مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

برای اطلاع از قسمت دوم (مقدمه، مواد و روش ها) این مقاله اینجا را کلیک کنید.

پروفایل پروتئومیکس نزدیک به تک سلولی لوله پروگزیمال و گلومرول کلیه طبیعی انسان

تارا کی سیگدل¹، پل دی. پیهوفسکی²، سودشنا روی¹، جولیان لیبرتو¹، جاشوا آر. هانسن²، آدام سی. سوئنسن²، روی ژائو³، یینگ زو³، پریانکا راشمی¹، اندرو شرودر¹، ایزابلا دام¹، سواستیکا سور¹، Jinghui Luo4، Yingbao Yang4، Wei-Jun Qian²* و Minnie M. Sarwal¹* برای کنسرسیوم پروژه پزشکی دقیق کلیه (KPMP).

¹بخش پیوند چند عضو، گروه جراحی، دانشگاه کالیفرنیا، سانفرانسیسکو، سانفرانسیسکو، کالیفرنیا، ایالات متحده

²آزمایشگاه ملی شمال غربی اقیانوس آرام، بخش علوم زیستی، ریچلند، WA، ایالات متحده

³آزمایشگاه علوم مولکولی محیطی، آزمایشگاه ملی شمال غرب اقیانوس آرام، ریچلند، WA، ایالات متحده

⁴گروه آسیب شناسی، دانشگاه میشیگان، آن آربور، MI، ایالات متحده

کلید واژه ها:گلومرولطیف سنجی جرمی، آنالیز تک سلولی، پروتئومیکس،کلیه

ارزیابی‌های مولکولی در سطح تک سلولی می‌تواند با ارائه ارزیابی‌های دقیق سازمان‌دهی سلولی و ناهمگونی بافت در بیماری و سلامت، تحقیقات بیولوژیکی را تسریع بخشد. انسانکلیهدارای حالت های پیچیده چند سلولی با عملکردهای مختلف است که اکنون می توان بسیاری از آنها را با پیشرفت های تکنولوژیکی اخیر در پروتئومیک بافت در سطح تقریباً تک سلولی به طور کامل مهار کرد. ما مراحل اساسی را در اولین کاربرد این روش پروتئومیکس مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی (MS) برای تجزیه و تحلیل زیربخش‌های انسان عادی مورد بحث قرار می‌دهیم.کلیه، به عنوان بخشی از پروژه پزشکی دقیق کلیه (KPMP). با استفاده از حدود 30 تا 40 سلول کلیوی ریز جدا شده با لیزر، ما بیش از 2500 پروتئین انسانی را شناسایی کردیم که اختصاص بهلوله پروگزیمال(PT; n=25 پروتئین) و ناحیه گلومرولی (Glom; n=67 پروتئین) ازکلیهو عملکرد متابولیک منحصر به فرد آنها. این مطالعه آزمایشی نقشه راه را برای استفاده از گردش کار پروتئومیکس تقریباً تک سلولی ما برای تجزیه و تحلیل سایر ریز محفظه‌های کلیوی، در مقیاس بزرگتر، برای کشف اختلالات عملکرد زیر سلولی کلیه در کلیه طبیعی و همچنین علل مختلف ارائه می‌کند. حاد و مزمنبیماری کلیوی.

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

مقدمه

پیشرفت‌های اخیر در پروفایل مولکولی، به‌ویژه آنالیز رونویسی در سطح تک سلولی، می‌تواند جمعیت‌های سلولی کمیاب را در بافت‌های بالینی ناهمگن کشف کند، که به درک ما از زیست‌شناسی کلیه و فرآیندهای مولکولی آن کمک می‌کند (1-7). نیازی برآورده نشده برای توسعه روش هایی وجود دارد که بتواند اطلاعات بیولوژیکی جامعی را در سطوح RNA و DNA ارائه دهد و همچنین امکان تجزیه و تحلیل بافت پروتئومی تک سلولی را فراهم کند.

فناوری‌های پروتئومیک، بر خلاف ژنومیک، می‌توانند اطلاعات عملکردی در حالت‌های سلولی و شبکه‌های نظارتی ارائه دهند (2). یک چالش تکنولوژیکی برای پروتئومیکس مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی (MS) محدودیت مواد اولیه است. برخلاف رونویسی، پروتئومیکس اجازه تقویت مولکولی را نمی دهد. این فاکتوئید منجر به تلاش‌های اساسی برای افزایش حساسیت تحلیلی پروتئومیکس مبتنی بر MS، شامل کوچک‌سازی فناوری و راندمان بالاتر در منبع یونیزاسیون الکترواسپری شده است (8، 9)، به طوری که حساسیت تحلیلی اکنون برای شناسایی پروتئین‌ها در یک پستاندار کافی است. سلول ها. علیرغم داشتن حساسیت تحلیلی بالا، کاربردهای پروتئومی در حجم های نمونه کوچک، چالش های دیگری مانند جذب غیر اختصاصی پروتئین ها و پپتیدها به سطوح لوله های واکنش، سینتیک هضم ناکارآمد، نیاز به پاکسازی، و چالش های تحویل را معرفی کرده است. گروه ما اخیراً در مورد روش پروتئومیکس تقریباً تک سلولی (nscProteomics) در سلول‌های HeLa گزارش داده است که فناوری بسیار نوآورانه و حساسی را برای اندازه‌گیری پروتئوم نمونه‌هایی با مقادیر زیر نانوگرمی پروتئین از تعداد کمی از سلول‌ها ارائه می‌کند (10). این روش به تجهیزات پردازش نمونه بسیار سفارشی شده نیاز دارد و انتقال آن به آزمایشگاه های تحقیقاتی دیگر در وضعیت فعلی توسعه آن دشوار است. پردازش انسانکلیهبافت‌هایی که از این خط لوله عبور می‌کنند به توسعه پروتکل به منظور بهینه‌سازی حفظ بافت و جذب سلول نیاز دارند.

در این مطالعه، ما بر روی ارائه یک نقشه راه برای اندازه‌گیری موفقیت‌آمیز بازجویی پروتئومی زیر بخش‌های مختلف تمرکز کرده‌ایم.کلیهدر سطح تقریباً تک سلولی، با نتایج زیر: (i) ارزیابی جمع‌آوری و ذخیره بهینه بافت کلیه برای nscProteomics. (ii) شناسایی استاندارد مرجع مناسب برای nscProteomics. (iii) بهینه سازی ضخامت بافت کلیه برای میکرودیسکشن گرفتن با لیزر (LCM). (IV) بهینه سازی پارامترهای LCM. (v) توصیف روش nscProteomics با استفاده از روش میکرو POTS کاملاً خودکار مبتنی بر LC-MS (μPOTS؛ پردازش در یک گلدان برای نمونه‌های ردیابی) (11). (vi) تجزیه و تحلیل داده ها برای nscProteomics.

برای دستیابی به وظایف فوق، 11 انسان منحصر به فرد را پردازش کرده ایمکلیهبیوپسی ها و پروتکل ها و روش های توسعه یافته برای جمع آوری، پردازش و بازجویی از بیان پروتئومی انسانکلیهنمونه ها توسط μPOTS. هنگامی که با LC-MS بسیار حساس همراه می‌شویم، یک روش μPOTS کاملاً خودکار را نشان می‌دهیم که تکرارپذیری را امکان‌پذیر می‌کند و اندازه‌گیری‌های کمی پروتئومی ~3،{2}} پروتئین از 10 تا 100 سلول کلیوی میکرو تشریح شده (LCM) را با لیزر جذب می‌کند. سطح پوشش فقط قبلاً برای هزاران سلول به دست آمده بود (12-17). این مطالعه به شناسایی مولکولی ناهمگنی و آسیب شناسی سلولی بافت در بیوپسی کلیه از بیماران مبتلا به علل مختلف بیماری حاد و مزمن کلیوی کمک خواهد کرد. این فناوری منحصر به فرد این پتانسیل را دارد که ناهمگنی پروتئومی و نشانگرهای پروتئین منحصر به فرد را در موارد مختلف آشکار کندکلیهانواع و زیرساختارهای بیماری که با پاتوژنز بیماری، پیش آگهی و طبقه بندی خطر مرتبط هستند. این مطالعه در شکل 1 خلاصه شده است.

شکل 1. گردش کار پروتئومیکس نزدیک به تک سلولی (nscProteomics) برای پردازش انسان بهینه شده است.کلیهبافت ها گردش کار شامل شناسایی بهینه استکلیهجمع‌آوری و ذخیره‌سازی بافت، کنترل‌های کیفی برای استقرار میکرودیزکسیون ضبط لیزری روش nscProteomics برای سلول‌های کلیه.

فرایندهای تجربی

طراحی مطالعه

نمایش شماتیک از مطالعات پروتئومی انجام شده بر روی 11 انسان طبیعی منحصر به فردکلیه هادر شکل 2 الف نشان داده شده است. در مجموع 28 آزمایش طیف سنجی جرمی (MS) برای nscProteomics میکرو تشریح شده با لیزر (LCM) بر روی مقاطع گلومرولی جفتی (Glom) و لوله های پیچیده پروگزیمال (PT) انجام شد. بافت از دو مورد اولکلیه هابه عنوان FFPE و در محیط ترکیب دمای برش بهینه (OCT) نگهداری شدند. مشکلات بافت کلیه از 9 کلیه دیگر فقط در OCT پردازش شد (شکل 2A).

شکل 2. (الف) خلاصه ای از نمونه های مطالعه و سنجش. (ب) نمودار QC برای تکرارپذیری فرآیند با استفاده از بافت OCT. تفاوت تعداد طیفی بین پروتئین ها برای 2 اجرا جداگانه با استفاده از بافت OCT در برابر میانگین تعداد طیفی پروتئین برای 1257 پروتئین ترسیم شد. در طرح، خط آبی تفاوت میانگین را نشان می دهد. خطوط قرمز و سبز به ترتیب 2 SD و 3 محدودیت SD را نشان می دهند. 96/97 درصد پروتئین ها در محدوده تکرارپذیری محاسبه شده 52/13 قرار دارند که نشان دهنده درجه بالایی از تکرارپذیری است. همچنین مشاهده می‌شود که تغییرپذیری بین‌اجرای فرآیند شامل بافت OCT کمتر از فرآیندی است که شامل بافت FFPE است (محدودیت تکرارپذیری محاسبه‌شده: 24.43). (C) مقایسه توزیع شمارش طیفی 374 پروتئین رایج در OCT و FFPE. تعداد بیشتری از پروتئین‌ها از بافت OCT تعداد طیفی بالایی را نشان می‌دهند در حالی که برتری بالاتری از تعداد کم طیفی برای پروتئین‌های بافت FFPE دیده می‌شود. (D) مقایسه توزیع تعداد طیفی 76 پروتئین منحصر به فرد در FFPE و 244 پروتئین منحصر به فرد در OCT. برتری بیشتر پروتئین های کم طیفی در بافت OCT دیده می شود. این ممکن است نشان دهد که تکنیک بافت OCT برای تشخیص پروتئین های کم فراوان در سناریوی فعلی بهتر است. ضریب همبستگی بین پروتئین های شناسایی شده از 2 OCT بافت منجمد {18}}.96 (P < 0.001)="">

نمونه برداری از بافت کلیه

انسانبافت های کلیهاز مجموع 11 نفرکتومی نسبی شناسایی نشده، به دست آمده از دانشگاه کالیفرنیا سانفرانسیسکو (UCSF) و دانشگاه میشیگان (UM)، با IRB تایید شده، به عنوان بخشی از یک مطالعه امکان سنجی فناوری آزمایشی در NIH Kidney Precision Medicine جمع آوری شد. پروژه (KPMP). فقط ناحیه سالم ازکلیههمانطور که توسط پاتولوژیست آموزش دیده برای این منظور استفاده شد. نمونه‌ها با تنها اخطار این بود که بافت‌ها از بزرگسالان جمع‌آوری شدند، ناشناس شدند. برای ارزیابی پروتکل جمع‌آوری نمونه بهینه برای این فناوری، در ابتدا ~100 میلی‌گرم از بافت 2 کلیه به طور مساوی تقسیم شد و یا به‌عنوان بخش‌های بافت پارافین ثابت شده با فرمالین (FFPE) تهیه شد یا در انجماد منجمد شد. Tissue-Plus™ OCT Compound (فیشر علمی). یک برش متوالی به ضخامت 5 میکرومتر و سه قسمت متوالی به ضخامت 10 میکرومتر از هر بلوک OCT با یک کرایو میکروتوم بریده شد و بر روی لامهای غشایی 1.0 پلی اتیلن ترفتالات (PET) (Zeiss) برای گلومرولی و نصب شد.لوله پروگزیمالتشریح بخش با ضخامت 5 میکرومتر برای تجسم ساختارهای اصلی بافت شناسی H&E رنگ آمیزی شد. مقاطع ضخامت 10 میکرومتر باقی مانده بدون رنگ رها شدند. تمام اسلایدها تا زمان تشریح در دمای 80- درجه نگهداری شدند.

سیستانچ برای بهبود اختلال عملکرد کلیه

ارزیابی تأثیر حمل و پردازش بافت بر بازده پروتئومی

برای ارزیابی تأثیر تأخیر در آنالیز پروتئومی بافت منجمد OCT،کلیهtissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 ساعت سفر دور، و پردازش در مرکز دوم، و بالعکس. پروتئومیکس فله بر روی دو 2 منحصر به فرد انجام شدکلیه ها(کلیه #3، #4)، در دانشگاه میشیگان تهیه شد، و به 2 مکان مختلف (دانشگاه ایالتی اوهایو و UCSF) برای تجزیه و تحلیل MS، با استفاده از پروتکل یکسان و پارامترهای MS در هر دو سایت، ارسال شد. سپس نتایج اجراهای MS بین 2 سایت مقایسه شد.

استخراج و رسوب پروتئین

این در هر دو روش آماده سازی بافت OCT و FFPE برای انتخاب روش بهینه برای پروتئومیکس بافت انجام شد. بافت OCT با استفاده از کرایومیکروتوم به ضخامت 10 میکرومتر برش داده شد. برای انتخاب حداقل مقدار بافت مورد نیاز برای استخراج پروتئین برای ام اس، سه حلقه (بخشی که به جای پخش شدن روی لام در لوله اپندورف قرار می گیرد) و 5 حلقه بافت منجمد بریده، ذوب و به لوله های میکروسانتریفیوژ منتقل شدند. حاوی یک مهره فولادی ضد زنگ 5 میلی متری (Qiagen)، در معرض بافر لیز سلولی پستانداران (شامل بنزوناز® نوکلئاز و محلول بازدارنده پروتئاز؛ Qiagen)، و همگن شده در TissueLyser LT (Qiagen) در 50 r/s به مدت 3 دقیقه. غلظت پروتئین (آزمایش برادفورد؛ Thermo Scientific) اندازه‌گیری شد و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه نگهداری شد. بافت ذخیره شده برای<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

هضم تریپسین

تقریباً 15{8}} میکروگرم از کل پروتئین (تقریباً 15 درصد ورودی موجود) در معرض عوامل کاهنده (200 میلی‌مولار DTT و 100 میلی‌مولار Tris-HCl) و معرف‌های آلکیله‌کننده (200 میلی‌مولار یدوااستامید و 100 میلی‌مولار Tris-HCl) قرار گرفت. سپس با آب بدون RNAse/DNAse رقیق شد تا غلظت اوره به 0.6 مولار کاهش یابد. غلظت پروتئین اندازه گیری شد (آزمایش برادفورد؛ ThermoScientific) و 10 گرم پروتئین برای MS استفاده شد.

MS برای پروتئومیکس حجیم برای ارزیابی روش بهینه پردازش بافت کلیه

مخلوط پپتید تریپتیک با اسید فرمیک اسیدی شد، با ستون‌های C18 Monospin تمیز شد و روی Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) آنالیز شد. MS/MS با استفاده از تفکیک دام C با انرژی بالاتر (HCD) انجام شد. طیف‌های جرمی با استفاده از Byonic v2.14.27 (متریک پروتئین) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند که امکان تحمل جرم 12 ppm را فراهم می‌کرد. تغییرات پس از ترجمه متغیر، از جمله اکسیداسیون، متیلاسیون، کاربامیلاسیون و فسفوریلاسیون مجاز بود. پروتئین‌ها محدود به آنهایی بودند که امتیاز بهتری نسبت به نرخ کشف کاذب 1 درصدی (FDR) داشتند. مقایسه فراوانی پروتئین و داده های MS برای انتخاب روش بهینه انجام شدکلیهجمع آوری بافت بین FFPE و OCT.

میکرودیسکشن ضبط لیزری

مقاطع لکه‌نشده با ضخامت 5، 10 و 20 میکرومولار نصب‌شده بر روی اسلایدهای PET روی استیج سیستم Microdissection لیزری Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss) قرار داده شد تا ضخامت برش بهینه را آزمایش کند. گلومرولی ولوله پروگزیمالنواحی با استفاده از ابزار دست آزاد انتخاب شدند و کالبد شکافی با هدف 10X انجام شد. بخش‌هایی با مساحت ~4580 میکرومتر مربع و ضخامت 10 میکرومولار گرفته شد که بر اساس فرمول منتشر شده قبلی برای تخمین سلول‌های گلومرولی در یک بزرگسال سالم حدود 40 سلول گلومرولی را به خود اختصاص داد.کلیه(18). برایلوله پروگزیمالسلول‌ها، 2900 میکرومتر مربع از آن را گرفتیملوله پروگزیمالسلول ها که حدود 36 سلول را تشکیل می دادند. بخش‌های برش‌خورده در یک کلاهک چسبنده مات 200 میکرولیتری (Zeiss) منجنیق شدند (LPC Energy، 66؛ LPC Focus، 79) و در دمای 80- درجه نگهداری شدند.

پروتئومیکس تقریباً تک سلولی (nscProteomics)

برای حل کردن پروتئین‌های جمع‌آوری‌شده در کلاهک‌های جذب شده با LCM، یک قطره 10 میکرولیتری از ۰.۱ درصد DDM 50 میلی‌مولار Tris pH 8 مستقیماً به کلاهک اضافه شد. نمونه ها به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه در ترمومیکسر Eppendorf ThermoTop برای کاهش تبخیر و سپس سانتریفیوژ در 2،{8}} × گرم به مدت ۱ دقیقه برای انتقال لیزات به ویال انکوبه شدند. پروتئین ها با 5 میلی مولار دی تیوتریتول کاهش یافته و در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. آلکیلاسیون در 10 میلی مولار یدوااستامید با 45 دقیقه انکوباسیون در تاریکی در دمای 25 درجه انجام شد. سپس مقدار 10 نانوگرم Ls-C اضافه شد و سپس 3 ساعت انکوباسیون در دمای 25 درجه اضافه شد. سپس مقدار 10 نانوگرم تریپسین اضافه شد و سپس هضم یک شبه در دمای 25 درجه انجام شد. پپتیدهای هضم شده با مقدار 15 میکرولیتر آب 18 MΩ مخلوط شدند.

پلت فرم LC-MS برای نمونه های فوق العاده کوچک

نمونه های پپتید (25 میکرولیتر) با استفاده از یک ستون 60 سانتی متری، با قطر داخلی 50 میکرومتر و یک قطره چکان یکپارچه (هدف جدید) جدا شدند. ستون ها در داخل خانه با رسانه های Waters BEH قطر 1.7 میکرومتر بسته بندی شدند. یک گرادیان 100- دقیقه ای با استفاده از یک پمپ نانو دیونکس Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific) تولید شد. این سیستم به یک طیف سنج جرمی QExactive Plus (Thermo Scientific) جفت شد. طیف جرمی از 300 تا 1800 متر برز، با استفاده از 12 روش اکتسابی وابسته به داده بالا جمع آوری شد. طیف MS1 با وضوح جرم 35K و MS2 با 17.5K جمع آوری شد. حداکثر 100 ms IT برای افزایش شناسایی از یون های کم فراوانی استفاده شد.

استخراج داده های پروتئومیک

تمام فایل های خام با استفاده از MaxQuant (نسخه 1.5.3.30) برای تشخیص ویژگی، جستجوی پایگاه داده و تعیین کمیت پروتئین/پپتید (19) به دنبال تنظیماتی که قبلاً توضیح داده شد (10) پردازش شدند. طیف های جرمی پشت سر هم در پایگاه داده انسانی UniProtKB/Swiss-Prot (دانلود شده در 29 دسامبر 2018 و حاوی 20,417 ورودی بررسی شده) جستجو شدند. داده های MS proteomics برای nscProteomics از طریق مخزن شریک PRIDE (20) با شناسه مجموعه داده PXD015058 و 10.6019/PXD015058 به کنسرسیوم ProteomeXchange سپرده شده است.

تحلیل داده ها

داده‌های MS از آزمایش‌های انجام‌شده در PNNL (nscProteomics) و دانشگاه استنفورد (پروتئومیکس فله) به‌دست آمد. برای پروتئومیک های حجیم. برای انتخاب بهینه از روش های آماری زیر استفاده شدکلیهروش جمع‌آوری بافت، یا در OCT منجمد شده یا به‌عنوان FFPE پردازش می‌شود، همانطور که توسط پروتئومیکس بافتی کمی ارزیابی شد، (من) بازده پروتئین / میلی‌گرم بافت ورودی معادل محاسبه شد. (2) تکرارپذیری MS بر روی خروجی MS از بخش‌های FFPE و OCT از هر یک از 2 کلیه، تهیه‌شده توسط همان فرد با استفاده از پروتکل یکسان، آزمایش شد و بر روی همان ابزار MS با استفاده از یک پروتکل تنظیمی، با فاصله چند روز تجزیه و تحلیل شد (21). یک حد تکرارپذیری (22) برای ارائه یک حد تقریبی در تفاوت های اندازه گیری بین اجرای متوالی یک فرآیند واحد و همچنین برآورد دقت برای مقایسه بین فرآیندها استفاده شد. ضریب همبستگی، که درجه توافق بین اجراهای متوالی (با استفاده از همان بافت) را فراهم می‌کند، محاسبه شد. (iii) فراوانی پروتئین و توزیع اندازه قطعات پپتیدی برای ارزیابی تغییرات ناشی از تخریب پروتئین، اتصال عرضی به دلیل فرمالین، و غیره محاسبه شد.کلیهمرجع و (v) محاسبه سوگیری. تجزیه و تحلیل کمی دقیق و شناسایی پروتئین های منحصر به فرد از داده ها فقط با پروتئین هایی با تعداد طیفی بزرگتر یا مساوی 5 استفاده کرد (23). آزمایش دقیق فیشر برای ارزیابی غنی‌سازی پروتئین‌های رایج و منحصربه‌فرد نقشه‌برداری شده بین دو کلیه طبیعی انسان، (#1 و #2) استفاده شد. بر اساس تجزیه و تحلیل فوق (نتایج را ببینید)، بافت منجمد OCT به عنوان روش جمع آوری برای تمام آنالیزهای بعدی انتخاب شد.

مرحله بعدی تمرکز تجزیه و تحلیل داده ها، شناسایی، تعیین کمیت و اعتبار سنجی مجموعه های پروتئینی غنی شده یا مختص به 10-100 سلول به دست آمده از هر یک از دو انتخاب شده بود.کلیهمحفظه های فرعی-مناطق Glom و PT، به دست آمده از همانکلیه، به صورت عمده و LCM OCT منجمد شده استبافت کلیه(n=9؛ کلیه های #3-11) و توسط nscProteomics اجرا می شود.

یک رویکرد فیلترینگ نیمه محافظه‌کار مرحله‌ای {{0}} برای مقابله با مسائل مربوط به داده‌های گمشده/ناقص اتخاذ شد و از آزمون G (24) برای شناسایی اینکه آیا داده‌ها به‌طور تصادفی گم شده‌اند (MAR) استفاده شد. یا از دست رفته تصادفی نیست (MNAR). ارزیابی پایایی داده‌های اضافی با انتخاب دقیق پروتئین‌های مشاهده‌شده در بیشتر یا برابر با 50 درصد کل نمونه‌ها انجام شد. از آزمون T برای شناسایی غنی‌سازی معنی‌دار پروتئین در گلومینگ یا PT استفاده شد و از روش اصلاح چندگانه (Benjamini-Hochberg FDR) با آستانه معنی‌داری 0.1 استفاده شد. برای اهداف تجزیه و تحلیل، داده‌های شدت نسبی MS (log 2 تبدیل شده) به‌دست‌آمده از Glom، PT، و بخش‌های حجیم از یک واحدکلیهجفت شده در نظر گرفته شدند. ما پروتئین های غنی شده در Glom (با سطوح پایین در PT/bulk)، و منحصر به فرد Glom (در PT وجود ندارد) و همچنین پروتئین های غنی شده در PT (با سطوح پایین در Glom/bulk) و منحصر به فرد برای PT (غایب در Glom) شناسایی کردیم. . تجزیه و تحلیل غنی سازی تنها بر روی داده ها بدون مقادیر از دست رفته در هر گروه برای افزایش اطمینان انجام شد. همبستگی بین مقادیر فراوانی پروتئین‌های رایج برای ارزیابی میزان توافق بین پروتئین‌های زیر محفظه غنی‌شده بین اجراهای جداگانه همان آزمایش استفاده شد. ما همچنین با تجزیه این مقایسه‌ها از مجموعه‌های نمونه منحصربه‌فرد بین دو دوره مختلف، اجرا 1 و اجرای 2، اعتبار متقاطع پروتئین‌های غنی‌شده قابل‌توجهی را در هر بخش انجام دادیم. پرس و جو در مورد اینکه آیا پروتئین‌های غنی‌شده زیر محفظه شناخته شده را می‌توان در داده‌های عمومی از اطلس پروتئین انسانی (https://www.proteinatlas.org/) به مناطق خاص خود بازگرداند یا نه، (25).

سیستانچ برای علائم نارسایی کلیه

مقایسه/ادغام داده های Cross-Omics

برای ارزیابی تطابق بیان پروتئین در سطح RNA، داده های تولید شده از توالی یابی RNA تک سلولی (scRNA Seq) انجام شده بر روی 10 نفرکتومی بومی مورد استفاده قرار گرفت که 9 مورد از آنها با RNA همپوشانی داشتند.کلیه هامورد استفاده در nscProteomics برای این کار، پلت فرم 10x Genomics Chromium با شیمی v3 با استفاده از روش بهینه‌سازی شده در آزمایشگاه سروال به عنوان سایت بازجویی بافت (TIS) کنسرسیوم KPMP استفاده شد (نسخه خطی با جزئیات روش و نتایج در دست آماده‌سازی است). برای این تجزیه و تحلیل متقاطع omics، ما از داده های رونوشت 45411 استفاده کردیمکلیهسلول ها به 9 نوع سلول اصلی تجزیه می شوند: پودوسیت ها، سلول های مزانژیال، اندوتلیوم گلومرولی، استروما/اینترستیتیوم، سلول های ایمنی،لوله پروگزیمال، اندام صعودی ضخیم حلقه هنله، لوله دیستال/اتصال کننده و مجرای جمع کننده. تجزیه و تحلیل داده های تک سلولی با استفاده از بسته Seurat R نسخه 2.3.4 انجام شد. تجزیه و تحلیل عمیق تر این داده ها در حال توسعه است (26).

از: «پروتئومیکس نزدیک به تک سلولیلوله پروگزیمالوگلومرولاز انسان عادیکلیهتوسط Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika سوربائو Yang4، Wei-Jun Qian2* و Minnie M. Sarwal1* برایکلیهکنسرسیوم پروژه پزشکی دقیق (KPMP).

---مقاله اصلی پژوهشی. پزشکی، 17 سپتامبر 2020 |