مونوکسید کربن (CO) به طور موثر نفروپاتی دیابتی (DN) را کاهش می دهد

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

بخش Ⅰ: مونوکسید کربن با بهبود اتوفاژی، پیری در نفروپاتی دیابتی را کاهش می دهد.

Guibin Meil; چونجی جیانگ; شویر چنگ; & در al.V

مقدمه

نفروپاتی دیابتی (DN) یکی از شایع ترین و جدی ترین عوارض میکروواسکولار دیابت است. از نظر آماری، 20 درصد -40 درصد از بیماران مبتلا به DN (نفروپاتی دیابتی) با سرعت 14 برابر سریعتر از سایر بیماری های کلیوی به مرحله نهایی بیماری کلیوی (ESRD) تبدیل می شود. علاوه بر این، افزایش خطر قلبی عروقی DN (نفروپاتی دیابتی)بیماران تا حد زیادی به مرگ و میر بالا کمک می کند. پاتوژنز پیچیده DN (نفروپاتی دیابتی)با رویکرد درمانی محدود موجود هنوز مشخص نیست. از این رو، شناسایی پاتوژنز و عوامل درمانی برای جلوگیری از از دست دادن پیشرونده عملکرد کلیوی DN ضروری است. (نفروپاتی دیابتی).

سلول های پیر که با توقف دائمی چرخه سلولی مشخص می شوند، به عنوان سلول های زامبی توجه گسترده ای را به خود جلب کرده اند. به دلیل مقاومت در برابر آپوپتوز و تولید مداوم فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری (SASP)، سلول‌های پیر به طور فزاینده‌ای به عنوان عامل مهم بیماری‌های مرتبط با افزایش سن شناخته می‌شوند. اختلال عملکرد کلیوی مرتبط با پیری معمولاً در DN مشاهده شده است (نفروپاتی دیابتی)بیماران و مدل های تجربی، مانند موش های القا شده با STZ (دیابت نوع 1 (T1D)) و db/db (دیابت نوع 2 (T2D)). نکته مهم این است که پاکسازی سلول‌های p{4}مثبت موش‌های مسن باعث بهبود گلومرولواسکلروز شد. علاوه بر این، حذف p21 یا p27 در موش‌های T1D پروتئینوری و اتساع گلومرولی را کاهش داد. این نتایج نشان داد که پیری نقش مهمی در پاتوژنز DN ایفا می کند (نفروپاتی دیابتی). با این حال، تنظیم پیری در DN (نفروپاتی دیابتی)مبهم باقی می ماند

شواهد نوظهور نشان داد که اتوفاژی، مکانیزم تخریب محتویات درون سلولی، تنظیم کننده پیری معتبری است. گزارش شده است که اتوفاژی طول عمر موش‌های مسن و مگس‌های مسن را افزایش می‌دهد.10 مطالعات بیشتر نشان داد که حذف Atg7 پیری سلول‌های بنیادی را تشدید می‌کند. مهمتر از آن، حذف Atg5 باعث تشدید پروتئینوری و فیبروز می‌شود.کلیهپیری. 12.13 بنابراین، داروهایی که اتوفاژی را برای کاهش پیری هدف قرار می دهند، ممکن است یکی از امیدوارکننده ترین استراتژی ها برای DN باشد. (نفروپاتی دیابتی)پیشگیری و درمان

مونوکسید کربن (CO) تولید شده از طریق کاتابولیسم هم توسط آنزیم های هم اکسیژناز یک مولکول درون زا گازی است. تعدادی از نشریات خواص ضد التهابی، ضد آپوپتوز و سایر خواص محافظتی CO را نشان دادند.مونوکسید کربن) هنگامی که در دوزهای پایین استفاده شود.14 اگرچه CO (مونوکسید کربن)به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است تا محافظت مجدد را به ایسکمی-پرفیوژن مجدد یاکلیهموش های پیوندی، 15 اثر و مکانیسم CO (مونوکسید کربن)در DN (نفروپاتی دیابتی)نامشخص هستند. اخیرا، ادبیات نشان داد که CO (مونوکسید کربن)نقش محافظ سلولی را به عنوان یک فعال کننده اتوفاژی در جزایری که توسط هیپوکسی، 16 موش سپسیس 7 و موش های مسن مبتلا به ایست قلبی به چالش کشیده شده اند. 18 علاوه بر این، تجویز CO (مونوکسید کربن)پیری سلول‌های اندوتلیال ناشی از سمیت دارویی را کاهش داد. (مونوکسید کربن)برای بهبود پیری

از این رو، ما فرض کردیم که تجمع سلول های پیر درکلیهاز DN (نفروپاتی دیابتی)موش ها را می توان با CO معکوس کرد (مونوکسید کربن)از طریق فعال سازی اتوفاژی، متعاقباً اختلال عملکرد کلیه را بهبود می بخشد. برای آزمایش فرضیه خود و کشف مکانیسم‌های اساسی، از درمان مولکول آزادکننده مونوکسید کربن-2 (CORM-2) در داخل بدن (DN تجربی) استفاده کردیم. (نفروپاتی دیابتی)موش) و در شرایط آزمایشگاهی (سلول های مزانژیال موش، سلول های اپیتلیال لوله ای انسان و پودوسیت انسان).

عملکرد کلیه: نحوه تأثیر مونوکسید کربن (CO)نفروپاتی دیابتی (DN)

برای بیماری کلیوی روی سیستانچ و محصولات سیستانچ کلیک کنید

مواد و روش ها

2.1|طراحی آزمایشی روی حیوانات

موش‌های نر هشت هفته‌ای C57BL/6J (چارلز ریور) در یک چرخه استاندارد نور/تاریکی (12:12 ساعت) با رژیم غذایی معمولی (ND) یا رژیم غذایی پرچرب (HFD) (60 درصد انرژی حاصل از چربی) نگهداری شدند. ) به مدت 16 هفته. 20 در هفته 17 مطالعه، موش های تغذیه شده با HFD تزریق داخل صفاقی STZ (50 میلی گرم بر کیلوگرم) را به مدت 7 روز دریافت کردند، در حالی که موش های دارای ND با وسیله نقلیه (بافر سیترات، pH{13}}) تزریق شدند. .5). یک هفته پس از تزریق، سطح گلوکز خون دم پریک دو بار در فاصله 24 ساعت اندازه گیری شد. بعد، DN (نفروپاتی دیابتی)موش های با سطوح گلوکز 16.9 میلی مول در لیتر یا بیشتر به طور تصادفی به سه گروه با 15 حیوان در هر گروه تقسیم شدند (DN (نفروپاتی دیابتی)، DN (نفروپاتی دیابتی)به علاوه CO، و DN (نفروپاتی دیابتی)پلاس iCO): گروهی به نام کنترل DN و سایر گروه‌هایی که با تزریق داخل صفاقی (دو بار در هفته به مدت 16 هفته) CORM{1}} (3 میلی‌گرم/کیلوگرم) یا CORM غیر معتبر{4}} تحت درمان قرار گرفتند. تولید شده با انتشار CO (مونوکسید کربن)از CORM-2 در دمای اتاق. در پایان دوره آزمایشی، موش‌ها بیهوش شدند، نمونه‌های خونی با انوکولاسیون کره چشم جمع‌آوری شد و کلیه‌ها برای تجزیه و تحلیل برداشت شدند. همه حیوانات مطابق با اصول راهنما در مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی منتشر شده توسط مؤسسه ملی بهداشت ایالات متحده تحت درمان قرار گرفتند و تمام روش های حیوانی توسط شورای کالج پزشکی Tongji در کمیته مراقبت از حیوانات تأیید شد.

2.2|تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی و بافت شناسی پلاسما

خون کامل و سرم جمع آوری شده برای تجزیه و تحلیل در درجه{0}} ذخیره شد. نیتروژن اوره خون (BUN) با کیت های سنجش تجاری موجود (موسسه مهندسی زیستی Jiancheng، چین) اندازه گیری شد. پس از برداشتن کلیه ها و شستشوی سطح با سالین. بافت کلیه با رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و ماسون تری کروم رنگ آمیزی شد و در نهایت با میکروسکوپ مشاهده شد.

2.3|میکروسکوپ الکترونی

قطعات کوچکی از قشر کلیه در گلوتارآلدئید (2.5 درصد) تثبیت شد و در آرالدیت جاسازی شد. بافت پلیمریزه شد و با استفاده از یک اولترامیکروتوم (Leica EM UC7) به بخش‌های بسیار نازک ({2}} نانومتر) برش داده شد. برش های نازک روی شبکه مش مسی رنگ آمیزی شده و در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری (Tecnai G220 TWIN) مشاهده شد.

2.4|الاستوگرافی موج برشی

در پایان دوره آزمایشی، موش‌ها بیهوش شدند و به آزمایشگاه اولتراسونیک (بیمارستان اتحادیه، کالج پزشکی تونگجی، دانشگاه علم و فناوری Huazhong، ووهان، چین) برای الاستوگرافی موج برشی با استفاده از یک محدوده سریع (تصور مافوق صوت) فرستاده شدند. برای اندازه گیری سفتی پارانشیم کلیه از میانگین مدول یانگ (ایمان) استفاده شد.

2.5|رنگ آمیزی SA{2}}گال

منجمدکلیهبخش‌ها و سلول‌های کاشته‌شده در یک 6-صفحه چاه برای تشخیص فعالیت SA- - توسط یک کیت تجاری (بیوتیم بیوتکنولوژی) طبق دستورالعمل‌های سازنده استفاده شد. لکه آبی به عنوان محل تجمع سلول های پیر در نظر گرفته شد.

2.6|PCR کمی در زمان واقعی برای بیان mRNA

طبق دستورالعمل (TaKaRa BIO INC)، RNA بافت کلیه با استفاده از معرف TRlzol استخراج شد. بیان mRNA با کیت gRT-PCR مبتنی بر سبز سل و پرایمرهای خاص اندازه گیری شد (جدول 1). بیان هر ژن با منحنی استاندارد خود ارزیابی شد و سطح mRNA Gapdh به عنوان یک کنترل درون زا کمی سازی شد.

2.7|وسترن بلات و رسوب ایمنی

بافت یا سلول کلیوی همگن و لیز شد، سپس توسط کیت سنجش پروتئین BCA (بیوتکنولوژی Beyotime) اندازه‌گیری شد. پروتئین جدا شد و متعاقباً بر روی غشاهای PVDF (Millipore) منتقل شد. پس از مسدود شدن، غشاها یک شبه با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند (جدول 2). پس از شستشو، غشاها با آنتی بادی ثانویه مربوطه انکوبه شدند. چگالی هر باند هدف توسط نرم افزار Image Pro-Plus 6.{3}} اندازه گیری شد و به عنوان چگالی نوری به GAPDH نرمال شد. تمام اندازه های نمونه حیوانات یا سلول ها بزرگتر یا مساوی 3 بودند.

لیز بافت کلیه ({0}} گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه) سانتریفیوژ شد و مایع رویی با 20 میکرولیتر پروتئین A/G آگارز به مدت 2 ساعت پاکسازی شد و یک شب با Bcl انکوبه شد{{6} } یا آنتی بادی lgG موش. رسوبات ایمنی شسته شده، مجدداً معلق شدند، جوشانده شدند و با استفاده از آنتی بیکلین{9}} (فناوری سیگنال دهی سلولی) و ضد Bcl-2 (Proteintech) با استفاده از وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. .21

جدول 1 توالی پرایمر کمی PCR در زمان واقعی

2.8|ایمونوفلورسانس

بافت کلیوی تعبیه شده در محیط OCT به ضخامت {0}} میکرومتر برش داده شد. پس از مسدود شدن با 10 درصد سرم طبیعی بز، مقاطع به مدت یک شب با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند. روز بعد، بافت با آنتی بادی های ثانویه برچسب گذاری شد. پس از شستشو با PBS، اسلایدها با DAPI انکوبه شدند و متعاقباً در زیر میکروسکوپ فلورسنت (Olympus) عکسبرداری شدند.

2.9|کشت سلولی

HBZY-1 در DMEM (Gibco) و HK-2 در DMEM/F12 (Gibco) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو، 100 U ml-1 پنی سیلین/استرپتومایسین (Gibco) نگهداری شد. ) در دمای 37 درجه در اتمسفر مرطوب حاوی 95 درصد هوا و 5 درصد CO (مونوکسید کربن). HPC ارائه شده توسط پروفسور چون ژانگ از دانشگاه علم و فناوری Huazhong در RPMI 1640 (Gibco) نگهداری شد. HPC ابتدا در 33 درجه تکثیر شد و سپس برای تمایز به 37 درجه منتقل شد تا بتوان از آن در آزمایشات همانطور که قبلا توضیح داده شد استفاده کرد.

2.10|سنجش ELIS

پس از درمان متفاوت HPC و کشت به مدت 5 روز، نیمی از مایع رویی برای تشخیص (VEGF آزاد شده) خارج شد. سلول ها با استفاده از یک سنگ شکن سلولی اولتراسونیک (SONICS) شکسته شدند و به پروتئین ها اجازه می داد تا به طور کامل در مایع رویی باقی مانده (کل VEGF) آزاد شوند. سپس غلظت VEGF با استفاده از کیت تجاری ELISA (MEIMIAN) اندازه گیری شد. نسبت VEGF آزاد شده به کل VEGF نرخ نشت VEGF بود.

2.11|خاموش کردن ژن

از بین بردن Atg7 در سلول‌های HK{1}} با استفاده از روش ترانسفکشن reverse siRNA که در صفحات شش چاهی انجام شد به دست آمد. پس از رشد تا 70 درصد تلاقی، سلول ها با siRNA یا siRNA درهم (RiboBio) با استفاده از Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) طبق پروتکل سازنده ترانسفکت شدند. پس از 48 ساعت از ترانسفکشن، کارایی ترانسفکشن با وسترن بلات برای تایید توالی تایید شد (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).

جدول 2 همه لیست های آنتی بادی

2.12|شار اتوفاژیک را کنترل کنید

پلاسمیدهای حاوی ناقل لنتی ویروسی RFP-GFP-LC3 (Genecopoeia) ساخته و سپس طبق دستورالعمل سازنده (GeneCopoeia) در سلول های HEK293T بسته بندی شدند. مایع رویی ویروس برای آلوده کردن سلول‌های HK{4}} و HBZY-1 برای نظارت بر جریان اتوفاژی جمع‌آوری شد. این کاوشگر می تواند اتوفاگوزوم ها (GFP*/RFPt، puncta زرد) و autolysosomes (GFP-/RFPt، puncta قرمز) را تشخیص دهد.

2.13|تحلیل داده ها

داده ها با استفاده از Graph Pad Prism8 تجزیه و تحلیل شد و میانگین ± SEM نشان داده شد. تفاوت بین گروه ها با تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه تعیین شد. اهمیت به صورت P تعیین شد<>

نتایج

3.1|CO (مونوکسید کربن)تضعیف اختلال عملکرد کلیه DN (نفروپاتی دیابتی)موش

برای کشف حفاظت مجدد از CO (مونوکسید کربن)، یک DN (نفروپاتی دیابتی)مدل توسط HFD و STZ القا شد (شکل 1A). پس از 34 هفته تغذیه آزمایشی، گلوکز خون، وزن،کلیهنسبت بدن، کراتینین و BUN اندازه گیری شد. در DN (نفروپاتی دیابتی)گروه،کلیهنسبت بدن، کراتینین و BUN افزایش یافت، در حالی که درمان CO (مونوکسید کربن)ناهنجاری های معکوس شده (جدول 3). به طور مداوم، مورفولوژی کلیه DN (نفروپاتی دیابتی)موش‌ها با لایه‌برداری سلول‌های اپیتلیال، دژنراسیون واکوئلی، بزرگ‌شدن فضای بومن گلومرولی و گسترش مزانژیال به شدت دچار اختلال بودند (شکل 1B). بعلاوه، فراساختار گلومرول ضخیم شدن غشای پایه و ریزش فرآیند پای podocyte را نشان می دهد (شکل 1B). برعکس، CO (مونوکسید کربن)درمان بالاتر از تغییرات مورفولوژیکی منفی نرمال شد (شکل 1B). علاوه بر این، کلاژن فیبریلار رسوب شده در قشر کلیه (شکل 1C) و سختی کلیه، اندازه گیری شده با الاستوگرافی موج برشی، هر دو در DN افزایش یافتند. (نفروپاتی دیابتی)موش ها (شکل 1D). همانطور که انتظار می رفت، CO (مونوکسید کربن)به طور قابل توجهی اختلال عملکرد کلیه DN را بهبود بخشید (نفروپاتی دیابتی)از جمله فیبروز

شکل 1 CO (مونوکسید کربن)تضعیف اختلال عملکرد کلیه DN (نفروپاتی دیابتی)موش های القا شده توسط HFD و STZ.

طرحواره ای از طراحی تجربی. ب، تصاویر نماینده ازکلیهبافت رنگ آمیزی شده با H&E (نوار مقیاس: 50 میکرومتر)، PAS (نوار مقیاس: 10 میکرومتر)، و تغییرات فراساختاری در مورفولوژی گلومرولی که توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری ارزیابی شد (نوار مقیاس: 1 میکرومتر).

و داده‌های آماری نسبت PAS مثبت به ناحیه گلومرولی، ضخامت GBM، عرض فرآیند پا، و تعداد فرآیندهای پا در هر میلی‌متر GBM (n=3).

ج، تصاویری از بافت کلیوی رنگ‌آمیزی شده با تری کروم ماسون و داده‌های آماری ناحیه مثبت (n=3). نوار مقیاس: 25 میکرومتر.

D، الاستوگرافی موج برشی با دامنه سونو و تعیین کمی مدول یانگ به عنوان درجه فیبروز کلیه (n=7) شناسایی شد. *P <.05، **p=""><.01، ***p=""><>

جدول 3 داده های متابولیک موش ها در همه گروه ها

3.2|CO (مونوکسید کربن)کاهش پیری در DN (نفروپاتی دیابتی)موش ها و سلول های کلیوی که توسط گلوکز بالا به چالش کشیده شده اند

پیری به طور فزاینده ای علت اصلی فیبروز کلیه، یکی از نشانه های بارز پیری در نظر گرفته می شود. برای بررسی اثر ضد پیری CO2 (مونوکسید کربن)، ما رنگ آمیزی SA{0}}گال را روی کلیه انجام دادیم. افزایش سلول‌های SA{1} gal* و p16* در سراسر قشر کلیه در DN انباشته شدند. (نفروپاتی دیابتی)گروه، در حالی که شاهد و CO (مونوکسید کربن)کلیه‌های درمان گاهی اوقات مثبت نشان دادند (شکل 2A، B). از موقعیت آناتومیکی کلیه، بیان مثبت p16 در سلول‌های مزانژیال (فلش زرد)، سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی (فلش قرمز) و پودوسیت‌ها (فلش سیاه) تشخیص داده شد. پیری که در DN رخ داده است (نفروپاتی دیابتی)موش‌ها با افزایش آشکار پروتئین‌های کلاسیک مرتبط با پیری، از جمله p53، p21، و p16 حمایت شدند (شکل 2C). برعکس، مدیریت CO (مونوکسید کربن)عملکرد پیری فوق را کاهش داد.

فنوتیپ ترشحی مرتبط با پیری، ترشح متمایز سلول‌های پیر، گزارش شده است که ریزمحیط را مختل می‌کند و پیشرفت بیماری را تسهیل می‌کند.2 از این رو، سطوح mRNA برخی از SASP نماینده اندازه‌گیری شد، از جمله I-1، Il-6 ، Tgf-، Tnf-a، Vegf، Icam-1، و Vcam-1. نتایج نشان داد که افزایش غیرعادی این SASP توسط CO جلوگیری شد (مونوکسید کربن)مداخله (شکل 2D).

با توجه به پیری سرکوب کننده CO (مونوکسید کربن)در داخل بدن، ما بیشتر به بررسی اثر ضد پیری آن در مدل آزمایشگاهی 3 نوع سلول کلیوی، از جمله سلول‌های مزانژیال موش صحرایی (HBZY-1)، سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای انسان (HK-2) و پودوسیت انسان می‌پردازیم. (HPC). پس از قرار گرفتن در معرض گلوکز بالا (HG، 35 میلی مول در لیتر)، 3 نوع سلول افزایش SA{6} gal را با مورفولوژی بزرگتر در روز 7 (شکل 2E)، روز 5، و روز 14 (شکل 2) نشان دادند. ، به ترتیب. قابل توجه، افزایش نرخ نشت LDH HBZY{12}} نشان داد که پیری و آسیب سلولی ناشی از HG است (شکل 2F). به منظور بررسی دوز مناسب CO (مونوکسید کربن)، HBZY-1 با غلظت های مختلف CORM-2 تیمار شد. با اندازه‌گیری میزان نشت LDH (شکل 2F)، سلول‌های مثبت EdU (شکل 2G)، و SA{5}}gal (شکل 2H)، متوجه شدیم که غلظت 1 میکرومول در لیتر اثر مداخله‌ای بهتری دارد. به طور مداوم، CO (مونوکسید کربن)(1μmol/L) همچنین بیان مثبت SA- -gal را در HK-2 و HPC کاهش داد (شکل 2). روی هم، این یافته ها نشان داد که CO (مونوکسید کربن)نقش ضد پیری قابل توجهی را هم در داخل بدن و هم در شرایط آزمایشگاهی ایفا کرد.

شکل 2 CO (مونوکسید کربن)کاهش پیری در DN (نفروپاتی دیابتی)موش ها و سلول های کلیوی که توسط HG به چالش کشیده شده اند.

الف، تصویر نمایندهکلیهبافت رنگ آمیزی شده با SA{0}}gal و داده های آماری ناحیه مثبت (n=3). گلومرول با دایره نقطه قرمز نشان داده شد. نوار مقیاس: 25 میکرومتر.

ب، بیان مثبت p16 درکلیهتوسط ایمونوهیستوشیمی (n=3) نشان داده شد. فلش‌های زرد نشان‌دهنده سلول‌های مزانژیال، قرمز نشان‌دهنده سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی و فلش‌های سیاه نشان‌دهنده پودوسیت‌ها هستند. نوار مقیاس: 25 میکرومتر.

C، سطح پروتئین نشانگرهای پیری توسط ایمونوبلات و تجزیه و تحلیل تراکم سنجی p53، p21 و p16 تعیین شد (n=3).

D، تغییرات در سطوح بیان mRNA SASP (Il-1، Il-6، Tgf-، Tnf-، Vegf، Icam-1، و Vcam-1) (n بزرگتر یا مساوی 4).

E، HBZY{{0}} در معرض NG (5 mmol/L) یا HG (35 mmol/L) با SA{3}}gal از روز 0 تا 7 رنگ آمیزی شد و داده های آماری SA - -سلول‌های gal مثبت در 5 و 7 روز (n=3). نوار مقیاس: 50 میکرومتر.

F، نرخ آزادسازی LDH HBZY{{0}} تحت درمان با غلظت‌های مختلف CORM-2 (0.1، 1، 10 و 100 میکرومول در لیتر) (n=6).

G، نسبت HBZY-EU مثبت-1 تیمار شده با غلظت‌های مختلف CORM-2 (n=3).

H، رنگ آمیزی SA- -گال در HBZY-1 تحت درمان با غلظت های مختلف CORM-2 (n=3). نوار مقیاس: 50 میکرومتر.

I، تصاویر نماینده SA- -gal از HPC (روز 5) و HK-2 (روز 14) با تجویز CORM-2 (1μmol/L) و داده های آماری (n { {6}}). نوار مقیاس: 50 میکرومتر. *P <.05، **p=""><.01، ***p=""><>

3.3|CO (مونوکسید کربن)اتوفاژی فعال شد و جریان اتوفاژی در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی بهبود یافت

تعداد فزاینده ای از تحقیقات تنظیم منفی اتوفاژی به پیری و CO را نشان می دهد (مونوکسید کربن)به عنوان یک فعال کننده اتوفاژی در نظر گرفته شده است. برای بررسی اثرات اتوفاژی COon در DN (نفروپاتی دیابتی)یک سری از پروتئین های مربوط به اتوفاژی اندازه گیری شد. در مقایسه با موش های دیابتی، CO (مونوکسید کربن)درمان به طور قابل توجهی بیان پروتئین شروع اتوفاژی Beclin-1 (شکل 3A) را افزایش داد و بستر اتوفاژی p62 را کاهش داد (شکل 3B)، اما نسبت LC3Il به LC3l، نشانگر اتوفاگوزوم (شکل 3C) را کاهش داد. شواهد قبلی نشان می‌دهد که این تناقض ممکن است به دلیل مسدود شدن جریان اتوفاژی ناشی از اختلال عملکرد لیزوزوم باشد. نتایج نشان داد که پروتئین‌های مرتبط با لیزوزوم کاتپسین B و LAMP2 در DN افزایش یافته‌اند. (نفروپاتی دیابتی)به علاوه COgroup در مقایسه با DN (نفروپاتی دیابتی)گروه (شکل 3D). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل هم‌محلی‌سازی LC3 puncta و LAMP2 از CO پشتیبانی می‌کند (مونوکسید کربن)به طور قابل توجهی تجمع اتوفاگوزوم ها را کاهش داد و تعداد اتولیزوزوم ها را افزایش داد (شکل 3E).

به طور مداوم، همانطور که توسط سطوح پروتئین و پروب های لیزوزومی نشان داده شده است، اختلال اتوفاژی و لیزوزوم در شرایط آزمایشگاهی پیدا شد (شکل 3F، G). علاوه بر این، HK-2 و HBZY-1 با لنتی ویروس RFP-GFP-LC3 برای نظارت بر جریان اتوفاژی ترانسفکت شدند. در شرایط HG، نقاط اتوفاگوزوم‌ها افزایش و اتولیزوزوم‌ها در HBZY-1 و HK-2 کاهش یافت که با تیمار کلروکین (CQ) تغییر بیشتری پیدا نکرد. CO (مونوکسید کربن)افزایش تعداد اتولیزوزوم ها و کاهش اتوفاگوزوم ها، که با افزودن CQ مهار شد (شکل 3H، I). به طور خلاصه، این نتایج نشان داد که CO (مونوکسید کربن)اتوفاژی فعال شد و جریان اتوفاژی در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی بهبود یافت.

3.4|CO (مونوکسید کربن)از طریق بهبود اتوفاژی در شرایط آزمایشگاهی، پیری را کاهش داد

برای بررسی بیشتر نقش اتوفاژی در مکانیسم ضد پیری CO (مونوکسید کربن)ترکیبی از CORM-2 و مهارکننده‌های اتوفاژی در سلول‌های کلیوی در معرض HG استفاده شد. دو نوع بازدارنده، ورتمانین (WORT) برای جلوگیری از شروع اتوفاژی و CQ برای فشار دادن مجدد جریان اتوفاژی، به طور موثر کاهش SA{2}}گال توسط CO را معکوس کردند. (مونوکسید کربن)در 3 نوع سلول کلیوی (شکل 4A). به طور مداوم، CO (مونوکسید کربن)به طور قابل توجهی نسبت سلول های EdU را افزایش داد، که توسط دو مهار کننده در HBZY-1(شکل 4B) و HK-2 (شکل 4C) مهار شد. در HBZY-1، اثر کاهش پیری از CO (مونوکسید کربن)که با کاهش بیان p53، p21 و p16 نشان داده شده است، پس از افزودن مهارکننده های اتوفاژی وجود نداشت (شکل 4D). به طور مشابه، تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس نشان داد که مهارکننده‌های اتوفاژی کاهش سلول‌های p{4}} و p{5} مثبت توسط CO را مسدود می‌کنند. (مونوکسید کربن)در HK-2 (شکل 4印) و HPC (شکل 4F). علاوه بر این، سکوت Atg7 (شکل 4G) اثرات محافظتی CO را مسدود کرد. (مونوکسید کربن)، با افزایش سلول‌های SA{0}}گالت و کاهش سلول‌های EdU* در HK-2 نشان داده شده است (شکل 4H). نتایج فوق الذکر نشان داد که CO (مونوکسید کربن)با بهبود اتوفاژی، پیری را سرکوب کرد.

3.5|اتوفاژی فعال ممکن است SASP را در DN تخریب کند (نفروپاتی دیابتی)موش

ما بیشتر رابطه خاص بین اتوفاژی و پیری را بررسی کردیم. تحقیقات نشان داد که اتوفاژی با تجزیه انتخابی GATA4 که به طور مثبت NF-KB را تنظیم کرد تا SASP را آزاد کند، پیری را کاهش داد. (نفروپاتی دیابتی)گروه (شکل 2D)، و بیان و جابجایی هسته ای p65 افزایش یافت (شکل 5A). با این حال، سطح پروتئین GATA4 بدون تغییر باقی ماند، که نشان می دهد GATA4 ممکن است واسطه تولید SASP در حالت گلوکز بالا نباشد (شکل 5B). علاوه بر این، مطالعات نشان داد که محفظه جفت فضایی TOR-اتوفاژی (TASCC) تشکیل شده توسط ترکیب mTOR، اتوفاگوزوم دیررس، و لیزوزوم، پیری را با افزایش ترشح SASP تسریع می‌کند. و LAMP2 که نشان دهنده تشکیل ناموفق TASCC در کلیه ها است (شکل 5C).

همانطور که می دانیم، اتوفاژی در تخریب اجزای سیتوزولی عمل می کند که عمدتاً توسط اتولیزوزوم ایجاد شده از ادغام اتوفاگوزوم و لیزوزوم انجام می شود. گزارش شده است که اتوفاژی ترشح IL-1 را با تخریب pro-IL-1 در ماکروفاژهای تحریک شده با LPS کاهش می‌دهد. جالب توجه است، ما متوجه شدیم که IL-1 (سبز) در یک محل قرار گرفته است. با LC3 puncta (قرمز) و LAMP2 (صورتی) در CON و DN (نفروپاتی دیابتی)به علاوه CO (مونوکسید کربن)گروه ها (شکل 5D، فلش قرمز)، نشان دهنده تقاطع بین SASP و تخریب اتوفاژی است. به طور مشابه، در مقایسه با DN (نفروپاتی دیابتی)گروه، سایر سایتوکاین‌های SASP از جمله IL{0}}، TGF- و VEGF نیز دارای هم‌محلی متوسط ​​اما آشکار با LC3 puncta و LAMP2 در CON و DN به علاوه CO بودند. (مونوکسید کربن)گروه‌ها (شکل 5E-G، فلش قرمز)، که در میان آن‌ها VEGF با اتولیزوزوم‌ها به وضوح هم‌زمان شده است (شکل 5G). با این حال، رنگ آمیزی زرد همپوشانی در DN (نفروپاتی دیابتی)گروه نشان داد که SASP فقط با نقطه LC3 قرار دارد (شکل 5D-G، فلش سفید). علاوه بر این، سطح پروتئین VEGF در HPC پس از افزودن آگونیست های اتوفاژی (ABT737 و راپامایسین) یا CORM اندازه گیری شد. اگرچه تفاوت معنی داری در سطح پروتئین کل VEGF وجود نداشت (شکل 5H)، وجود هر دو آگونیست اتوفاژی و CO (مونوکسید کربن)به طور قابل توجهی آزادسازی VEGF در HPC ناشی از HG را کاهش داد (شکل 5I, J). روی هم رفته، این نتایج نشان داد که مقداری از SASP از طریق اتوفاژی تخریب می‌شود.

شکل 4 CO (مونوکسید کربن)از طریق بهبود اتوفاژی در شرایط آزمایشگاهی، پیری را کاهش داد. HBZY-1، HPC و HK-2 با HG، CORM-2 و مهارکننده‌های اتوفاژی (WORT: 200nM و CQ: 5 میکرومول در لیتر) تحت درمان قرار گرفتند.

A، رنگ آمیزی و سلول های مثبت SA- -gal در 3 نوع سلول کلیوی (n=3). نوار مقیاس: 25 میکرومتر.

B، C، تکثیر سلولی با رنگ‌آمیزی EdU در HBZY-1 و HK-2 و کمیت نسبت سلول‌های مثبت (n=3) ارزیابی شد. نوار مقیاس: 50 میکرومتر.

D، بیان پروتئین مرتبط با پیری (p53، p16 و p21) در HBZY-1 (n=5).

E، F، تصاویر ایمونوفلورسانس نماینده p53 و p16 و کمی سازی نسبت سلول های مثبت در HK-2 و HPC (n=3). نوار مقیاس: 50 میکرومتر.

G، سطح بیان پروتئین Atg7 در HK{1}} با siRNA خاموش شد (سه دنباله).

H، تصاویری از SA{0}}gal (نوار مقیاس: 50 میکرومتر) و رنگ‌آمیزی EdU (نوار مقیاس: 25 میکرومتر)، و کمی‌سازی نسبت سلول‌های مثبت در HK-2 (n {{4) }}). *P <.05، **p=""><.01، ***p=""><>

3.6|CO (مونوکسید کربن)اتوفاژی را تا حدی با جدا کردن کمپلکس Beclin-1-Bcl-2 فعال کرد

گزارش شده است که جداسازی کمپلکس Beclin-1-Bcl-2 باعث بهبود اتوفاژی و همچنین جلوگیری از پیری زودرس از جمله تغییرات کلیوی مرتبط با سن می‌شود.21 علاوه بر این، CO (مونوکسید کربن)اتوفاژی را از طریق Beclin{0}} در موش‌های سپسیس فعال کرد. (مونوکسید کربن). نتایج هم‌رسوب ایمنی نشان داد که CO (مونوکسید کربن)کاهش اتصال Beclin-1-Bcl-2 در DN (نفروپاتی دیابتی) موش ها (شکل 6 الف). علاوه بر این، در مقایسه با درمان HG و CO (مونوکسید کربن)استفاده ترکیبی از HG، CO (مونوکسید کربن)و عامل تفکیک پیچیده Beclin-1-Bcl-2 ABT737 اتوفاژی HBZY-1 را بیشتر فعال کرد، همانطور که LAMP2 بدون تغییر نشان داد، p62 را کاهش داد و نسبت LC3ll/LC3l را افزایش داد (شکل 6B). علاوه بر این، نتایج نشان داد که استفاده ترکیبی از CO (مونوکسید کربن)و ABT737 بیان p53،p21 و p16 را در HBZY{5}} (شکل 6C) کاهش داد و سلول SA{7}}گالت را در HBZY-1، HK{{9} کاهش داد. }، و HPC (شکل 6D)، که نشان می دهد ABT737 اثر ضد پیری CO را افزایش می دهد. (مونوکسید کربن). این مشاهدات نشان داد که CO (مونوکسید کربن)می تواند اتوفاژی را با جدا کردن کمپلکس Beclin-1-Bcl-2 برای کاهش پیری فعال کند.

برای قسمت Ⅱ اینجا را کلیک کنید