مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

برای اطلاعات در مورد قسمت اول (مقدمه، مواد و روش ها) این مقاله اینجا را کلیک کنید.

پروفایل پروتئومیکس نزدیک به تک سلولی لوله پروگزیمال و گلومرول کلیه طبیعی انسان--بخش دوم

تارا کی سیگدل¹، پل دی. پیهوفسکی²، سودشنا روی¹، جولیان لیبرتو¹، جاشوا آر. هانسن²، آدام سی. سوئنسن²، روی ژائو³، یینگ زو³، پریانکا راشمی¹، اندرو شرودر¹، ایزابلا دام¹، سواستیکا سور¹، جینگهویی لو⁴، ینگبائو یانگ⁴، وی جون کیان²* و Minnie M. Sarwal¹* برای کنسرسیوم پروژه پزشکی دقیق کلیه (KPMP).

نتایج

کلکسیون کلیه منجمد OCT روش ترجیحی برای پروتئومیکس بافت کلیه است

برای همان مقدار بافت ورودی، OCT منجمد شدکلیهپروتئین بیشتری نسبت به بخش های FFPE از یک کلیه تولید کرد (OCT منجمد: 92 ± 1871 در مقابل FFPE: 1 ± 296 ng پروتئین؛ 0.0017 p <) که نشان دهنده تخریب احتمالی پروتئین در FFPE است، با وجود اینکه بافت در پارافین جاسازی شده است. بلوک برای<2 months.="" bulk="" proteomics="" data="" from="" the="" two="" human="">کلیه ها(#1، #2) همپوشانی قابل توجهی از پروتئین های شناسایی شده با 84 درصد همپوشانی بین کلیه های 2 OCT (محدودیت تکرارپذیری=13. 52، 97.96 درصد مقادیر در محدوده تکرارپذیری) و 83 درصد همپوشانی از همان کلیه را نشان داد. پروتئین بین 2 کلیه FFPE (محدودیت تکرارپذیری=24.43، مقادیر 98.5 درصد در محدوده تکرارپذیری) (جدول تکمیلی 1 و شکل 2B). در هر کلیه، صرف نظر از روش ذخیره‌سازی بافت، 70 درصد از پروتئین‌های ساختاری کلیه (عمدتاً ماتریکس خارج سلولی) حفظ شدند، که نشان می‌دهد برخی از پروتئین‌ها ترجیحاً با هر روش شناسایی می‌شوند. برای ارزیابی اینکه چه غنی‌سازی پروتئینی بین روش‌های مختلف جمع‌آوری دیده می‌شود، متوجه شدیم که پروتئومیکس بافت OCT پروتئین‌های بیشتری با تعداد طیفی بالا بزرگتر یا مساوی 5 (نسبت شانس=1.460601؛ فاصله اطمینان 95 درصد {{21}) تولید می‌کند. }.238969, 1.722593؛ p=4.472e-06)، که ممکن است منعکس کننده حفظ بهتر بافت کلیه در OCT باشد (شکل 2C). آنالیز پروتئومی بافت OCT همچنین پروتئین‌های منحصربه‌فرد بیشتری را در مقایسه با بافت FFPE نمونه‌برداری کرد (نسبت شانس=3.207089; 95 درصد فاصله اطمینان=2.371221, 4.370600; p=4.985e{{{ 38}} (شکل 2D). علاوه بر این، بسیاری از این پروتئین‌های منحصربه‌فرد از فراوانی کم برخوردار بوده و احتمال نادیده گرفته شدن آن‌ها، حتی با زمان‌های بسیار کوتاه بافت کلیه در FFPE، بیشتر است. صرف نظر از روش حفظ بافت، ما اشاره کردیم که همپوشانی قوی در مسیرهای بیولوژیکی رایج وجود دارد. مسیرها شامل فرآیندهای متابولیک مولکولی کوچک (p=2.59E-121 برای OCT و p=2.15E-109 برای FFPE)، فرآیند متابولیک اسید کربوکسیلیک (p=3 }}.62E-80 برای OCT و p=1.93 E-76 برای FFPE)، فرآیندهای متابولیکی اسید آلی (p=1}.26E-76 برای OCT و p=3.62E-80 برای FFPE) و فرآیندهای متابولیسم دارو (p=7.90E-83 برای OCT و p=4}}.01E{{{64} } برای FFPE). این داده ها نشان می دهد که چگونه پروتئومیکس بافت کلیه، صرف نظر از روش حفظ بافت برای دو روش آزمایش شده، بسیار قابل تکرار است.

پروتئومیکس بافت کلیه بر روی بافت کلیه منجمد OCT حمل شده قابل تکرار است

ما داده های تولید شده در دو سایت (UCSF و دانشگاه ایالتی اوهایو) را که از پروتکل یکسانی برای انجام پروتئومیکس انبوه پیروی می کردند، همانطور که در بخش روش ها توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل کردیم. به طور قابل توجهی، حدود 70 درصد پروتئین ها معمولاً در آن شناسایی شدندکلیهدر دو مکان مختلف با تعداد طیفی بزرگتر یا مساوی 5 پردازش شده است (r=0.95، P < 0.0001)="" (داده="" های="" خام="" ارائه="" شده="" در="" جدول="" تکمیلی="" 2).="" مهمتر="" از="" همه،="" این="">کلیه هاارسال شده از یک سایت مرکزی، داده های بسیار همبسته ای را تولید می کند (r=0.89، P=0.0001) (جدول تکمیلی 2)، که نشان می دهد پروتکل های تحلیلی پردازش بافت در محل کاملاً قوی هستند.

سیستانچ برایکلیه

بهینه‌سازی گرفتن سلول‌های کلیه با استفاده از میکرودیسکشن ضبط لیزری (LCM)

ضخامت های مختلف مقاطع OCT نصب شده بر روی اسلایدهای PET از همانکلیه(n=2) در ضخامت های 5، 10 و 20 میکرومتر، در سه تکرار، برای تکرارپذیری LCM آزمایش شدند. بخش 10 میکرومتری با استفاده از سیستم ریزشکن لیزری MicroBeam Zeiss PALM (Cut Energy, 64؛ Cut Focus, 75) بهینه ترین بخش در آزمایش LCM سریال است. سلول‌های بریده شده روی کلاهک‌های چسبنده گرفته شدند. علاوه بر تکرارپذیری فرآیند LCM، ما همچنین حداکثر بازده جذب سلول‌های منجنیق را در ضخامت بخش OCT 10 میکرومتر پیدا کردیم.

پروتئومیکس سلول های زیر محفظه در کلیه طبیعی انسان، پروتئین های لوله ای گلومرولی و پروگزیمال غنی شده و منحصر به فرد را شناسایی می کند.

در میان 9 انسان عادیکلیه هاprocessed by nscProteomics, with input of an average of 10–40 cells input each/Glom and PT fraction, we identified an average of ~2,560 proteins/sample. Interestingly, ~20% of the total proteins assessed by nscProteomics, from either sub-compartment overlapped across compartments/cells and bulk tissue, representing likely housekeeping or more structural kidney proteins that are not compartment specific. In a direct comparison of the two sub-compartments, 208 proteins were enriched (>2 fold) in Glom, and 67 were completely unique to Glom (absent in PT); and conversely, 247 proteins were enriched (>2 برابر) در PT، و 25 برابر PT منحصر به فرد بود (در Glom وجود ندارد) (جدول تکمیلی 3). علیرغم مجموعه نسبتاً کوچک نمونه، ما همچنین اعتبار سنجی متقاطع را انجام دادیم و هر دسته از اجراها را به عنوان یک مجموعه مستقل در نظر گرفتیم. حتی با یک مجموعه کوچک منحصر به فرد ازکلیه ها(2 در دسته 1، 4 در دسته 2)، 210 پروتئین غنی شده با Glom بین دو مجموعه مستقل همبستگی زیادی داشتند، علیرغم اینکه این داده ها از گروه های مختلف طبیعی می آمدند.کلیه ها(r=0.83؛ شکل 3A) و در زمان های مختلف مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. 246 پروتئین های غنی شده با PT همچنین می توانند بین دو گروه مختلف کلیه های طبیعی همبستگی داشته باشند (r=0.77؛ شکل 3B). نتایج نشان می‌دهد که nscProteomics قادر به شناسایی پروتئین‌های خاص زیر محفظه ذخیره‌شده در واحدهای عملکردی مختلف کلیه است.

شکل 3. (الف) همبستگی مجموعه ای از 210 پروتئین به طور قابل توجهی درگلومرولبین دو دسته مختلف از نمونه های مستقل کلیه. دسته 1 (دوره 1) از 2 کلیه و دسته 2 (دوره 2) از 4 کلیه بود. مقیاس رنگ برای نمایش بصری فراوانی انتخاب شد. یک همبستگی مثبت قوی 83.83 0 بین میانگین فراوانی پروتئین های مجموعه مشابه از دو دسته مختلف. خطوط چین قرمز با نشان دادن فاصله پیش بینی 95 درصدی برای مقادیر فراوانی میانگین این پروتئین ها در تکرار آزمایش های آینده (ب) همبستگی 246 پروتئین به طور قابل توجهی غنی شده استلوله های پروگزیمالدر مقابل.گلومرولبین دو دسته یک همبستگی مثبت 0.77 0 بین میانگین فراوانی همین پروتئین‌ها بین دو دسته.

برای تعیین ویژگی رویکرد nscProtoemics برایکلیهتجزیه و تحلیل زیر محفظه، ما داده‌های Glom و PT زیر محفظه کلیه nscProteomics را با پروتئومیک‌های حجیم مجموعه مشابهی از بافت کلیه مقایسه کردیم. ما دریافتیم که 25 درصد (n=656) از پروتئین‌های شناسایی‌شده در هر دو بخش فرعی حتی توسط پروتئومیک بافت حجیم شناسایی نشدند، زیرا به احتمال زیاد فراوانی آنها در نمونه فله بسیار کم بود. پروتئین‌های 118 Glom و 74 PT غنی‌شده را نمی‌توان در کلیه‌های حجیم شناسایی کرد، که محدودیت‌های انجام پروتئومیکس بافت حجیم را برجسته می‌کند. تنها 9 درصد از پروتئین‌های اختصاصی Glom، اما تعداد بیشتری از پروتئین‌های اختصاصی PT، 48 درصد، توسط پروتئومیکس حجیم کلیه شناسایی شدند، که نشان‌دهنده فراوانی بسیار بالاتر سلول‌های PT نسبت به سلول‌های گلوم در حالت طبیعی است.کلیه. در واقع، برخی از نشانگرهای شناخته شده برای سلول های گلومرولی مانند پودوسین (NPHS2)، eva{1}} همولوگ B (EVA1B)، MARCKS مانند 1 (MARCKSL1)، فاکتور رشد فیبروبلاست 1 (FGF1) و کلودین 5 (CLDN5) می توانند توسط پروتئومیکس حجیم کلیه در عمق های استاندارد ~2،{10}} شناسایی نمی شود.

سیستانچ برای بهبودکلیهعملکرد

اعتبار سنجی نشانگرهای Glom و PT همانطور که توسط nscProteomics ارزیابی شده است

اکثر پروتئین های زیر محفظه به صورت شناسایی شده در گزارش شده اندکلیهتوسط IHC در داده های قبلاً منتشر شده (اطلس پروتئین انسانی) (25). پروتئین‌هایی که یا توسط IHC شناسایی نشده‌اند (با علامت *) یا داده‌هایی در دسترس نیستند (با برچسب **) در شکل‌های 4A، B نشان داده شده‌اند. داده‌های رونویسی (داده‌های scRNA Seq) برای یکپارچه‌سازی و اعتبارسنجی "cross-omics" (شکل 4B). نتیجه تجزیه و تحلیل یکپارچه نشانگرهای Glom و PT توسط پروتئومیکس و ترانسکریپتومیکس، همبستگی قوی برخی از پروتئین های مارکرهای Glom و PT شناخته شده را نشان داد. نشانگرهای پودوسیت مانند PODXL و CLIC5 و نشانگرهای PT مانند PDZK1 و ANPEP در هر دو مجموعه داده بسیار غنی شدند. جدا از اعتبارسنجی نشانگرهای شناخته شده، nscProteomics پروتئین هایی را نیز شناسایی کرده است که در مجموعه داده های رونویسی یا مجموعه داده های IHC به وفور کم شناسایی می شوند. به عنوان مثال، PITPNB یک نشانگر گلومرولی بسیار غنی شده توسط داده های nscProteomics است. با این حال، تشخیص این ژن در داده‌های رونویسی کم بود و توسط IHC قابل تشخیص نبود (25). مورد مشابهی با SLC5A1 مشاهده شد که سیگنال آن در داده‌های nscProteomics افزایش یافته بود، اما در مجموعه داده‌های transcriptomic یا IHC (شکل 4C) تقویت نشد.

شکل 4. (الف) نقشه حرارتی نشان دهنده توزیع تفاضلی فراوانی پروتئین در 5 نرمالکلیه ها(دسته 2)، از 26 پروتئین (از 372) به طور قابل توجهی در G (در مقابل T) و 26 پروتئین (از 411) به طور قابل توجهی در T (در مقابل G) غنی شده بودند، با مقادیر متناظر در 2 نمونه فله برای مقایسه نشان داده شده است. . فراوانی پروتئین به صورت شدت های نسبی تبدیل شده log 2 اندازه گیری می شود. خوشه‌بندی بدون نظارت پروتئین‌های مهم، مجموعه‌ای از پروتئین‌های مرتبط با اندازه‌گیری شباهت فاصله اقلیدسی را در مجموعه‌های غنی‌شده بزرگ‌تر برجسته می‌کند. ذکر شده است که نمونه های فله با نمونه های PT خوشه می شوند. این انتظار می رود از آنجالوله های پروگزیمالبه وفور در داخل پراکنده هستندکلیه. (B) ارتباط نمودار بیان ژن داده‌های scRNA-seq از انسانکلیه. ژن‌های کدکننده پروتئین‌های اختصاصی Glom و PT که در نقشه حرارتی ارائه شده‌اند انتخاب شدند. افزایش اندازه نقطه مربوط به درصد بیشتری از سلول‌ها در جمعیت سلولی است که ژن را بیان می‌کنند، در حالی که رنگ تیره‌تر مربوط به بیان بالاتر ژن است. PT،لوله پروگزیمال; پودو، پودوسیت ها؛ Mes، سلول های مزانژیال. LOH، حلقه هنله، سلول های ایمنی. اندو، سلول های اندوتلیال؛ DT، لوله های دیستال. سی دی، مجرای جمع آوری. *علامت کنار نماد ژن نشان می دهد که پروتئین بر روی گلومرول ها همانطور که توسط Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org) گزارش شده است، شناسایی نشده است، **اطلاعات در Human Protein Atlas در دسترس نیست (https://www. proteinatlas.org). (C) پروتئین‌های نماینده‌ای که نشان می‌دهند چگونه nscProteomics نه تنها نشانگرهای مثبتی مانند PODXL و PDZK1 را شناسایی می‌کند، بلکه نشانگرهای پروتئینی مانند مواردی که توسط رونوشت‌شناسی یا ایمونوهیستوشیمی نادیده گرفته می‌شوند را نیز شناسایی می‌کند.

ارتباط بیولوژیکی پروتئین های غنی شده با گلوم و PT

ما از داده‌های تولید شده از طریق پروتکل توسعه‌یافته برای nscProteomics برای بررسی پروتئین‌هایی استفاده کردیم که به طور قابل توجهی در سلول‌های گلومرولی یا سلول‌های گلومرولی غنی شده بودند.لوله پروگزیمالسلول ها. 208 پروتئین غنی شده Glom در حمل و نقل با واسطه وزیکول (FDR 3.6E-15) و تنظیم سازمان اجزای سلولی (FDR 9.75E-14) به عنوان فرآیندهای بیولوژیکی برتر و اتصال پروتئین اسکلت سلولی (FDR 2.63) غنی شدند. E{10}}) و اتصال اکتین (FDR 2.40E-17) در میان عملکرد مولکولی رتبه برتر. علاوه بر این، اسکلت سلولی اکتین (FDR 3.73 E-25) و چسبندگی کانونی (FDR 4.07E-20) اجزای سلولی غنی‌شده برتر بودند. پروتئین های غنی شده با 247 PT در فرآیندهای متابولیک مولکولی کوچک (FDR 7.55E{25}}) و فرآیندهای متابولیک دارو (FDR 5.00E-41) به عنوان فرآیندهای بیولوژیکی برتر غنی شدند. پروتئین‌ها برای فعالیت اکسیدوردوکتاز (FDR 9.07E{31}}) و فعالیت کاتالیزوری (FDR 1.05E-27) در میان توابع مولکولی با رتبه برتر غنی شدند.

nscProteomics مجموعه ای منحصر به فرد از پروتئین های Glom و PT را شناسایی می کند

جدای از پروتئین های غنی شده در بخش گلوم یا PT، 92 پروتئین یا منحصر به گلوم (n=67) یا منحصر به PT (n=25) بودند، زیرا آنها فقط در سلول های گلومرولی شناسایی شدند. یالوله پروگزیمالسلول ها (جدول 1). پروتئین‌هایی که فقط در سلول‌های گلومرولی شناسایی شدند در عملکردهای مولکولی مانند اتصال به اکتین (FDR 4.92E{4}})، اتصال به پروتئین اسکلت سلولی (FDR 3.47E-05)، اتصال به اینتگرین (3.9E {11}})، و غیره. ما از این فهرست برای بازجویی از داده‌های در دسترس عموم استفاده کردیم که قبلاً حضور خود را درگلومرول. از میان 67 پروتئین شناسایی شده تنها در بخش گلوم، 41 مورد گزارش شده است که درکلیه(25). از این 41 پروتئین، زیرمجموعه ای از 18 (43.9 درصد) با nscProteomics مطابقت دارند و 23 (56.1 درصد) گزارش شده است که در Glom در مقایسه با توبول ها افزایش نمی یابند. از بین 25 پروتئینی که فقط در بخش های PT شناسایی شده اند، 20 مورد گزارش شده است که درکلیه(25). این پروتئین ها در عملکردهای مولکولی مانند فعالیت انتقال دهنده گذر غشایی آنیون آلی (FDR 6.34E{3}})، فعالیت انتقال دهنده غشایی کربوکسیلیک اسید (FDR 1.4E-04)، املاح: فعالیت سمپورتر سدیم (FDR 1.8 E) غنی شده اند. -04)، و غیره. از 25 پروتئین خاص PT، زیرمجموعه ای از 19 پروتئین (95.{13}} درصد ) با nscProteomics مطابقت دارد و تنها 1 (5.{16}} درصد ) است. گزارش شده است که در لوله ها در مقایسه با Glom افزایش نیافته است.

جدول 1. پروتئین های غنی شده در گلومرولی ولوله پروگزیمالسلول های شناسایی شده توسط nscProteomics.

بحث

با پیشرفت سریع ژنومیک تک سلولی و سنجش ترانسکریپتومی، هنوز نیازی برآورده نشده برای انجام مطالعات موازی تک سلولی بر روی نمونه های گرانبهای انسانی در زمینه پروتئومیکس وجود دارد (27). پروفیل پروتئین از چهره های تک سلولی مانع از این فضیلت است که ما توانایی تقویت پروتئین را به روشی که می توانیم نوکلئوتیدها را تقویت کنیم، نداریم. در این اولین کاربرد پروتئومیکس تقریباً تک سلولی بر روی انسانکلیه، ما نشان می دهیم که تعیین کمیت پروتئومی بدون برچسب قوی برای 40 مورد امکان پذیر استکلیهسلول ها، خاص برای زیر محفظه های مختلف LCM. پروتکل های توسعه یافته برای پروتئومیکس کلیه تقریباً تک سلولی برای سایر محققانی که در زمینه بیماری های کلیوی کار می کنند مفید خواهد بود.

مطالعه اخیر توسط Hoehne و همکاران. استفاده از فناوری آماده سازی نمونه با فاز جامد تک گلدان (SP3) را برای آنالیز پروتئومی بخش های کلیوی نشان داد (4). نویسندگان با استفاده از گلومرول‌های ریز جدا شده با 200 سلول، ناهمگونی پروتئوم‌های گلومرول‌های منفرد را از مدل‌های موش و بیماران انسانی نشان دادند. مطالعه اخیر دیگری توسط سونگ و همکاران. (28) از بافت FFPE از گیرندگان پیوند کلیه برای ایجاد یک پلت فرم تشخیص مولکولی با استفاده از پروتئومیکس حجیم استفاده کرد. در این دست‌نوشته، فرآیند جمع‌آوری بافت به MS را بهینه‌سازی و تجزیه و تحلیل کرده‌ایم تا یک پروتکل استاندارد برای آنالیز پروتئومی نمونه‌های بافت کوچک ایجاد کنیم. ابتدا، ما روش FFPE در مقابل OCT را برای ذخیره سازی بافت مقایسه کردیم تا نشان دهیم که در حالی که همبستگی بالایی بین دو مجموعه داده وجود دارد، بافت OCT محتوای پروتئین بالاتر و مهمتر از آن توانایی شناسایی پروتئین های کم فراوانی دارد. دوم، پروتکل‌های MS برای پروتئومیکس انبوه به‌گونه‌ای بهینه‌سازی شده‌اند که می‌توان نتایج بسیار قابل تکرار (r=0.95) را در سایت‌های متفاوت در برش سریال، مجاور به دست آورد.کلیهمقاطع بافتی سوم، جایی که ما رویکردی را برای ریز شکاف گرفتن با لیزر زوجی برای کاهش مقدار نمونه ورودی به 10-40 سلول با فناوری نانو POTS متشکل از یک پلت فرم رباتیک برای کنترل دقیق حجم‌های پیکو لیتری توصیف می‌کنیم. رویکرد ما به ما اجازه می‌دهد تا تعداد سلول‌های ورودی را کنترل کنیم، بنابراین تکرارپذیری نمونه‌های گلوم و لوله‌های مختلف را افزایش می‌دهیم. با توجه به سادگی LCM و دقت فناوری نانو POTS، ما معتقدیم که مطالعه ما اجازه می دهد تا پروتئومیکس را بر روی نمونه های بالینی گرانبها به روشی تکرارپذیر بپذیریم.

سیستانچ برای درمانکلیهعملکرد

محدودیت های این مطالعه شامل حجم نمونه کوچک و محدودیت بافت است که به ما اجازه نمی دهد اعتبار فضایی بافت را با روش ایمونوهیستوشیمی انجام دهیم. برای کاهش بخشی از این محدودیت، تجزیه و تحلیل داده‌های یکپارچه را با داده‌های scRNA Seq از همان بافت‌ها ارائه می‌کنیم تا تأیید کنیم که پروتئین‌های شناسایی شده درکلیهمحفظه های فرعی نیز در همان سلول بافتی منشا با رونویسی شناسایی می شوند. یک محدودیت اضافی این است که ما تعداد محدودی از پروتئین‌ها را توسط nscProteomics شناسایی می‌کنیم، احتمالاً به دلیل مواد ورودی کوچک، که این خطر را دارد که برخی از پروتئین‌ها توسط MS شناسایی نشوند زیرا ممکن است زیر حد تشخیص ابزار باشند. بهبود حساسیت ابزار و استخراج پروتئین از ورودی نمونه کوچک ممکن است به بهبود این محدودیت فعلی کمک کند.

ما تصدیق می کنیم که متغیرهای زیادی وجود دارند که می توانند به کیفیت داده ها کمک کنند. زمان نگهداری، تثبیت کننده های FFPE (یعنی PFA در مقابل گلوتارآلدئید)، مدت زمان در فیکساتور، زمان در فریزر/روی یخ خشک/در نیتروژن مایع، رویکردهای حلالیت پروتئین چند فاکتور هستند که می توانند به نتایج پروتئومیکس کمک کنند. مهم است که بدانیم حتی زیست شناسی دوکلیه هاهمیشه یکسان نیست و این حتی در همان کلیه‌ها به عنوان گلومرول‌های مشابه صادق استکلیهبیوپسی ها می توانند در حالت عملکردی متفاوت باشند. از نظر بافت شناسی،کلیهمحفظه ها حتی در شرایط بیماری مشابه بسیار ناهمگن هستند. nscProteomics با گرفتن همان مناطق کلیه از نمونه‌های ورودی مختلف، امکان بررسی ناهمگنی را در بخش‌های زیر سلولی خاص فراهم می‌کند که نقطه قوت این فناوری است.

ما مشاهده کردیم که برخی از پروتئین های زیر محفظه شناسایی شده توسط nscProtoemics به طور بالقوه جدید گلومرولی هستند ولوله پروگزیمالپروتئین ها نوآوری در تجزیه و تحلیل داده های یکپارچه با RNA تک سلولی همانکلیهنمونه‌ها، هر چند مقدماتی، تأیید می‌کنند که این پروتئین‌ها واقعاً در مناطق فرعی نمونه‌برداری شده/پیش‌بینی‌شده خود محلی هستند.

این مطالعه بینش هایی را در مورد پیچیدگی کشف نشده الگوهای مولکولی در ارائه می دهدکلیهبخش های فرعی در سلامت و پشتیبانی از کاربرد این فناوری در نمونه های بیماری کلیوی برای درک اختلال پروتئین ها در زیرمجموعه های مختلف کلیه که ممکن است ترجیحاً در اختلالات کلیوی مختلف تحت تأثیر قرار گیرند. تنظیم متفاوت این پروتئین‌ها در بیماری‌های کلیوی مختلف می‌تواند ناهمگنی بالینی و پیش آگهی در فنوتیپ‌های پیچیده بیماری‌های گلومرولی و لوله‌ای را آشکار کند و محرک‌های جدید آسیب و بهبودی کلیه را آشکار کند. بعلاوه، با توجه به کمبود هر داروی محافظ کلیوی، کشف این مسیرهای جدید در نواحی خاص کلیه می‌تواند اهداف مهم جدیدی را برای طراحی منطقی دارو برای رسیدگی به آسیب‌های خاص به بخش‌های فرعی مختلف در انواع اختلالات کلیوی فراهم کند.

بنابراین، در نتیجه، ما یک گردش کار nscproteomics برای مدیریت 10-40 ارائه می‌کنیمکلیهسلول ها؛ بهبود این فناوری نوید کاهش مواد ورودی را در آینده به سطح تک سلولی می دهد. تحولات آینده مانند حجم پردازش بهینه و اصلاحات بیشتر در پلت فرم LC-MS در حال انجام است.

بیانیه در دسترس بودن داده ها

مجموعه داده های تولید شده برای این مطالعه را می توان در PRIDE PXD015058 و 10.6019/PXD015058 یافت.

مشارکت های نویسنده

TS و MS این مطالعه را مفهوم‌سازی کردند. TS، JLi، JH، ACS، RZ، YZ، PR، ID، SS، JLu، و YY در پردازش نمونه و تولید داده های تجربی کمک کردند، TS، PP، SR، AS، W-JQ و MS در تجزیه و تحلیل داده ها و تهیه نسخه خطی همه نویسندگان به مقاله کمک کردند و نسخه ارسال شده را تایید کردند.

منابع مالی

تامین مالی این کار از محل بودکلیهپروژه پزشکی دقیق، NIDDK NIHUG3 -DK114937 (MS) و R01 DK109720-02 (MS)، DP3 DK110844 (W-JQ)، R01 DK122160 (W-JQ) و پشتیبانی از Division of Multi -پیوند اعضا (MS).

تضاد منافع

نویسندگان اعلام می کنند که این تحقیق در غیاب هر گونه روابط تجاری یا مالی که می تواند به عنوان تضاد منافع بالقوه تعبیر شود، انجام شده است.

قدردانی

ما از کمک Zoltan Laszik و Gyula Szabo از UCSF برای کمک به پردازش بافت قدردانی می کنیم. سمیر پاره و برد رووین از دانشگاه ایالتی اوهایو (OSU)، برای همکاری با مشخصات انبوه بر روی پروتئومیکس حجیم و QC برای بافت پروتئومی انبوه مشترک بین UCSF و OSU، و جف هاجین و ماتیاس کرتزلر از دانشگاه میشیگان برای دسترسی مهربانانه به مرجعکلیهنمونه ها. برخی از کارهای آزمایشی شرح داده شده در اینجا در آزمایشگاه علوم مولکولی محیطی، آزمایشگاه ملی شمال غربی اقیانوس آرام، یک مرکز علمی ملی کاربر با حمایت وزارت انرژی تحت قرارداد DEAC05-76RL0 1830 انجام شد.

مواد تکمیلی

مطالب تکمیلی این مقاله را می‌توانید به صورت آنلاین در آدرس زیر پیدا کنید: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2020.00499/full#supplementary-material

اختصارات

nscProteomics، پروتئومیکس تقریباً تک سلولی. KPMP،کلیهپروژه پزشکی دقیق; PT،لوله پروگزیمال; گلوم، گلومرولی; LCM، microdissection ضبط لیزر. μPOTS، پردازش میکرولیتر در یک گلدان برای نمونه های ردیابی. OCT، دمای بهینه برش؛ FFPE، پارافین ثابت با فرمالین تعبیه شده است. UM، دانشگاه میشیگان؛ OSU، دانشگاه ایالتی اوهایو؛ DDM، n-دودسیل -D-مالتوزید؛ scRNA Seq، توالی RNA تک سلولی. IHC، ایمونوهیستوشیمی.

از: «پروتئومیکس نزدیک به تک سلولی پروگزیمال توبولار و گلومرول کلیه طبیعی انسان» توسطتارا کی سیگدل¹، پل دی. پیهوفسکی²، سودشنا روی¹، جولیان لیبرتو¹، جاشوا آر. هانسن²، آدام سی. سوئنسن²، روی ژائو³، یینگ زو³، پریانکا راشمی¹، اندرو شرودر¹، ایزابلا دام¹، سواستیکا سور¹، جینگهویی لو⁴، ینگبائو یانگ⁴، وی جون کیان²* و Minnie M. Sarwal¹* برای کنسرسیوم پروژه پزشکی دقیق کلیه (KPMP).

---مقاله اصلی پژوهشی. پزشکی، 17 سپتامبر 2020|https://doi.org/10.3389/fmed.2020.00499

منابع

1. لی JW، Chou CL، Knepper MA. توالی یابی عمیق در لوله های کلیوی ریز جدا شده، رونوشت های خاص بخش نفرون را شناسایی می کند. جی ام سوک نفرول. (2015) 26:2669-77. doi: 10.1681/ASN.2014111067 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

2. Cisek K، Krochmal M، Klein J، Mischak H. کاربرد زیست شناسی چند omics و سیستم برای شناسایی اهداف درمانی در مزمنکلیهمرض. پیوند نفرول دیال. (2016) 31:2003–11. doi: 10.1093/ndt/gfv364 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

3. وو اچ، هامفریس بی دی. وعده تعیین توالی RNA تک سلولی برایکلیهبررسی بیماری کلیه بین المللی (2017) 92:1334-42. doi: 10.1016/j.kint.2017.06.033 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

4. Hohne M، Frese CK، Grahammer F، Dafinger C، Ciarimboli G، Butt L، و همکاران. پروتئوم های تک نفرونی مورفولوژی و عملکرد را در پروتئینوریک به هم متصل می کنندکلیهمرض. کلیه بین المللی (2018) 93:1308-19. doi: 10.1016/j.kint.2017.12.012 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

5. Wu H، Malone AF، Donnelly EL، Kirita Y، Uchimura K، Ramakrishnan SM، و همکاران. رونویسی تک سلولی یک انسانکلیهنمونه بیوپسی آلوگرافت یک پاسخ التهابی متنوع را تعریف می کند. جی ام سوک نفرول. (2018) 29:2069–80. doi: 10.1681/ASN.2018020125 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

6. Wilson PC، Humphreys BD. ترانس کریپتومیکس تک سلولی کلیه و ارگانوئید: پایان آغاز. نفرول اطفال. (2019) 35:191-7. doi: 10.1007/s00467-018-4177-y PubMed Abstract|متن کامل CrossRef|Google Scholar

7. Wu H، Kirita Y، Donnelly EL، Humphreys BD. مزایای تک هسته نسبت به توالی یابی RNA تک سلولی بزرگسالانکلیه: انواع سلولی نادر و حالات سلولی جدید در فیبروز آشکار شد. جی ام سوک نفرول. (2019) 30:23-32. doi: 10.1681/ASN.2018090912 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

8. Shen Y، Tolic N، Massillon C، Pasa-Tolic L، Camp DG، Hixson KK، و همکاران. پروتئومیکس فوق حساس با استفاده از میکرو-SPE-nanoLC-nanoESI MS و MS/MS روی خط. مقعد شیمی. (2004) 76:144-54. doi: 10.1021/ac030096q PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

9. Sun L، Zhu G، Zhao Y، Yan X، Mou S، Dovichi NJ. تجزیه و تحلیل فوق حساس و سریع از پایین به بالا از مقادیر فمتوگرام هضم های پیچیده پروتئوم. Angew Chem Int Ed Engl. (2013) 52:13661-4. doi: 10.1002/anie.201308139 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

10. Zhu Y، Piechowski PD، Zhao R، Chen J، Shen Y، Moore RJ، و همکاران. پلت فرم پردازش نانو قطرات برای پروفایل پروتئوم عمیق و کمی سلول های پستانداران 10-100. Nat Commun. (2018) 9:882. doi: 10.1038/s41467-018-03367- w

چکیده PubMed|متن کامل CrossRef|Google Scholar

11. Xu K، Liang Y، Piechowski PD، Dou M، Schwarz KC، Zhao R، و همکاران. گردش کار پردازش نمونه سازگار با رومیزی برای پروفایل پروتئوم<100 mammalian="" cells.="" anal="" bioanal="" chem.="" (2018)="" 411:4587–96.="" doi:="">

چکیده PubMed|متن کامل CrossRef|Google Scholar

12. Waanders LF، Chwalek K، Monetti M، Kumar C، Lammert E، Mann M. تجزیه و تحلیل کمی پروتئومی جزایر منفرد پانکراس. Proc Natl Acad Sci USA. (2009) 106:18902-7. doi: 10.1073/pans.0908351106 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

13. Wisniewski JR، Ostasiewicz P، Mann M. FASP با بازیابی بالا که در آنالیز پروتئومی بافت‌های سرطانی پارافین تثبیت‌شده با فرمالین ریز جدا شده اعمال می‌شود، نشانگرهای شناخته شده سرطان کولون را بازیابی می‌کند. J Proteome Res. (2011) 10:3040-9. doi: 10.1021/pr200019m PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

14. Chen Q، Yan G، Gao M، Zhang X. پروفایل پروتئوم فوق حساس برای 100 سلول زنده با تزریق مستقیم سلول، هضم آنلاین و تجزیه و تحلیل نانو-LC-MS/MS. مقعد شیمی. (2015) 87:6674-80. doi: 10.1021/acs.analchem.5b00808 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

15. Li S، Plouffe BD، Belov AM، Ray S، Wang X، Murthy SK، و همکاران. یک پلت فرم یکپارچه برای جداسازی، پردازش، و پروفایل پروتئومی مبتنی بر طیف سنجی جرمی سلول های نادر در خون کامل. پروتئومیکس سلول مول. (2015) 14:1672-83. doi: 10.1074/MCP.M114.045724 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

16. Chen W، Wang S، Adhikari S، Deng Z، Wang L، Chen L، و همکاران. فن آوری ساده و یکپارچه مبتنی بر نوک چرخشی که برای پروفایل پروتئوم عمیق استفاده می شود. مقعد شیمی. (2016) 88:4864-71. doi: 10.1021/acs.analchem.6b00631 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

17. Huang EL، Piechowski PD، Orton DJ، Moore RJ، Qian WJ، Casey CP، و همکاران. SNaPP: پلت فرم نانوپروتئومیک ساده شده برای تجزیه و تحلیل پروتئومی جهانی قابل تکرار مقادیر پروتئین نانوگرم. غدد درون ریز. (2016) 157:1307-14. doi: 10.1210/en.2015-1821 PubMed Abstract|متن کامل CrossRef|Google Scholar

18. Steffes MW, Schmidt D, McCrery R, ​​Basgen JM, International Diabetic Nephropathy Study G. تعداد سلولهای گلومرولی در افراد عادی و در بیماران دیابتی نوع 1.کلیهبین المللی (2001) 59:2104-13. doi: 10.1046/j.1523-1755.2001.00725.x

چکیده PubMed|متن کامل CrossRef|Google Scholar

19. Tyanova S, Temu T, Cox J. پلت فرم محاسباتی MaxQuant برای پروتئومیکس شاتگان مبتنی بر طیف سنجی جرمی. پروتوک Nat. (2016) 11:2301-19. doi: 10.1038/nprot.2016.136 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

20. Perez-Riverol Y، Csordas A، Bai J، Bernal-Llinares M، Hewapathirana S، Kundu DJ، و همکاران. پایگاه داده PRIDE و ابزارها و منابع مرتبط در سال 2019: بهبود پشتیبانی از داده های کمی سازی. Nucleic Acids Res. (2019) 47:D442–50. doi: 10.1093/var/gky1106 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

21. استاندارد I. روش اساسی برای تعیین تکرارپذیری و تکرارپذیری یک روش اندازه‌گیری استاندارد، دقت (صحت و دقت) روش‌ها و نتایج اندازه‌گیری. بخش استاندارد اندام بین المللی. (1994) 2:5725.

22. بلند جی ام، آلتمن دی جی. روش های آماری برای ارزیابی توافق بین دو روش اندازه گیری بالینی. لانست. (1986) ​​1:307–10. doi: 10.1016/S0140-6736(86)90837-8 PubMed Abstract|متن کامل CrossRef|Google Scholar

23. Lundgren DH، هوانگ SI، وو L، Han DK. نقش شمارش طیفی در پروتئومیکس کمی Expert Rev Proteomics. (2010) 7:39-53. doi: 10.1586/epr.09.69 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

24. Webb-Robertson BJ، Mccue LA، Waters KM، Matzke MM، Jacobs JM، Metz TO، و همکاران. تجزیه و تحلیل آماری ترکیبی از شدت پپتید و وقوع پپتید شناسایی پپتیدهای قابل توجه از داده های پروتئومیکس مبتنی بر MS را بهبود می بخشد. J Proteome Res. (2010) 9:5748-56. doi: 10.1021/pr1005247 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar

25. Uhlen M، Fagerberg L، Hallstrom BM، Lindskog C، Oksvold P، Mardinoglu A، و همکاران. پروتئومیکس. نقشه بافتی پروتئوم انسانی. علوم پایه. (2015) 347:1260419. doi: 10.1126/science.1260419 PubMed چکیده|متن کامل CrossRef|Google Scholar 26. Schroeder AW, Sur S, Rashmi P, Damm I, Zarinsefat A, Kretzler M, et al. رمان انسانکلیهزیر مجموعه های سلولی شناسایی شده توسط Mux-Seq. bioRxiv [پیش چاپ]. (2020) doi: 10.1101/2020.03.02.973925 CrossRef متن کامل|Google Scholar

27. مارکس V. رویای پروتئومیکس تک سلولی. روش‌های Nat (2019) 16:809–12. doi: 10.1038/s41592-019-0540-6 PubMed Abstract|متن کامل CrossRef|Google Scholar

28. آهنگ L، Fang F، Liu P، Zeng G، Liu H، Zhao Y، و همکاران. پروتئومیکس کمی برای نظارت بر آسیب پیوند کلیه Proteomics Clin Appl. (2020) 14:e1900036. doi: 10.1002/prca.201900036

چکیده PubMed|متن کامل CrossRef|Google Scholar