به سیستم ایمنی سرکوب شده مرتبط بود. در سلول‌های ایمنی، miR{16}}p فعال‌سازی NF-kB را در لنفوسیت‌های T تنظیم می‌کند، در حالی که miR{18}}p پیوند mRNA را در سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن تنظیم می‌کند. در مجموع، omics یکپارچه ما را قادر ساخت تا مسیرهای جدیدی درگیر در التهاب ریز عروقی را بشناسیم و پیشنهاد کنیم که تغییرات متابولیسم در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای در نتیجه رد پادتن با واسطه، فراتر از محفظه اندوتلیال مجاور رخ می‌دهد.

کلید واژه ها:پیوند کلیه، microRNA، multi-omics، التهاب میکروواسکولار، رد پادتن با واسطه

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مقدمهکه درپیوند کلیه(KT)، آسیب آلو ایمنی معمولاً به دو نوع رد آلوگرافت با توجه به توزیع فضایی نفوذ ایمنی و اطلاعات مربوط به وجود یا عدم وجود آنتی بادی های ضد HLA اختصاصی دهنده تقسیم می شود. تشخیص بر اساس بیوپسی آلوگرافت با درجه بندی ضایعات بافت شناسی بر اساس طبقه بندی اجماع بین المللی بنف (1) است. توبولیت (ضایعه "t") و التهاب بینابینی (ضایعه "I") ویژگی های بافتی بارز رد سلول های T (TCMR) هستند و به سمیت سلولی مستقیم به محفظه توبولو بینابینی مربوط می شوند. رد با واسطه آنتی بادی (ABMR) اغلب با آنتی بادی های ضد HLA در گردش همراه با التهابی است که بخش میکروواسکولار را هدف قرار می دهد. ضایعات بافت شناسی فعال ABMR شامل حضور سلول های تک هسته ای در مویرگ های گلومرولی ("ضایعه") و در مویرگ های اطراف لوله ای (ضایعه "ptc") است که در مجموع به عنوان "التهاب میکروواسکولار" (MVI) شناخته می شود. در ABMR فعال مزمن، آسیب بافتی مزمن مانند گلومرولوپاتی پیوند یا فیبروز انتیما شریانی به این ضایعات حاد اضافه می شود (1). با استفاده از عوامل سرکوب کننده سیستم ایمنی هدفدار سلول T فعلی، TCMR در نظر گرفته می شود که تأثیر پیش آگهی محدودی دارد، در حالی که ABMR یک علت اصلی شکست پیوند است که به فقدان رویکردهای درمانی کارآمد مربوط می شود (2).

به منظور یافتن درمان های بهتر برای MVI و ABMR، بینش بهتری در مکانیسم های بیولوژیکی زیربنایی این فرآیندهای آسیب مورد نیاز است. به نظر می‌رسد فناوری‌های omics با کارایی بالا برای این هدف مناسب هستند، زیرا امکان غربالگری دقیق و همزمان هزاران ژن، پروتئین و متابولیت را فراهم می‌کنند (3). بازجویی کل رونویسی ازکلیهبیوپسی آلوگرافت تغییرات عمیق بیان ژن mRNA را در سلول های ساکن آسیب دیده یا در جمعیت های سلولی در حال نفوذ در طول ABMR (4) نشان داده است. در همین حال، microRNA ها (miRNA ها) با تنظیم RNA پیام رسان (mRNA) در سطح پس از رونویسی، به عنوان بازیگران کلیدی در متابولیسم سلول ظاهر شده اند. در واقع، miRNA ها درک ما از تنظیم دقیق فرآیندهای فیزیولوژیکی بدن درگیر در تکثیر، آپوپتوز، تمایز و توسعه را متحول کردند (5). جای تعجب نیست که بیان miRNA نامنظم منجر به ایجاد بسیاری از آسیب شناسی ها از جمله می شودبیماری کلیوی(6). از آنجایی که پروفایل های بیان miRNA بین وضعیت های بیمار و سالم متفاوت است، بسیاری از مطالعات miRNA ها را به تنهایی یا در ترکیب با سایر نشانگرهای سنتی تر، نه تنها برای تشخیص بیماری و پیش بینی پیشرفت بیماری، بلکه برای طراحی کاربردهای درمانی بالقوه تجزیه و تحلیل کرده اند (7).

در زمینه پیوند عضو جامد، miRNA ها ممکن است از طریق نقش خود در تنظیم عملکرد سلول های ایمنی و در پاسخ سلول های ساکن آلوگرافت به آسیب، در رد شدن نقش داشته باشند (6،8). چندین مطالعه miRNA های آلوگرافت را به عنوان نشانگرهای زیستی و/یا اثرگذار در تنظیمات TCMR مورد بررسی قرار داده اند (8،9)، اما هیچ کدام تا کنون بر MVI و ABMR تمرکز نکرده اند. در این مطالعه، هدف ما ادغام سطوح مختلف omics ازکلیهبیوپسی آلوگرافت، برای به دست آوردن بینشی در مورد نقش miRNA ها در این فنوتیپ رد مضر.

مواد و روشها طراحی مطالعهاین مطالعه بخشی از FP{0}}BIOMARkers استکلیویبرنامه تحقیقاتی آسیب های پیوندی (BIOMARGIN، https://cordis.europa. eu/project/id/305499، ClinicalTrials.goy، شماره NCT02832661)، به رهبری یک کنسرسیوم تحقیقاتی اروپایی در جستجوی نشانگرهای زیستی ضایعات ایمنی آلوگرافت درپیوند کلیهگیرندگان، با ارزش تشخیصی و/یا پیش آگهی. BIOMARGIN یک مطالعه چند مرکزی، آینده نگر و چند فازی است که در چهار انجام شده استپیوند کلیهمراکز در اروپا (بیمارستان نکر، پاریس، فرانسه؛ بیمارستان های دانشگاه، لوون، بلژیک؛ دانشکده پزشکی هانوفر، هانوفر، آلمان؛ و بیمارستان دانشگاه، لیموژ، فرانسه). نمونه‌ها در زمان غربالگری و بیوپسی‌های اندیکاسیون بین آوریل 2013 و ژوئن 2015 جمع‌آوری شدند (شکل IA). همه پیوندها با تطابق متقاطع سمیت سلولی وابسته به مکمل منفی انجام شد. در این چهار مرکز بالینی، بیوپسی های پروتکل در 3، 12 و گاهی 24 ماه پس از پیوند، طبق رویه مرکز محلی، علاوه بر بیوپسی های اندیکاسیون انجام شد. هیئت بازبینی سازمانی در هر سایت مطالعه را تأیید کرد و همه بیماران رضایت آگاهانه کتبی ارائه کردند.

گروه های مطالعهاین مطالعه به سه فاز تقسیم شد (شکل 1A). در مرحله اول کشف مورد شاهدی، از نمونه‌های بیوپسی N{2}} برای تجزیه و تحلیل بیان سراسری miRNA (N{3}} miRNA‌ها، به استثنای miRNA‌های نرمال‌کننده بالقوه) استفاده شد. . ما نمونه ها را بر اساس در دسترس بودن و معیارهای بافت شناسی (به استثنای موارد با تشخیص گلومرولونفریت یا نفروپاتی مرتبط با پلیوماویروس و موارد با تشخیص نامشخص) انتخاب کردیم. بر اساس قرائت‌های بیوپسی محلی، اولین انتخاب انجام شد که از طریق قرائت مرکزی توسط گروهی از آسیب‌شناسان مستقل از مرکز اصلی، بیشتر اصلاح شد. تجزیه و تحلیل آماری (به انتخاب miRNA مراجعه کنید) برای انتخاب لیست توسعه یافته miRNA ها، که بیشترین تفاوت را بین فنوتیپ های بافت شناسی بیان می شود، که متعاقباً در مرحله دوم کمی سازی شدند، استفاده شد.

یک طرح مطالعه مورد-شاهدی مشابه برای مرحله دوم (انتخاب) استفاده شد، جایی که تجزیه و تحلیل بیان هدفمند miRNA (N=143) بر روی نمونه‌های بیوپسی N=99 انجام شد. همان خط لوله آماری برای انتخاب یک لیست محدودتر از miRNAها اعمال شد تا پس از آن در مرحله 3 کمیت شود. در نهایت، در گروه سوم (اعتبارسنجی)، تمام نمونه‌ها به‌طور آینده‌نگر و متوالی بر اساس پروتکل BIOMARGIN بین 24 ژوئن 2014 تا 2 ژوئیه 2015 و با مقدار کافی جمع‌آوری شدند.کلیهکیفیت بیوپسی آلوگرافت، برای 38 miRNA انتخاب شده در نتیجه مرحله انتخاب دوم ارزیابی شد. در این کوهورت تنظیمات واقعی، هیچ انتخابی بر اساس بافت شناسی، جمعیت شناسی، زمان یا هر عامل دیگری به جز معیارهای در دسترس بودن نمونه و کنترل کیفیت (کفایت بیوپسی و بازده RNA) انجام نشد.

انتخاب miRNAیک خط لوله آماری قوی به طور خاص برای مطالعه BIOMARGIN در R(R Core Team(10)، نسخه 1.0.44)، به عنوان توسعه بسته بیوسیگنال R (1l) توسعه داده شد. به طور خلاصه، در مرحله کشف، ما یک استراتژی انتخاب ویژگی شامل رویکردهای تک متغیره و چند متغیره را انجام دادیم. برای انتخاب تک متغیره، از یک آزمون ناپارامتریک (آزمون ویلکاکسون-من-ویتنی) و یک آزمون پارامتریک (آزمون t-استودنت) و یک گروه کشف (BIOS{8}}، BIOS-06-0238) استفاده کردیم. نمرات پیش‌بینی هر رونوشت miRNA در هر مدل چند متغیره برای به دست آوردن یک "نمره چند متغیره" ادغام شد. با ترکیب نتایج این تحلیل‌های تک متغیره و چند متغیره، ما توانستیم زیرمجموعه‌ای از کاندیداهای miRNA را رتبه‌بندی و انتخاب کنیم تا بخشی از فهرست توسعه‌یافته برای تعیین کمیت در مرحله بعدی باشند.برای این تجزیه و تحلیل posthoc با تمرکز بر مسیرهای VMI، میانگین بیان نرمال شده هر miRNA بین موارد و گروه شاهد با استفاده از آزمون Wilcoxon در هر سه گروه مقایسه شد. ما آزمایش‌های چندگانه را با استفاده از روش نرخ کشف کاذب بنجامینی و هوچبرگ (FDR) کنترل کردیم.

ارزیابی بالینی پاتولوژیکنمرات ضایعات بافتی فردی به صورت نیمه کمی بر اساس معیارهای Banff 2019 ارزیابی شد (16). اصطلاح "التهاب میکروواسکولار" (MVI) برای اشاره به هر درجه ای از ترکیب گلومرولیت (g) و/یا مویرگ پری لوله ای (ptc) استفاده شد. همه موارد ABMR دارای 2 معیار اول طبقه بندی Banf 2015 یا Banff 2017 (هیستولوژیک) بودند. شواهد آسیب حاد بافتی و شواهد برهمکنش آنتی بادی فعلی/اخیرا با اندوتلیوم عروقی)، اما همه معیار سوم [شواهد سرولوژیک آنتی‌بادی‌های اختصاصی دهنده (DSA)و/یا رنگ‌آمیزی CAd] را برآورده نمی‌کنند. DSAs پس از پیوند در هر مرکز محلی تعیین شد، با DSA مثبت به عنوان آنتی بادی ضد HLA سرم اختصاصی دهنده قابل تشخیص با میانگین شدت فلورسانس (MFI) مقدار 500 در زمان بیوپسی یا هر زمان قبل از آن.

استخراج RNA از نمونه های بیوپسی برای پروفایل mRNA و miRNAاز هر کدام دو هسته سوزنی گرفته شدکلیهبیوپسی آلوگرافت یکی برای درجه بندی بافت شناسی معمولی استفاده شد و حداقل نیمی از دیگری بلافاصله در معرف بافتی Allprotect (Qiagen Benelux BV، Venlo، هلند) ذخیره شد. لوله های Allprotect در دمای 4C (حداقل 24 ساعت تا حداکثر 72 ساعت) ذخیره شدند. ، و سپس در درجه{3}} تا استخراج RNA ذخیره می شود. RNA کل از آن جدا شدکلیهنمونه‌های بیوپسی آلوگرافت با استفاده از کیت جهانی Allprep DNA/RNA/miRNA (Qiagen Benelux BV) روی ابزار QIAcube (Qiagen Benelux BV). مقدار (جذب در 26{{2{24}}}} نانومتر) و خلوص (نسبت جذب در 230260 و 280 نانومتر) RNA جدا شده با استفاده از اسپکتروفتومتر NanoDrop ND{4}} (Thermo) اندازه‌گیری شد. Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV، گنت، بلژیک). عدد یکپارچگی RNA (RIN) با کیت RNA نانو/پیکو یوکاریوت (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgium) بر روی ابزار Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV) ارزیابی شد. شاخص‌های کنترل کیفیت بین VMI و No تفاوت معنی‌داری نداشتند. MVIgroups [RIN(mean±SD):5.6±1.96vs5.4±1.97,P{14}}.66;260/280 ratio (mean±SD):1.87±0.06 vs 1.87±0.1l,P{26 }}.40]. برای نمونه های RNA با RIN پایین (<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

سیستانچ دیالیز کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

پروفایل miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 بیان نشده در نظر گرفته شد. RNU44 و RNU48 بیان ثابتی را در تمام نمونه‌ها نشان دادند. میانگین ضریب تغییرات (RNU44 به علاوه RNU48) در کارت آرایه A 3.73 درصد و در کارت آرایه B 3.79 درصد بود و به عنوان ژن‌های خانه‌دار برای نرمال‌سازی داده‌ها در تمام مطالعات فرعی استفاده شدند.

تجزیه و تحلیل ترانس کریپتومی mRNAهمانطور که قبلاً توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل ترانویسی توسط ریزآرایه انجام شد (17). به طور خلاصه، RNA کل استخراج‌شده از نمونه‌های بیوپسی ابتدا با استفاده از کیت معرف GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) به RNA مکمل (cRNA) بیوتینیله شد و با آرایه‌های ژنوم انسانی Affymetrix GeneChip U133 Plus 2 ({{2) هیبرید شد. Affymetrix) که شامل 54675 مجموعه کاوشگر بود که کل ژنوم را پوشش می داد. ما از نرمال سازی میانگین چند تراشه قوی (RMA) استفاده کردیم. بیان عادی شده متوسط ​​هر mRNA بین افراد مورد و شاهد با استفاده از آزمون Wilcoxon مقایسه شد. تورم آلفای ریسک ناشی از آزمایش‌های چندگانه را با استفاده از روش نرخ کشف کاذب بنجامینی و هوچبرگ (FDR) کنترل کردیم. داده‌های ریزآرایه مطابق با دستورالعمل‌های Minimum Information About Microarray Experiment اداره می‌شوند.

در Silico Analysesنرم افزار تفسیر بیولوژیکی آزمایش های چندگانه (BIOMEX) برای تجزیه و تحلیل دیفرانسیل داده های رونویسی، با استفاده از حاشیه نویسی Ensembl ID (18) استفاده شد. تجزیه و تحلیل مسیر هوشمندی (IPA، ساخت: 478438M نسخه محتوا: 44691306، Qiagen) و OMICSnet(19) برای تعیین مجموعه‌های ژن‌های تنظیم‌شده توسط miRNA‌های انتخابی استفاده شد. OMICSnet برای انجام تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن با پایگاه داده مسیر Reactome، با استفاده از مسیر کامل (20) استفاده شد. ساخت شبکه‌های ژنی کاملاً بدون نظارت بود و بر تعداد برهمکنش‌های مولکولی گزارش‌شده هر ژن با همه ژن‌های دیگر در شبکه تکیه داشت. ژن‌هایی که بیشترین تعداد برهمکنش‌ها را ارائه می‌کنند به‌طور خودکار در مرکز شبکه قرار می‌گیرند، در حالی که ژن‌هایی با تعداد کمتری از برهمکنش‌ها در محیط پخش می‌شوند. منشاء سلولی miRNA های انتخاب شده با استفاده از پروژه Fantom5 (21) مورد بررسی قرار گرفت، که تجزیه و تحلیل کلامی از بیان ژن در سلول ها و بافت های انسانی ارائه می دهد. برای تجزیه و تحلیل بیان miRNA، ما همه را در نظر گرفتیمکلیهسلول های ساختاری مرتبط و همه سلول های خونساز در گردش، بدون انتخاب بیشتر.

تجزیه و تحلیل داده های توالی RNA تک سلولیداده‌های توالی‌یابی RNA تک سلولی انسانی (siRNA-seq) منتشر شده قبلی از دو بیوپسی ABMR و چهار مرجع سالم مربوط به بیوپسی‌های نظارت پیوند استفاده شد. تعداد یا ماتریس های خام مرتبط به ترتیب از GEO(GSE145927، https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) وکلیهپروژه پزشکی دقیق (KPMP، https://atlas.kpmp.org/repository). ماتریس های بیان ژن خام تولید شده در هر نمونه با استفاده از بسته Seurat V4 (23) ادغام و تجزیه و تحلیل شدند. پارامترهای اعمال شده برای ایجاد و فیلتر اشیاء Seurat به شرح زیر بود: شامل سلول هایی که بین 500 تا 10000 ژن شناسایی شده و کمتر از 25 درصد رونوشت های میتوکندری را بیان می کنند. پس از فیلتر کردن، همه اشیا با استفاده از گردش کار ادغام SCTransform در Seurat یکپارچه شدند (24). به طور خلاصه، 3000 ویژگی برای ادغام با استفاده از تابع PrepSCTIntegration و تابع FindIntegrationAnchors برای محدود کردن اثر دسته ای استفاده شد. با استفاده از تابع DimPlot و 16 جزء اصلی، یک مجموعه داده تقریب و طرح ریزی منیفولد کامل (UMAP) ایجاد شد. خوشه ها با استفاده از توابع FindNeighbors و FindClusters با وضوح 0.6 ساخته شدند. شناسایی خوشه با استفاده از تابع FeaturePlot با ارزیابی بیان نشانگرهای خاص در هر خوشه انجام شد. نمودارهای نقطه‌ای با استفاده از توابع ترسیم نقطه‌ای و FeaturePlot، با شمارش نرمال‌شده در سنجش RNA به عنوان داده‌های ورودی، تولید شدند.

سیستانچ عفونت کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

تحلیل آماریویژگی‌های بیمار و اهداکننده با اعداد، درصد و فرکانس برای متغیرهای طبقه‌بندی توصیف شد. ما متغیرهای پیوسته را با استفاده از میانگین و انحراف استاندارد (SD) در صورت توزیع نرمال، میانه‌ها و محدوده‌های بین چارکی (IQR) برای متغیرهایی با توزیع اریب گزارش کردیم. ما ویژگی های آنها را با استفاده از آزمون فیشر یا ویلکاکسون در صورت لزوم مقایسه کردیم. ما از آزمون کروسکال-والیس برای مقایسه بیان miRNA میانه با توجه به شدت MVI و آزمون اسپیرمن برای تجزیه و تحلیل همبستگی استفاده کردیم. ما اهمیت آماری را برای مقادیر P کمتر از 0 در نظر گرفتیم.05. ما از GraphPad Prism (نسخه 8؛ GraphPad Software، San Diego، CA) و RStudio (نسخه 4.{14}}.3) برای تجزیه و تحلیل آماری و ارائه داده ها استفاده کردیم. بسته‌های R زیر مورد استفاده قرار گرفتند: Heatmap3 (Heatmap3_1.1.9)برای تجزیه و تحلیل نقشه‌های حرارتی، fmsb(fmsb_0.7.0)و مقیاس‌ها (مقیاس‌ها_1.1.1) بسته‌هایی برای نمودارهای راداری، ggplot2 (ggplot{19}}.3.5) برای نمودارهای میله ای، و complot(corrplot_0.90) برای تجزیه و تحلیل ماتریس همبستگی.

نتایج

شناسایی چند مرحله ای miRNA های مرتبط با MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). 59 بیمار دیگر (MVI-) تشخیص های مختلفی شامل رد با واسطه سلول T (TCMR، N{4}})، فیبروز بینابینی و آتروفی توبولار (IFIA،N=20)، و بیوپسی طبیعی (N{{6) ارائه کردند. }})، اما MVI. از 754 کاندید miRNA، 18 miRNA به طور متفاوتی بین گروه های MVI plus و MVI- بیان شد (شکل 1B). در گروه انتخاب، یک لیست محدود از 143 miRNA در 99 نمونه اندازه‌گیری شد. در این گروه انتخابی، 14 miRNA بین موارد با (N{14}}) و بدون (N{15}})ABMR (شکل 1C) متفاوت بیان شد. در نهایت، در بزرگترین گروه مقطعی، 38 miRNA در 298 نمونه تعیین شد، که 12 miRNA به طور متفاوت بین بیوپسی‌های ABMR(N=29) در مقابل بدون ABMR (N=269) بیان شدند (شکل 1D). ).

شناسایی مداوم 6 MiRNA مرتبط با MVI و ارتباط آن با بافت شناسیدر مرحله بعد، ما 3 لیست miRNA های متفاوت بیان شده را قطع کردیم و 6 miRNA را شناسایی کردیم که به طور مداوم با MVI یا ABMR در 3 گروه مستقل مرتبط بودند (شکل 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p، miR-222-3p و miR-223-3p در MVI/ABMR بیش از حد بیان شدند، در حالی که بیان miR-139-5p کاهش یافت. نمودارهای رادار (شکل 2B) برای هر مرحله بیان تفاضلی بین مورد و کنترل 6 miRNA را نشان می دهد و از استحکام پروفایل های miRNA در سه گروه مستقل پشتیبانی می کند. در مرحله بعد، نحوه ارتباط بیان 6 miRNA با ضایعات بافتی فردی را در تمام 483 بیوپسی آلوگرافت مطالعه کردیم. بیان 5 miRNA تنظیم شده به تدریج با شدت ضایعات MVI افزایش یافت، در حالی که بیان miR{16}}p همبستگی منفی داشت (شکل 2C).MiR{18}}p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p نه تنها با ویژگی‌های مرتبط با ABMR (g, ptc, C4d رسوب) ارتباط زیادی داشت، بلکه با ضایعات مرتبط با TCMR (i, t ) و ضایعات IFTA (ct، ci)، که نشان دهنده دخالت آنها در فرآیندهای التهابی و اسکار مشترک، غیر اختصاصی ABMR است. متناوباً، ممکن است طبیعتاً مقداری همخطی ذاتی بین ضایعات وجود داشته باشد که منجر به ناتوانی ما در شناسایی ویژگی واقعی یک ضایعه می شود. MiR{28}}p با ضایعات بافتی TCMR یا IFTA ارتباط نداشت (شکل 2D).

ادغام Multi-Omics: تعامل mRNA-miRNA در MVدر مرحله بعد، ژن‌های بیان شده متفاوت بین موارد MVI plus و MVI- را در مجموعه اکتشافات منتشر شده قبلی (25) ارزیابی کردیم. از 54675 پروب، در مجموع 2755 ژن متفاوت بیان شده (DEGs) بین MVI plus و MVI- شناسایی شدند.

گروه ها، شامل 1085 ژن با تنظیم پایین و 1670 ژن با تنظیم بالا (شکل 3A). متفاوت ترین mRNA های بیان شده در نمونه های MVI plus CXCL9 و CXCL10 بودند، مطابق با گزارش های قبلی (17،26) که این ژن ها بیش از حد در ABMR بیان می شوند. در مرحله بعد، ما از IPA و OMICSnet برای شناسایی در سیلیکو ژن‌های هدف فرضی برای هر miRNA استفاده کردیم. در مجموع 4504 mRNA پیش بینی شده بود که توسط حداقل یکی از 6 miRNA مورد هدف قرار گیرند. سپس، ما این 4504 هدف پیش‌بینی‌شده را با DEGs در بیوپسی‌های آلوگرافت ادغام کردیم. تجزیه و تحلیل یکپارچه miRNA/mRNA 61 DEG مورد هدف miR{13}} را شناسایی کرد که به طور قابل توجهی در نمونه‌برداری‌های MVI به علاوه افزایش یافتند. همچنین 28، 58، 52، 43 و 27 درجه در نمونه‌برداری‌های MVI به‌علاوه کاهش قابل‌توجهی را شناسایی کرد که به ترتیب توسط miR{19}}p، miR{20}}p، miR-155-5p، miR {22}}p و miR{23}}p (شکل 3B).

منشاء سلولی miRNA های مرتبط با MVمنشا سلولی شش miRNA در موارد مختلف مشخص شدکلیهزیرگروه های سلولی و سلول های خونساز با استفاده از اطلس miRNA موجود به صورت آنلاین [پایگاه داده Fantom (27)]. خوشه بندی بدون نظارت تبعیض آمیز استکلیهmiRNA های مشتق شده از سلول از miRNA های مشتق از سلول ایمنی (شکل 4A). همچنین یک یا دو نوع سلول غالب را برای هر miRNA نشان داد. به نظر می‌رسد که MiR{3}} عمدتاً توسط سلول‌های اندوتلیال گلومرولی (EC) بیان می‌شود. MiR{4}}p، اگرچه بیان آن با التهاب لوله‌ای همبستگی نداشت (ضایعات Banff "t"، شکل 2D)، در درجه اول مربوط بهکلیهسلول های اپیتلیال چهار miRNA باقی مانده عمدتاً در سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMC) یا گرانولوسیت‌ها، با miR{0}}p غنی‌شده در سلول‌های NK و مونوسیت‌ها، miR-150-5p در سلول‌های CD4 پلاس و CD8 پلاس T، miR بیان شدند. -155-5p در CD19 به علاوه سلول‌های B و ماکروفاژها، andmiR-223-3p در نوتروفیل‌ها.

توالی یابی RNA تک سلولی همه سلول های کلیوی و سلول های ایمنی نفوذی را شناسایی کرد برای توصیف نقش بالقوه هر miRNA مرتبط با MVI، داده‌های sc-RNAseq در دسترس عموم را از دو مورد تجزیه و تحلیل کردیم.کلیهبیوپسی آلوگرافت با ABMR و امتیاز MVI بالا (g2، ptc3) (22). این مجموعه داده ها با 4 بیوپسی مرجع سالم بدون MVI ادغام شدند. پس از کنترل کیفیت و فیلتر کردن، 31545 سلول شناسایی شد و خوشه‌بندی بدون نظارت 12 خوشه را نشان داد (شکل 4B). ما از نشانگرهای تثبیت شده (28) برای شناسایی همه زیرگروه‌های سلولی ساکن و نفوذی و برچسب‌گذاری آنها استفاده کردیم (شکل S2 تکمیلی). در مرحله بعد، ما بر روی جمعیت های سلولی تمرکز کردیم که تصور می شد شش miRNA ما از آنها منشا گرفته اند. در این هدف، ما سلول ها را به 4 خوشه اصلی مربوط به اندوتلیوم، اپیتلیوم، لنفوسیت ها و APCs طبقه بندی کردیم (شکل 4C). مطابق با تجزیه و تحلیل قبلی این داده ها (22)، نه جمعیت سلول های نوتروفیل و نه NK در مجموعه داده های sc-RNASeg شناسایی نشدند.

miR{0}}p فعال‌سازی EC و مسیر ارائه آنتی‌ژن را در طول MVI کنترل می‌کندMiR{0}}p تنها miRNA تنظیم‌شده در مطالعه ما در موارد مبتلا به MVI/ABMR بود (شکل 2A) و مشخص شد که عمدتاً از EC گلومرولی منشأ می‌گیرد (شکل 4A). شصت و یک ژن هدف آن تأیید شد که در ریزآرایه‌های توده‌ای از موارد MVI به علاوه تنظیم می‌شوند (شکل 3B) و بیان آن‌ها در وضوح تک سلولی در 3 زیرخوشه EC شناسایی شده قبلی (شکل 4B,C) بیشتر مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 5A نشان داده شده است، ECcluster فعال شده فقط در نمونه های MVI plus قابل تشخیص بود. علاوه بر این، نیمی از 61 ژن (N{10}}) به طور مداوم در بیوپسی‌های sc-RNAseq MVI به‌علاوه بدون در نظر گرفتن سه گروه فرعی EC افزایش یافتند. در این میان، GBP5 بیشترین افزایش ژن را داشت. سپس، تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن با استفاده از این 30 رونوشت مشتق از اندوتلیال، UBE2D1 و YWHAG را به عنوان بازیگران مرکزی در شبکه ژن شناسایی کرد (شکل 5B). به طور خاص، مسیرهای مرتبط با ایمنی و مسیرهای پردازش و ارائه آنتی ژن با واسطه کمپلکس سازگاری بافتی اصلی (MHC) غنی شدند (شکل 5C). تجزیه و تحلیل شبه زمان برای مشخص کردن بهتر تغییرات بیان ژن در دوره فعال‌سازی EC انجام شد، مسیر وضعیت سلول‌ها (شکل‌های 5D، E)، UBE2D1، YWHAG و GBP5 به طور مداوم در طول فعال‌سازی اندوتلیال مرتبط با MVI افزایش یافت. مسیرهای بسیار مشابهی برای ژن‌های مرتبط با MHC HLA-A،-B و -DRA و همچنین برای نشانگرهای فعال‌سازی اندوتلیال و التهابی مانند VCAM1، CXCL9 و CXCL10 یافت شد، که نشان می‌دهد همه این ژن‌ها همزمان در طول فعال‌سازی اندوتلیال بیان می‌شوند. در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که miR{32}}p در طول ضایعات MV کاهش می‌یابد و دیگر مسیر ارائه آنتی‌ژن MHC را در EC فعال شده سرکوب نمی‌کند.

miR{0}}p هر دو را مختل می کندکلیویمسیرهای فیزیولوژیکی و مرتبط با ایمنی در سلول های اپیتلیال در طول MVI در مرحله بعد، روی miR{1}}p، یک miRNA تنظیم شده در نمونه های MVI با یککلیهمنشاء سلول های اپیتلیال و ارتباط انحصاری تر با ضایعات بافتی مرتبط با ABMR (شکل های 2A, D,4A). در بافت آلوگرافت حجیم، بیان 43 ژن هدف آن کاهش یافت (شکل 3B) و بیشتر در یک مورد ارزیابی شد. وضوح سلول در متفاوت استکلیهجمعیت های اپیتلیالی که قبلاً شناسایی کرده بودیم (شکل 4B, C). کاهش گسترده 41 مورد از این 43 ژن (95 درصد) در همه شناسایی شده استکلیهخوشه های سلولی اپیتلیال نشان دهنده خاموشی ژن است

نمایه در VMI (شکل 6A). جالب اینجاست که 4 ژن درکلیهمسیرهای فیزیولوژیکی (ERBB4، ATPIB1، TIMM50 و KIF3B)، اما همچنین ژن‌های مرتبط با ایمنی (TRAPI و PEBPI) به عنوان ژن‌های مرکزی در شبکه شناسایی شدند (شکل 6B). هستی شناسی ژنی ژن های 43 غنی سازی را در مسیرهای سیگنال دهی ErbB و همچنین در مسیرهای مرتبط با ایمنی و پاسخ سیتوکین (شکل 6C) و بیان ERBB4 در همه موارد تایید شد.کلیهسلول ها (شکل 6D). در مجموع، این نتایج نشان می دهد که در طول VMI، سطح بالایی از-222-3 p inکلیهسلول های اپیتلیال با سرکوب قوی ژن های درگیر در هر دو مرتبط استکلیهمسیرهای هموستاز الکترولیت و مسیرهای مرتبط با ایمنی در اپیتلیوم

miR{0}}p فعال‌سازی NF-kB را در لنفوسیت‌های T در طول MVI تنظیم می‌کند به طور مشابه، ما نقش تنظیمی (افزایش) miR-150-5p را در طول MVI در خوشه سلول T بررسی کردیم، که در آن بیشتر بیان شد. (شکل 4 الف). ما 58 DEG مرتبط با MVI کاهش یافته را که در نمونه های بیوپسی آلوگرافت انبوه شناسایی شده بودند ترسیم کردیم (شکل 3B) و آن را با بیان ژن در خوشه سلول T sc-RNAseq مواجه کردیم (شکل 7A). نسبت ژن‌هایی که هم توسط miR{11}}p هدف قرار می‌گیرند و هم به‌طور خاص در سلول‌های T در طول MVI کمتر بیان شده‌اند، به‌طور شگفت‌انگیزی کم بود (۱۵/۵۸،۲۵.۹ درصد) که نشان می‌دهد کاهش جهانی این ژن‌ها در داخل بدن منحصراً به دلیل محفظه لنفوسیت T با این وجود، از این فهرست بسیار انتخاب شده از 15 ژن و با استفاده از پلت فرم OMICSnet، ما یک شبکه ژنی (شکل 7B) ساختیم و تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن را انجام دادیم (شکل 7C). مشاهده کردیم که بیان بیش از حد miR{20}}p با NF مرتبط است. تنظیم KB در لنفوسیت های T در طول MVI.

miR{0}}p اتصال mRNA را در APCها در طول MV تنظیم می‌کند در نهایت، دقیقاً همان استراتژی برای ژن‌های هدف 52miR-155-5، که در طول MVI کمتر بیان شده‌اند، اعمال شد (شکل 3B). برخلاف miR-150-5p در لنفوسیت‌های T، ما مشاهده کردیم که تقریباً دو سوم ژن‌های هدف miR{6}}به‌طور پیوسته در خوشه APC sc-RNAseq کاهش یافت (31/52,59.6 درصد، شکل 8A). تجزیه و تحلیل شبکه ژن نشان داد که AIFMI و CIAO1 ژن های مرکزی هستند (شکل 8B). علاوه بر این، هستی شناسی ژن غنی سازی قوی را در مسیرهای مرتبط با پیوند mRNA نشان داد (شکل 8C).

بحثبا طراحی منحصر به فرد خود، مطالعه BIOMARGIN چارچوب معمولی برای یکپارچه سازی داده های چند omic است. در واقع، خطوط لوله بسیار قوی در هر دو گروه‌های کشف، انتخاب و اعتبارسنجی استفاده شد که تعداد زیادی از بیماران از مراکز مختلف پیوند را در بر می‌گرفت. در سه گروه مستقل، ما به طور همزمان نمایه بیان عجیب و غریب 6 miRNA را در طول MVI مشاهده و تأیید کردیم: miR{2}}p کاهش یافت در حالی که miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p و miR-223-3p افزایش یافت. نکته مهم این است که سطح هر یک از این 6 miRNA با شدت MVI در ارتباط بود که نشان‌دهنده یک مکانیسم تنظیم وابسته به دوز است. ما در مرحله بعد از پلتفرم های سیلیکونی برای بررسی هر منشا سلولی miRNA استفاده کردیم. به طور شگفت انگیزی، دو گروه متمایز از miRNA ها مشاهده شد: اولی که از سلول های ایمنی نفوذی مشتق شده بود و دومی که مختص به ساکنین بود.کلیهسلول ها. سپس، هم miRNA ها و هم mRNA ها در یک مجموعه اکتشافی از نمونه های بیوپسی اندازه گیری شدند، که امکان تجزیه و تحلیل یکپارچه ای از mRNA/miRNA های متفاوت بیان شده در داخل بدن مرتبط با MVI را فراهم می کند. در نهایت، پس از توصیف ارتباط mRNA ها/miRNA ها در وضوح بافت حجیم، تعامل mRNA ها/miRNA ها را در وضوح تک سلولی برای چهار مورد از 6 miRNA شناسایی شده تایید کردیم.

جالب است که miR{0}}p تنها miRNA بود که با ضایعات MVI همبستگی منفی داشت. این عمدتا از EC منشاء می گیرد و گزارش شده است که ژن های مرتبط با MHC را تنظیم می کند. در میان ژن‌های هدف آن، UBE2D1 در طول فعال‌سازی اندوتلیال مرتبط با MVI به شدت تنظیم شد. خانواده UBE2D یک خانواده آنزیم کونژوگه کننده یوبیکوئیتین E2 در سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم است (29، 30) و نشان داده شد که UBeD1 باعث افزایش یوبیکوئیتیناسیون در March-I می شود که منجر به افزایش تنظیم پروتئین های کلاس II MHC می شود (31). علاوه بر این، GBP5 نشان‌دهنده‌ترین EC غیرفعال‌شده ژن در طول MVI بود، که مطابق با گزارش‌های اخیر ما است که نشان می‌دهد GBP5 در بیوپسی‌های ABMR (17) و همچنین در نمونه‌های خون (32) به شدت تنظیم‌شده است. جالب توجه است که نشان داده شد که بیان GBP5 توسط اینترفرون نوع II در سلول‌های اندوتلیال ریز عروقی رحم انسان همراه با CXCL9 و CXCL10 القا می‌شود (33). نقش اولیه این دو کموکاین پیش التهابی در فرآیندهای رد حاد به خوبی ثبت شده است و سطح آنها در ادرار برای نظارت بر خطر رد حاد در نظارت معمول گیرندگان پیوند کلیه پیشنهاد شده است (34). هدف دیگر miR{23}p کدهای YWHAG.YWHAG برای خانواده پروتئین HLA-F است و به صورت متفاوتی در طی فرآیند پروفیبروتیک فعال در نفروپاتی دیابتی بیان شده است (35). نقش احتمالی miR{26}}p در فیبروز، یک مسیر مشترک نهایی پس از التهاب، بیشتر مرتبط است که IFTA اخیراً در یک امتیاز ترکیبی برای پیش‌بینی بقای پیوند کلیه پس از ABMR (36) گنجانده شده است. در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که miR{28}} دیگر بیان آنتی‌ژن MCH را در سطح Anethum در طول MVI سرکوب نمی‌کند و می‌تواند در شیمی‌جذب و فرآیند فیبروز شرکت کند، اما این مکانیسم‌ها همچنان تائید تجربی بیان در سطح اندوتلیوم در طول MVI و MVI هستند. می تواند در فرآیندهای شیمی جذب و فیبروز شرکت کند، اما این مکانیسم ها هنوز به طور تجربی تایید می شوند.

دومینکلیهmiRNA مشتق شده که ما شناسایی کردیم miR-222- 3p است، که مشخص شد بیان آن مختص ضایعات MVI است: با نمرات g و PTC و همچنین با رسوب C4d مرتبط است، اما نه با ضایعات i یا t. با این حال، عمدتا از سلول های اپیتلیال منشاء می گیرد. پس از ادغام چند omic در وضوح سلول، ما تعیین کردیم که miR{4}}به طور عمده سیگنالینگ ErbB را که برای عملکردهای اساسی سلولی، مانند تکثیر، مهاجرت، رشد و تمایز حیاتی است، سرکوب می کند (37). در زیست شناسی انسان، سیگنالینگ فیزیولوژیکی ErbB مورد نیاز استکلیههموستاز الکترولیت و حفظ یکپارچگی کلیه (38). نتایج ما همچنین ADAM22، NRG1، ZNF91 را به‌عنوان ژن‌های مرتبط با سیگنال‌دهی ErbB شناسایی کرد که در طول MVI در اپیتلیوم سرکوب شده‌اند. سایر ژن‌های ضروری برای فیزیولوژی کلیه مانند ATP1B1 و KIF3B نیز توسط miR{8}} در طول MVI در اپیتلیوم کلیه سرکوب شدند. پیش از این، بیکر و همکاران. نشان داد که ATP1B1 (زیر واحد b1 Na به علاوه /K به علاوه -ATPase) درایو می کندکلیهبازجذب لوله ای سدیم (39). علاوه بر این، Aguado-Fraile و همکاران. عضو خانواده کینسین 3B (KIF3B) را به عنوان دخیل در قاچاق سلول در سلول های لوله پروگزیمال موش شناسایی کرده اند. KIF3B به عنوان یک واسطه کلیدی برای پاسخ سلول های لوله اپیتلیال پروگزیمال به ایسکمی / خونرسانی مجدد با کاربرد بالقوه درکلیهمدیریت آسیب ایسکمیک (40). بنابراین می توانیم حدس بزنیم که miR{1}} مسیرهای فیزیولوژیکی ضروری را در طول MVI در اپیتلیوم سرکوب می کند. علاوه بر این، مسیرهای مرتبط با ایمنی نیز با بیان بیش از حد miR{3}P تنظیم می‌شوند: ژن‌های مهمی مانند TRAP1 و PEBP1 در نمونه‌هایی با MVI قوی کاملاً مهار شدند. جالب توجه است که TRAP1 بهبود می یابدکلیهفیبروز توبولو بینابینی در موش با انسداد یک طرفه حالب با محافظتکلیهمیتوکندری سلول های اپیتلیال لوله ای (41). علاوه بر این، PEBP1 اثرات ضد التهابی را از طریق مهار هر دو مسیر MAPK و NF-kB تحت شرایط هموستاتیک/پایه ارائه می‌کند (42). که درکلیهاپیتلیوم، مطالعه ای توسط مارکو و همکاران. به زیبایی نشان داد که فعال سازی NF-kB پس از ایسکمیک آسیب لوله ای را تشدید می کند و التهاب را تشدید می کند (43). در دست ما، PEBP1 به طور کامل توسط miR-222-3p سرکوب شد، که نشان می‌دهد مسیر NF kB در طول MVI آزاد می‌شود. در مجموع، این نتایج نشان می دهد که زیست شناسی اپیتلیال در طول MVI مختل می شودکلیهسلول های اپیتلیال به طور فعال به آسیب های MVI پاسخ می دهند در حالی که درگیری این بافت در MVI به ندرت مورد توجه قرار می گیرد. این یافته‌های مولکولی ممکن است نور جدیدی را بر ضایعات آسیب حاد لوله‌ای، یک معیار ABMR که به خوبی تثبیت شده و در عین حال مدت‌ها نادیده گرفته شده است، بیافزاید. علاوه بر این، نشان داده شده است که سلول های اپیتلیال می توانند miR{2}} اگزوزومی ترشح کرده و فنوتیپ M2 را در ماکروفاژها القا کنند (44). در این بین لی و همکاران. اخیراً گزارش شده است که ماکروفاژهای M2 miR را بیش از حد بیان می کنند{6}} و این miRNA را در ریزمحیط، همچنین از طریق اگزوزوم ترشح می کنند. در پیوند کلیه، miR{7}} در شرایط مختلف (IFTA، رد حاد و TCMR) و در مایع یا بافت بدن افزایش یافت (45). جالب توجه است که miR{9}} می‌تواند انتقال اپیتلیال- مزانشیمی را از طریق هدف قرار دادن RASSF4 در سلول‌های اپیتلیال ترویج کند (46). این ارتباط متقابل مبتنی بر miRNA بین ماکروفاژها وکلیهسلول‌های اپیتلیال باید در آن ارزیابی شوندپیوند کلیهو به ویژه در زمینه MVI. مطابق با این یافته‌ها، مشاهده کردیم که miR{0}}p عمدتاً توسط APCهایی که مونوسیت‌ها و ماکروفاژها را در بر می‌گیرند بیان می‌شود. در این زیرمجموعه خاص، هستی‌شناسی ژن‌های هدف miR{1}p غنی‌سازی در مسیرهای پیوند premRNA را نشان داد. جالب توجه است که Janssen et al. گزارش داد که التهاب ریه باعث ایجاد مسیرهای پیرایشی قبل از mRNA در ماکروفاژهای آلوئولی می شود. علاوه بر این، فعال‌سازی پیوند قبل از mRNA در ماکروفاژهای ساکن بافت در مقایسه با ماکروفاژهای مشتق شده از مونوسیت (به‌کار گرفته شده از خون) متفاوت بود. تغییرات در متابولیسم هسته در ماکروفاژهای استخدام شده، با افزایش جریان از طریق گلیکولیز و کاهش جریان از طریق چرخه اسید تری کربوکسیلیک (چرخه TCA، یعنی چرخه کربس) گزارش شد (47). در مورد miR{9}}p، ما دریافتیم که بیان بیش از حد آن در طول MVI با مسیر NF-kB در خوشه لنفوسیتی مرتبط است که هم سلول‌های NKT ذاتی و هم سلول‌های T سازگار را در بر می‌گیرد. جالب توجه است که miR{11}}p برای تولید سلول‌های NK بالغ و عملکردی حیاتی است (48) و سلول‌های CD8 به علاوه T با کمبود miR{13}p، کمتر سیتوتوکسیک گزارش شده‌اند (49). علاوه بر این، سلول‌های CD8 T همچنین می‌توانند miR{17}}p را در اگزوزوم‌ها (50) ترشح کنند که می‌تواند به نوبه خود باعث فعال شدن فیبروبلاست در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای و متعاقب آن شود.کلیهفیفیبروز همانطور که توسط گزارش های اخیر پیشنهاد شده است (51، 52).

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

تحقیق ما محدودیتهایی دارد. ما تحقیقات خود را بر روی 6 miRNA متمرکز کردیم که به طور مداوم در طراحی چند مرحله‌ای ما شناسایی شده‌اند. با این حال، ما با انتخاب گام به گام miRNA، با تنها کسری از همه miRNA های شناخته شده در گروه اعتبار سنجی، اقدام کردیم. مسیر آماری برای انتخاب miRNA ها بر طراحی اولیه BIOMARGIN متکی بود که برای شناسایی نشانگرهای زیستی تشخیصی برای چندین نقطه پایانی (ABMR، بلکه TCMR و IFTA) مناسب است. از این رو، اگرچه به طور قابل توجهی در گروه‌های کشف و انتخاب افزایش یافته است (شکل 2A)، miR{4}}a در گروه اعتبارسنجی اندازه‌گیری نشد. بنابراین، miR{5}a عملاً از فرآیند انتخاب ما حذف شد، اگرچه ادبیات نقشی را در ایسکمی/پرفیوژن مجدد در پیوند کلیه (53) و در کنترل پاسخ‌های آلی ایمنی با واسطه Treg نشان می‌دهد (54). علاوه بر این، نمی‌توانیم این نکته را رد کنیم که اندازه نمونه قوی‌تر miRNA‌های بیشتری را به همراه داشته باشد، مانند miR-138 (پایین) و miR{10}} (بالا) که به طور متفاوت در موارد ABMR گروه انتخاب بیان می‌شوند و روندی در همین جهت در گروه کشف نشان داد. علاوه بر این، ما آنالیز sc-RNAseq را روی نمونه‌های بیوپسی خود انجام ندادیم، اما از یک مجموعه داده sc-RNAseq آنلاین در دسترس استفاده کردیم. در زمان طراحی مطالعه و جمع‌آوری نمونه‌های بیوپسی، فناوری scRNAseq در واقع هنوز در دسترس نبود و نیاز به نمونه‌های تازه جمع‌آوری‌شده اجازه استفاده گذشته‌نگر از نمونه‌های منجمد یا تعبیه‌شده در پارافین را نمی‌داد. به طور مشابه، پروفایل mRNA با استفاده از ریزآرایه ها انجام شد، فناوری معیار در آن زمان که اکنون از نسل بعدی RNA-seq بهتر عمل کرده است. استفاده از مجموعه داده sc-RNAseq آنلاین در دسترس، توانایی ما را برای گزارش ویژگی های جمعیت شناختی اولیه بیماران محدود می کند. این اطلاعات گم شده می تواند نگرانی هایی را در مورد نمایندگی گروه های جمعیتی ایجاد کند. علاوه بر این، ما هیچ جنبه فنی توالی را کنترل نکردیم. از این رو در وضوح انتخاب شده، تجزیه و تحلیل sc-RNAseq ما هیچ گونه سلول های نوتروفیل یا NK را در این نمونه ها شناسایی نکرد. بنابراین، تجزیه و تحلیل‌های پایین‌دستی ما از miR{19}}p و miR{20}}p به ساخت شبکه ژن هدف و هستی‌شناسی مربوطه آن‌ها (شکل S2 تکمیلی) محدود شد و اجازه کاوش وضوح تک سلولی را نمی‌داد. با این حال، شبکه ژنی و هستی‌شناسی 27 ژن هدف miR{24}p غنی‌سازی چرخه TCA (شکل تکمیلی S2) همراه با سیگنال‌دهی ERBB را نشان داد. بنابراین می‌توانیم حدس بزنیم که هم miR{26}}p در مونوسیت‌ها و هم miR-223-3p در نوتروفیل‌ها در متابولیسم و ​​پاسخ التهابی درگیر شده توسط این سلول‌ها در طول MVI نقش دارند. علاوه بر این، miR{28}}p قبلاً در رد پیوند کلیه افزایش یافته است (9، 55، 56)، اما تاکنون به طور خاص با ABMR مرتبط نبوده است. یکی دیگر از محدودیت های مطالعه ما این است که تغییرات بیان ژن خاص در سلول های نفوذی نادر ممکن است در تجزیه و تحلیل بیان ژن توده پنهان شود. بنابراین، مطالعات بیشتر شامل نمونه‌های بیشتر برای اجازه دادن به بررسی مناسب همه، حتی زیرگروه‌های سلولی کمیاب، مورد نیاز است، اما در حال حاضر به دلیل هزینه نسبتاً بالای این روش محدود شده‌اند.

در نتیجه، ما در اینجا مسیرهای مولکولی مرتبط با MVI، آسیب بافتی اصلی مربوط به ABMR را بررسی کردیم. رویکرد omics یکپارچه مورد استفاده ما را قادر می سازد تا مسیرهای جدید درگیر در MVI را باز کنیم و نشان می دهد که تغییرات متابولیسم اپیتلیال لوله ای در نتیجه ABMR، فراتر از محفظه اندوتلیال مجاور رخ می دهد. مطالعه ما پتانسیل بزرگ چند omics برای کشف مکانیسم های بیماری را نشان می دهد و راه را برای تحقیقات جدید برای روشن کردن بیشتر گفتگوهای متقابل بینکلیهزیر مجموعه های سلولی مقیم و نفوذ کننده آلوگرافت.