آیا ارتباط پلی‌مورفیسم ژن نادر Rs35667974 IFIH1 با بیماری‌های خودایمنی یک مورد از اپی ژنتیک RNA است؟

تجسم - AA، AP، و EEE، نظارت - EEE، و کسب بودجه - EEE. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند. خلاصه

اینترفرون القا شده با ژن پروتئین 1 حاوی دامنه هلیکاز C (IFIH1) یک RNA هلیکاز سیتوپلاسمی را کد می کند که به نام 5 مرتبط با تمایز ملانوم (MDA5) شناخته می شود، یک RIG{6}}شبیه RNA هلیکاز که RNA ویروسی را تشخیص می دهد و در ذاتی نقش دارد. ایمنی از طریق شناسایی RNA ویروسی پس از اتصال به RNA دو رشته ای (ds)، MDA5 یک مجموعه رشته ای در طول dsRNA تشکیل می دهد و از امضاهای مولکولی برای تمایز خود در مقابل غیر خود بر اساس طول dsRNA و متیلاسیون استفاده می کند. نوع نادرست آن rs35667974 در برابر دیابت نوع 1، پسوریازیس و آرتریت پسوریاتیک محافظت می کند، اما همچنین مشخص شده است که با افزایش خطر ابتلا به اسپوندیلیت آنکیلوزان، بیماری کرون و کولیت اولسراتیو همراه است. برای به دست آوردن بینشی در مورد نقش پیچیده این نوع، ما با استفاده از شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی، آنالیز ساختاری MDA5 را در مجتمع با dsRNA انجام دادیم.

داده‌های ما نشان می‌دهد که در حالی که جهش Ile923Val در نوع rs35667974 به طور قابل‌توجهی بر اتصال به dsRNA بومی تأثیر نمی‌گذارد، اما در حضور متیلاسیون یوریدین 2'-O اثر بی‌ثبات‌کننده‌ای را نشان می‌دهد. بنابراین، حضور 2'-O-متیلاسیون در dsRNA یک امضای حسگر را معرفی می کند که منجر به کاهش انتخابی فعالیت کلی کاتالیزوری MDA می شود. این مطالعه ارزیابی نقش نوع مشترک rs35667974 جایگاه خودایمنی IFIH1 را نشان می‌دهد که گزارش شده است که منجر به کاهش انتخابی فعالیت کاتالیزوری فنوتیپ اصلاح‌شده MDA5 و در نتیجه کاهش بازخورد منفی در سیگنال‌دهی سیتوکین و کموکاین و محافظت انتخابی در برابر خودایمنی می‌شود. .

دامنه هلیکاز C یک پروتئین آنزیمی مهم است که می تواند ساختار مارپیچ دوگانه DNA را باز کند. این می تواند به DNA برای تکمیل همانندسازی، ویرایش و تحویل صحیح در فرآیند تکثیر، ترمیم و رونویسی سلول کمک کند و یکی از کلیدهای عملکرد طبیعی سلول ها است. در عین حال، ایمنی یک مکانیسم دفاعی بسیار مهم در بدن انسان است که می تواند به طور موثری از ما در برابر عوامل بیماری زا مانند باکتری ها و ویروس ها محافظت کند.

مطالعات نشان داده اند که دامنه هلیکاز C نقش مهمی در ایمنی ایفا می کند. اول از همه، دامنه هلیکاز C می تواند با کمک به تکثیر طبیعی، ترمیم و رونویسی DNA سلولی، پایداری و کارایی کدگذاری ژن ها را تضمین کند و در نتیجه ایمنی بدن انسان را بهبود بخشد. ثانیاً، دامنه هلیکاز C می‌تواند به شناسایی مولکول‌های ناهمگونی پروتئین توسط سلول‌ها کمک کند و انتقال سیگنال سیستم ایمنی را تنظیم کند و در نتیجه از عملکرد دفاعی بدن پشتیبانی کند. هر دو روش فوق نقش مثبتی در ارتقاء حفظ و تقویت ایمنی داشته اند.

علاوه بر این، مطالعه عمیق رابطه بین دامنه هلیکاز C و ایمنی نیز الهام‌بخش مهمی برای کشف داروهای جدید برای درمان سرطان و بیماری‌های مرتبط با ایمنی است. توسعه دارو و ژن درمانی با هدف قرار دادن دامنه هلیکاز C می تواند مقاومت بدن در برابر سرطان و سایر بیماری های مرتبط با ایمنی را بهبود بخشد و به بیماران کمک کند تا بهتر با درمان و بهبود بیماری های مرتبط کنار بیایند.

به طور خلاصه، رابطه بین دامنه هلیکاز C و ایمنی بسیار نزدیک است و نقشی حیاتی در تضمین ثبات ژن، ارتقای ایمنی سلولی و حمایت از دفاع بدن دارد. امید است با روش های تحقیقاتی و درمانی مرتبط، بتوانیم ایمنی انسان را بهتر حفظ و تقویت کنیم و زندگی سالم تر و بهتری را برای خود رقم بزنیم. از این منظر، ما باید مصونیت شخصی را تقویت کنیم. سیستانچ تاثیر بسزایی در بهبود ایمنی دارد زیرا خمیر گوشت سرشار از انواع مواد آنتی اکسیدانی مانند ویتامین C، ویتامین C، کاروتنوئیدها و غیره است، این مواد می توانند رادیکال های آزاد را از بین ببرند و استرس اکسیداتیو را کاهش دهند. تقویت و بهبود مقاومت سیستم ایمنی بدن.

روی مزایای cistanche tubulosa کلیک کنید

کلید واژه ها

پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) · مدل مولکولی · اینترفرون القا شده با هلیکاز C دامنه 1 (IFIH1) · تمایز ملانوما مرتبط با 5 (MDA5) · متیلاسیون RNA.

معرفی

ژن‌ها و مکانیسم‌های دخیل در بیماری‌های خودایمنی، که تقریباً 5 درصد از جمعیت را تحت تأثیر قرار می‌دهند، همچنان مبهم باقی می‌مانند، اما داده‌های انباشته قویاً نشان می‌دهد که بیماری‌های خودایمنی مختلف می‌توانند زمینه ژنتیکی مشترکی داشته باشند، بنابراین به وجود انواعی اشاره می‌کند که در بیماری‌های خودایمنی مختلف مشترک است. (ژرناکوا و همکاران 2009). تلاش برای کشف این اطلاعات ژنتیکی در مکانیسم‌های بیولوژیکی معنی‌دار منجر به بیماری‌ها، به شناسایی ژن‌های علّی اشاره دارد. شناسایی انواع بیماری‌زا یک کار دشوار اما ضروری در تلاش برای ایجاد روش‌های مؤثر برای پیش‌بینی، پیشگیری و مداخله بیماری است (Biros et al. 2005).

انواع مختلفی از مولکول های RNA در تنظیم چندین فرآیند بیولوژیکی از جمله RNA پیام رسان (mRNA)، RNA انتقالی (tRNA)، RNA ریبوزومی (rRNA)، microRNA (miRNA)، و RNA طولانی غیر کدکننده (lncRNA) نقش دارند. مولکول های RNA حاوی تغییرات شیمیایی متعدد (بیش از 150) هستند (Machnicka et al. 2013; Boccaleto et al. 2018). این تغییرات از نظر عملکردی با تمام مراحل متابولیسم RNA، مانند ساختار، پایداری، و برهمکنش‌ها مرتبط هستند و نقش‌های حیاتی در چندین فرآیند بیولوژیکی، مانند تعدیل تکثیر ویروس‌ها و پاسخ‌های ایمنی ضد ویروسی ایفا می‌کنند (Machnicka و همکاران 2013). در میان آنها، متیلاسیون ریبوز یکی از رایج ترین تغییرات موجود در RNA است. 2'-O-methyluridine در rRNA، snRNA، snoRNA و tRNA آرکیا، باکتری ها و یوکاریوتا یافت می شود (Aučynaitė et al. 2018). ریبوز{8}}'-متیلاسیون آب گریزی نوکلئوتیدها را افزایش می دهد و از آنها در برابر عملکرد نوکلئازها محافظت می کند (Yildirim et al. 2014).
شواهد انباشته نشان می دهد که 2'-O-متیلاسیون RNA ویروسی (2'OMe-RNA) نقش مهمی در فرار از پاسخ های ایمنی ذاتی سلولی در سلول های میزبان ایفا می کند (Dimitrova et al. 2019). Züst و همکارانش نشان داده اند که 2' OMe RNA ویروسی به فرار از پاسخ ضد ویروسی با واسطه اینترفرون (IFN) کمک می کند و در نتیجه تکثیر ویروس را تقویت می کند (Züst et al. 2011). همچنین، Vitali و Scadden پیشنهاد کرده اند که IU-dsDNA مسیر تحریک کننده MDA5 IFN را سرکوب می کند (Vitali and Scadden 2010).

اینترفرون القا شده با ژن هلیکاز C دامنه 1 (IFIH1) یک RNA هلیکاز سیتوپلاسمی را کد می کند که با نام MDA5 (پروتئین مرتبط با تمایز ملانوما 5) نیز شناخته می شود، و یک گیرنده RIG-I مانند (RLR) است که عملکرد ضد ویروسی را در ایمنی ذاتی انجام می دهد. با شناسایی RNA های ویروسی MDA5 ساختار ساقه دوبلکس RNA را 5-1 کیلوبایت تشخیص می دهد که معمولاً در طی تکثیر پیکورناویروسی شکل می گیرد و واسطه پاسخ ایمنی به عفونت ویروسی است (Nejentsev و همکاران 2009؛ Crow 2011). MDA5 با شناسایی RNA های دو رشته ای ویروسی طولانی (dsRNA) که در طی تکثیر پیکورناویروس ها تولید می شوند، مسیر سیگنال دهی اینترفرون نوع I را فعال می کند. مطالعات نشان داده اند که MDA5 رشته ای را در طول dsRNA تشکیل می دهد و از دینامیک رشته های وابسته به ATP برای تمایز بین خود و غیر خود بر اساس طول dsRNA استفاده می کند (Toro et al. 2015). نشان داده شد که MDA5 در تعدیل ارتباط بین سلول‌ها و سیستم ایمنی ذاتی/تطبیقی ​​از طریق تولید محلی سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها نقش دارد.

تغییرات در بیان و/یا فعالیت MDA5 ممکن است باعث واکنش سلولی به dsRNA، محصول جانبی تکثیر ویروس شود (Colli et al. 2010). همچنین نشان داده شده است که جهش بقایای مرتبط با تشکیل فلامنت منجر به از دست دادن تشکیل رشته و سیگنال‌دهی وابسته به MDA می‌شود، به جز یک جفت جهش، که سیگنال‌دهی را به طور متوسط ​​افزایش می‌دهند. این نتایج نشان می‌دهد که مکانیسم‌های مستقل از ATP، یعنی اتصال محکم‌تر به RNA و/یا برهمکنش پروتئین-پروتئین پایدارتر، احتمالاً مسئول پایداری مشاهده‌شده تشکیل رشته MDA5 در شرایط آزمایشگاهی و برای فعالیت سیگنال‌دهی بالاتر در سلول‌ها هستند (Sohn و هور 2016).

اسمیت و همکاران (2006) و Nejentsev و همکاران. (2009) یک آلل نادر از ژن IFIH1 را توصیف کرد که از دیابت نوع 1 (T1D) محافظت می کند. این پلی‌مورفیسم تک نوکلئوتیدی rs35667974 IFIH1 (SNP)، که در آن ایزولوسین (کدون [ATT]) حفظ شده در موقعیت #923 به والین (کدون [GTT]) تغییر می‌کند، یک نوع نادر است زیرا فرکانس آلل جزئی (MAF) C {{ 9}}.010031 (2655 نفر در کل نمونه 264690) بر اساس TOPMED (Taliun et al. 2021) و C = 0.016267 (3343 نفر در کل نمونه 205514) بر اساس ALFA (Phan et) همکاران 2020؛ شری و همکاران 2001). در جدول 1، جغرافیای زیستی انسانی فراوانی چندشکلی در مناطق مختلف قاره ای بر اساس داده های پروژه ALFA (فان و همکاران 2020؛ شری و همکاران 2001)، ارائه شده است. مطالعات بعدی تأیید کرد که این آلل نادر بر T1D، پسوریازیس (PS) (Li et al. 2010) و آرتریت پسوریاتیک (PsA) تأثیر یکسانی داشت (Budu-Aggrey et al. 2017). برعکس، این SNP به عنوان یک عامل خطر برای ابتلا به اسپوندیلیت آنکیلوزان (AS) (Ellinghaus و همکاران 2016)، بیماری کرون (CD) (Ellinghaus و همکاران 2016؛ Budu-Aggrey و همکاران 2017) مرتبط بوده است. و کولیت اولسراتیو (UC) (Ellinghaus و همکاران 2016؛ Budu-Aggrey و همکاران 2017).

چیستیاکوف و همکاران (2010) نشان داده اند که جهش های از دست دادن عملکرد E627X و I923V MDA5 با تولید اینترفرون ناشی از پلی (I: C) کمتر در سلول های تک هسته ای خون محیطی بیماران دیابتی نوع 1 مرتبط است و بنابراین محافظ T1D هستند. همچنین بیان شده است که در مولکول MDA5، جایگزینی اسید آمینه I923V در مجاورت باقیمانده H927 قرار دارد که به اتصال dsRNA کمک می کند (یونیاما و فوجیتا 2008). با این حال، نشان داده شد که نوع MDA I923V دارای توانایی طبیعی برای اتصال dsRNA است اما فعالیت کاتالیزوری 2 برابری کاهش می‌یابد (Shigemoto و همکاران 2009). بنابراین، به نظر می‌رسد که این پلی‌مورفیسم به‌طور عمده‌ای بر خواص اتصال اسید نوکلئوتیدی این هلیکاز حساس به RNA سیتوپلاسمی تأثیر نمی‌گذارد، اما عملکرد آن را با مکانیسمی هنوز ناشناخته تغییر می‌دهد.

ارتباط بین پلی مورفیسم IFHI1 و بروز عفونت انتروویروس در T1D و ارتباط بین نوع MDA5 I923V و فراوانی RNA انتروویروسی در بیماران T1D پیدا شده است (Looney et al. 2015). علاوه بر این، مطالعات اخیر بر روی موش‌های MDA5- و MAVSknockout نقش حیاتی این پروتئین‌ها را در میانجی‌گری پاسخ‌های اینترفرون نوع 1 در برابر ویروس Coxsackie B نشان داد (وانگ و همکاران 2010). نشان داده شده است که یک پروتئین رهبر منگوویروس از بیان IFN- با مسدود کردن دیمریزاسیون IRF3 مورد نیاز برای فعال شدن این فاکتور جلوگیری می کند (هاتو و همکاران 2007). این مشاهدات نشان می‌دهد که انواعی که عملکرد IFIH1 را در پاسخ ضد ویروسی میزبان مختل می‌کنند، به جای انتخاب مثبت، منفی انتخاب شده‌اند، زیرا از T1D محافظت می‌کنند (Crow 2011).

چاو و همکاران (2018) به طور گسترده در میان دیگران گیرنده های RIG-I مانند را تجزیه و تحلیل کرده اند، در حالی که Brisse و Ly (2019) تکامل و گونه زایی MDA5 و RIG-I مربوط به آن را به طور گسترده بررسی کردند. محل باقیمانده های تغییر یافته در یا نزدیک محل های اتصال به RNA و ATP یا رابط رشته ما را به این فرض سوق داد که جهش های مشاهده شده ممکن است با افزایش میل ترکیبی بین IFIH1 و dsRNA یا بین IFIH1، پایداری رشته IFIH1 را افزایش دهند. مولکول های موجود در رشته یا با کاهش کارایی هیدرولیز ATP و در نتیجه سرعت جداسازی رشته ها (Rice et al. 2014).

این کار نشان دهنده یک مطالعه ساختاری از نقش بالقوه گونه مشترک rs35667974 منبع خودایمنی IFIH1 است که گزارش شده است که منجر به یک فنوتیپ عملکرد مهار شده می شود که جایگزین اسید آمینه Ile923Val در محصول پروتئین ژن IFIH1 MDA5 را کد می کند. دومی یک ژن کاندید علّی قابل قبول بیولوژیکی است که در میان چندین بیماری مشترک است و بر کنترل بیان موضعی سیتوکین‌ها و کموکاین‌ها تأثیر می‌گذارد که در برابر خودایمنی محافظت می‌کنند (Colli et al. 2010). هدف این کار کشف مکانیسم ثابت ناشناخته ای است که توسط آن جایگزینی Ile923Val فعالیت کاتالیزوری MDA5 انسانی را کاهش می دهد. در این مطالعه، تفاوت‌ها در تعامل MDA5 با dsRNA بین نوع بومی و نادر Ile923Val در شروع مکانیسم التهاب بررسی شد. بر این اساس، هدف ما بررسی رفتار دینامیکی مجتمع MDA5/dsRNA انسانی در یک محیط آبی در حضور Ile923 یا Val923 در زمانی که اوراسیل 2'-O متیله شده است یا نه. این تحلیل ساختاری حساسیت ژنتیکی مشترک نادر یا جایگاه‌های حفاظتی ممکن است بینش‌هایی را در مورد درک ما از پاتوفیزیولوژی بیماری‌های خودایمنی ارائه دهد و یافته‌های تحقیق ممکن است بر مدیریت بهتر بیماری‌های مورد مطالعه تأثیر بگذارد.

مواد و روش ها

بازیابی توالی، ساخت درخت فیلوژنتیک، و تجزیه و تحلیل انتخاب مثبت

توالی پروتئین هومو ساپینس (شناسه توالی: NP{0}}.2) از پایگاه داده UniProt (کنسرسیوم UniProt 2021) بازیابی شد. برای یافتن همولوگ‌ها در بین گونه‌ها، جستجوهای BLAST با Mega BLAST (مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی، NCBI، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) در پایگاه‌داده پروتئین RefSeq و NR (و PDB و UniProt) با استفاده از Blastp (بلاست پروتئین-پروتئین) با پارامترهای پیش فرض (Altschul et al. 1997). 1000 همولوگ پروتئین های MDA5 انسانی در ابتدا انتخاب شدند و انتخاب بین گونه ای با تمرکز بر دامنه C ترمینال حاوی توالی در اطراف جایگزینی I923V انسانی برای شناسایی این تنوع در گونه های دیگر استفاده شد. Clustal Omega، برنامه هم ترازی توالی چندگانه (Clustal-O) (Sievers et al. 2011) و سرور همترازی توالی چندگانه T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) برای انجام ترازهای توالی پروتئین استفاده شد. و نرم افزار بیوانفورماتیک پلت فرم Unipro UGENE (Okonechnikov و همکاران 2012) برای تجسم انتخابی ترازهای چندگانه.

تجزیه و تحلیل تکاملی برای شناسایی موقعیت‌هایی در توالی‌های پروتئینی که به شدت در بین گونه‌ها حفظ شده‌اند، استفاده می‌شود که نشان‌دهنده اهمیت ساختاری است (Andreou et al. 2018). درخت فیلوژنتیک با استفاده از روش حداکثر درستنمایی (Nei and Kumar 2000) و مدل Tamura-Nei (Tamura and Nei 1993) با 500 تکرار بوت استرپ ساخته شد (Felsenstein 1985). درخت(های) اولیه برای جستجوی اکتشافی به طور خودکار با استفاده از الگوریتم های Neighbor-Join و BioNJ به ماتریسی از فواصل زوجی تخمین زده شده با استفاده از مدل Tamura-Nei و سپس انتخاب توپولوژی با ارزش ورود به سیستم برتر به دست آمد. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک شامل 52 توالی نوکلئوتیدی همولوگ (39 ارتولوگ و 13 پارالوگ) از ژن IFIH1 انسانی بود. موقعیت های کدون شامل 1 به علاوه 2 به علاوه 3 به علاوه غیر کدگذاری بود. در مجموع 3729 موقعیت در مجموعه داده نهایی وجود داشت. تجزیه و تحلیل های تکاملی با استفاده از بسته نرم افزاری MEGA11 انجام شد (Tamura et al. 2021).

برای تشخیص اینکه آیا ژن IFIH1 به صورت تطبیقی ​​تکامل یافته است، از برنامه codeml در بسته نرم افزاری PAML v4.9j استفاده کرده ایم (Yang 2007). توالی نوکلئوتیدی و فایل همترازی توالی پروتئین مربوطه به PAL2NAL (Suyama et al. 2006) ارسال شد تا فایل های تراز نوکلئوتیدی ورودی CODEML مناسب را تشکیل دهد. آنالیزهای انتخاب مثبت برای ژن‌های MDA5 ارتولوگ با استفاده از مدل‌های سایت و شعبه-سایت انجام شد (Yang et al. 2005; Yang and Bielawski 2000). نسبت نرخ جایگزینی غیرمترادف/مترادف (ω=dN/dS) اندازه‌گیری فشار انتخابی را در سطح اسید آمینه ارائه می‌کند. بزرگی مقدار dN/dS (ω) نشان دهنده انواع انتخاب است: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 برای انتخاب مثبت (Yang et al. 2005). در CODEML مدل‌های سایت (M0، M1، M2، M3، M7 و M8) و مدل‌های شعبه سایت (کلاد A و C) برای انجام تحلیل انتخاب مثبت انتخاب شدند (Bielawski and Yang 2004؛ Yang and Nielsen 2002). در مدل‌های سایت، از آزمون نسبت درستنمایی (LRT) برای تست انتخاب مثبت با مقایسه سه جفت مدل (M0/M3، M2/M1 و M7/M8) استفاده شد. تجزیه و تحلیل هم برای توالی تمام طول و هم برای توالی C-Terminal Domain (CTD) انجام شد.

تجزیه و تحلیل ساختاری و شبیه سازی دینامیک مولکولی

ساختار میکروسکوپ کرایوالکترونی (cryo-EM) رشته hMDA5-dsRNA در حضور ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) به عنوان یک سیستم مدل برای دینامیک مولکولی استفاده شد. MD) شبیه سازی ها تمام باقی مانده های پروتئینی حل شدند (307-1020)، 14 جفت باز RNA دو رشته ای (dsRNA) و روی هماهنگ حفظ شدند، در حالی که باقی مانده های گمشده با استفاده از سرور SWISS-MODEL مدل شدند (Waterhouse et al. 2018). پارامترهای میدان نیرو و اتم های هیدروژن با استفاده از ماژول XLEaP AMBER 18 اضافه شدند (Case et al. 2005). میدان های نیروی AMBER f14SB (Maier et al. 2015) و f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) به ترتیب برای پروتئین و RNA با پارامترهای modrna08 (Aduri و همکاران 2007) برای نوکلئوزیدهای اصلاح شده استفاده شدند. جهش I923V در MDA5 با حذف دستی گروه متیل Cδ از I923 معرفی شد، در حالی که ریبوز اصلاح شده U12 در 2'-O با استفاده از باقیمانده کتابخانه modrna08 MRU متیله شد. یون روی با 4 باقیمانده سیستئین 907، 910، 962، و 964، با استفاده از پارامترهای میدان نیروی مناسب برای حفظ یک کره هماهنگی چهار وجهی (طول پیوند Zn-S 2.35 A با 50 kcal·mol-1·Å-2) پیوند خورد. ثابت‌های نیرو و زوایای S-Zn-S 109.5 درجه با 25 kcal·mol-1·rad-2).

به این ترتیب، ما 4 سیستم را برای شبیه سازی MD آماده کردیم: (i) MDA5-dsRNA بومی، (ب) MDA5(V923)-dsRNA، (iii) MDA5-dsRNA(2'OMe)، و (iv) MDA5( V923-dsRNA(2'OMe). همه سیستم‌ها در جعبه‌های حلال هشت‌وجهی کوتاه مولکول‌های آب TIP3P از پیش متعادل، با حداقل بافر 1{18}} در اطراف کمپلکس حل شدند و سپس تعداد مورد نیاز یون ضد برای به دست آوردن خنثی‌سازی بار سیستم‌ها اضافه شد. شبیه‌سازی‌های MD با نسخه شتاب‌دهی شده توسط GPU ماژول PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 20}13) در AMBER 18 و یک گام زمانی 2 fs انجام شد. دما با استفاده از ترموستات Langevin با فرکانس برخورد 1.0 ps-1 تنظیم شد، در حالی که فشار با استفاده از باروستات Berendsen با زمان شل شدن فشار 1.0 ps تنظیم شد. SHAKE برای محدود کردن پیوندهای شامل اتم های هیدروژن با تحمل 10-6 A استفاده شد، در حالی که برهمکنش های غیر پیوندی با محدودیت فضای مستقیم 10 آن محاسبه شد.

کمینه سازی انرژی در ابتدا برای 1{{20}}،000 مرحله با محدودیت های موقعیتی 10{34}} kcal·mol-1·Å-2 ثابت نیرو انجام شد. بر روی اتم های غیر هیدروژن MDA5-dsRNA. سپس حلال در 300 K و 1 اتمسفر از طریق دورهای کوتاه شبیه سازی در مجموعه های NVT و NPT، به ترتیب 100 ps و 400 ps، متعادل شد، در حالی که محدودیت ها بر روی اتم های غیر هیدروژن املاح حفظ شد. پس از آن، به حداقل رساندن انرژی برای 10،{13}} مرحله انجام شد، اما با محدودیت های موقعیتی 10 کیلوکالری مول-1·Å-2 فقط بر روی اتم های C MDA5 و ستون فقرات فسفات dsRNA. در 3 زیر به تدریج آرام شدند (10.0، 1.0، 0.1 کیلوکالری · مول - 1 · Å - 2) در طول 1 ns، به دنبال 9 ns تعادل بی بند و باری تحت فشار ثابت. پس از این 10 نانو ثانیه تعادل اولیه (که در تجزیه و تحلیل استفاده نشده است)، 100 ns شبیه سازی تولید در مجموعه NPT برای هر سیستم در 300 K و 1 اتمسفر انجام شد، در حالی که عکس های فوری از سیستم هر 5.0 ثانیه برای تجزیه و تحلیل با استفاده از CPPTRAJ ذخیره می شد. ماژول AMBER 18 (رو و چیتام 2013). تمام شکل‌هایی که مدل‌های سه‌بعدی را نشان می‌دهند با استفاده از سیستم گرافیکی مولکولی PyMOL (نسخه 2.3 متن باز) تولید شدند.

نتایج

تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی جایگزینی Ile923Val MDA5

تکامل و گونه زایی MDA5 و RIG-I مربوط به آن به طور گسترده توسط (Brisse and Ly 2019) بررسی شده است. در اینجا تکامل IFIH1 برای تعریف عناصر حفاظتی در توالی MDA5 در مورد چندشکلی خاص مورد استفاده قرار گرفت. تجزیه و تحلیل تکاملی حفظ توالی سنگین را در میان MDA5 گونه‌های مختلف نشان داد (984 توالی از 1000 توالی مورد بررسی دارای ایزولوسین در موقعیت معادل hMDA #923) در حوزه RD/CTD هستند که نشان‌دهنده اهمیت ساختاری/عملکردی است. پلی مورفیسم rs35667974 در اگزون 14 ژن انسانی باعث ایجاد یک جهش اسید آمینه حفاظت شده در موقعیت 923 از Ile تا Val در hMDA5 می شود. با این حال، شانزده گونه دوردست دیگر وجود دارد که موقعیت یکسانی را دارند که توسط یک والین اشغال شده است (شکل 1) که نشان دهنده زنده بودن این تغییر در بین گونه ها در حوزه RD/CTD MDA5 و حوزه RS/GY نزدیک همولوگ ایزوفرم های X1 است. هلیکازهای X3 و DHX58 (شکل 2). علاوه بر این، هم ترازی توالی منطقه در اطراف موقعیت hMDA #923 (حلقه تعامل CTD MDAs) یک توالی متوسط ​​تا بسیار حفاظت شده را در بین گونه های دور نشان می دهد که نشان دهنده اهمیت عملکردی بین گونه ها در منطقه است.

تشخیص انتخاب مثبت

برای تشخیص اینکه آیا ژن IFIH1 به طور تطبیقی ​​تکامل یافته است، از مدل‌های سایت و مدل‌های مکان شاخه برای انجام تجزیه و تحلیل انتخاب مثبت ارتولوگ‌های کل ژن و دامنه CTD استفاده شد. در مدل های سایت، هیچ سایت انتخاب مثبتی برای دامنه CTD شناسایی نشد (جدول 2). M0 بر نرخ ثابت تکامل (ω=dN/dS=0.2) دلالت دارد (جدول 2). برخی از سایت‌هایی که تحت انتخاب مثبت قرار گرفته بودند، با استفاده از روش مدل‌های سایت M{8- برای کل ژن شناسایی شدند (جدول 1)، اگرچه در نواحی برهم‌کنش RNA و دامنه CTD نیستند. در مدل های سایت، ω (dN/dS) است<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

به طور خاص، برای مدل شعبه-سایت C برای دامنه CTD (جدول تکمیلی 3)، 33 درصد از سایت ها در دسته ω0=0 در حال تکامل هستند. 036. از آنجایی که سایت‌هایی که تحت این دسته تکامل می‌یابند، بین انواع شاخه‌ها تمایز قائل نمی‌شوند، هر دو نوع شاخه دارای مقدار ω برای سایت‌های زیر این دسته هستند. علاوه بر این، 55 درصد از سایت ها تحت رده ω2 در حال تکامل هستند. با این حال، اینها مقادیر ω دارند که مشروط به نوع شاخه هستند (ω20=0.25 و ω21=0). همچنین، برای مدل شاخه-سایت C برای ژن‌های 39 ارتولوگ MDA5 (جدول 4)، 33 درصد از سایت‌ها در دسته ω{15}} تکامل می‌یابند. 027. از سوی دیگر، 41 درصد از سایت ها تحت رده ω2 در حال تکامل هستند. با این حال، اینها مقادیر ω دارند که مشروط به نوع شاخه هستند (ω{19}}.25 و ω21=15.32).

تحلیل ساختاری

تجزیه و تحلیل تکاملی انجام شده نشان می دهد که جایگزینی Ile923Val یک نوع منحصر به فرد در گونه انسان نیست، زیرا Val در موقعیت توالی MDA5 در گونه های دیگر نیز وجود دارد. MDA5 یک گیرنده RNA دو رشته ای ویروسی (dsRNA) است که از طریق ویژگی متمایز خود برای RNA ویروسی، نقش کلیدی در ایمنی ضد ویروسی ایفا می کند (Wu et al. 2{50}}13). نشان داده شده است که 2'-O-متیلاسیون mRNA ویروسی برای پاسخ های ایمنی ذاتی مهم است، بنابراین پیشنهاد شده است که 2'-O-متیلاسیون یک امضای مولکولی برای تمایز mRNA خود در مقابل غیرخود است. (زوست و همکاران 2011). برای بررسی نقش بالقوه جایگزینی Ile923Val در نوع IFIH1 اشتباه rs35667974، ما ساختار میکروسکوپ کرایوالکترونی (cryo-EM) رشته MDA5-dsRNA را در حضور ATP (PDB ID: 6GKM) تجزیه و تحلیل کردیم (Yu et al.). موقعیت 923 در حلقه 921-927 قرار دارد که مستقیماً با dsRNA در تعامل است (شکل 3A). به طور خاص، Ile923 در 4.8 A از 2'-ΟΗ یوریدین U12 قرار دارد، و برهمکنش آنها از طریق پیوند هیدروژنی بین His927 مجاور و پایه اوراسیل تثبیت می شود. انتظار نمی رود جایگزینی Ile923 توسط Val در نوع rs35667974، به جای به حداقل رساندن فعل و انفعالات با 2'-ΟΗ یوریدین U12، هیچ گونه درگیری فضایی ایجاد کند (شکل 3B). در صورتی که RNA در ریبوز U12 متیله شود، نوع طبیعی MDA5 با Ile923 تماس مطلوب واندروالسی را با گروه 2'-OMe U12 در 3.6 Å (شکل 3C) نشان می دهد، در حالی که Val923 از نوع rs35667974 است. واقع در 5.0 Å (شکل 3D). این تفاوت ها نمی توانند اثر عمده ای از جایگزینی Ile923Val را به خودی خود نشان دهند. با این حال، تغییرات ساختاری ظریف اغلب به تغییرات عملکردی قابل توجهی از طریق اختلال در پویایی ساختاری سیستم منجر می شود.

محاسبات دینامیک مولکولی

برای بررسی اثر جهش I923V MDA5 در تعامل آن با dsRNA، هم بومی و هم 2'-0-متیله، ما از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی 4 سیستم در مقیاس زمانی 100-ns استفاده کرده‌ایم. دینامیک سیستم ها با استفاده از نوسانات ریشه میانگین مربع (RMSF) هر باقیمانده پروتئین و فاصله پیوند هیدروژنی H927 با U12 مورد بررسی قرار گرفت (شکل 4). محاسبات ما نشان می دهد که جهش I923 به V923 در MDA5 منجر به اختلال جزئی در پویایی در ناحیه تماس RNA (باقیمانده 923-934) و حلقه تعامل بین پروتئینی (950-955) مجتمع با dsRNA بومی (شکل 4C) شده است. . این مشاهدات در مورد 2'-O-متیلاسیون در U12 مشابه بود، اگرچه یک اثر بارزتر در دینامیک کلی ناحیه کربوکسی ترمینال جهش MDA5 V923 مشاهده شد (شکل 4D).

اکنون با در نظر گرفتن تعامل کلیدی پیوند هیدروژنی باقیمانده H927 مجاور با پایه اوراسیل، شبیه سازی MD ما نشان می دهد که متیلاسیون در 2'-O بر آن در MDA5 بومی تأثیر نمی گذارد (شکل 4E). با این حال، جهش V923 بر پیوند هیدروژنی H927 در dsRNA بومی تأثیر نمی‌گذارد، اما اثر بی‌ثبات‌کننده‌ای در حضور 2'-O-متیلاسیون نشان می‌دهد (شکل 4F). در مجموع، شبیه‌سازی‌های MD ما نشان می‌دهد که اگرچه اثر جهش I923V MDA5 در تعامل با dsRNA بومی حاشیه‌ای است، اما تأثیر آن در پویایی و پایداری مجتمع MDA5/RNA زمانی که اوراسیل 2'-O-متیله شده باشد، مهم‌تر است. .

بحث

این مطالعه نشان دهنده یک بررسی تکاملی و ساختاری از نقش نوع مشترک rs35667974 منبع خودایمنی IFIH1 است که گزارش شده است که منجر به یک فنوتیپ عملکردی اصلاح شده برای MDA5 می شود (Downes et al. 2010). استفاده از مدل‌های مکان تکاملی و مکان شاخه برای انجام تجزیه و تحلیل انتخاب مثبت، هیچ مکان انتخاب مثبتی را در مکان‌های برهمکنش RNA که در آن پلی‌مورفیسم rs35667974 قرار دارد، نشان نمی‌دهد. مدل های شعبه سایت نشان نمی دهد که هیچ سایت خاصی در حوزه CTD انتخاب مثبتی داشته است.

این با فرکانس های ظاهری بسیار پایین نوع Ile923Val حتی در بین جمعیت انسانی مطابقت دارد (جدول 1). با این وجود، جمعیت اروپا در مقایسه با سایرین دارای تفاوت در فراوانی آلل C یک مرتبه قدر هستند. بدون نادیده گرفتن حجم نمونه کوچک، توزیع جغرافیایی پلی مورفیسم مورد مطالعه نشان می دهد که ظهور آن در جمعیت اروپا به عنوان نقطه شروع ممکن است به دلیل شرایط زندگی و تغذیه باشد که در سال های اخیر تغییر کرده است. بررسی ساختاری نقش SNP مورد بررسی با بررسی ساختار کمپلکس dsRNA-MDA5 (بومی و جهش یافته) انجام شد.

در سطح تشکیل کمپلکس dsRNA-MDA5، معرفی جهش Ile923Val بر تعامل دامنه C ترمینال پروتئین (CTD) با dsRNA با معرفی یک حفره آبگریز در کنار قند ریبوز یک رشته ای از dsRNA تأثیر می گذارد. . ما نشان داده‌ایم که در مورد RNA متیله در زنجیره فسفریبوسیل یک رشته، اثرات دینامیکی بیشتر ممکن است بر تعامل جهش تأثیر بگذارد در حالی که بر نوع وحشی تأثیر نمی‌گذارد. این با مطالعات تجربی مطابقت دارد (Looney et al. 2015; Brisse and Ly 2019) که نشان می دهد اثر پلی مورفیسم Ile923Val شناسایی شده در مجاورت یک نقطه برهمکنش MDA5-dsDNA ممکن است بر خواص اتصال به dsRNA بومی تأثیر نگذارد، اما با تغییر آن تغییر می کند. 2.{10}}فعالیت کاتالیزوری را تا برابر کاهش دهید (Shigemoto و همکاران 2009). همچنین، مطالعات دینامیک مولکولی نقش مهم متیلاسیون در جهش را در مورد تحرک و پایداری حلقه‌های MDA5 941-959 و 970-977 درگیر در برهمکنش dsRNA و تعامل بین پروتئینی در تشکیل رشته MDA نشان داده‌اند. چنین اثراتی ممکن است مانع مجموعه رشته MDA5، انجمن MDA5-MAVS و مجموعه رشته MAVS شود که بیان ژن های اینترفرون نوع I (IFN1: IFN و IFN) را بیشتر فعال می کند. در موارد T1D و PsA، در نتیجه، کاهش سطح فعالیت پروتئین MDA5 و در نتیجه کاهش تولید IFN از خود ایمنی محافظت می کند. این مشاهدات نشان می دهد که چندین نوع IFIH1 که پیش بینی می شود بر تعامل MDA5 با MAVS تأثیر بگذارد و کاهش تولید IFN خطر ابتلا به بیماری ها را کاهش می دهد، در حالی که عملکرد طبیعی MDA5 با آنها مرتبط است (Shigemoto et al. 2009).

این منجر به این نتیجه می شود که مانند RNA ویروسی، متیلاسیون self-dsRNA، یک جهش شناسایی شده توسط RNA، یک عامل انتخاب/فعال سازی مهم برای معرفی اثرات محافظتی در برخی بیماری های خودایمنی است. نتایج مطالعه حاضر دانش اهمیت بیولوژیکی rs35667974 SNP منبع IFIH1 را در توسعه بیماری‌های فوق الذکر گسترش می‌دهد و اهمیت مطالعات ژن‌های مشترک توسط بیماری‌های خودایمنی متعدد را برجسته می‌کند. با این حال، در مطالعات جمعیتی برای ارتباط ژنتیکی SNP ها با بیماری های خودایمنی، با استفاده از، به عنوان مثال، PCR-RFLP، توالی یابی، یا تراشه های ژنوتیپ، موردی از متیلاسیون RNA در نظر گرفته نشده است. بنابراین دانستن وضعیت متیلاسیون dsRNA در حال تعامل و تأثیر آن بر آلل MDA5 مهم است. همانطور که در مورد شناسایی dsRNA ویروسی (Wu et al. 2013) و تمایز بین mRNA خود و غیر خود (Züst et al. 2011)، از دست دادن یک گروه متیل از MDA5 در حال تعامل، مانند مورد جهش یافته Ile923Val MDA5، ممکن است بر تشکیل رشته و القای اینترفرون نوع I تأثیر بگذارد.

قابل توجه است، پلنگ و همکاران. (2013) قبلاً پتانسیل یک نوع نادر در یک ژن بیماری علّی را برای نشان دادن یک هدف درمانی احتمالی برای مداخله دارویی مورد بحث قرار داده بود. برای این منظور، عملکرد بیولوژیکی نوع مسبب باید در هر تلاشی برای پیوند یافته های ژنتیکی با یک هدف درمانی جدید شناخته شود. بنابراین، به نظر می رسد تعیین موقعیت یک نوع عامل در ساختار سه بعدی پروتئین مربوطه و بررسی نقش آن از دیدگاه ساختاری/عملکردی در یک مسیر پاتوژنتیکی که منجر به یک بیماری خودایمنی می شود، برای مدیریت بیشتر و درمان بهتر آن اهمیت اساسی داشته باشد. بیماران. نیاز اساسی به حرکت فراتر از کشف SNP های مرتبط به درک عمیق تر انواع مسبب برای روشن کردن مکانیسم های مولکولی و مسیرهای بیماری وجود دارد. تجزیه و تحلیل ساختاری-عملکردی بیشتر برای بررسی اتصال ریبوز{3}}'-Ο-متیله self-dsRNA به MDA5 و چگونگی تأثیر آن بر مونتاژ فیبریل MDA5 مورد نیاز است. نقش بیولوژیکی گریزان 2'-0-متیله mRNA به عنوان حسگر تمایز بین ویروسی و mRNA خود در القای اینترفرون نوع I ممکن است به یک حسگر محافظ در برخی از خودایمنیوپاتی ها گسترش یافته باشد.

نتیجه

پلی مورفیسم نادر ژن rs35667974 IFIH1 از T1D، PS و PsA محافظت می کند، در حالی که آلل IFIH1 حامل اکثریت جمعیت مستعد ابتلا به بیماری ها است. بودجه ای که نشان می دهد جهش یافته Ile923Val MDA5 در تعامل با self-dsRNA و به ویژه با 2'-O-متیله عملکرد متفاوتی دارد، نشان می دهد که در برخی موارد، گونه هایی که با dsRNA متیله در تعامل هستند، تشکیل رشته MDA5، برهمکنش MAVS و تشکیل رشته را مختل می کنند. سیگنال‌دهی IFN، مانند پاسخ ضد ویروسی میزبان، ممکن است منفی انتخاب شده باشد زیرا محافظت در برابر بیماری‌ها را به همراه دارد.

مشارکت های نویسنده

مفهوم‌سازی - AA، AP، EEE، و GNG، روش‌شناسی - AA، AP، و EEE، اعتبارسنجی - AA، AP، MIZ، GNG، و EEE، تحقیق - GNG، AA، AP، و MIZ، منابع - GNG، AA، AP، و MIZ، نگهداری داده‌ها - AA و AP، نوشتن و آماده‌سازی پیش‌نویس اصلی - EEE، GNG، AA، AP، و MZ، نوشتن، بازبینی و ویرایش نسخه خطی - AA، AP، MZ، GNG، و EEE، تجسم - AA، AP، و EEE، نظارت - EEE، و کسب بودجه - EEE. همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

منابع مالی

بودجه دسترسی آزاد توسط HEAL-Link یونان ارائه می شود. این کار توسط پروژه "INSPIRED-The National Research Infrastructure on Integrated Structural Biology, Drug Screening Effort and Drug Screening Functional Chartering" (Grant MIS 5002550) که تحت اقدام "تقویت زیرساخت تحقیق و نوآوری" اجرا می شود، پشتیبانی می شود. بودجه توسط برنامه عملیاتی "رقابت، کارآفرینی و نوآوری" (NSRF 2014-2020) و با سرمایه مشترک یونان و اتحادیه اروپا (صندوق توسعه منطقه ای اروپا) تامین می شود.

در دسترس بودن داده ها

مجموعه داده‌های مورد استفاده و/یا تجزیه‌وتحلیل‌شده در طول مطالعه جاری در صورت درخواست از نویسنده مربوطه در دسترس است.

اعلامیه ها

تضاد منافع

نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند. تامین کنندگان مالی هیچ نقشی در طراحی مطالعه نداشتند. در جمع آوری، تجزیه و تحلیل یا تفسیر داده ها؛ در نوشتن دست‌نوشته یا تصمیم به انتشار نتایج.

تایید اخلاقی

قابل اجرا نیست.

رضایت برای مشارکت

قابل اجرا نیست.

رضایت برای انتشار

قابل اجرا نیست.

دسترسی آزاد

این مقاله تحت مجوز Creative Commons Attribution 4 مجوز دارد.0 مجوز بین‌المللی، که اجازه استفاده، اشتراک‌گذاری، اقتباس، توزیع، و تکثیر را در هر رسانه یا قالبی می‌دهد، تا زمانی که اعتبار مناسب را به نویسنده (نویسندگان) اصلی بدهید. ) و منبع، پیوندی به مجوز Creative Commons ارائه دهید و نشان دهید که آیا تغییراتی ایجاد شده است یا خیر. تصاویر یا سایر مطالب شخص ثالث در این مقاله در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده شده است، مگر اینکه در خط اعتباری مطالب به شکل دیگری مشخص شده باشد. فرض کنید مطالب در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده نشده است و استفاده مورد نظر شما توسط مقررات قانونی مجاز نیست یا بیشتر از استفاده مجاز است. در این صورت، باید مستقیماً از دارنده حق چاپ اجازه بگیرید.

منابع

1. Aduri R، Psciuk BT، Saro P و همکاران (2007) پارامترهای میدان نیروی AMBER برای نوکلئوزیدهای اصلاح شده طبیعی در RNA. J Chem Theory Comput 3:1464-1475.

2. Altschul SF، Madden TL، Schäfer AA و همکاران (1997) Gapped BLAST و PSI-BLAST: نسل جدیدی از برنامه های جستجوی پایگاه داده پروتئین. Nucleic Acids Res 25:3389-3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) بینش های ساختاری و تکاملی در خانواده ژن پلی ساکارید داستیلاز باسیلوس آنتراسیس و باسیلوس سرئوس.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D و همکاران (2018) شناسایی یک هیدرولاز نوکلئوزیدی 2'-O-methyluridine با استفاده از کتابخانه های متاژنومی. مولکول ها.

5. برمن اچ ام، وستبروک جی، فنگ زی و همکاران (2000) بانک داده پروتئین. Nucleic Acids Res 28:235-242.

6. Bielawski JP، Yang Z (2004) یک روش حداکثر احتمال برای تشخیص واگرایی عملکردی در مکان‌های کدون منفرد، با کاربرد برای تکامل خانواده ژن.

7. Biros E، Jordan MA، Baxter AG (2005) ژن های واسطه تعاملات محیطی در دیابت نوع 1.

8. Boccaleto P، Machnicka MA، Purta E، و همکاران (2018) MODOMICS: پایگاه داده مسیرهای اصلاح RNA. به روز رسانی 2017. Nucleic Acids Res 46:D303-D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) ساختار مقایسه ای و عملکرد گیرنده های RIG-I: RIG-I و MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) یک آلل کد کننده نادر در IFIH1 از آرتریت پسوریاتیک محافظت می کند. Ann Rheum Dis 76:1321-1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com