رابطه بین سیکلواکسیژناز (COX-2) و بیماری ناشی از هیپوکسی

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

پروستاگلاندین E2 داخل سلولی به مرگ سلولی لوله پروگزیمال ناشی از هیپوکسی کمک می کند.

کورال گارسیا-پاستورل، سلما بنیتو-مارتینز، ریکاردو جی.بوش1، آنا بی. فرناندز-مارتینز، فرانسیسکو جی. لوسیو-کازانا

سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال (PTC) به ویژه در برابر آپوپتوز ناشی از هیپوکسی آسیب‌پذیر هستند، یک عامل مرتبط برایبیماری کلیوی. ما در اینجا فرض کردیم که مرگ PTC تحت هیپوکسی توسط تولید وابسته به سیکلواکسیژناز (COX{1}}) پروستاگلاندین E، (PGE،)، که در سلول‌های HK لوله پروگزیمال انسان به دلیل هیپوکسی تأیید شد، ایجاد می‌شود. آپوپتوز (i) ناشی از (1 درصد O) توسط COX-2(cyclo) جلوگیری شد-مهارکننده اکسیژناز) و توسط آنتاگونیست‌های گیرنده‌های پروستاگلاندین (EP) و (ii) با افزایش PGE درون سلولی، (iPGE،) به دلیل فاکتور القای هیپوکسی{1}}رونویسی وابسته به افزایش تنظیم COX مرتبط بود{3 }}(سیکلو-اکسیژناز). آپوپتوز همچنین توسط مهارکننده های PGT ناقل جذب پروستاگلاندین جلوگیری شد، که نشان داد iPGE به آپوپتوز ناشی از هیپوکسی کمک می کند (برعکس، مرگ PTC ناشی از هیپوکسی/اکسیژناسیون مجدد منحصراً به دلیل PGE خارج سلولی بود). بنابراین، iPGE یک بازیگر جدید در پاتوژنز آسیب لوله‌ای ناشی از هیپوکسی است و PGT ممکن است یک هدف درمانی جدید برای پیشگیری از ضایعات وابسته به هیپوکسی در بیماری‌های کلیوی باشد.

به خوبی ثابت شده است که هیپوکسی لوله ای یک عامل مرتبط برای هر دو حاد و مزمن استبیماری کلیوی'سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال (PTC) از نظر مصرف اکسیژن بسیار فعال هستند زیرا فعالیت‌های بازجذب نیازمند انرژی هستند و در نتیجه در برابر هیپوکسی آسیب‌پذیر هستند. نشان داده شده است که آپوپتوز نقش مرتبطی در PTC کشت شده در معرض هیپوکسی ایفا می کند، اما مسیرهای سیگنال دهی مسئول فعال شدن دستگاه آپوپتوز بررسی نشده است. ما و دیگران دریافته‌ایم که پروستاگلاندین E، (PGE)، یک واسطه چربی مهم در فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک متعدد درکلیهنقش مهمی در سیگنال دهی منجر به آپوپتوز PTC پس از درمان با سیس پلاتین 7، آلبومین 8 یا لپتین و جنتامایسین ایفا می کند. در همه موارد، افزایش PGE وابسته به افزایش بیان سیکلواکسیژناز-2(COX-2) بود.(سیکلواکسیژناز)یک آنزیم القایی که همراه با COX{0}}l، مرحله محدود کننده سرعت در سنتز پروستاگلاندین ها است. در انسانکلیهCOX پایه-2(سیکلواکسیژناز)شدت بیان کمتر از COX-1 است. COX{1}}(سیکلواکسیژناز)در پودوسیت‌ها و بخش‌هایی از حلقه هنله و عروق کلیوی تحت شرایط فیزیولوژیکی شناسایی شده است.کلیهاز جمله PTC، و احتمالا به آسیب کلیوی کمک می کند. جالب است که هیپوکسی بیان COX را افزایش می دهد-2(سیکلواکسیژناز)و/یا تولید PGE،12-i7 در بسیاری از انواع سلول. در واقع، قبلاً دریافته‌ایم که هیپوکسی باعث افزایش محتوای درون سلولی در PGE و همچنین انتشار آن به محیط خارج سلولی می‌شود. بنابراین، از نظر تئوری ممکن است که PGE واسطه اثر آپوپتوز هیپوکسی در PTC باشد.

اکثر مطالعات در مورد آپوپتوز وابسته به PGE اساساً بر روی مکانیسم‌های مربوط به PGE خارج سلولی متمرکز شده‌اند، زیرا به طور گسترده پذیرفته شده است که PGE اثرات بیولوژیکی خود را از طریق فعال‌سازی گیرنده‌های PGE جفت شده با پروتئین G در غشای پلاسمایی (گیرنده‌های پروستاگلاندین سری E) اعمال می‌کند. EP1-4)1. با این وجود، در برخی از مدل‌ها، PGE درون سلولی، (iPGE،)در مرگ سلولی آپوپتوز مرتبط است{6}}. این بدان معناست که برای القای آپوپتوز، PGE باید دوباره به محیط داخل سلولی برسد و زیرمجموعه ای از گیرنده های EP را فعال کند که در داخل سلول (گیرنده های iEP) قرار دارند. از آنجایی که وظیفه گرفتن PGE عمدتاً توسط ناقل جذب پروستاگلاندین (PGT) انجام می‌شود، مهار PGT منجر به پیشگیری از مرگ سلولی آپوپتوز با واسطه iPGE می‌شود.

با در نظر گرفتن این پیشینه، در کار حاضر، بررسی کردیم که آیا یک COX-2(سیکلواکسیژناز)افزایش وابسته به iPGE، سطح آپوپتوز ناشی از هیپوکسی را در PTC واسطه می کند.

برای بیماری کلیوی روی Cistanche ارگانیک کلیک کنید

مواد و روش ها

معرف ها

AG1478، Bromocresolgreen (BG)، PGE، AH6809، GW627368X، کریستال بنفش، محلول های آبی تریپان، بروموسولفوفتالئین (BRS)، 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzyl indazole (YC1) و اکتینومایسین D از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. Z-VAD-FMK و سلکوکسیب به ترتیب از Calbiochem (دارمشتات، آلمان) و Cayman Chemical (Ann Arbor، MI، ایالات متحده آمریکا) بودند. TriReagent از Vitro (مادرید، اسپانیا) خریداری شد و غشاهای PVDF و معرف لومینول وسترن بلات از Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. USA) خریداری شد. کیت تشخیص آپوپتوز فنیل ایندول (DAPI)، annexin-V-FITC (فلورسئین ایزوتیوسیانات)/ یدید پروپیدیوم (PI) و پروب 2'،7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) از Invitrogen (CA,Carlsbad, CA) خریداری شد. ایالات متحده آمریکا)، و کاوشگرهای مولکولی (اورگان، ایالات متحده)، به ترتیب. آنتی بادی ها از منابع زیر به دست آمدند: anti-PGE و anti-COX{23}}(سیکلواکسیژناز)آنتی بادی ها از Abcam (کمبریج، انگلستان) بودند. anti-Bax و anti-Bcl-2 از Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA) بودند. آنتی بادی anti-HIF-la و -rabbit-Alexa-Fluor 488 به ترتیب از BD Biosciences (Palo Alto، CA، USA) و Invitrogen (Carlsbad، CA، USA) بودند. کنژوگه ضد اکتین و خرگوش ضد IgG پراکسیداز موش از سیگما (St.Louis, MO, USA) خریداری شد.

کشت سلولی و شرایط تجربی.

سلول‌های HK{0}} لوله‌ای پروگزیمال انسانی از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) (Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. سلول‌ها در 5 درصد CO، در 37 درجه Cin DMEM/F12 همراه با 10 درصد جنین گاو نگهداری شدند. سرم (FBS)، 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین/آمفوتریسین B و 1 درصد گلوتامین (Invitrogen. Carlsbad، CA، USA) و 1 درصد انسولین-ترانسفرین-سلنیوم (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). در تمام آزمایشات، سلول ها در 70-90 درصد تلاقی آبکاری شدند و پس از اتصال کامل، در شرایط هیپوکسیک (اکسیژن 1 درصد) یا نرموکسیک (اکسیژن 21 درصد) کشت داده شدند.هیپوکسیآزمایش ها در In vivo200 انجام شدهیپوکسیایستگاه کاری (تکنولوژی راسکین، یورکشایر غربی، بریتانیا). برایهیپوکسی/ آزمایش اکسیژن رسانی مجدد، سلول ها تحت آزمایش قرار گرفتندهیپوکسیبه مدت 24 ساعت، و پس از آن، سلول ها در شرایط نرموکسیک تا 3 ساعت (دوره اکسیژن رسانی مجدد) انکوبه شدند.

آنالیز ایمونوفلورسانس iPGE و آنالیز وسترن بلات COX-2(سیکلواکسیژناز)و HIF-1 .

سلول‌ها برای آنالیز ایمونوفلورسانس و آنالیز وسترن بلات به ترتیب بر روی ورقه‌های شیشه‌ای (4×104 سلول / ورقه شیشه‌ای) یا به صفحات شش چاهی (15×104 سلول / چاه) تقسیم شدند و همانطور که در "نتایج" توضیح داده شد انکوبه شدند. سپس، آنالیز ایمونوفلورسانس و ایمونوبلات اساساً همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. رقت‌های کاری ضد بدن عبارتند از: 1/50 برای PGE،، 1/1000 برای COX{10}}(سیکلواکسیژناز)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 و 1/5000 برای -اکتین. تشخیص ایمونوفلورسانس با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال لایکا SP5 (Leica Microsystems، Wetzlar، آلمان)، از طریق سرویس میکروسکوپ کانفوکال (ICTS 'NANBIOSIS'U17) مرکز شبکه تحقیقات زیست پزشکی در مهندسی زیستی، مواد زیستی و نانوپزشکی در BER-BBNCI انجام شد. دانشگاه آلکال، مادرید، اسپانیا)

ترانسفکشن گذرا

انتقال گذرا با siRNA PGT (سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، کالیفرنیا)، ناقل بیانی پستانداران pcDNA3 حاوی cDNA نوع وحشی انسانی 15-هیدروکسی پروستاگلاندین دهیدروژناز (p15-PGDH) یا سازه های پلاسمید گزارشگر لوسیفراز برای COX انسانی-2(سیکلواکسیژناز)phPES{0}}Luc، انسانهیپوکسیعنصر پاسخ (HRE)p9HIF{1}}Luc و R. reniformis pRL-CMV (Promega، Madison، WI) و تعیین فعالیت لوسیفراز همانطور که در جاهای دیگر توضیح داده شد انجام شد.

تعداد سلول و مورفولوژی سلول/هسته.

تعداد سلول‌های چسبنده به روش اسپکتروفتومتری با رنگ‌آمیزی کریستال ویولت اصلاح‌شده تعیین شد. برای شناسایی شواهد آپوپتوز، مورفولوژی سلولی با استفاده از میکروسکوپ کنتراست فاز مشاهده شد. هسته های سلولی پس از رنگ آمیزی DNA با DAPI همانطور که قبلاً توضیح داده شد، مشاهده شدند، مورفولوژی آپوپتوتیک معمولی که مورد بررسی قرار گرفت شامل انقباض سلولی، تراکم هسته ای و تکه تکه شدن، و تشکیل اجسام آپوپتوز بود. برای تعیین کمیت، شش میدان در هر شرایط آزمایشی به صورت کور برای تخمین درصد هسته‌هایی با ظاهر آپوپتوز بررسی شد.

سنجش آپوپتوز فلوسیتومتری و سنجش زنده ماندن سلولی با استفاده از آزمون حذف رنگ آبی تریپان.

سلول های چسبنده به صفحه توسط تریپسینیزاسیون جدا شدند و همراه با سلول های جدا شده که قبلاً از محیط کشت بازیابی شده بودند، برای سنجش استفاده شدند.

کیت تشخیص آپوپتوز Annexin-V-FITC/PI امکان تشخیص فلوسیتومتری سلول‌های HK{2}} آپوپتوز و نکروزه را فراهم کرد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد. رنگآمیزی. سلول‌های نکروزه فقط به PI مثبت بودند و سلول‌های HK{4} زنده هیچ رنگ‌آمیزی نشان ندادند.

برای ارزیابی بقای سلولی از آزمون حذف رنگ تریپان بلو استفاده شد. سلول های زنده (سفید) و سلول های مرده (آبی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و هموسیتومتر شمارش شدند.

تحلیل آماری.

هر آزمایش حداقل سه بار تکرار شده بود. نتایج به صورت میانگین ± SEM بیان می شود. آنها تحت یک آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و سپس آزمون بونفرونی برای مقایسه های چندگانه قرار گرفتند. سطح معنی داری P کمتر یا مساوی 0.05. 0 تعیین شد.

نتایج

هیپوکسی باعث مرگ سلولی HK{0}} لوله پروگزیمال می شود.

هیپوکسیتعداد سلول‌های HK{0}} را کاهش داد، همانطور که با روش کریستال ویولت ارزیابی شد (شکل la)، و همچنین باعث گرد شدن و جدا شدن سلول از صفحه شد (شکل lb، پانل بالایی). همانطور که انتظار میرفت،هیپوکسیمدلی از مرگ سلولی با ویژگی‌های مورفولوژیکی واضح آپوپتوز (نگاه کنید به رنگ‌آمیزی هسته‌ای با DAPI در شکل lb، پانل پایین، سمت چپ) مانند انقباض سلولی با تراکم هسته‌ای قابل‌توجه، تکه تکه شدن، و تشکیل اجسام آپوپتوز مانند را ایجاد کرد.هیپوکسیآپوپتوز ناشی از افزایش رنگ آمیزی انکسین V-FITC، همانطور که توسط فلوسیتومتری ارزیابی شد، و پیشگیری از آن با بازدارنده پان کاسپاز Z-VAD-FMK بیشتر تایید شد (شکل lc).هیپوکسیهمچنین کاهش تعداد سلول‌های زنده را تعیین کرد اما تغییرات آماری معنی‌داری در تعداد سلول‌های نکروزه ایجاد نکرد (شکل lc، inset).

شکل 1. هیپوکسی باعث مرگ سلولی HK{1}} لوله پروگزیمال می شود.(الف) کاهش تعداد سلول (آزمایش کریستال ویولت). (ب) خصوصیات مورفولوژیکی آپوپتوز. میکروگراف‌های فتومیکروگراف با کنتراست فاز (پانل بالایی، بزرگ‌نمایی اصلی، 10×) میکروگراف‌های رنگ‌آمیزی DAPI (پانل پایین، بزرگ‌نمایی اصلی، 40×). ج) افزایش آپوپتوز (مطالعات فلوسیتومتری). سلول‌های Annexin V Plus شامل سلول‌های Annexin V به علاوه /پروپیدیوم یدید (یعنی سلول‌های آپوپتوز اولیه با حفظ یکپارچگی غشای پلاسمایی) و Annexin V به علاوه /پروپیدیوم یدید به علاوه سلول‌ها (یعنی سلول‌های آپوپتوز دیررس) هستند. قسمت داخلی: انواع جمعیت سلولی (Annexin V-/ Propidium Iodide به اضافه سلول ها سلول های نکروزه هستند و annexin V-/propidium iodide سلول های زنده هستند). نتایج به صورت درصد با توجه به تعداد کل رویدادها بیان می شود. اطلاعات عمومی: (1) سلول ها به مدت 24 ساعت در شرایط نرموکسیک (21 درصد O2) یا هیپوکسیک (1 درصد O) انکوبه شدند، همانطور که در "روش ها؟" نشان داده شده است. مهار کننده پان کاسپاز Z-VAD-FMK (25 میکرومولار) بود. 1 ساعت قبل از شروع قرار گرفتن در معرض اضافه شده استهیپوکسی. (2) عکس‌های ریز نمونه‌هایی از سه آزمایش مستقل هستند. میله ها و میله های خطا در نمودارها: هر نوار نشان دهنده میانگین±SEM 3 آزمایش مختلف است *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">هیپوکسی;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">هیپوکسیبه علاوه ZVAD.

COX-2(سیکلواکسیژناز)مسیر گیرنده /iPGE،/EP واسطه مرگ سلولی HK{0}} لوله پروگزیمال ناشی از هیپوکسی است.

به منظور ارزیابی نقش COX-2(سیکلواکسیژناز)مسیر گیرنده /iPGE2/EP درهیپوکسیمرگ سلولی HK{1}} القا شده، ما ابتدا سلول‌ها را با سلکوکسیب، یک COX، از قبل انکوبه کردیم-2(سیکلواکسیژناز)بازدارنده 1; AH6809، آنتاگونیست گیرنده های EP1، EP2 و EP3 یا GW627368X، آنتاگونیست گیرنده EP433. یا با بروموکرزول سبز یا بروموسول-فوفتال در هر دوی آنها بازدارنده های PGT435. PGT نیز از طریق ترانسفکشن با siRNA از بین رفت.

شکل 2. COX-2(سیکلواکسیژناز)مسیر گیرنده /iPGE،/EP واسطه مرگ سلولی HK{1}} پروگزیمال لوله‌ای ناشی از هیپوکسی است.(الف) جلوگیری از مرگ سلولی توسط مهارکننده های مسیر. پانل بالایی؛ نوارها درصد مرگ کل سلولی (سمت چپ) یا درصد آپوپتوز انکسین V به اضافه سلول ها (راست) را نشان می دهند. قبل از قرار گرفتن در معرضهیپوکسیسلول ها به مدت 1 ساعت با 3 میکرومولار سلکوکسیب (COX{3}} پیش انکوبه شدند.(سیکلواکسیژناز)بازدارنده)؛ 10 میکرومولار AH6809، (آنتاگونیست گیرنده‌های EP1-3)، 10 میکرومولار GW627368X (آنتاگونیست گیرنده EP4). یا با 50 میکرومولار بروموکرزول سبز (BG) یا 25 میکرومولار بروموسولفوفتالئین (BrS)، دو مهارکننده PGT. پانل پایینی: سمت چپ: جلوگیری از مرگ سلولی با از بین بردن PGT از طریق ترانسفکشن با siRNA (تست خروج از غواصی تریپان آبی). ورودی: اثربخشی شکست PGT (تحلیل وسترن بلات) راست: وابستگی به غلظت اثر پیشگیرانه بروموکرزول سبز (BG). (ب)جلوگیری از مرگ سلولی با ترانسفکشن با ناقل بیانی پستانداران حاوی آنزیم غیرفعال کننده پروستاگلاندین 15-هیدروکسی پروستاگلاندین دهیدروژناز (15-PGDH) cDNA (تست حذف رنگ آبی تریپان). Inset: بیان {{ 11}}PGDH (تحلیل وسترن بلات) در سلول های ترانسفکت شده. (ج)هیپوکسیباعث افزایش حساس به PGT در iPGE می شود، سمت چپ: PGE، ایمونوفلورسانس وابسته به تنهایی یا ادغام شده با رنگ آمیزی هسته ای با DAPI نشان داده شده است (بزرگنمایی اصلی، 40×) سمت راست: رویکرد کمی به تصاویر ارائه شده در پانل سمت چپ با استفاده از نرم افزار Image J. (د) بازدارنده فعال سازی EGFR AG1478 از مرگ سلولی HK-2 EGFR جلوگیری نمی کند. سلول ها قبل از قرار گرفتن در معرض میکرومولار AG1478 به مدت 1 ساعت از قبل انکوبه شدند.هیپوکسی. (e) بازدارنده PGT BG بیان Bax و Bcl-2 در سلول‌های HK-2 را تغییر نمی‌دهدهیپوکسی(تحلیل وسترن بلات). (و) پیشگیری ازهیپوکسیمرگ سلولی ناشی از اکسیژن‌رسانی مجدد توسط مهارکننده‌های مسیر (تست حذف رنگ آبی تریپان). سلول ها از قبل با مهارکننده های مسیر انکوبه شدند و در معرض قرار گرفتندهیپوکسیمانند (الف). سپس سلول ها به مدت 3 ساعت در معرض نورموکسی قرار گرفتند. اطلاعات عمومی: (1) سلول ها به مدت 24 ساعت در شرایط نرموکسیک (21 درصد O) یا هیپوکسیک (1 درصد O) انکوبه شدند، همانطور که در "روش ها" نشان داده شده است. (2) عکس‌های ریز نمونه‌هایی از سه آزمایش مستقل هستند. (3) حلال های بازدارنده (محیط luL/ml) اثرهیپوکسیدر مورد مرگ سلولی (نتایج نشان داده نشده است). (4) تجزیه و تحلیل وسترن بلات: پروتئین برابر با کاوش با یک آنتی اکتین یا آنتی بادی ضد GAPDH تأیید شد. (5) میله ها و نوار خطا در نمودارها: هر نوار نشان دهنده میانگین±SEM 3 آزمایش مختلف است.*P<0.01><0.01>هیپوکسییاهیپوکسی/ اکسیژن رسانی مجدد

همانطور که در شکل 2 الف نشان داده شده است،هیپوکسیمرگ سلولی لوله پروگزیمال القا شده در همه موارد جلوگیری شد. مهار آپوپتوز توسط سلکوکسیب نشان داد که COX{1}}(سیکلواکسیژناز)نقش مرتبطی درهیپوکسیمرگ سلولی آپوپتوتیک القا شده (شکل 2a، پانل بالایی، سمت راست). به طور خاص، این واقعیت که آپوپتوز توسط تضاد گیرنده های EP جلوگیری شد، نشان می دهد که آپوپتوز توسط COX واسطه می شود{2}}(سیکلواکسیژناز)تولید وابسته به PGE. از سوی دیگر، به احتمال زیاد iPGE به آن کمک می کندهیپوکسیالقای مرگ سلولی HK-2 زیرا توسط؛ (i) مهار PGT (شکل 2a) یا (i) بیان بیش از حد 15-PGDH(شکل 2b)، که iPGE2 را از طریق آن غیرفعال می‌کند، جلوگیری شد. oxidation25 (توجه داشته باشید، روش ترانسفکشن به خودی خود حساسیت سلولهای HK-2 را بههیپوکسی: مرگ سلولی 45-55 درصد برای ترانسفکشن در شرایط کنترل در مقایسه با 15-20 درصد در سلول های غیر ترانسفکت شده بود). پشتیبانی بیشتر از مشارکت iPGE، بههیپوکسیمرگ سلولی القایی HK-2، یافته های قبلی ما هستند کههیپوکسیافزایش محتوای سلولی iPGE،1 را تعیین می کند و اینکه این افزایش توسط مهارکننده های PGT جلوگیری شد (شکل 2c).

مسیرهای سیگنال دهی MAPK ممکن است آپوپتوز را القا کنند، زیرا گیرنده های iEP گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (EGFR)36 را فعال می کنند، که منجر به فعال شدن MAP کینازهای ERK1/2 و p38 در سلول های HK-20 می شود، ما پرسیدیم که آیا قبل از انکوباسیون سلول‌های HK{7}} با مهارکننده فعال‌سازی EGFR AG1478 جلوگیری شدهیپوکسیمرگ سلولی ناشی از ما نتایج منفی پیدا کردیم (شکل 2d) و بنابراین، بعید است که فعال سازی EGFR واسطه مرگ سلولی HK-2 تحتهیپوکسی.

در چندین مدل تجربی، کاهش ATP مشتق شده از میتوکندری در طولهیپوکسیباعث افزایش نسبت بیان پروتئین پرو آپوپتوز Bax به پروتئین ضد آپوپتوز Bcl-2 می‌شود که منجر به آزاد شدن سیتوکروم C در سیتوزول، فعال شدن کاسپاز 9 و متعاقب آن برش و فعال شدن اثرگذار پایین‌دستی می‌شود. کاسپاز37،38. با این حال، قبل از جوجه کشی با مهارکننده PGT BG در سلول های HK{8}} تحتهیپوکسیمنجر به تغییرات سازگار با یک تغییر ضد آپوپتوز در تعادل بین بیان Bc-2 و Bax (شکل 2e) نشد، که از نقش این پروتئین ها در سلول HK-2 پشتیبانی نمی کند. مرگ زیرهیپوکسی.

به دنبال قرار گرفتن در معرض هیپوکسیک، دوره‌های اکسیژن‌رسانی مجدد (ایسکمی/آسیب خونرسانی مجدد) می‌تواند باعث آسیب سلولی اضافی شود. "پارادوکس" آسیب اکسیژن‌رسانی مجدد را می‌توان با در نظر گرفتن اینکه سلول‌ها تحت تغییرات خاصی در فعالیت آنزیمی، عملکرد میتوکندری، ساختار اسکلت سلولی، انتقال غشاء و دفاع آنتی‌اکسیدانی در پاسخ بههیپوکسی، که سپس مجموعاً مستعد آسیب اکسیژن رسانی مجدد می شوند39. Reoxy-genation به آسیب حاد کلیه در طول سکته مغزی ایسکمیک، پیوند کلیه، نارسایی گردش خون، یا جراحی کلیه و قلب و عروق کمک می کند. در این زمینه، ارزش درمانی بالقوه مهارهیپوکسی/مرگ سلولی پروگزیمال لوله ای ناشی از اکسیژن رسانی مجدد از طریق مداخله در COX-2(سیکلواکسیژناز)مسیر گیرنده /iPGE/iEP مشهود است. بنابراین، ما پرسیدیم که آیا iPGE به طور خاص واسطه استهیپوکسیالقای مرگ سلولی یا واسطههیپوکسی/ مرگ سلولی ناشی از اکسیژن‌رسانی مجدد (یک مدل آزمایشگاهی که در شرایط in vivo ایسکمی کلیوی / آسیب خونرسانی مجدد را تقلید می‌کند). همانطور که در شکل 2f نشان داده شده است، مرگ سلولی (همانطور که توسط تست طرد غواصی تریپان بلو ارزیابی شد) توسط COX جلوگیری شد{2}}(سیکلواکسیژناز)مهارکننده سلکوکسیب و همچنین توسط آنتاگونیست های گیرنده EP AH6809 یا GW627368X. همانند شکل 2a، این نتایج نشان می دهد که COX{3}} نقش مرتبطی در آن ایفا می کندهیپوکسی/مرگ سلولی ناشی از اکسیژن رسانی مجدد و به طور خاص تر، این مرگ سلولی توسط COX انجام می شود-2(سیکلواکسیژناز)تولید وابسته به PGE، زیرا با تضاد گیرنده های EP از آن جلوگیری شد. با این حال، از آنجایی که از مرگ سلولی توسط مهارکننده های PGT بروموکرزول سبز یا بروموسولفتالئین جلوگیری نشد (شکل 2f و شکل تکمیلی 2d)، احتمال بیشتری وجود دارد کههیپوکسیمرگ سلولی HK{1}} ناشی از اکسیژن‌رسانی مجدد منحصراً توسط PGE خارج سلولی انجام می‌شود.

HIF-1 -تنظیم رونویسی وابسته COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان ژن به الف کمک می کندهیپوکسیافزایش ناشی از iPGE، در سلول های HK لوله پروگزیمال-2. PGE، بیوسنتز شامل آزادسازی گلیسروفسفولیپیدهای غشایی اسید آراشیدونیک توسط فسفولیپاز A، به دنبال تبدیل ایزوآنزیم های COX آراشیدونیک اسید به پروستاگلاندین H، و در نهایت، ایزومریزاسیون غده پروستا در H، به PGE، توسط پروستاگلاندین است. مانند میکروزومی PGE سنتاز-1 (mPGES-1)19. ما آن را یافته ایمهیپوکسیآپوپتوز القا شده در سلول های HK{1}} به احتمال زیاد توسط COX انجام می شود-2(سیکلواکسیژناز)افزایش وابسته به تولید PGE، (شکل 2). با توجه به اینکه COX-2(سیکلواکسیژناز)آنزیمی است که بیان آن ممکن است توسطهیپوکسی، ما فرض کردیم که الفهیپوکسیافزایش ناشی از PGE، تولید در سلول‌های HK{1}} ممکن است نتیجه افزایش بیان COX باشد-2(سیکلواکسیژناز). به منظور تأیید فرضیه خود، ما (i) اثرهیپوکسیدر مورد بیان COX-2(سیکلواکسیژناز)پروتئین و mRNA و (ii) اثر COX-2(سیکلواکسیژناز)مهارکننده سلکوکسیب درهیپوکسیافزایش ناشی از iPGE، نتایج ما نشان داد کههیپوکسیتنظیم رونویسی بالا COX به صورت گذرا تعیین می شود-2(سیکلواکسیژناز)عبارت (شکل 3a,b)و COX-2(سیکلواکسیژناز)مهار افزایش iPGE را در سلول‌های HK-2 در زیر کاهش دادهیپوکسی(شکل 3ج). جالب اینکه،هیپوکسیهمچنین تنظیم گذرا بیان پروتئین mPGES-1 (شکل، 3a، داخل) را تعیین کرد، اما بر بیان mRNA mPGES{3}} تأثیری نداشت (شکل، 3b. inset). این نتایج نشان داد که بیان COX افزایش یافته است{5}}(سیکلواکسیژناز)و mPGES-1 مسئول این استهیپوکسیافزایش ناشی از iPGE.

شکل 3. تنظیم رونویسی وابسته به HIF-la COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان ژن به افزایش ناشی از هیپوکسی در iPGE در سلول‌های HK{1}} پروگزیمال لوله کمک می‌کند.(الف) بیان COX-2(سیکلواکسیژناز)پروتئین به طور موقت افزایش می یابدهیپوکسی(تحلیل وسترن بلات). ورودی: بیان پروتئین mPGES{0}} نیز به طور گذرا توسطهیپوکسی. (ب) COX بیان-2(سیکلواکسیژناز)mRNA به طور موقت افزایش می یابدهیپوکسی. Inset: بیان mPGES{0}} تحت تاثیر قرار نمی گیردهیپوکسی. (ج)پیشگیری توسط سلکوکسیب، یک COX-2(سیکلواکسیژناز)بازدارنده، افزایش iPGE، ناشی ازهیپوکسی. سلول ها به مدت 1 ساعت با 3 میکرومولار سلکوکسیب پیش انکوبه شدند. سمت چپ∶PGE، ایمونوفلورسانس وابسته به تنهایی یا ادغام شده با رنگ آمیزی هسته ای با DAPI نشان داده شده است (بزرگنمایی اصلی، 40×). راست: رویکرد کمی به تصاویر ارائه شده در پنل سمت چپ با استفاده از نرم افزار Image J. (د) مشارکت مکانیسم‌های رونویسی. سمت چپ: بازدارنده رونویسی اکتینومایسین D (Act. D) از aهیپوکسیافزایش ناشی از COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان پروتئین (تحلیل وسترن بلات). سلول ها به مدت lh با 1 ug/ml Act پیش تیمار شدند. د قبل از قرار گرفتن در معرضهیپوکسیبرای 3 ساعت. راست: افزایش فعالیت COX-2(سیکلواکسیژناز)سازه گزارشگر (ه) بازدارنده HIF-la YC-1 جلوگیری می‌کندهیپوکسیCOX رونویسی القایی-2(سیکلواکسیژناز)افزایش مقررات سلول ها به مدت 1 ساعت با 0.5 uM YC-1 پیش انکوبه شدند. سمت چپ: پیشگیری از COX-2(سیکلواکسیژناز)افزایش مقررات سلول ها در معرضهیپوکسیبه مدت 8 ساعت مرکز: جلوگیری از افزایش فعالیت COX-2(سیکلواکسیژناز)سازه گزارشگر راست: ممانعت از فعالیت یک ساختار گزارشگر مبتنی بر HRE. سلول ها در معرضهیپوکسیبه مدت 8 ساعت (f) مهارکننده HIF-la YC{2}} مرگ سلولی آپوپتوز را افزایش می‌دهد (مطالعات فلوسیتومتری). قبل از قرار گرفتن در معرضهیپوکسیسلول‌ها به مدت 1 ساعت با 0.5 میکرومولار YC{4}} پیش انکوبه شدند. Inset∶ YC{5}} را مهار می کندهیپوکسیافزایش ناشی از HIF{1}}یک بیان (تحلیل وسترن بلات). اطلاعات عمومی: (1) سلول ها به مدت 24 ساعت در شرایط نرموکسیک (21 درصد O) یا هیپوکسیک (1 درصد O) انکوبه شدند، همانطور که در "روش ها" نشان داده شده است. (2) عکس‌های ریز نمونه‌هایی از سه آزمایش مستقل هستند. (3) تجزیه و تحلیل وسترن بلات: پروتئین برابر با کاوش با آنتی بادی ضد اکتین (4) میله ها و نوارهای خطا در نمودارها تأیید شد: هر نوار نشان دهنده میانگین ± SEM 3 آزمایش مختلف است *P<0.01 vs.="" other="">

برای بررسی بیشتر نقش مکانیسم‌های رونویسی در افزایش COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان پروتئین تحتهیپوکسی، بیان COX-2(سیکلواکسیژناز)در سلول‌های HK-2 که قبل از قرار گرفتن در معرض بازدارنده رونویسی اکتینومایسین D از قبل انکوبه شده بودند، ارزیابی شد.هیپوکسیبه مدت 5 ساعت همانطور که در شکل 3d نشان داده شده است،هیپوکسیافزایش ناشی از COX-2(سیکلواکسیژناز)از بیان پروتئین توسط اکتینومایسین D جلوگیری شد.هیپوکسیهمچنین افزایش فعالیت یک COX را تعیین کرد-2(سیکلواکسیژناز)ساختار پروموتر که قبلاً در سلول‌های HK{0}} ترانسفکت شده بود (شکل 3d سمت راست). روی هم رفته، نتایج نشان داده شده در شکل 3d نشان می دهد که مکانیسم های رونویسی به aهیپوکسیافزایش ناشی از COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان پروتئین با این وجود، بین زمان فعال‌سازی پروموتر COX-2 و زمان حداکثر COX-2 اختلاف وجود داشت.(سیکلواکسیژناز)بیان mRNA: در حالی که افزایش گذرا در COX-2(سیکلواکسیژناز)بیان mRNA پس از 2 ساعت حداکثر بود (شکل 3b)، پروموتر COX{2}} پس از 3 ساعت فعال شد (شکل 3d)، که احتمالاً نشان دهنده سهم مکانیسم‌های پس از رونویسی در افزایش COX است. }}(سیکلواکسیژناز)بیان 4. بر این اساس، ما حدس می زنیم که COX-2(سیکلواکسیژناز)mRNA تحت تثبیت می شودهیپوکسی، که منجر به افزایش سطح COX می شود-2(سیکلواکسیژناز)بیان mRNA بدون هیچ مشارکتی (در آن لحظه) در افزایش فعالیت COX-2(سیکلواکسیژناز)مروج با این حال، ممکن است یک فاصله زمانی بین فعال‌سازی پروموتر و تجمع سوبسترای قابل اندازه‌گیری نیز به اختلاف بین زمان‌بندی فعال‌سازی پروموتر COX-2 و زمان‌بندی حداکثر COX کمک کند. }}(سیکلواکسیژناز)بیان mRNA

HIF{0}} یک فاکتور رونویسی هترودیمری است که از زیرواحد وابسته به اکسیژن و زیرواحد - که به طور اساسی بیان می‌شود، تشکیل شده است. زیرهیپوکسی، HIF-l جمع می شود و وارد هسته می شود، جایی که فاکتور رونویسی HIF-1 را پس از دیمر شدن با HIF-1 تولید می کند. سپس HIF{3}} بیان ژن های هدف خود را با اتصال به آن ترویج می کندهیپوکسی- عناصر پاسخگو (HREs) در ناحیه تنظیمی خود حضور دارند و متعاقباً پاسخ های تطبیقی ​​سلولی را برای مبارزه هماهنگ می کنند.هیپوکسی 3. با توجه به اینکههیپوکسیممکن است COX را فعال کند-2(سیکلواکسیژناز)بیان به روشی وابسته به HIF از طریق HRE عملکردی موجود در دنباله پروموتر COX-2، نقش HIF-l را درهیپوکسیافزایش ناشی از COX-2(سیکلواکسیژناز)اصطلاح. ما همچنین به فعالیت یک ساختار پروموتر COX-2 ترانسفکت شده در سلول‌های HK-2 نگاه کردیم. همانطور که در شکل 3e نشان داده شده است، قبل از جوجه کشی با HIF-1یک بازدارنده YC-1، که کمرنگ شدهیپوکسیافزایش بیان HIF-la و فعالیت یک سازه گزارشگر HRE، منجر به جلوگیری از افزایش هر دو بیان COX شد{2}}(سیکلواکسیژناز)و فعالیت COX-2(سیکلواکسیژناز)ساختار پروموتر در HK-2 در معرضهیپوکسی. به طور خلاصه، نتایج در شکل 3a-e نشان داده شده است که از این ایده حمایت می کند که HIF-1 -تغییر تنظیم رونویسی وابسته COX-2(سیکلواکسیژناز)مسئول استهیپوکسیافزایش ناشی از iPGE2.

اگرچه عواقب فعال‌سازی HIF-1 درهیپوکسیآپوپتوز ناشی از بحث برانگیز است (احتمالاً به این دلیل که ممکن است وابسته به زمینه باشند)، ما نقش HIF{2}}a را در سیستم تجربی خود (به روشی مقدماتی) تجزیه و تحلیل کردیم. از آنجایی که قبلاً آن مداخله در COX را یافته‌ایم-2(سیکلواکسیژناز)/iPGE، مسیر گیرنده EP از افزایش بیان HIF-la ناشی ازهیپوکسی8،56 ما پرسیدیم که آیا مهار HIF-la منجر به پیشگیری می شود یا خیرهیپوکسیآپوپتوز سلول HK{1}} القا شده است. همانطور که در شکل 3f نشان داده شده است، قبل از جوجه کشی با YC{4}}، یک مهارکننده HIF-l، در واقع افزایش یافته است.هیپوکسیآپوپتوز ناشی از بنابراین، بعید است که HlF-la

بحث

بافتهیپوکسیتصور می شود که در پاتوفیزیولوژی بیماری مزمن کلیوی و آسیب حاد کلیه بسیار مهم است، زیرا PTC حساس ترین بخش لوله های کلیوی در برابر است.هیپوکسی. در اینجا ما نقش PGE را در آسیب وارد شده توسط آن بررسی کردیمهیپوکسیبه PTC انسان و دریافت که افزایش تولید iPGE ناشی از تنظیم بالای COX وابسته به HIF-la است-2(سیکلواکسیژناز)بیان ژن و افزایش بیان mPGES-1، بههیپوکسیمرگ سلولی آپوپتوتیک القا شده در سلول های HK-2. با توجه به اینکه هیپوکسی لوله ای یک عامل مرتبط برای بیماری حاد و مزمن کلیوی است{2}}، این نتایج PGT ناقل پروستاگلاندین را به عنوان یک هدف درمانی جدید در بیماری های کلیوی نشان می دهد.

هیپوکسینه تنها iPGE را افزایش می دهد بلکه انتشار آن به محیط خارج سلولی را نیز افزایش می دهد.هیپوکسیآپوپتوز القا شده (به عنوان مثال، ایجاد آبشارهای آپوپتوز از طریق فعال سازی متعارف گیرنده های EP واقع در غشای سلولی). دو مطالعه قبلی نشان داده اند که مرگ سلولی در زیرهیپوکسیهمچنین به دلیل COX بود-2(سیکلواکسیژناز)تولید وابسته PGE,1345. از سوی دیگر، در انواع خاصی از سلول ها (فیبروبلاست ها، میکروگلیاها، نورون ها و رده های سلولی لوسمی لنفوبلاستیک حاد)، آپوپتوز ناشی از PGE توسط PGE، فعال شدن وابسته به گیرنده های EP واسطه می شود. ما اینجا پیدا کردیم کههیپوکسیآپوپتوز سلول HK{1}} القا شده با تضاد گیرنده های EP نیز جلوگیری شد (شکل 2a، پانل بالایی، سمت راست). اما از آنجایی که گیرنده های EP به طور کلاسیک به عنوان گیرنده های غشای پلاسمایی توصیف شده اند - به طوری که برای iPGE غیرقابل دسترس هستند2-ما حدس می زنیم که گیرنده های EP که واسطه اثر آپوپتوز iPGE هستند، در سلول های HK-2 هیپوکسیک یک زیر مجموعه ای که در داخل سلولی قرار دارند (یعنی گیرنده های iEP).

برخلاف نقش iPGE2 درهیپوکسیآپوپتوز القا شده در سلول های HK-2، ما دریافتیم که فقط PGE خارج سلولی واسطههیپوکسیمرگ سلولی HK-2 ناشی از اکسیژن‌رسانی مجدد، زیرا توسط مهارکننده‌های PGT از آن جلوگیری نشد (شکل 2f). اگر چه مکانیسم های پاتولوژیک آسیب سلولی پس ازهیپوکسی/ اکسیژن رسانی مجدد به طور کامل درک نشده است، پذیرفته شده است که مرگ سلولی تا حد زیادی از طریق تولید گونه های اکسیژن فعال بیش از حد (ROS) رخ می دهد. این به ویژه برای سلول های HK-249،50 صادق است. با این حال، اگرچههیپوکسیهمچنین ممکن است تولید ROS را افزایش دهد، تا آنجا که ما می دانیم هیچ مدرکی مبنی بر اینکه ROS در آن مرتبط است وجود نداردهیپوکسیمرگ سلولی HK-2 را القا کرد. این نشان می‌دهد که اثرات کشنده هیپوکسی و هیپوکسی/ اکسیژن‌رسانی مجدد در سلول‌های HK-2 با مکانیسم‌های مختلفی انجام می‌شود، که ممکن است توضیح دهد که چرا BG و BS در برابر محافظت می‌کنند.هیپوکسیاما نه مخالفهیپوکسی/ اکسیژن رسانی مجدد در نتیجه، مهار PGT ممکن است مزایای درمانی در PTC در برابر آسیب سلولی ناشی از هیپوکسی داشته باشد، اما نه در برابر اثرات مضرهیپوکسی/ اکسیژن رسانی مجدد

HIF-1 -تنظیم افزایش وابسته به COX-2(سیکلواکسیژناز)یک رویداد حیاتی برایهیپوکسیآپوپتوز سلول HK{1}} القا شده (شکل 3e). با این حال، مشاهدات ما مبنی بر اینکه مهارکننده HIF YC{3}} مرگ سلولی آپوپتوتیک را افزایش می‌دهد (شکل 3f) گیج‌کننده است، اگرچه گزارش‌های قبلی قبلاً نتایج مشابهی را نشان داده‌اند. یکی از توضیح‌های احتمالی یک سناریوی فرضی است که در آن HIF-la نه‌تنها در تنظیم بالادستی طرفدار آپوپتوز COX دخالت می‌کند{10}}(سیکلواکسیژناز)بلکه افزایش تنظیم مولکول های محافظ. در واقع، HIF-1-بیان مولکول‌های محافظ را تنظیم می‌کندهیپوکسیمانند RNA طولانی غیر کد کننده DARS-AS1'و microRNA{3}} به طور خاص در سلول های HK-2 یافت شده است. با این حال، اگرچه این شواهد از سناریوی فرضی ما حمایت می‌کنند، اما باید آزمایش‌های خاصی برای تأیید آن انجام شود.

بررسی پاسخ سلول های کلیه بههیپوکسیممکن است درک ما از آسیب شناسی کلیه را بهبود بخشد. ما نقش افزایش نسبت بیان پروتئین پرو آپوپتوز Bax به پروتئین ضد آپوپتوز Bcl-2 را مطالعه کرده‌ایم، اگرچه به صورت مقدماتیهیپوکسیآپوپتوز القا شده در سلول های HK-2. نتایج ما نشان داد که مهار PGL منجر به تغییرات سازگار با یک تغییر ضد آپوپتوز در تعادل بین بیان Bcl-2 و Bax (شکل 2e) نمی‌شود، که نقش این پروتئین‌ها را پشتیبانی نمی‌کند. مرگ سلولی HK-2 وابسته به iPGE تحتهیپوکسی. تا جایی که ما می دانیم، تنها دو مطالعه در مورد نقش محور Bcl{{0}}/Bax در آپوپتوز ناشی از هیپوکسی در PTC وجود دارد و هر دوی آنها درگیر غلظت O بدون اکسیژن یا تقریباً بدون اکسیژن بودند. هنگامی که PTC در معرض 0.2 درصد O. قرار گرفت، بیان Bax بدون تغییر باقی ماند و آپوپتوز با کاهش درجه بیان Bcl{5}} مرتبط شد. وجود آپوپتوز، که با نتایج ما همزمان است. بنابراین، مکانیسم‌های دیگری که لزوماً شامل تغییرات کمی در بیان Bcl{8}} یا Bax نیستند، باید در نظر گرفته شوند: برای مثال، القای آپوپتوز در سلول‌های گلیومای کشت شده توسط iPGE2 فقط نیاز دارد. ارتباط فیزیکی آن با Bax، که باعث انتقال Bax به میتوکندری می شود.

گروه ما دریافته است که یک COX-2(سیکلواکسیژناز)افزایش وابسته به iPGE، واسطه مرگ آپوپتوتیک در سلول‌های HK{1}} در معرض سیس‌پلاتین، اجسام آپوپتوز و...هیپوکسی(نتایج فعلی ما). از آنجا که PGE پس از svnthesized به سرعت به خارج از سلول آزاد می شود، انتقال به داخل آن توسط PGl نقش مهمی در آپوپتوز ناشی از iPGE در سلول های HK-2 ایفا می کند. بنابراین، هر زمان که آسیب PTC توسط iPGE واسطه شود، درمان با مهارکننده‌های PGT ممکن است یک رویکرد درمانی مفید با کاربردهای بالقوه مانند پیشگیری از آسیب PTC ناشی از سیس پلاتین، مهار انتشار آسیب لوله‌ای از طریق اجسام آپوپتوز، یا محدودیت اثر مضر ازهیپوکسیدر PTC