سلول های بینابینی کلیه فاگوسیت زا هستند و اشرشیاکلی اروپاتوژن داخلی شده را اسیدی می کنند

edmund.chen@wecistanche.com

کلیهسلول های intercalated در هموستاز اسید-باز از طریق بیان ATPase واکوئولی درگیر هستند. در اینجا ما شش زیرگروه سلولی انسانی را گزارش می‌کنیم، از جمله سلول‌های ترکیبی اصلی ترکیبی شناسایی‌شده از رونویسی سلول‌های تک سلولی. بلوغ فاگوزوم یک فرآیند بیولوژیکی است که رتبه آنالیز مسیر بیولوژیکی را به دنبال قرار گرفتن در معرض اشریشیاکلی اروپاتوژنیک در دو زیرگروه سلولی افزایش می‌دهد. تجسم میکروسکوپ کانفوکال زمان واقعی موشکلیهلوله‌های پرفیوژن با پروتئین فلورسنت سبز بیان‌کننده Escherichia coli یا pHrodo Green E. coli BioParticles نشان می‌دهد که سلول‌های درون‌آمیزی به طور فعال باکتری‌ها را فاگوسیتوز می‌کنند و سپس فاگولیزوزوم‌ها را اسیدی می‌کنند. علاوه بر این، سلول های intercalated بیان ATPase واکوئولی را به دنبال UTI تجربی در داخل بدن افزایش داده اند. در مجموع، سلول‌های درون‌آمیزی یک پاسخ رونویسی را نشان می‌دهند که منجر به این می‌شودکلیه هادفاع، باکتری ها را می بلعد و باکتری های درونی شده را اسیدی می کند. سلول های بینابینی نشان دهنده یک سلول اپیتلیال با ویژگی های فاگوسیت های حرفه ای مانند ماکروفاژها هستند.

کلید واژه ها:بیماری کلیه، بافت کلیه، سلول های کلیه، کلیه کلیه

لوله جمع‌آوری کلیه محل پایانی تنظیم اسید-باز است. لوله جمع‌آوری از سلول‌های اصلی و سلول‌های درون‌پیچیده (ICs) تشکیل شده است. سلول های اصلی (PCs) واسطه جذب نمک و آب هستند و با سیتوپلاسمی آکواپورین 2 (AQP2) 2 مشخص می شوند. IC ها به حفظ هموستاز اسید- باز کمک می کنند و دارای سه زیرگروه توصیف شده، نوع A (A-IC)، نوع B (B-IC) و nonA-nonB 2،3 هستند. A-IC ها پروتون ها را از طریق H-ATPase واکوئولی آپیکال (V-ATPase) ترشح می کنند و بی کربنات را از طریق ناقل کلرید/بی کربنات (Cl-/HCO 3)، تبادل آنیون 1 (AE1/band 3/SLC4A1) 1،4 بازسازی می کنند. B-IC ها HCO3- را از طریق یک انتقال دهنده Cl-/HCO3 آپیکال، پندرین (SLC26A4) ترشح می کنند و V-ATPase 2،3 قاعده جانبی را بیان می کنند. آی سی های nonA-nonB جوندگان دارای pendrin آپیکال و V-ATPase هستند، اما AE1 ندارند، و در مجرای جمع کننده و لوله اتصال (CNT) شناسایی شده اند. شواهد فزاینده ای از نقش ایمنی ذاتی IC ها همراه با عملکرد سنتی آنها در تنظیم pH حمایت می کند. اول، اکثریت ده بیمار غیر مرتبط با دیستالکلیهاسیدوز توبولار، وضعیتی که با اختلال عملکرد IC مشخص می شود، گزارش شده است که سابقه UTI دارد 5 . دوم، اشرشیاکلی اوروپاتوژنیک (UPEC)، ارگانیسمی که در 70 درصد پیلو نفریت حاد در مردان و 80 درصد در زنان جدا شده است، به طور انتخابی در سیتوپلاسم ICs 6،7 موضعی می شود. سوم، ما شناسایی کردیم که IC ها پپتیدهای ضد میکروبی (AMPs) مانند ریبونوکلئاز 7 (RNASE7) 8-11 را بیان می کنند. این AMPها در ابتدا و/یا در پاسخ به عفونت فعالیت مستقیمی در برابر طیف وسیعی از پاتوژن‌ها از جمله باکتری‌ها دارند. چهارم، ما و دیگران به طور مستقل گزارش کرده‌ایم که موش‌هایی با رشد غیرطبیعی IC حساسیت به عفونت‌های دستگاه ادراری (UTIs) و/یا پیلونفریت را افزایش داده‌اند. پنجم، IC ها هم التهاب را حس می کنند و هم التهاب را واسطه می کنند 14 . در آخر، ما بیان ژن ایمنی ذاتی را در IC های جدا شده موش 15،16 نشان داده ایم.

سیستانچ عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

درک اینکه چگونه آی سی ها از دستگاه ادراری در برابر عفونت دفاع می کنند مهم است زیرا UTIs اغلب با آن مواجه می شوند. بیش از 50 درصد از زنان در طول زندگی خود عفونت ادراری را تجربه می کنند و عفونت های ادراری 1 تا 6 درصد از کل ویزیت های پزشکی را تشکیل می دهند 17 . وقتی باکتری ها به سمت بالا می روندکلیه هامنجر به پیلونفریت، عوارض بالقوه شامل فشار خون بالا، مزمن استبیماری کلیویو اوروسپسیس 18،19. تخمین زده می شود که سالانه 250،{3}} مورد پیلونفریت در ایالات متحده رخ می دهد 17 . مقاومت چند دارویی به عنوان یک چالش حیاتی در مورد درمان عفونت های ادراری و سایر عفونت ها در حال ظهور است 20 . بنابراین، مکانیسم‌هایی که ICها برای دفاع در برابر اوروپاتوژن‌های صعودی استفاده می‌کنند ممکن است اهداف درمانی باشند که می‌توان از آنها برای توسعه استفاده کرد.کلیه-درمان پیلونفریت خاص از آنجا که اکثر مطالعات IC شامل مدل های حیوانی است، درک بهتر IC های انسانی برای هدایت مطالعات علوم پایه به سمت بهبود مراقبت های بالینی مورد نیاز است.

زیراکلیهیک اندام پیچیده است، تفسیر پروفایل های mRNA ممکن است دشوار باشد. به عنوان مثال، نفرون دارای تخصص منطقه ای با بخش های لوله ای متمایز و زیرگروه های سلولی است. راکلیهحاوی سلول های اندوتلیال، اپیتلیال، بینابینی و التهابی جذب شده است که همگی دارای عملکردهای بیولوژیکی متمایز و الگوهای بیان ژن هستند. توالی یابی RNA تک سلولی (scRNA-seq) نشان دهنده یک روش به سرعت در حال پیشرفت برای شناسایی و مشخصات انواع سلول های متمایز در ابتدا یا در پاسخ به عوامل استرس زا است 21 . در اینجا، ما با استفاده از فناوری scRNA-seq آن انسان را نشان می‌دهیمکلیهآی سی ها از شش زیر مجموعه مختلف تشکیل شده اند که شامل سه آی سی A-IC، یک IC-PC هیبریدی، یک آی سی nonA-nonB و یک آی سی B-IC می باشد. تجزیه و تحلیل سرعت RNA تغییر رونویسی را از رایانه های شخصی به سمت زیر مجموعه های A-IC در مواجهه با UPEC نشان داد. تجزیه و تحلیل مسیر نبوغ بلوغ فاگوزوم را به عنوان مسیر بیولوژیکی کلیدی در یک زیر مجموعه A-IC در مواجهه با UPEC نشان داد. در این مسیر، V-ATPases اجزای کلیدی درگیر هستند. ما از میکروسکوپ داخل حیاتی برای تجسم جذب UPEC در داخل بدن توسط IC ها استفاده کردیم و اسیدی شدن UPEC درونی در این IC ها را تایید کردیم. در نهایت، یک مدل UTI موش افزایش بیان mRNA V-ATPase (Atp6v1b1) را نشان داد. این مطالعه پایه ای را برای کشف و دستکاری درمانی سلول های اپیتلیال بیان کننده V-ATPase به عنوان فاگوسیت های باکتریایی فراهم می کند.

نتایج

IC های انسانی را می توان از طریق مرتب سازی سلول های فعال شده با مغناطیسی (MACS) با مهره های مغناطیسی پوشش داده شده با گیرنده فاکتور رشد سلول های بنیادی/مست (CD117/c-KIT) غنی کرد. انسانکلیهبافت، در درجه اول از حاشیه طبیعیکلیهبرداشتن انبوه، به قطعات 2-4- میلی متری تشریح شد و سپس توسط شبکه بافت انسانی تعاونی [https://www.chtn.org] به آزمایشگاه ما در محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) روی یخ فرستاده شد. ما c-KIT را به عنوان نشانگر سطح سلولی برای مرتب سازی IC های انسانی ارزیابی کردیم زیرا c-KIT برای این منظور در موش ها با موفقیت استفاده شده است. بیان c-KIT بومی سازی شده در IC های انسانی بر اساس این یافته که c-KIT و نشانگر IC انسانی V-ATPase، زیرواحد B1 (ژن ATP6V1B1)، سلول های مشابهی را در انسان نشان می دهند.کلیهبخش (شکل 1 تکمیلی) 22،23. پس از مرتب سازی مغناطیسی که شامل حذف CD45 به علاوه سلول های ایمنی و سلول های مرده بود. غنی‌سازی IC‌های فرضی با c-KIT مثبت با بیان mRNA ATP6V1B1 نشان داده شد که 8-{11}} برابر در c-Kit مثبت در مقایسه با سلول‌های c-KIT منفی افزایش یافت. هر دو SLC4A1 و SLC26A4 به طور متغیر در IC ها غنی شدند که نشان می دهد غنی سازی A-IC و/یا B-IC با استفاده از این روش امکان پذیر است (شکل تکمیلی 2). پیشینه بافت کلیه مورد استفاده در این مطالعه در جدول تکمیلی 1 ارائه شده است.

تجزیه و تحلیل خوشه‌ای یکپارچه شش زیرگروه IC را شناسایی کرد.ScRNA-seq در سال 1861 جدا شدکلیهسلول هایی که برای IC ها همانطور که در بالا توضیح داده شد غنی شده بودند. IC های غنی شده از حاشیه های معمولی یک تک به دست آمدکلیهبرداشتن دسته جمعی فیلتر کنترل کیفیت (QC) توسط 859 سلول در معرض UPEC در شرایط آزمایشگاهی به مدت 1 ساعت و 1002 سلول در معرض سالین در شرایط آزمایشگاهی برای 1 ساعت عبور داده شد. تجزیه و تحلیل عملکرد Seurat 12 خوشه را در آماده سازی سلول مرتب شده شناسایی کرد (شکل 1a). نه نشانگر حفظ شده در هر خوشه در شکل های تکمیلی ارائه شده است. 3-14. به طور کلی، زیرگروه های IC 1066 (57 درصد) از سلول های 1861 را تشکیل می دهند. شش تا از خوشه ها زیرگروه های IC را نشان می دادند. به طور خاص، ما سه نوع A-IC، یک B-IC، یک nonA-nonB-IC، و یک زیرگروه PC-IC هیبریدی پیدا کردیم.کلیهنامگذاری سلولهای اپیتلیال توصیه شده توسط چن و همکارانش، سازندگان حفاظت شده که قبلاً گزارش شده است نشانگرهای نوع سلولی هستند یا نشانگرهای حفظ شده ای که یکی از 12 خوشه را از سایرین متمایز می کند، برای اختصاص یک نوع سلول به هر خوشه استفاده شد (جدول تکمیلی 2). ، شکل 1b، c، شکل 2) 24-28.

زیرگروه A-IC و بیان پروتئین هیبریدی PC-IC با نتایج scRNA-seq ارتباط دارد. ما یافته‌های کلیدی scRNA-seq را تأیید کردیم، به‌ویژه اینکه SLC8A1 (همچنین به عنوان مبدل Na plus /Ca به اضافه 1 (NCX1) نیز شناخته می‌شود) نشانگری برای PC–ICهای هیبریدی است و آن پروتئین شوک حرارتی خانواده A (Hsp70) عضو 1A (HSPA1A) همراه با پاسخ رشد اولیه 1 (EGR1) نشانگرهایی هستند که می توانند زیرگروه های A-IC را متمایز کنند (شکل 3). چون از حاشیه های معمولی استفاده کردیمکلیهبرداشتن سرطان، ما SLC8A1، HSPA1A و EGR1 خود را تأیید کردیمکلیهالگوهای بیان با آنچه در حالت عادی دیده می شود سازگار بودکلیهبافت از اطلس پروتئین انسانی موجود در http://www.proteinatlas.org (تصویر تکمیلی 15) 29

جمع آوری پروفایل های نشانگر زیرنوع سلول مجرای که قبلاً در موش نشان داده شده بودکلیهسلول ها تا حد زیادی در انسان دست نخورده باقی می مانندکلیهسلول ها. از آنجایی که مهم است که یافته‌های مدل موش آینده را برای پاتوفیزیولوژی انسان مورد بررسی قرار دهیم، ما بیان IC انسانی نشانگرهای سلول مجرای جمع‌آوری موش را که قبلاً در مطالعات scRNA-seq انجام شده توسط چن و همکاران شناسایی شده بود، ارزیابی کردیم. 22 و رانسیک و همکاران. 30 . نمودار نقطه‌ای از نتایج در شکل 4 ارائه شده است. نشانگرهای نوع سلول مجرای جمع‌آوری کننده موش عمدتاً در سلول‌های مجرای جمع‌آوری انسان حفظ می‌شوند.

A-IC زیرگروه A در درصد نسبی با 1 ساعت قرار گرفتن در معرض UPEC افزایش می یابد. درصد سلول‌های درون خوشه‌ها بین نوع مواجهه سازگار بود به استثنای A-IC زیرگروه A/Cluster 0 که از 16.2 به 20.1 درصد افزایش یافت و زیرگروه A-IC C/cluster 5 که از 9.4 کاهش یافت. به 6.6 درصد، با مواجهه با نمک در مقابل UPEC، P =0.03 (جدول 1).

سلول های PC-IC هیبریدی در پاسخ به 1 ساعت قرار گرفتن در معرض UPEC، سرعت RNA خود را از رایانه های شخصی دور و به سمت A-IC تغییر می دهند. فراوانی نسبی پیش-mRNA های بدون پیوند اخیراً رونویسی شده در مقابل mRNA پیوند شده بالغ، می تواند برای محاسبه تغییر در فراوانی mRNA، که سرعت mRNA 31 نامیده می شود، استفاده شود. سرعت mRNA مثبت در مطالعات تک سلولی نشان می‌دهد که ژن‌ها در حال تنظیم مثبت هستند، در حالی که سرعت mRNA منفی به این معنی است که ژن‌ها کاهش می‌یابند. جهت سرعت RNA استنباط می کند که یک سلول دارای مسیر بیان mRNA به سمت سلول دیگری است 31،32. سرعت mRNA در پاسخ به قرار گرفتن در معرض UPEC در شکل 5 ارائه شده است. نکته مهم این است که PC-ICهای هیبریدی سرعت RNA خود را از PCها دور کرده و در پاسخ به UPEC به سمت ICها تغییر می دهند. علاوه بر این، IC ها فعالیت رونویسی خود را حفظ می کنند، در حالی که فعالیت رونویسی در سایر موارد حداقل می شودکلیهانواع سلولی

نمایه ایمنی ذاتی کلیه تغییرات اولیه بیان تک سلولی را به دنبال 1 ساعت قرار گرفتن در معرض UPEC نشان می دهد.الگوهای بیان scRNA-seq ژن‌های ایمنی ذاتی منتخب به دنبال قرار گرفتن در معرض UPEC در برابر سالین برای 1 ساعت در شکل‌های تکمیلی ارائه شده‌اند. 16 و 17. یافته های کلیدی عبارتند از بیان بالای AMP آدرنو مدولین (ADM) در زیرگروه های A-IC A و B، PC-IC هیبریدی و B-IC. رایانه‌های شخصی در ابتدا آدرنومدولین را بیان نمی‌کنند، اما در پاسخ به قرار گرفتن در معرض UPEC بیان را به طور قابل‌توجهی افزایش می‌دهند. بیان SH{8} حاوی پروتئین (CISH) و مانعی برای بیان فاکتور خودادغام 1 (BANF1) القایی با سیتوکین به طور قابل توجهی در IC های غیرA-nonB به دنبال قرار گرفتن در معرض UPEC القا می شود. اینترلوکین 18 (IL18)، گالکتین 3 (LGALS3)، بتا دفنسین 1 (DEFB1) و مبدل سیگنال CD24 لیپوکالین 2 / لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (LCN2/NGAL) فقط شناسایی شد.

در PC-ICهای هیبریدی و تنها بیان mRNA 4 گیرنده شبه عوارض حداقل وجود داشت. ما بیان ریبونوکلئاز 7 (RNASE7) را در scRNA-seq شناسایی نکردیم. ما بیان mRNA RNASE7 را در IC و غیر IC ادغام شده به صورت مغناطیسی ارزیابی کردیمکلیهسلول ها. بیان mRNA RNASE7 در IC ها از یک از چهار مورد شناسایی شدکلیه ها(شکل تکمیلی 18).

فرآیند بیولوژیکی بلوغ فاگوزوم با IC هایی که به مدت 1 ساعت در معرض UPEC قرار می گیرند همراه است.ده مسیر بیولوژیکی پیشرو مرتبط با هر خوشه با مقدار p که توسط تجزیه و تحلیل مسیر هوشمندی تعیین شد رتبه‌بندی شدند. سه خوشه اختصاص داده شده به مجرای جمع آوری A-IC زیر گروه A/cluster 0، A-IC زیرگروه B/ cluster 3 و A-IC زیرنوع C/cluster 5 دارای فرآیندهای مسیر بیولوژیکی متفاوتی به دنبال قرار گرفتن در معرض UPEC در مقایسه با سالین بودند (شکل 6a-c). بلوغ فاگوزوم بالاترین رتبه در سلول‌های در معرض UPEC و سالین در زیرگروه C/Cluster 5 A-IC بود، از جایگاه دوم به اول در زیرگروه A/Cluster A-IC 0 و از جایگاه چهارم به سوم بالاترین مکان منتقل شد. در A-IC زیرگروه B/ خوشه 3. هیچ یک از زیرگروه های سلول مجرای جمع کننده باقیمانده (شکل 19 تکمیلی) ده مسیر مرتبط را نداشتند که پس از قرار گرفتن در معرض UPEC در مقایسه با سالین متفاوت بودند. نمایه بیان ژنی که منجر به رتبه بندی بلوغ فاگوزوم برای A-IC زیرگروه A/cluster 0 در جدول تکمیلی 3 ارائه شده است.

بیان mRNA IC Atp6v1b1 در پاسخ به افزایش می یابدپیلونفریت تجربی در داخل بدنمسیر بلوغ فاگوزوم Ingenuity، V-ATPase را به عنوان درگیر در IC ها برجسته کرد (جدول تکمیلی 3). برای تعیین اینکه آیا V-ATPase با قرار گرفتن در معرض UPEC فعال می شود، از یک مدل UTI موش استفاده کردیم. یک ساعت پس از تلقیح UPEC از طریق مجرای ادراری در مقابل موش های "IC reporter" که دارای بیان tdTomato (tdT، یک نوع پروتئین فلورسنت قرمز) در IC ها بودند، معدوم شدند و IC ها از جدا شده غنی شدند.سلول های کلیه. IC های غنی شده بیان mRNA ژن Atp6v1b1 بالاتری در موش های با تلقیح UPEC در مقایسه با شاهد سالین داشتند (شکل 6d).

IC ها UPEC را در داخل بدن فاگوسیت می کنند.ما روشی را برای پرفیوژن یک تک توسعه دادیمکلیهلوله با UPEC در یک موش زنده با دست نخوردهکلیهتجمعات UPEC بیانگر پروتئین فلورسنت سبز (GFP) که در یک مجرای لوله کلیه موشهای "IC reporter" ریزپرفیوژن شده اند، در حال جریان در لوله ها، به طور انتخابی به سطح مجرا چسبیده و توسط IC ها (شکل 7) در طول میکروسکوپ داخل حیاتی، مشاهده شد.

IC ها UPEC حاوی فاگولیزوزوم ها را در داخل بدن اسیدی می کنند ودرونکشتگاهی.ما همچنین لوله‌هایی را با ذرات زیستی pHrodo Green E. coli پرفیوژن کردیم که فقط وقتی اسیدی می‌شوند فلورسانس می‌شوند. جذب و فلورسانس این ذرات زیستی تنها در طول میکروسکوپ داخل حیاتی در IC ها مشاهده شد (شکل 8). تجزیه و تحلیل تقسیم بندی ایماریس نشان داد که فلورسانس سبز به طور قابل توجهی در طول زمان در tdT به علاوه IC ها در 2 لوله پرفیوژن شده با PHrodo Green E. coli BioParticles در مقایسه با یک لوله کنترل tdT به علاوه افزایش یافته است (شکل 9a, b). هنگامی که فلورسانس بر اساس سلولی ارزیابی شد، سلول‌های 12/16 (75 درصد) tdT به علاوه افزایش در فلورسانس سبز را در طول زمان به دنبال پرفیوژن لوله‌ای با ذرات زیستی pHrodo Green E. coli نشان دادند (شکل 9b). نتایج رگرسیون خطی از هر سلول در جدول تکمیلی 4 ارائه شده است. یافته‌های تصویربرداری زنده in vivo از فاگوسیتوز و اسیدی شدن ذرات زیستی PHrodo Green E. coli توسط ICs با استفاده از روش فلوسیتومتری in vitro تأیید شد. موشسلول کلیهتعلیق از موش های "گزارشگر IC" که در آن IC ها (CD45 - tdT پلاس) به طور درون زا tdT را بیان می کنند در مقابل سلول ها با محیط به تنهایی در معرض pHrodo Green E. coli BioParticles قرار گرفتند. CD45 به علاوه سلول های ایمنی ساکن در سوسپانسیون سلولی به عنوان یک کنترل مثبت و سلول های CD45 - tdT - (غیر ICs) به عنوان یک کنترل منفی دریچه شدند. مقایسه رسانه به تنهایی با

قرار گرفتن در معرض ذرات زیستی، فلورسانس سبز نشان دهنده جذب و اسیدی شدن ذرات زیستی از {{0}}.7 به 62.8 درصد از سلول های CD45 پلاس افزایش یافته است. این یافته جذب باکتریایی مورد انتظار توسط فاگوسیت های حرفه ای مانند نوتروفیل ها را نشان می دهد. جالب توجه است که 22.2 درصد از IC ها جذب ذرات زیستی سبز را داشتند در مقایسه با 5.6 ​​درصد از غیر IC ها (شکل تکمیلی 20)، کنترل رسانه ها در 0.7 درصد از IC ها و 0 درصد از غیر IC ها جذب داشتند.

بحث

مطالعه IC ها، به ویژه در انسان، دشوار است، زیرا تنها 7 درصد از آنها را تشکیل می دهندکلیهسلول ها از طیفی از زیرگروه ها تشکیل شده اند و فنوتیپ خود را در کشت حفظ نمی کنند 33 . چن و همکاران 22 تجزیه و تحلیل تک سلولی روی موش را گزارش کردندکلیهسلول ها و لیک و همکاران یک خط لوله توالی یابی RNA تک هسته ای بر روی انسان گزارش کردکلیهسلول های 34،35. این مطالعات دو زیرگروه A-IC را شناسایی کردند. در اینجا، ما روشی را برای انجام توالی یابی تک سلولی بر روی آی سی های انسانی غنی شده توسعه داده ایم. ما به جای توالی یابی همه، آی سی های قابل دوام را غنی کردیمکلیهسلول‌ها اجازه می‌دهند تمرکز بیشتری روی این نوع سلول داشته باشند. یافته‌های اولیه ما عبارت بودند از (الف) شناسایی این که PC-ICهای هیبریدی می‌توانند جهت سرعت RNA خود را در پاسخ به قرار گرفتن در معرض UPEC به سمت A-IC تغییر دهند، (ب) حداقل سه زیرگروه A-IC وجود دارد و نسبی آنها فرکانس ها می توانند در پاسخ به قرار گرفتن در معرض UPEC تغییر کنند، (ج) بلوغ فاگوزوم یک مسیر بیولوژیکی پیشرو در چندین زیرگروه A-IC است و می تواند اهمیت نسبی را با قرار گرفتن در معرض UPEC افزایش دهد، و (د) IC ها در طی تصویربرداری زنده، UPEC را فاگوسیتوز و اسیدی می کنند. موش.

IC ها در پاسخ به اسیدوز با معکوس کردن قطبیت خود متمایز می شوند 36،37. گزارش شده است که IC ها از سلول های بیان کننده AQP2- 38 ایجاد می شوند. در سال 2017، چن و همکارانش سلول‌های مضاعف مثبتی را شناسایی کردند که Aqp2 را همراه با Slc4a1 یا Slc26a4 با پروفایل تک سلولی موش بیان می‌کردند. این یافته ها توسط پارک و همکارانش در سال 22،35 تایید شد. در سال 2019، ما با برچسب گذاری پروتئین و mRNA نشان دادیم که PC-IC های هیبریدی وجود دارند 15. به طور خاص، 9 درصد از ICهای موش تعریف شده با نشان‌گذاری ایمونولوژی فلورسنت V-ATPase B1 نیز mRNA ژن Aqp2 را که توسط هیبریداسیون درجا فلورسنت تعریف شده است، بیان کردند. مطالعه حاضر جمعیتی از انسان را تعریف کردکلیهسلول‌های مجرای جمع‌آوری که AQP2، ATP6V1G3 و SLC4A1 مطابق با PC–IC هیبریدی را بیان می‌کنند. در نمودارهای tSNE و UMAP، این سلول‌های ترکیبی در نزدیک‌ترین نقطه به رایانه‌های شخصی قرار گرفتند، اما از رایانه‌های شخصی سنتی بر اساس بیان نشانگر IC متمایز بودند. بیان SLC8A1 با این نوع سلول متمایز بود. جالب توجه است که SLC8A1 به شدت با انتقال اپیتلیال به مزانشیمی درگیر است. به طور خاص، عدم وجود SLC8A1 فنوتیپ‌های سلول‌های اپیتلیال را از طریق بی‌ثباتی E-cadherin به واسطه کاتنین تغییر می‌دهد. در اینجا، ما نشان می دهیم که IC ها در پاسخ به قرار گرفتن در معرض uropathogen متمایز می شوند. سلول‌های PC-IC هیبریدی سرعت RNA خود را تغییر می‌دهند، مشتق زمانی بیان mRNA، از رایانه‌های شخصی دور می‌شوند و در پاسخ به UPEC به سمت A-IC می‌روند. در موش، Ransick و همکاران. 30 بیان Slc8a1 را عمدتاً در توبول پیچیده دیستال و سلول‌های شبیه رایانه‌های شخصی در لوله اتصال شناسایی کردند. در حال ارزیابی تصاویر میکروکپی هم کانونی ماکلیهبیان SLC8A1، سلول‌های جدا شده‌ای را یافتیم که SLC8A1 را در لوله‌های AQP{4} مثبت بیان می‌کنند (مثلاً مجاری جمع‌آوری یا لوله‌های اتصال). ما همچنین لوله‌های AQP{5}منفی را شناسایی کردیم که در آن‌ها اکثر سلول‌ها SLC8A1 را بیان می‌کنند، که به طور بالقوه با بیان Slc8a1 لوله پیچیده دیستال فوق‌الذکر در موش سازگار است. برخی از زیرگروه های A-IC دارای مسیرهای بیولوژیکی پیشرو متفاوتی به دنبال قرار گرفتن در معرض UPEC هستند و زیرگروه A-IC A در فرکانس نسبی در پاسخ به UPEC افزایش یافته است. این یافته ها نشان می دهد که زیرگروه A-IC A ممکن است نشان دهنده یک نوع ایمنی ذاتی باشد. نقش SLC8A1 در تمایز IC مستلزم بررسی در مطالعات آینده است.

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

ما scRNA-seq را روی 1861 انسان انجام دادیمکلیهسلول که 1066 IC بودند. برای زمینه سازی مدل های تجربی موش به پاتوفیزیولوژی انسانی، مقایسه IC های انسان و موش مهم خواهد بود. چن و همکارانش IC های موش را با c-KIT غنی کردند و scRNA-seq 22 را انجام دادند. آنها 74 سلول را به عنوان PC، 87 سلول را به عنوان A-IC و 23 سلول را به عنوان B-ICs طبقه بندی کردند. رانسیک و همکاران 30 عدد scRNA-seq را روی 688 آی سی انجام دادند. آنها برای آی سی ها غنی نشدند، بلکه آنها را تقسیم کردندکلیهبه قشر، مدولای داخلی و مدولای خارجی برای ارزیابی تفاوت های ناحیه ای 30 . ما نشان دادیم که به نظر می‌رسد بیان نشانگر نوع سلول مجرای جمع‌آوری موش تا حد زیادی در سلول‌های مجرای جمع‌آوری انسان حفظ می‌شود. اینکه آیا موش‌ها دارای زیرگروه‌های A-IC قابل مقایسه با انسان هستند، احتمالاً به ارزیابی هدفمند تک سلولی تعداد بیشتری از IC‌های موش نیاز دارد.

ما بیان scRNA-seq IC پروتئین‌های ایمنی ذاتی مانند واسطه ایمنی و التهابی گالکتین 3 (LGALS3) و ADM را که قبلاً در ICهای جوندگان 15،40-42 گزارش کرده‌ایم، شناسایی کردیم. با این حال، برخی از پروتئین‌های ایمنی ذاتی کلیدی که قبلاً در ICها گزارش شده بودند، مانند لیپوکالین 2 (LCN2/NGAL)، RNASE7، و گیرنده شبه 4 (TLR4) بیان کمتری داشتند یا در ICهای انسانی در سطح تک سلولی مشاهده نشدند. تجزیه و تحلیل ما 6,9 . کمبود بیان LCN2/NGAL و TLR4 در ICها با آنچه در ICهای موش توسط گروه تحقیقاتی ما همراه با Ransick و همکاران گزارش شده است مطابقت دارد. 30کلیهcellexplorer/] 15. چن و همکاران 22 مقداری از بیان mRNA TLR4 و NGAL را در IC ها گزارش کردند، اما چندین برابر کمتر از رایانه های شخصی. ما IC های انسانی را برای بیان RNASE7 ارزیابی کردیم و آن را در IC ها از 1 از 4 شناسایی کردیم.کلیه ها(تصویر تکمیلی 18)، نشان می دهد که بیان آن ممکن است بسته به منطقه، نقطه زمانی و شرایط فیزیولوژیکی متناوب باشد. بیان CISH، که در IC های غیر A غیر B در پاسخ به UPEC القا می شود، نشان داده شده است که پاسخ ایمنی ذاتی به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را در ریه و طحال تنظیم می کند. IC ها باکتری ها را طی چند دقیقه فاگوسیتوز کردند و سلول های ما برای scRNA-seq برای یک زمان نسبتاً کوتاه 1 ساعته در معرض UPEC قرار گرفتند. مطالعات آینده برای تعیین اینکه آیا سایر مسیرهای IC، مانند بیان AMP یا تنظیم مرگ سلولی، در زمان‌های بعدی پس از قرار گرفتن در معرض UPEC برجسته‌تر می‌شوند، مورد نیاز است.

Phagocytosis involves the cellular uptake of particulates >0.5 میکرومتر توسط پوشش غشای پلاسمایی 44 . فاگوسیت‌های حرفه‌ای، سلول‌های ایمنی مشتق از میلوئید، از جمله ماکروفاژها، نوتروفیل‌ها و استئوکلاست‌ها، میکروب‌های مهاجم را از میکروبیوتا و سلول‌های سالم متمایز می‌کنند، هدف را در فاگوزوم فرو می‌برند، گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) تولید می‌کنند، AMPs ترشح می‌کنند و آنتی‌ژن ارائه می‌کنند. سلول های دیگر 45-49. مهم این است که اسیدی شدن قوی فاگولیزوزوم ها توسط V-ATPase ایجاد یک ریزمحیط اسیدی کافی برای کشتن بیشتر میکروب ها، مشخصه بارز فاگوسیت های حرفه ای 48،50 است. برای مثال، مهار V-ATPase با بافیلومایسین A1، فعالیت باکتری‌کشی ماکروفاژ را سرکوب می‌کند. سلول های اپیتلیال خاصی میکروب ها را فاگوسیتوز می کنند اما در کشتن باکتری ها نسبت به فاگوسیت های حرفه ای کارایی کمتری دارند و به عنوان فاگوسیت های غیرحرفه ای توصیف شده اند. IC ها نشان دهنده یک دودمان اپیتلیالی هستند که دارای فاگوسیتوز و قابلیت های ارائه آنتی ژن هستند (شکل 6-9) همراه با بیان قوی AMP و میتوکندری سخاوتمندانه برای تولید ROS. بنابراین، به نظر می رسد که IC ها پتانسیل کشتن باکتریایی قابل مقایسه با ماکروفاژها نسبت به فاگوسیت های غیرحرفه ای فوق الذکر 8،53-55 دارند. قبلاً ثابت شده بود که A-ICها قادر به نرخ بالای اندوسیتوز آپیکال دکستران در وزیکول‌های سیتوپلاسمی هستند. ما حدس می زنیم که فاگوسیتوز IC UPEC گسترش ویژگی های مشترک با ماکروفاژها است، از جمله بیان V-ATPase، پتانسیل ردوکس، ترشح AMP، و قابلیت های اندوسیتوز 8،16،49،57،58. اینکه آیا IC ها می توانند بقایای سلولی و باکتری های غیر از UPEC را به روشی مشابه فاگوسیت های حرفه ای فاگوسیتوز کنند، هنوز مشخص نیست.

تصویربرداری کانفوکال از تککلیهتوبولی که در داخل بدن با باکتری‌ها پرفیوژن می‌شود، روی تکنیک‌های قبلی آزمایشگاهی مانند کشت سلولی و پرفیوژن توبول‌های جدا شده گسترش می‌یابد. در اینجا، ما روشی را توسعه دادیم تا مستقیماً در موش های زنده آزمایش کنیم که آیا فاگوسیتوز یک عملکرد IC است یا خیر. میکروسکوپ داخل حیاتی امکان مطالعه پیچیده فرآیندهای سلولی پویا را در موش در حال کار فراهم می کندکلیه ها59 . استراتژی‌های گذشته برای استفاده از میکروسکوپ داخل حیاتی شامل تزریق سیستمیک رنگ‌ها یا نشانگرهای داخل حیاتی به موش‌ها برای مطالعه اندوسیتوز توبول پروگزیمال بوده است.کلیهدینامیک جریان خون و نفوذپذیری عروقی یا گلومرولی 60 . هنگامی که میکروسکوپی داخل حیاتی با تکنیک های جراحی پیچیده ترکیب می شود، ارزیابی نقاط زمانی اولیه فرآیندهای عفونی دشوار است. قبلاً، باکتری ها در لوله های پروگزیمال موش برای ارزیابی جریان خون، جذب نوتروفیل و انسداد ادراری میکروپرفیوژن شدند. اکثریت قریب به اتفاق عفونت های ادراری ناشی از پاتوژن های صعودی هستند و در ابتدا با مجرای جمع کننده 64،65 مواجه می شوند. بنابراین، ما پیشنهاد می‌کنیم که مجرای جمع‌آوری یک منطقه لوله‌ای حیاتی برای ارزیابی تعاملات میزبان و پاتوژن است. سیستم مدل intravital ما به طور موثر یک کلاسیک را بازسازی می کند

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مطالعه پرفیوژن لوله جمع آوری تک، اما در یک موش زنده با دست نخوردهکلیه،منبع خون، لنفاوی و عصبی همراه با حفظ توانایی در تعامل با سلول های ایمنی. پاتوفیزیولوژی پیلونفریت دارای تمایزات مردانه در مقابل زنانه است. برای مثال، در انسان‌ها، ماده‌ها پنج برابر بیشتر در معرض ابتلا به پیلونفریت حاد هستند، اما موش‌های نر با واسطه آندروژن، شدت پیلونفریت را افزایش می‌دهند. Ransick و همکارانش تفاوت‌های افتراقی نر و ماده را در سلول‌های لوله پروگزیمال، به ویژه در انتقال‌دهنده‌های آنیون آلی نشان دادند. IC های مرد در هر دو توالی یابی تک سلولی و مطالعات داخل حیاتی ما مورد ارزیابی قرار گرفتند. به دلیل نقش IC ها در دفاع باکتریایی ازکلیهو تعادل الکترولیت، تنوع مرتبط با جنسیت در عملکردهای IC، مانند فاگوسیتوز و بیان ژن تک سلولی، زمینه های کلیدی برای مطالعات آینده خواهد بود. این مطالعه دارای محدودیت هایی است. قرار گرفتن در معرض UPEC با آی سی های انسانی در scRNA-seq ما در شرایط آزمایشگاهی تا یک واحد بودکلیهو ممکن است در مقایسه با قرار گرفتن در معرض UPEC در داخل بدن تفاوت هایی داشته باشد. علاوه بر این، یافته های ما نشان دهنده ناحیه آناتومیکی انسان استکلیهمطالعات نمونه برداری شده و آینده با مکان های مختلف ممکن است تنوع منطقه ای داشته باشند همانطور که توسط Ransick و همکاران نشان داده شده است. 30 . IC ها 57 درصد از سلول های scRNA-seq ما را تشکیل می دهند که از 7 درصد ترکیب IC در ما غنی شده است.کلیه هادر پایه 33. نمونه ما حاوی برخی دیگر از انواع سلول های اپیتلیال و اندوتلیال بود، اما برای CD45 به علاوه سلول های ایمنی که قبل از غنی سازی IC ها مرتب شده بودند، منفی بود (شکل 1، شکل تکمیلی 1). با scRNA-seq، IC های هدف را می توان به طور جداگانه شناسایی و ارزیابی کرد. سلول های بنیادی خونساز، c-KIT را بیان می کنند، اما به احتمال زیاد نشان دهنده آن نیستندکلیهجمعیت های سلولی میلوئیدی ساکن 68. ما دیگر سلول‌های بیانگر c-KIT موجود در انسان سالم را شناسایی نکردیمکلیه هامانند سلول های استرومایی/تلوسیت ها 69. برخی از حلقه های جدا شده از مثبت بودن c-KIT هنله و لوله پروگزیمال قبلاً در مورد گزارش شده است.کلیهایمونوهیستوشیمی مطابق با نتایج scRNA-seq ما 70