تداخل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Cistanche Tubulosa با سنجش MTT

1. معرفی

گیاه انگلیسیستانچ توبولوزا(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae (اوروبانچاسه)خانواده) به طور گسترده در کشورهای آفریقای شمالی، عربی و آسیایی پراکنده است [1]. ناشی ازC. توبولوزاوC. deserticolaدر طب سنتی چینی مهم هستند، زیرا برای درمان ناتوانی جنسی، عقیمی، کمر و یبوست ناشی از اینرسی کولون استفاده می‌شوند [2]. علاوه بر این، عصاره اتانولی ازC. توبولوزانشان داده شده است که اثر محافظتی قابل توجهی در برابر هیپوکسی مغزی در موش دارد [3].

سلول های اندوتلیال نقش مهمی در پاتوژنز فشار خون ریوی هیپوکسیک دارند. رده سلولی اندوتلیال EA.hy926 به طور قابل توجهی شبیه سلول های اندوتلیال اولیه است. در طول مطالعه ما در مورد اثر ضد هیپوکسیک عصاره اتانولی C. tubulosa بر روی سلول‌های اندوتلیال EA.hy926، متوجه شدیم که 3-(4,{5}}dimethylthiazol-2-yl){{7 }}،5-آزمایش دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT)، که معمولاً برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی در مطالعات سمیت سلولی و فعالیت سیتواستاتیک استفاده می‌شود، نتایج متناقضی را با نشان دادن افزایش زنده‌مانی سلولی EA.hy926 پس از درمان ایجاد کرد.

ارزیابی دقیق بقای سلول برای شناسایی اثرات سیتوتوکسیک یا سیتوپروتکتیو بالقوه یک عامل دارویی ضروری است. بنابراین، ما بررسی کردیم که کدام اجزای موجود در عصاره اتانولی C. tubulosa ممکن است مسئول نتایج متناقض مشاهده شده با روش MTT باشد. ما دو اصلی را جدا کردیمگلیکوزیدهای فنیل اتانوئید (PhGs)از عصاره اتانولی C. tubulosa،اکیناکوزید (از این پس ترکیب 1) و آکتئوزید (از این پس ترکیب 2). ما تأثیر آنها را بر روی زنده ماندن سلول EA.hy926 با استفاده از روش‌های مختلف تعیین کردیم. علاوه بر این، برای روشن شدن بیشتر اینکه کدام جایگزین از ترکیبات 1 و 2 ممکن است مسئول نتایج متناقض باشد، آگلیکون، اسید کافئیک (از این پس ترکیب 3) و 3،4-دی هیدروکسیل فنیل اتانول (از این پس ترکیب 4) آنها را بر روی EA آزمایش کردیم. زنده ماندن سلول .hy926 با استفاده از روش های مشابه.

توبولوزای طبیعی سیستانچه برای مهار آپوپتوزیس PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2. نتایج و بحث

2.1. شناسایی ترکیبات

ساختارهای دو ترکیب جدا شده ازعصاره اتانولی C. tubulosaهمانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، با آنالیزهای تشدید مغناطیسی هسته ای (NMR) و طیف سنجی جرمی (MS) شناسایی شدند. ترکیب 1 با مقایسه با NMR گزارش شده قبلی (جدول 1) و MS (m/z 785 [M-H) به عنوان اکیناکوزید شناسایی شد. ]- ) داده [4]. طیف NMR ترکیب 2 بسیار شبیه به ترکیب 1 بود، به جز عدم وجود یک گروه -D-glucopyranosyl (جدول 1). ترکیب 2 (m/z 623 [M-H]-) به عنوان شناسایی شداکتئوزید[5]. نکته مهم این است که هر دو ترکیب دارای آگلیکون یکسانی هستند که شامل اسید کافئیک (ترکیب 3) و 3،4-دی هیدروکسیل فنیل اتانول (ترکیب 4) است.

2.2. سنجش زنده ماندن سلولی

سنجش MTT و CCK{{0}} برای تجزیه و تحلیل اثر ترکیبات 1-4 بر زنده ماندن سلول EA.hy926 استفاده شد. سنجش MTT نشان داد که زنده ماندن سلول‌های EA.hy926 پس از تیمار با 25 و 5{62}} میکرومولار ترکیبات 1، 2 یا 3 (166.3٪ و 174.1٪ برای ترکیب 1، 205.8٪ و 224.3٪ برای ترکیب به طور قابل توجهی افزایش یافت. 2، و 164.8٪ و 189.6٪ برای ترکیب 3، به ترتیب در مقایسه با سلول های کنترل (شکل 2A). علاوه بر این، بازرسی مورفولوژیکی سلول‌ها مشخص کرد که تیمار با 50 میکرومولار ترکیب 1، 2، یا 3 باعث افزایش تشکیل بلورهای بنفش فرمازان می‌شود که نشانه مستقیم نسبت سلول‌های زنده است (شکل 3). برعکس، سنجش CCK{33}} نشان داد که زنده ماندن سلولی پس از درمان با ترکیب 1، 2، یا 3 12.5، 25، و 50 میکرومولار (75.5٪، 45.1٪ و 43.7٪ برای ترکیب 1، 85.5٪) به طور قابل توجهی کاهش می یابد. 51.8٪، و 34.3٪ برای ترکیب 2، و 64.5٪، 48.2٪، و 36.4٪ برای ترکیب 3، در مقایسه با سلول های کنترل (شکل 2B). ترکیب 4 بر زنده ماندن سلولی در آزمون MTT یا CCK{66} تأثیری نداشت. اختلاف بین نتایج به‌دست‌آمده با دو سنجش نشان می‌دهد که یکی از دو سنجش ممکن است به‌طور دقیق اثرات ترکیبات 1 و 2 را بر زنده‌مانی سلول EA.hy926 منعکس نکند.

2.3. ارزیابی آپوپتوز توسط هوخست

رنگ آمیزی Hoechst 33342 یک رنگ DNA قابل نفوذ به سلول است که توسط نور ماوراء بنفش برانگیخته می شود و فلورسانس آبی در طول موج 460 تا 490 نانومتر منتشر می کند. کروماتین متراکم سلول های آپوپتوز روشن تر از کروماتین سلول های نرمال رنگ می شود [6]. در حالی که سلول های کنترل کروماتین پراکنده یکنواخت، اندامک های طبیعی و غشای سلولی دست نخورده را نشان دادند، سلول های انکوبه شده با ترکیبات 50 میکرومولار 1، 2، یا 3 به مدت 48 ساعت، رنگ آمیزی معمولی سلول های آپوپتوز را نشان دادند (شکل 4A). در مقابل، قرار گرفتن سلول ها در معرض 50 میکرومولار ترکیب 4، تعداد هسته های آپوپتوز را در مقایسه با تیمار شاهد افزایش نداد.

2.4. آنالیز فلوسایتومتری سلول های آپوپتوز

روش رنگ‌آمیزی دوگانه انکسین V-FITC/PI سلول‌های آپوپتوز را با اتصال با میل ترکیبی بالا انکسین V-FITC به فسفاتیدیل سرین شناسایی می‌کند که در سلول‌هایی که تحت آپوپتوز قرار می‌گیرند بیرونی می‌شوند [7]. در این روش، سلول‌های زنده به انکسین V یا PI متصل نمی‌شوند و بنابراین رنگ‌آمیزی نمی‌شوند (ربع پایین سمت چپ)، سلول‌های آپوپتوز اولیه با اتصال انکسین V-FITC (ربع پایین سمت راست) و سلول‌های آپوپتوز دیررس سبز رنگ می‌شوند. با اتصال انکسین V-FITC به فسفاتیدیل سرین و PI به سلول های نکروزه به ترتیب سبز و قرمز رنگ می شوند (ربع سمت راست بالا). همانطور که در شکل 4B نشان داده شده است، سلول های انکوبه شده با 50 میکرومولار ترکیبات 1، 2 یا 3 به مدت 48 ساعت، درصد سلول های آپوپتوز به ترتیب از 3.74٪ (سلول های شاهد) به 10.32٪، 12.95٪ و 11.30٪ افزایش یافت. در مقایسه با سلول های کنترل، ترکیب 4 درصد سلول های آپوپتوز EA.hy926 را افزایش نداد.

مطابق با نتایج به‌دست‌آمده با روش CCK-8 و رنگ‌آمیزی Hoechst 33342، روش فلوسیتومتری نشان داد که ترکیبات 1، 2 و 3 باعث القای آپوپتوز در سلول‌های EA.hy926 می‌شوند. در مجموع، این مشاهدات نشان می دهد که افزایش زنده ماندن سلول EA.hy926 مشاهده شده با روش MTT پس از درمان با ترکیبات 1-3 نشان دهنده یک نتیجه مثبت کاذب است.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای تقویت ایمنی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.5. بحث

در سال 1983، Mosmann یک روش رنگ سنجی میکروپلیت MTT برای اندازه گیری تکثیر سلولی و سمیت سلولی ایجاد کرد [8]. این روش ساده و اصلاحات آن اکنون به طور گسترده در آزمایشگاه های زیست شناسی سلولی در سراسر جهان استفاده می شود. مطالعات شکنش در سلول های پستانداران نشان داد که کوفاکتور نوکلئوتیدی پیریدین کاهش یافته، NADH، مسئول بیشتر کاهش MTT است. این توسط مطالعات با استفاده از سلول های کامل [9] پشتیبانی شد. بنابراین کاهش MTT با سلول‌های فعال متابولیکی مرتبط است و نه تنها با تنفس میتوکندری، بلکه با سیتوپلاسم و غشاهای غیر میتوکندری از جمله بخش اندوزوم/لیزوزوم و غشای پلاسمایی همراه است [10]. بار مثبت خالص روی مولکول MTT عامل اصلی برای جذب سلولی آن از طریق پتانسیل غشای پلاسمایی است.

قابل ذکر است، سنجش MTT ممکن است گاهی اوقات به طور دقیق تأثیر واقعی یک ترکیب آزمایش شده بر روی سلول های خاص را منعکس نکند. با این حال، ساختارها یا گروه های شیمیایی که ممکن است نتایج متناقضی در سنجش MTT ایجاد کنند، شناسایی نشده اند. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که سنجش MTT می‌تواند اثر ضد تکثیر (-)-اپی‌گالوکاتچین-3-گالات، فراوان‌ترین پلی‌فنول در چای سبز را دست کم بگیرد [11]. در مطالعاتی که از روش MTT برای تشخیص حساسیت شیمیایی تومور استفاده کردند، عوامل شیمی درمانی ضد سرطان، مانند اپی روبیسین، پاکلی تاکسل، دوستاکسل و ایماتینیب مسیلات (Gleevec)، افزایش زنده ماندن سلولی را نشان دادند [12،13]. علاوه بر این، چندین مطالعه گزارش کرده‌اند که عصاره‌های گیاهی خاص و پلی‌فنول‌های فعال ردوکس می‌توانند با سنجش MTT تداخل داشته باشند، زیرا به طور مستقیم نمک تترازولیوم MTT را در غیاب سلول کاهش می‌دهند [14].

نیاز به حل کردن کریستال‌های فرمازان MTT قبل از تجزیه و تحلیل اسپکتروفتومتری در یک میکروپلیت‌خوان و ماهیت نقطه پایانی ذاتی واکنش، استفاده از سنجش MTT را برای کاربردهای خاص محدود می‌کند. این منجر به توسعه آنالوگ های تترازولیوم شد که در آن قسمت های فنیل با گروه های سولفونات دارای بار منفی مانند 2،3-بیس-(2-متوکسی-4-نیترو- 5- تزئین شده بودند. سولفوفنیل)-2H-تترازولیوم-5-کربوکسانیلید (XTT)، یک نمک داخلی با بار منفی [15] و 3-(4،{12}}دی متیل تیازول{13}}ایل) -5-(3-کربوکسی متوکسی فنیل)-2-(4-سولفوفنیل)-2H-tetrasolium (MTS)، یک نمک داخلی اسیدی ضعیف که نزدیک به MTT است [16] . این تغییرات منجر به تولید محصولات فرمازان محلول در محیط کشت شد که نیاز به مرحله انحلال را قبل از تعیین کمی حذف کرد. به همین ترتیب، با افزایش بار منفی روی این مولکول‌ها، توانایی آنها برای حرکت در غشای سلولی کاهش می‌یابد [17]، گیرنده‌های الکترون میانی (IEA)، مانند 1-متوکسی{24}}متیل فنازین متیل سولفات ({25) }} متوکسی PMS) برای تسهیل کاهش رنگ تترازول یا افزایش سرعت کاهش مورد نیاز بود.

اخیراً، نسل جدیدی از نمک های تترازولیوم محلول در آب توسعه یافته است که WST{1}} نمونه اولیه آن است [18]. WST{3}}، یک نمک داخلی دی سولفون دار با بار منفی حاوی باقیمانده ید، پایدارتر از XTT و MTS در حضور 1-متوکسی PMS است، این یک IEA اجباری است. این منجر به بازاریابی WST-1/{1-متوکسی PMS به عنوان یک کیت تک واکنش تک سلولی مناسب شد. چندین نمک تترازولیوم دیگر در سری WST ایجاد شده است که مفیدترین آنها شاید WST{7}} [19] باشد. به نظر می‌رسد که WST-8 دارای ویژگی‌های کاهش سلولی بسیار مشابه با WST{10}} است و به‌صورت مستقل به‌عنوان سنجش CCK{11}} به بازار عرضه می‌شود. WST{12}} غیرقابل نفوذ سلولی است و بنابراین به صورت خارج سلولی، از طریق انتقال الکترون از NADH درون سلولی به WST{13}} در سراسر غشای پلاسما با واسطه 1-متوکسی PMS کاهش می‌یابد. اگرچه کاهش MTT و WST{15}}/1-متوکسی PMS توسط NADH درون سلولی انجام می‌شود، به نظر می‌رسد منبع NADH در این دو روش متفاوت است. کاهش WST{17}}/1-متوکسی PMS بیشتر به شاتل مالات/آسپارتات وابسته است که چرخه اسید تری کربوکسیلیک میتوکندری-NADH را با فضای خارج میتوکندریایی پیوند می‌دهد [20].

در آزمایشات اولیه، ما تایید کردیم که ترکیبات 1، 2، 3 و 4 نمی توانند به طور مستقیم نمک تترازولیوم MTT را کاهش دهند (نشان داده نشده است). در مطالعه حاضر، تأثیر مستقیم خود ترکیبات با معرف با شستن دقیق میکروپلیت ها با سالین بافر فسفات (PBS) قبل از افزودن محلول MTT یا CCK{5}}، همانطور که در پروتکل های سازنده نشان داده شده است، حذف شد. با این وجود، نتایج به دست آمده با استفاده از دو روش همچنان متناقض بود (شکل 2). همانطور که انتظار می رفت، انکوباسیون سلول ها با ترکیبات 1، 2 و 3 باعث افزایش کاهش نمک تترازولیوم به فرمازان ارغوانی در مقایسه با گروه کنترل شد (شکل 3)، که نشان می دهد صرفاً کاهش نمک تترازولیوم در حضور یک ترکیب خاص. برای قضاوت در مورد توانایی ترکیب در تداخل با سنجش MTT کافی نیست.

برای تعیین اینکه آیا ترکیبات 1، 2، 3 و 4 می‌توانند آپوپتوز را در سلول‌های EA.hy926 القا کنند، تغییرات مورفولوژیکی سلولی و بیرونی‌سازی فسفاتیدیل سرین مورد بررسی قرار گرفت. مطابق با کاهش زنده ماندن سلولی مشاهده شده با روش CCK{5}}، نتایج رنگ‌آمیزی هوخست و آنالیز فلوسیتومتری با استفاده از انکسین V-FITC/PI نشان داد که مهار رشد مشاهده‌شده پس از تیمار ترکیب 1، 2 و 3 حداقل تا حدی به دلیل آپوپتوز سلولی EA.hy926 است. نتایج ما همچنین از این ایده حمایت کرد که گروه کافیل موجود در هر دو ترکیب 1 و 2 مسئول نتایج متناقض به‌دست‌آمده با روش MTT است.

مشابه یافته‌های ما، روتلرین، یک کانال بازکننده کانال پتاسیم با رسانایی بزرگ قوی، واکنش‌پذیری نسبت به MTT در شرایط آزمایشگاهی نشان نداد. با این حال، به شدت تشکیل کریستال های فورمازان را در داخل سلول ها افزایش داد، نتیجه ای که در تضاد آشکار با مهار روتلرین NF-κB و تکثیر سلولی مشاهده شده با تجزیه و تحلیل ادغام [3H]-تیمیدین در DNA بود [21]. مکانیسمی که توسط Rottlerin کاهش MTT را افزایش داد به اثر جداسازی میتوکندریایی آن نسبت داده شد [22]. روتلرین دارای یک گروه جایگزین اسید سیناموئیل است. در مقایسه با سیناموئیل اسید، ترکیب 3 دارای دو باقیمانده هیدروکسیل اضافی است که در C-3 و C{7}} قرار دارند. بنابراین، ما حدس می زنیم که مکانیسمی که توسط آن ترکیبات 1 و 2 باعث نتایج متناقضی در سنجش MTT می شوند، ممکن است با اثرات جداسازی میتوکندریایی آنها نیز مرتبط باشد. برای آزمایش این فرضیه، مطالعات مقایسه ای بین ترکیبات 1 و 2 و یک جداکننده شیمیایی مانند تری فلوروکربونیل سیانید فنیل هیدرازون (FCCP) مورد نیاز است.

 توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. بخش تجربی

3.1. معرف ها و مواد شیمیایی

ترکیب 3 (پودر اسید کافئیک، خلوص=98.6%) از شرکت Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (چنگدو، چین) خریداری شد. ترکیب 4 (3،4-دی هیدروکسیل فنیل اتانول-روغن، خلوص=98.5%) از شرکت Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (چنگدو، چین) به دست آمد. MTT و دی متیل سولفوکسید (DMSO) از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. سنجش CCK{11}} از آزمایشگاه‌های Dojin (کوماموتو، ژاپن) خریداری شد. کیت های تشخیص آپوپتوز Hoechst 33342 و annexin V-FITC/PI از موسسه بیوتکنولوژی Beyotime (هایمن، چین) خریداری شد.

3.2. ماده ی گیاهی

C. توبولوزاساقه ها از استان یوتیان، منطقه خودمختار اویغور سین کیانگ، چین جمع آوری شد. نمونه‌های کوپن در آزمایشگاه کلیدی پزشکی ارتفاع بالا، دانشگاه پزشکی نظامی سوم (چونگ‌کینگ، چین) سپرده شدند و توسط یی ژانگ از دانشگاه طب سنتی چینی چنگدو (چنگدو، چین) احراز هویت شدند.

3.3. استخراج و جداسازی مواد گیاهی

ساقه های C. tubulosa ({1}}.6 کیلوگرم) در هوا خشک شده پودر شده و با اتانول 50 درصد به مدت 2 ساعت در دمای 70 درجه استخراج شدند. پس از حذف حلال تحت فشار کاهش یافته، عصاره اتانولی (212.5 گرم) حل شد و در آب (2 لیتر) به حالت تعلیق درآمد و با n-بوتانول (2 L×3) استخراج شد. عصاره n-بوتانول (110 گرم) روی یک ستون پلی آمید کروماتوگرافی شد و با اتانول/آب (0:100، 5:95، 15:85، 30:70، 50:50) شسته شد و پنج فراکسیون (A-E) تولید کرد. . کسر B (65 گرم) بر روی یک ستون ODS تکه تکه شد. شستشو با اتانول: آب (1:9) ترکیب 1 (3 گرم) را جدا کرد. کسر D (10.5 گرم) بر روی یک ستون ODS تکه تکه شد. شستشو با اتانول / آب (1: 4) ترکیب 2 (1 گرم) جدا شده است.

طیف‌های NMR بر روی یک طیف‌سنج Bruker Avance 600 در CD3OD با تترا متیل سیلان (TMS) به عنوان استاندارد داخلی ثبت شد. طیف جرمی بر روی یک طیف سنج جرمی BioTOF-Q انجام شد.

3.4. کشت سلولی

رده های سلولی EA.hy926 از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ماناساس، VA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. سلول‌ها در محیط RPMI 1640 با 10% (v/v) سرم جنین گاوی و 1% (v/v) پنی‌سیلین-استرپتومایسین در محیط مرطوب شده با CO2 5% در دمای 37 درجه کشت شدند.

3.5. زنده ماندن سلولها

زنده ماندن سلول ها با استفاده از روش های MTT و CCK{{0}} ارزیابی شد. ترکیبات 1 و 2 و آگلیکون‌های آن‌ها، اسید کافئیک (3) و 3،{5} دی هیدروکسیل فنیل اتانول (4) در DMSO تا غلظت نهایی DMSO <0.1% (v/v) در محیط کشت حل شدند.

سلول‌های EA.hy926 بر روی صفحات چاهک در 4 × 103 سلول در چاه کاشته شدند. پس از انکوباسیون به مدت 24 ساعت، سلول ها با 6.25-50 میکرومولار ترکیب 1، 2، 3، یا 4 به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. محیط کشت برداشته شد و سلول ها دو بار با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند. مقدار کمی (10 میکرولیتر) از محلول موجود MTT (5 میلی گرم در میلی لیتر-1) به هر چاه حاوی 100 میکرولیتر محیط اضافه شد و به مدت 4 ساعت با سلول ها انکوبه شد. پس از انکوباسیون، محیط خارج شد و 150 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه شد تا بلورهای فورمازان حل شوند. جذب با استفاده از میکروپلیت خوان (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA) در طول موج 490 نانومتر اندازه گیری شد. زنده ماندن سلول به عنوان درصد کاهش MTT بیان شد و مقدار 100٪ را به جذب سلول های کنترل اختصاص داد. تمام آزمایش ها سه بار انجام شد و به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شد.

سنجش CCK{0}} بر اساس ادبیات و با تغییرات جزئی انجام شد [23]. به طور خاص، سلول ها با ترکیبات 1، 2، 3، یا 4 6.25-50 میکرومولار به مدت 24 ساعت تیمار شدند و قبل از افزودن 10 میکرولیتر CCK{11}} و 100 میکرولیتر محیط کشت، دو بار با PBS شسته شدند. پس از انکوباسیون میکروپلیت در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت، جذب با استفاده از میکروپلیت ریدر در طول موج 450 نانومتر اندازه گیری شد. زنده ماندن سلول به عنوان درصد سلول های زنده نسبت به سلول های کنترل (100٪) بیان شد. تمام آزمایش ها سه بار انجام شد و به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد.

3.6. ارزیابی آپوپتوز توسط رنگ آمیزی Hoechst 33342

تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوز با رنگ آمیزی Hoechst 33342 مشاهده شد. به طور خلاصه، سلول‌های EA.hy926 بر روی صفحات چاهک (2 × 104 سلول در چاه) کاشته شدند و با ترکیب 1، 2، 3 یا 4 به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه تیمار شدند و دو بار با PBS شسته شدند. و با 4% (v/v) پارافورمالدئید به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق ثابت شد. پس از دو بار شستشو با PBS، سلول ها با Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند و دو بار با PBS شسته شدند. هسته های رنگ آمیزی شده با هوخست با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (Olympus، توکیو، ژاپن) مشاهده شدند.

3.7. تجزیه و تحلیل آپوپتوز توسط فلوسایتومتری

سلول‌های آپوپتوز با رنگ‌آمیزی دوگانه انکسین V-FITC/PI و آنالیز فلوسیتومتری شناسایی شدند. به طور خلاصه، پس از درمان با 50 میکرومولار ترکیب 1، 2، 3، یا 4 به مدت 48 ساعت، سلول‌ها برداشت شدند و در PBS در 1 × 105 سلول · میلی‌لیتر - 1 به حالت تعلیق درآمدند. پس از سانتریفیوژ در 500× گرم به مدت 5 دقیقه در دمای 25 درجه، 195 میکرولیتر بافر اتصال انکسین V-FITC و 5 میکرولیتر انکسین V-FITC اضافه شد. پس از اختلاط ملایم گردابی، مخلوط به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از سانتریفیوژ در گرم 500 به مدت 5 دقیقه در دمای 25 درجه، 190 میکرولیتر بافر اتصال انکسین V کونژوگه با FITC و 10 میکرولیتر PI اضافه شد. پس از اختلاط ملایم گردابی، نمونه‌ها با استفاده از فلوسایتومتر FACSCalibur (Becton Dickinson، San Jose، CA، USA) در مدت 30 دقیقه آنالیز شدند.

3.8. تحلیل آماری

تمام داده های تجربی به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. معنی‌داری تفاوت بین نمونه‌های آزمایشی و شاهد مربوطه با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) با استفاده از نرم‌افزار SPSS (نسخه 11.5) ارزیابی شد. معنی‌داری آماری در p < 0.05 تنظیم شد.

4. نتیجه گیری

نتایج ما نشان می‌دهد که تخمین بیش از حد تعداد سلول‌های زنده مشاهده‌شده در سنجش MTT می‌تواند سمیت سلولی برخی ترکیبات را بپوشاند. بنابراین، در طول فرآیندهای غربالگری دارو، توصیه می‌کنیم از روش‌های مختلفی برای تعیین تأثیر ترکیب خاص بر زنده‌مانی سلول (مانند سنجش CCK-8 و 3 H-TdR) استفاده کنید تا از ایجاد نتایج گمراه‌کننده جلوگیری شود.

سیستانچ توبولوزای طبیعی برای افزایش ترشح تستوسترون PHGS75% ECH 30% ACT 12%