از دست دادن کاتابولیسم BCAA به واسطه فاکتور 6 کروپل مانند به آسیب کلیه در موش و انسان کمک می کند

edmund.chen@wecistanche.com

متابولیسم سلولی تغییر یافته درکلیهسلول های لوله پروگزیمال (PT) نقش مهمی در حاد بازی می کندآسیب کلیه (AKI). فاکتور رونویسی فاکتور 6 شبه کروپل (KLF6) به سرعت و قویاً در اوایل PT پس از AKI القا می شود. ما دریافتیم که ناک داون Klf6 مخصوص PT (Klf6PTKD) در برابر AKI وکلیهفیبروز در موش RNA ترکیبی و تجزیه و تحلیل توالی ایمونوپسیت کروماتین نشان داد که بیان ژن‌های کدکننده آنزیم‌های کاتابولیک اسید آمینه شاخه‌دار (BCAA) در موش‌های Klf6PTKD با KLF6 که ناحیه پروموتر این ژن‌ها را اشغال می‌کند، حفظ شد. برعکس، بیان بیش از حد القایی KLF6 بیان ژن‌های BCAA را سرکوب کرد و تشدید کرد.آسیب کلیهو فیبروز در موش در شرایط آزمایشگاهی، سلول های آسیب دیده با بیان بیش از حد KLF6 کاهش مشابهی در بیان ژن کاتابولیک BCAA داشتند و کمتر قادر به استفاده از BCAA بودند. علاوه بر این، نابودی BCKDHB، که یک زیر واحد از آنزیم محدود کننده سرعت را در کاتابولیسم BCAA کد می کند، منجر به کاهش تولید ATP شد، در حالی که درمان با تقویت کننده کاتابولیسم BCAA BT2 متابولیسم را افزایش داد. تجزیه و تحلیلعملکرد کلیهبیان ژن KLF6 و BCAA در مزمن انسانبیماری کلیویبیماران همبستگی معکوس معنی داری را بین KLF6 و هر دو نشان دادندعملکرد کلیه و بیان BCAA بنابراین، هدف قرار دادن KLF{0}}سرکوب کاتابولیسم BCAA با واسطه ممکن است به عنوان یک هدف درمانی کلیدی در AKI وکلیهفیبروز

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

مزمنبیماری کلیوی(CKD) باعث عوارض و مرگ و میر قابل توجهی می شود و شیوع آن در جمعیت بزرگسال ایالات متحده حدود 15 درصد است. CKD می تواند ناشی از حملات مکرر حاد باشدآسیب کلیه(AKI) منتسب به توهین های محیطی یا سمی یا ثانویه به سایر بیماری ها یا درمان های آنها. در اکثر موارد، توبول پروگزیمال (PT) یک محل اولیه آسیب در AKI است، زیرا فعالیت متابولیکی بالای سلول‌های PT آنها را مستعد آسیب ایسکمیک می‌کند و نقش آنها در دفع داروها و سموم مستلزم جریان آسیب بالقوه است. عوامل از طریق سلول های PT (1). یکی از این دسته از عوامل، شیمی‌درمانی‌های آسیب‌رسان به DNA هستند که در سلول‌های PT تجمع می‌کنند و باعث از دست دادن AKI و نفرون می‌شوند. پس از آسیب، سلول های PT تمایز زدایی می کنند و عوامل محلول مانند Wnt و اعضای خانواده خارپشت و سیتوکین ها را ترشح می کنند (1-4). سلول‌های PT تمایز‌زدایی‌شده زنده‌مانده می‌توانند دوباره وارد چرخه سلولی شده و برای ترمیم PT آسیب‌دیده تکثیر شوند و به دنبال آن تمایز مجدد به سلول‌های PT کاملاً عملکردی انجام شود (2). با این حال، سلول‌هایی که در عوض تحت توقف چرخه سلولی در ایست بازرسی G2/M قرار می‌گیرند، ممکن است بهبود پیدا نکنند، که منجر به آتروفی و ​​تنظیم بالا سیگنال‌های پروفیبروتیک می‌شود (5)، با تحریک تمایز فیبروبلاست‌های ساکن به میوفیبروبلاست‌هایی که پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی ترشح می‌کنند، باعث ایجاد فیبروز می‌شود. جذب سلول های ایمنی مانند ماکروفاژها و سلول های T (1).

کلید واژه ها:کلیه; آسیب حاد کلیه؛ لوله پروگزیمال؛ فاکتور رونویسی؛ آمینو اسیدهای زنجیرهای منشعب شده

علاوه بر القای مسیرهای سیگنالینگ بیماری زا، سلول های PT آسیب دیده همچنین متابولیسم سلولی را به شدت تغییر می دهند. سلول‌های PT صدمه‌نخورده به شدت به اکسیداسیون اسیدهای چرب میتوکندری، چرخه اسید تری کربوکسیلیک (TCA) و فسفوریلاسیون اکسیداتیو برای تولید ATP وابسته هستند. با این حال، در شرایط آسیب، اکسیداسیون اسیدهای چرب سرکوب می‌شود، تنها با یک تنظیم جبرانی نسبتاً بالا گلیکولیز، به طوری که سطح کلی ATP در PT آسیب دیده کاهش می‌یابد (6). علاوه بر این، مهار اکسیداسیون اسیدهای چرب در شرایط آزمایشگاهی باعث تمایز زدایی و آپوپتوز سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای شد و در شرایط in vivo بدتر شد.آسیب کلیهپس از درمان اسید فولیک (6). جالب توجه است، افزایش تنظیم اکسیداسیون اسیدهای چرب میتوکندری یا اکسیداسیون اسیدهای چرب پراکسی زومی (FAO) می تواند در برابرآسیب کلیه(6، 7)، نشان می دهد که حفظ متابولیسم سلولی ممکن است یک هدف درمانی در AKI باشد. مطالعات رونویسی در بیوپسی کلیه با CKD انسانی و همچنین پس از آسیب خونرسانی مجدد ایسکمی (IRI) در موش، متابولیسم اسیدهای چرب و همچنین متابولیسم اسیدهای آمینه نامنظم را نشان می دهد (6، 8). اگرچه نقش اکسیداسیون اسیدهای چرب PT قبلاً در AKI توضیح داده شده است، نقش متابولیسم اسید آمینه PT در AKI هنوز مورد بررسی قرار گرفته است. علاوه بر این، مکانیسم‌های آسیب PT که تا به امروز توضیح داده شده است تا حد زیادی با استفاده از مدل‌های موشی با حذف و بیان بیش از حد مولکول‌های سیگنال‌دهنده فردی مورد بررسی قرار گرفته‌اند، اما مکانیسم‌هایی که توسط آن مسیرهای جهانی، هم فیبروتیک/التهاب و هم متابولیک، و تغییر بین بهبودی طبیعی و آتروفی انجام می‌شود. در AKI تنظیم شده اند به خوبی مشخص نمی شوند.

عوامل رونویسی به دلیل توانایی آنها در تنظیم بیان چندین هدف پایین دست و تشکیل حلقه های بازخورد، به عنوان تنظیم کننده اصلی فرآیندهای بیولوژیکی اساسی عمل می کنند. در AKI، فاکتورهای رونویسی که به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته اند، مانند اعضای خانواده FOS و JUN بسیار تنظیم شده اند. مطالعات اخیر پاسخ‌های مولکولی به IRI در نمونه‌های انسانی و پروفایل ترجمه PT پس از انسداد یک طرفه حالب (UUO) در موش‌ها همچنین فاکتور رونویسی انگشت روی-انگشت Krüppel-like فاکتور 6 (KLF6) را به عنوان یک ژن پاسخ آسیب اولیه مشابه شناسایی کرد (9، 10). ). KLF ها شامل یک خانواده از فاکتورهای رونویسی انگشت روی با دامنه های اتصال به DNA ترمینال C بسیار حفاظت شده و انتهای متغیر N هستند که به طور گسترده بیان می شوند، از جمله درکلیه(11). KLF6 در فرآیندهای متعددی مانند تکثیر و تمایز سلولی، آپوپتوز، پاسخ های آسیب DNA، و عملکرد میتوکندری نقش دارد (12) و مشخص شده است که در کبد، قلب و...کلیهفیبروز، با اثرات وابسته به زمینه (13، 14). در داخلکلیهKLF6 در پودوسیت های گلومرولی بیان می شود و یک تنظیم کننده ضروری عملکرد میتوکندری در زمینه گلومرولواسکلروزیس سگمنتال کانونی (FSGS) است (15). علاوه بر بیان آن در پودوسیت های گلومرولی، KLF6 نیز به طور متغیر در PT بیان می شود، اما نقش آن در سلول های PT، چه در عملکرد طبیعی و چه پس از آسیب، شناخته نشده است. بیان بیش از حد KLF6 در سلول‌های HK{4}} منجر به یک فنوتیپ تمایز زدایی شده با کاهش E-cadherin و افزایش بیان ویمنتین و همچنین منجر به افزایش بیان پروتئین التهابی ماکروفاژ شد (16). علاوه بر این، بیان KLF6 در پاسخ به گلوکز بالا افزایش یافت و این اثر با از بین بردن TGFB1 یا درمان با آنتی‌بادی خنثی‌کننده TGF مسدود شد. درمان مستقیم با TGF{12}} همچنین بیان KLF6 را القا کرد، که نشان‌دهنده یک حلقه بازخورد مثبت احتمالی در سلول‌های HK{14}} است (16). همچنین نشان داده شده است که KLF6 در سلول های سرطانی در شرایط آزمایشگاهی توسط دوزهای ساب آپوپتوتیک داروی شیمی درمانی سیس پلاتین آسیب رسان به DNA القا می شود (17). به منظور تعیین نقش PT KLF6 در پاسخ به آسیب DNA، ما از سم طبیعی آریستولوکیک اسید I (AAI) استفاده کردیم. نفروپاتی مرتبط با AAI از نظر بالینی مرتبط است (18) و سمیت AAI برای PT بسیار خاص است، بنابراین امکان مطالعه نقش PT KLF6 به طور خاص در پاسخ به آسیب PT را فراهم می کند. علاوه بر این، AAI به طور قابل اعتمادی باعث ایجاد AKI و انتقال به فیبروز در موش ها می شود، برخلاف اکثر رژیم های سیس پلاتین (19). AAI از طریق انتقال دهنده های آنیون آلی پایه جانبی (OATs) 1 تا 3 وارد سلول های PT می شود و دارای اثرات ژنوتوکسیک، از طریق تشکیل ترکیب های افزایشی آریستولاکتام (AL)-DNA و اثرات سیتوتوکسیک است، که باعث آسیب میتوکندری می شود، که گونه های اکسیژن فعال را تولید می کند، و به طور خاص مهار کننده طبیعی است. عملکردهای PT مانند اندوسیتوز با واسطه گیرنده (18-20). در اینجا، ما از طریق مدولاسیون بیان KLF6 به طور خاص در PT از طریق مطالعات افزایش عملکرد و از دست دادن عملکرد در موش نشان می‌دهیم که سرکوب کاتابولیسم اسید آمینه شاخه‌دار (BCAA) با واسطه KLF به AKI کمک می‌کند. و متعاقب آنکلیهفیبروز

نتایج

درمان AAI بیان PT Klf6 کلیوی را افزایش می دهد. از آنجایی که چندین عضو از خانواده KLF در سلول های اپیتلیال درکلیه(21)، ما در ابتدا qRT-PCR را برای این Klfs اپیتلیال در انجام دادیمکلیهقشر 24 ساعت پس از یک دوز واحد سم مخصوص PT، AAI، در مقابل وسیله نقلیه (دی متیل سولفوکسید [DMSO]) در موش‌های C57BL/6 برداشت شد. Klf4، Klf5 و Klf6 به طور قابل توجهی تنظیم شده بودند، در حالی که Klf15 به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 1A)، و این تغییرات در بیان ژن قبل از افزایش قابل توجه کراتینین سرم رخ داد (شکل 1B). برای تعیین اینکه آیا تنظیم بالا Klf6 گذرا یا طولانی است، ما AAI را در چند تزریق 3 تا برای دو تزریق یا 3 هفته (فاز فعال) یا برای 3 هفته و سپس 3 هفته بدون AAI (مرحله بازسازی) تجویز کردیم (شکل 1C) . PT 24 ساعت پس از یک تزریق دست نخورده باقی ماند، اما پس از دو تزریق، سلول های PT تحت مرگ سلولی قرار گرفتند و موش های تحت درمان با دوزهای متعدد AAI از دست دادن PT، ارتشاح های التهابی، پروتئین را نشان دادند.

قالب ها و فیبروز در پایان مرحله بازسازی (شکل 1D). بیان Klf6 به طور قابل توجهی در مراحل فعال و بازسازی آسیب افزایش یافت (شکل 1E)، که نشان دهنده نقش KLF6 در تمام مراحل حاد و فیبروتیک آسیب است. KLF6 در سلول‌های گلومرولی، لوله‌ای و التهابی بیان می‌شود و برای تعیین سهم بیان Klf6 اختصاصی PT در افزایش مشاهده‌شده در بیان Klf6 قشر کلیوی، ما توالی‌یابی RNA (RNA-seq) را در بخش‌های PT S2/S3 24 انجام دادیم. ساعت پس از یک بار تزریق AAI، قبل از از دست دادن سلول های PT. Klf6 در سطحی قابل مقایسه با فاکتورهای معروف رونویسی پاسخ اولیه Fos و Jun بسیار تنظیم شده بود، که نشان می دهد القای اولیه بیان RNA پیام رسان Klf6 (mRNA) درکلیهتوسط بیان آن در سلول های PT هدایت می شود (شکل 1F). این یافته‌ها با داده‌های RNA-seq تک سلولی/هسته‌ای که اخیراً منتشر شده است مطابقت دارد که تنظیم بالای Klf6 در سلول‌های PT را در موش و انسان آسیب دیده نشان می‌دهد.کلیه ها(22، 23). در نهایت، داده‌کاوی آرایه‌های بیانی از مطالعات قبلی IRI گزارش شده در دوره زمانی (8) القای اولیه در بیان KLF6 را در عرض 2 ساعت از AKI، مشابه Fos و Jun (شکل 1G) تأیید کرد. این داده‌ها نشان می‌دهند که Klf6 یک ژن پاسخ آسیب القای اولیه پس از درمان با سم اختصاصی PT AAI و پس از IRI است و علی‌رغم قطع AAI همچنان بالا می‌ماند.

از دست دادن خاص PT از KLF6 آسیب کلیه را در فازهای فعال و بازسازی پس از درمان AAI کاهش می دهد.برای تعیین سهم KLF6 اختصاصی PT در آسیب ناشی از AAI، ما موش هایی با ناک دان خاص PT Klf6 (Klf6PTKD) با تقاطع موش های Klf6fl/fl (24) با موش Pepck-Cre (25) تولید کردیم. موش‌های Klf6PTKD زنده و بارور بودند، با کاهش قابل‌توجهی در بیان پروتئین KLF6 اختصاصی PT، اما هیچ تغییری در بیان mRNA Klf6 در کبد، در مقایسه با موش‌های Klf6fl/fl وجود نداشت (ضمیمه SI، شکل S1 A-C). هیچ تفاوت آشکاری در آن وجود نداشتکلیهبافت شناسی یا عملکرد بین موش های Klf6fl/fl و Klf6PTKD در 24 هفته سن (ضمیمه SI، شکل S1 D و E)، و سطوح بیان OATs 1 تا 3 (Slc22a6، Slc22a7، و Slc22a8)، مسیر ورود AAI PT، تفاوت معنی داری نداشتند (ضمیمه SI، شکل S1F).

موش‌های کنترل (Klf6fl/fl) و Klf6PTKD با وسیله نقلیه (DMSO) یا 3 میلی‌گرم بر کیلوگرم AAI به صورت داخل صفاقی هر 3 روز به مدت 3 هفته تحت درمان قرار گرفتند و 3 روز پس از آخرین تزریق AAI برای ارزیابی فاز فعال آسیب یا 3 هفته پس از تزریق، معدوم شدند. آخرین تزریق AAI برای ارزیابی مرحله بازسازی آسیب (شکل 1C). موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD مقادیر مشابهی از ترکیب‌های افزایشی AL-DNA هم پس از یک تزریق و هم در پایان فازهای فعال و بازسازی داشتند (ضمیمه SI، شکل S1 G و H)، که نشان دهنده جذب PT مشابه AAI و ترمیم AL است. ترکیب های افزایشی DNA در موش های Klf6fl/fl و Klf6PTKD. در حین تزریق، موش‌های دریافت کننده AAI نسبت به آنهایی که DMSO دریافت کردند، با کاهش مشابه 18 درصدی نسبت به پایه در موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD در تزریق نهایی AAI، وزن خود را کاهش دادند و به دنبال آن مقادیر مشابهی از وزن بدن به دست آمد. پیوست SI، شکل S2A).کلیهوزن نسبت به وزن بدن شروع (روز 0) بین موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD تیمار شده با DMSO و AAI در پایان فاز فعال مشابه بود (ضمیمه SI، شکل S2B). در مرحله بازسازی،کلیه هاوزن موش‌های Klf6fl/fl تحت درمان با AAI به‌طور قابل‌توجهی کمتر از موش‌های تحت درمان با DMSO بود، اما در موش‌های Klf6PTKD تحت درمان با AAI،کلیهوزن ها حفظ شدند (ضمیمه SI، شکل S2B).عملکرد کلیهبا اندازه گیری غلظت کراتینین سرم (شکل 2A) و نیتروژن اوره (شکل 2B) مورد ارزیابی قرار گرفت. هر دو کراتینین سرم و غلظت نیتروژن اوره در موش های دریافت کننده AAI در مقابل DMSO به طور قابل توجهی افزایش یافت. با این حال، ارتفاعات در موش های Klf6PTKD در مقایسه با موش های Klf6fl/fl به طور قابل توجهی کمتر بود (شکل 2 A و B). تجزیه و تحلیل تاریخچه منطقی با استفاده از رنگ‌آمیزی شیف هماتوکسیلین و ائوزین و اسید پریودیک نشان داد که موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD تحت درمان با AAI دارای لوله‌های ریزش شده با غشای پایه باقی‌مانده بودند، ارتشاح‌های التهابی که عمدتاً در موش‌ها موضعی بودند.

قشر بیرونی، و چندین قالب پروتئینی در قشر و مدولا (شکل 2 C و D). با این حال، این ویژگی‌ها در موش‌های Klf6PTKD در مقایسه با موش‌های Klf6fl/fl با حفظ توبول‌ها و نفوذهای التهابی کوچک‌تر کمتر بود. تجزیه و تحلیل ناحیه PT با استفاده از رنگ‌آمیزی لکتین لوتوس فلورسنت برای شناسایی مرزهای دست‌نخورده برس PT در سلول‌های PT کاملاً تمایز یافته و ایمونو فلورسانس برای سیتوکراتین-20 (KRT-20) برای شناسایی PTهای آسیب دیده انجام شد (8). در مقایسه با موش‌های تحت درمان با DMSO، موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD تحت درمان با AAI از دست دادن قابل‌توجهی از PT بالغ داشتند، همانطور که با از دست دادن رنگ‌آمیزی لکتین لوتوس، و القای بیان KRT نشان داده شده است، که نشان‌دهنده آسیب PT در هر دو است. فازهای فعال و بازسازی (شکل 2E و پیوست SI، شکل S2C). موش‌های Klf6PTKD تحت درمان با AAI، حفظ قابل‌توجهی از PT بالغ در مقایسه با موش‌های Klf6fl/fl داشتند که با سطوح مشابهی از القای KRT{13}} در هر دو فاز فعال و بازسازی همراه بود. رنگ آمیزی تری کروم فاز بازسازیکلیه هارسوب گسترده ای از مواد فیبروتیک را در موش های Klf6fl/fl نشان داد، با فیبروز به طور قابل توجهی در موش های Klf6PTKD (شکل 2F، رنگ آمیزی آبی؛ پیوست SI، جدول S1). رسوب کلاژن I جزء ماتریکس فیبروتیک، که با استفاده از ایمونوفلورسانس شناسایی شد (شکل 2G و ضمیمه SI، شکل S2D)، نشان داد که کلاژن I در موش های Klf6fl/fl با AAI به طور قابل توجهی افزایش یافته است اما در موش های Klf6PTKD با AAI در مقایسه با DMSO در فاز فعال در مرحله بازسازی، کلاژن I در موش‌های Klf6fl/fl و Klf6PTKD با AAI به طور قابل‌توجهی افزایش یافت، با درصد سطح قابل‌توجهی در موش‌های Klf6PTKD با AAI در مقایسه با موش‌های Klf6fl/fl با AAI. سلول های التهابی بینابینی شامل CD68 به علاوه ماکروفاژها و GR{13}} به علاوه مونوسیت های میلوئیدی در Klf6fl/fl وجود داشتند.

و موش های Klf6PTKD تحت درمان با AAI بودند اما در موش های Klf6PTKD در هر دو فاز فعال و بازسازی به طور قابل توجهی کمتر فراوان بودند (شکل 2H). بنابراین، از دست دادن KLF6 اختصاصی PT، علیرغم وجود مقادیر مشابه ترکیبات افزایشی AL-DNA در مقایسه با موش های کنترل تحت درمان با AAI، در برابر آسیب PT، فیبروز و التهاب ناشی از AAI محافظت می کند. از دست دادن خاص PT از KLF6 سیگنال های التهابی را کاهش می دهد و متابولیسم سلولی را پس از درمان AAI حفظ می کند. ما به دنبال درک مکانیسم هایی بودیم که از دست دادن PT KLF6 در برابر آسیب محافظت می کند، و بنابراین دنباله RNA را انجام دادیم.کلیهcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.{1}} یا<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

برای تعیین مسیرهایی که به طور بالقوه به طور مستقیم و غیرمستقیم توسط KLF6 تنظیم می‌شوند، ژن‌های بیان شده متفاوت را با طبقه‌بندی آنها بر اساس حضور و مکان مکان‌های اتصال KLF6، با استفاده از داده‌های توالی‌یابی ایمونوپسیتاسیون کروماتین KLF6 (ChIP-Seq) از پروژه دایره‌المعارف عناصر DNA تجزیه و تحلیل کردیم. . ژن‌های کلاس 2 به‌عنوان داشتن حداقل 1 مکان اتصال KLF6 در 1 ± کیلوبایت از محل شروع رونویسی (TSS)، ژن‌های کلاس 1 به‌عنوان حداقل 1 مکان اتصال KLF6 بین 1± و 1{13}} کیلوبایت تعریف شدند. ژن‌های TSS و کلاس 0 فاقد محل اتصال KLF6 در ±10 کیلوبایت از TSS هستند. 538 ژن وجود داشت که هم در موش‌های Klf6fl/fl تنظیم‌شده بودند و هم در موش‌های Klf6PTKD در مقابل موش‌های Klf6fl/fl در فاز فعال، به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافتند. تجزیه و تحلیل غنی سازی مسیر این 538 ژن نشان داد که ایمنی ذاتی (مانند TYROBP، فاگوزوم و ماکروفاژ) مرتبط با چسبندگی سلولی (مثلاً، اینتگرین، چسبندگی کانونی) به طور قابل توجهی غنی شده است (شکل 3A). طبقه بندی ژن ها بر اساس مکان های اتصال KLF6 نشان داد که اکثر DEG ها (428/538) مکان های اتصال KLF6 (کلاس 0) و تجزیه و تحلیل غنی سازی ژن های کلاس 2 (72) و ژن های کلاس 0 به طور جداگانه ندارند. نشان داد که اهمیت این مسیرها به شدت توسط ژن‌های کلاس 0 هدایت می‌شود، که نشان می‌دهد بیان کمتر این ژن‌ها در موش‌های Klf6PTKD احتمالاً یک اثر غیرمستقیم آسیب کمتر PT در نتیجه تخریب Klf6 خاص PT است (شکل 3A).

سیستانچ عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

388 ژن وجود داشت که هم در موش‌های Klf6fl/fl کاهش یافتند و هم در موش‌های Klf6PTKD در مقابل Klf6fl/fl به طور قابل‌توجهی حفظ شدند (تا تنظیم شدند). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر نشان داد که این ژن‌ها مسیرهای متابولیکی را نشان می‌دهند که متابولیسم اسیدهای آمینه و متابولیسم اسیدهای چرب برجسته هستند (شکل 3B و پیوست SI، شکل S4). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ژن‌های کلاس 2 (1{{1{19}}}}3) و ژن‌های کلاس 0 (246) نشان داد که علی‌رغم اینکه تنها 25 درصد از ژن‌ها دارای مکان‌های اتصال KLF6 در 1± کیلوبایت از TSS هستند. کلاس 2)، این زیر مجموعه از ژن ها محرک مقادیر P بسیار قابل توجه این مسیرها بود. به طور قابل توجهی، مسیرهای متابولیک اسید آمینه خاص (Val، Leu، و Ile [BCAA] و Gly، Ser، و Thr) زمانی که تنها ژن‌های کلاس 2 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند، به همان اندازه معنی‌دار بودند، که نشان‌دهنده تنظیم مستقیم بالقوه این مسیرها توسط KLF6 است (شکل 3B). . در مقابل، اهمیت بالای مسیرهای متابولیک اسیدهای چرب و مسیر سیگنال دهی PPAR عمدتاً توسط ژن‌های کلاس 0 هدایت می‌شود که نشان‌دهنده حفظ غیرمستقیم این مسیرها در نتیجه نابودی Klf6 خاص PT است. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن برای مسیرهای متابولیک کیوتو دایره المعارف ژن‌ها و ژنوم‌ها (KEGG) (تجزیه اسیدهای چرب، متابولیسم اسیدهای آمینه، چرخه TCA و گلیکولیز) با استفاده از همه ژن‌های تنظیم‌شده متفاوت، تأیید کرد که این مسیرها به طور قابل‌توجهی تنظیم (حفظ) می‌شوند. Klf6PTKD در مقابل موش Klf6fl/fl (شکل 3C).

القای KLF6 تشدید می کندآسیب کلیهو ژن های کاتابولیک BCAA را پس از درمان AAI سرکوب می کند. برای تعیین اینکه آیا بیان بیش از حد KLF6 اثرات معکوس دارد یا خیر، ما از سیستم "tet-on" برای تولید یک مدل موش با بیان القایی داکسی سایکلین (DOX) KLF6 انسانی (hKLF6OE؛ CAG-rtTA، TRE-hKLF6 دوگانه تراریخته) استفاده کردیم. موش) (ضمیمه SI، شکل S5A). موش‌های hKLF6OE القای قوی بیان hKLF6 پس از مکمل‌سازی رژیم غذایی با DOX به مدت 7 روز بدون تفاوت معنی‌دار در بیان Klf6 موش داشتند (ضمیمه SI، شکل S5B)، وکلیه هاآسیب بافتی یا از دست دادن آشکار را نشان ندادعملکرد کلیهپس از درمان مداوم با DOX به مدت 15 هفته (ضمیمه SI، شکل S5 C و D) در مقایسه با موش های کنترل (TRE-hKLF6 با تیمار DOX). با این حال، برای استخراج اینکه آیا القای hKLF6 در PT باعث تشدید AKI وکلیهفیبروز، hKLF6OE و موش‌های کنترل با دوز پایین‌تر 1 میلی‌گرم بر کیلوگرم AAI یا DMSO هر 3 روز به مدت 2 هفته تحت درمان قرار گرفتند و پس از 3 روز دیگر (فاز فعال) یا 2 هفته دیگر (فاز بازسازی) اتانازی انجام شد (ضمیمه SI، شکل). S6A). موش های کنترل و hKLF6OE دریافت کننده AAI مقادیر مشابهی از وزن بدن خود را از دست دادند (ضمیمه SI، شکل S6B) وکلیهوزن ها بین همه گروه ها مشابه بود (ضمیمه SI، شکل S6C). موش های hKLF6OE پس از درمان AAI در فاز فعال، کراتینین سرم و نیتروژن اوره را به طور قابل توجهی در مقایسه با موش های کنترل افزایش دادند (شکل 4 A و B). این با از دست دادن PT بالغ با نسبت بالاتری از KRT{3}}-PT مثبت همراه بود، که در موش‌های hKLF6OE در هر دو نقطه زمانی تشدید شد (شکل 4 C-E و SI ضمیمه، شکل S6D) و افزایش یافت. فیبروز در هر دو فاز (شکل 4F و ضمیمه SI، شکل S6E). تجزیه و تحلیل qRT-PCR ژن‌های کدکننده آنزیم‌ها در مسیر متابولیک BCAA، سرکوب ژن‌های BCAA را پس از درمان AAI در موش‌های کنترل و hKLF6OE، با سرکوب بیشتر در موش‌های hKLF6OE در مقایسه با موش‌های کنترل نشان داد (شکل 4G). علاوه بر این، بیان چندین ژن BCAA نیز به طور قابل توجهی کاهش یافت (Hibch) یا روندی به سمت بیان کمتر در موش‌های hKLF6OE در مقایسه با موش‌های کنترل حتی بدون درمان AAI (درمان با DMSO) نشان داد (شکل 4G). این داده‌ها نشان می‌دهند که القای hKLF6 در موش‌های بالغ باعث می‌شودکلیهبیشتر مستعد ابتلا به AKI و فیبروز نهایی با اختلال قابل توجهی در ژن‌های کدکننده کاتابولیسم BCAA است.

القای KLF6 کاتابولیسم BCAA را که یک بستر مهم برای تولید ATP در شرایط آزمایشگاهی است، سرکوب می کند.تابولیسم BCAA کلسیم میتوکندری می تواند با تولید استیل-CoA و سوکسینیل-CoA به فسفوریلاسیون اکسیداتیو کمک کند (ضمیمه SI، شکل S4B). برای بررسی اینکه آیا KLF6 BCAA و متابولیسم سلولی را در شرایط آزمایشگاهی تنظیم می‌کند، ما ابتدا بیان ژن‌های متابولیک BCAA را در سلول‌های HK{4}} با بیان بیش از حد KLF6 (KLF6-OE)، با یا بدون درمان AAI ارزیابی کردیم. همانطور که در موش‌های hKLF6OE، بیان بیش از حد KLF6 در سلول‌های HK{9}} به تنهایی منجر به گرایش به سمت سرکوب چندین ژن کدکننده آنزیم‌های BCAA، به ویژه BCKDHB شد. درمان سلول‌های KLF کنترل{10}}Con با 25 میکرومولار AAI به مدت 6 ساعت به طور قابل‌توجهی بیان چندین آنزیم را سرکوب کرد، و این‌ها بیشتر در سلول‌های KLF{13}}OE تیمار شده با AAI (شکل 5A) سرکوب شدند. به

شکل 3. از دست دادن KLF6 مسیرهای پروفیبروتیک را سرکوب می کند و مسیرهای متابولیکی را پس از درمان AAI حفظ می کند. (الف) طبقه‌بندی و تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر ژن‌های تنظیم‌شده در موش‌های Klf6fl/fl پس از AAI اما در موش‌های Klf6PTKD پس از AAI به میزان قابل‌توجهی تنظیم‌شده کمتری بر اساس کلاس محل اتصال: کلاس 2 با بیشتر یا مساوی 1 محل اتصال KLF6 در داخل ± 1 کیلوبایت TSS؛ کلاس 1 با بزرگتر یا مساوی 1 محل اتصال KLF6 در 1± تا 10 کیلوبایت از TSS. و کلاس 0 بدون محل اتصال KLF6 در فاصله ± 10 کیلوبایت از TSS. (ب) طبقه‌بندی و تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مسیر ژن‌های تنظیم‌شده در موش‌های Klf6fl/fl پس از AAI اما به طور قابل‌توجهی کمتر تنظیم‌شده (یعنی حفظ شده) در موش‌های Klf6PTKD پس از AAI با توجه به کلاس محل اتصال: کلاس 2 با بزرگ‌تر یا مساوی 1 محل اتصال KLF6 در ± 1 کیلوبایت TSS. کلاس 1 با بزرگتر یا مساوی 1 محل اتصال KLF6 در 1± تا 10 کیلوبایت از TSS. و کلاس 0 بدون محل اتصال KLF6 در ± 10 کیلوبایت از TSS. (C) نمودارهای تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن با استفاده از همه ژن‌های بیان شده متفاوت، برای تخریب اسیدهای چرب KEGG (FA DEGRAD)، متابولیسم اسید آمینه (AA METAB) و چرخه TCA (KEGG{35}}TCA).

تعیین اینکه آیا این سرکوب در بیان ژن BCAA در حضور AAI منجر به تغییراتی در کاتابولیسم BCAA شده است یا خیر، غلظت BCAA داخل سلولی را اندازه گیری کردیم. پس از درمان با AAI، سلول‌های KLF{0} Con کاهش در BCAA را نشان دادند که مطابق با افزایش کاتابولیسم BCAA، به طور بالقوه به عنوان جبران از دست دادن اکسیداسیون FA (شکل 5B). با این حال، این اثر در سلول‌های KLF{2}}OE از بین رفت، که پس از درمان AAI، کاهشی در BCAA داخل سلولی نداشتند، مطابق با کاهش توانایی کاتابولیزاسیون BCAA (شکل 5B)، و این با کاهش تولید ATP میتوکندریایی مرتبط بود. در مقایسه با سلول‌های KLF{5}}Con تیمار شده با AAI (شکل 5C).

محیط استاندارد مورد استفاده برای اندازه گیری تولید ATP حاوی غلظت بالایی از گلوکز (10 میلی مولار گلوکز، 1 میلی مولار گلوتامین و 2 میلی مولار پیرووات) است و برای تعیین اینکه آیا بیان KLF6 به تنهایی می تواند استفاده از منابع مختلف انرژی را تغییر دهد، ما در عوض سنجش هایی را انجام دادیم. نرخ مصرف اکسیژن (OCR) در محیط‌های دارای محدودیت انرژی (محیط‌های بدون سرم با گلوکز 1 میلی‌مولار، بدون گلوتامین و بدون پیروات). سلول‌های KLF{7}}OE OCR میتوکندریایی را کاهش داده بودند (تعریف شده به عنوان OCR اولیه منهای OCR غیرمیتوکندری که پس از تجویز روتنون/آنتی‌مایسین A تعیین شد) اما پس از مسدود کردن گلیکولیز با 2-دئوکسی گلوکز (2-) جبران مشابهی داشتند. DG) و FAO مشابه (کاهش OCR پس از مسدود کردن FAO با اتوموکسیر) (شکل 5 D و E). از آنجایی که پاسخ میتوکندریایی به از دست دادن گلیکولیز و OCR ناشی از اکسیداسیون FA در سلول‌های KLF{11}OE تغییر نکرده است، این نشان می‌دهد که عملکرد کلی میتوکندری تحت تأثیر قرار نگرفته است، بلکه ناتوانی در استفاده از BCAA به عنوان منبع ممکن است کاهش پایه در OCR میتوکندری در این شرایط محدود انرژی را به حساب می آورند. برای تعیین اینکه آیا از دست دادن کاتابولیسم BCAA منجر به کاهش تولید ATP میتوکندری می‌شود، سلول‌های HK{13}} را با حذف BCKDHB تولید کردیم (ضمیمه SI، شکل S7). BCKDHA و BCKDHB دو زیرواحد از کمپلکس پروتئینی بزرگ زنجیره شاخه دار کتواسید دهیدروژناز (BCKDH) را کد می کنند، که اولین مرحله غیرقابل برگشت و محدود کننده سرعت در کاتابولیسم BCAA را کاتالیز می کند و توسط فسفوریلاسیون توسط BCKDH کیناز (BCKDK) مهار می شود. برای تغییر BCKDHB-SCR کنترل و از بین بردن سلول‌های BCKDHB-sh به سمت تولید ATP میتوکندری، آنها در 2-DG پیش انکوبه شدند تا گلیکولیز را به مدت 1 ساعت قبل از انجام سنجش میزان تولید ATP مسدود کنند. از بین رفتن BCKDHB منجر به کاهش قابل توجهی در تولید ATP شد و نشان داد که BCAA برای تولید ATP در انسان استفاده می شود.کلیهسلول ها (شکل 5F). برعکس، به

شکل 4. موش های hKLF6OE تشدید شده اندآسیب کلیهبا سرکوب ژن های BCAA. (A و B) غلظت کراتینین سرم (A) و نیتروژن اوره (B) در موش های کنترل و hKLF6OE تحت درمان با DMSO یا AAI در فاز فعال. n=4 تا 9 در هر گروه؛ $P < 0.05،="" $$p="">< 0.01،="" $$$p="">< 0.0{23}}="" {26}}1="" در="" مقابل="" ژنوتیپ="" مشابه="" با="" dmso.="" **p="">< 0.01="" در="" مقابل="" کنترل="" با="" aai.="" anova="" یک="" طرفه="" با="" تصحیح="" sidak="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" (c="" و="" d)="" تصاویر="" بافت="" شناسی="" نماینده="" رنگ="" آمیزی="" با="" استفاده="" از="" رنگ="" آمیزی="" هماتوکسیلین="" و="" ائوزین="" (c)="" و="" اسید="" پریودیک="" شیف="" (d).="" فلش="" های="" زرد:="" لوله="" های="" ریزش.="" فلش="" های="" سیاه:="" غشاهای="" پایه="" باقی="" مانده؛="" نوک="" پیکان="" زرد:="" قالب="" های="" پروتئینی.="" و="" نوک="" پیکان="" سیاه:="" نفوذهای="" التهابی.="" (نوارهای="" مقیاس،="" 100="" میکرومتر.)="" (e)="" رنگ‌آمیزی="" ایمونوفلورسانس="" برای="" سیتوکراتین-20="" (krt{14}})="" به‌عنوان="" نشانگر="" pt="" آسیب="" دیده="" (قرمز)="" همراه="" با="" رنگ‌آمیزی="" با="" لکتین="" لوتوس="" (ll)="" )="" به="" عنوان="" نشانگر="" pt="" صدمه="" دیده="" (سبز).="" (نوارهای="" مقیاس،="" 250="" میکرومتر)="" (f)="" رنگ‌آمیزی="" ایمونوفلورسانس="" برای="" -sma="" (سبز)="" با="" رنگ‌آمیزی="" برای="" edu="" (ارغوانی).="" (نوارهای="" مقیاس،="" 100="" میکرومتر)="" (g)="" بیان="" mrna="" ژن‌های="" bcaa="" در="" موش‌های="" کنترل="" و="" hklf6oe="" تحت="" درمان="" با="" dmso="" یا="" aai="" در="" فاز="" فعال.="" n="5" تا="" 9="" در="" هر="" گروه.="" $p=""><0.01، $$p=""><0.001 در="" مقابل="" کنترل="" با="" dmso.="" همه="" hklf6oe="" با="" aai="" p=""><0.001 در="" مقابل="" hklf6oe="" با="" dmso="" هستند.="" *p=""><0.05، **p=""><0.01، ***p=""><0.001 در="" مقابل="" کنترل="" با="" همان="" درمان.="" آزمون="" t="" چندگانه="" با="" تصحیح="" نرخ="" کشف="" نادرست="" با="" استفاده="" از="" مدل="" پله‌آپ="" دو="" مرحله‌ای="" بنجامینی،="" کریگر="" و="" یکوتیلی.="" داده="" ها="" میانگین="" ±="" sem="" با="" n="" نشان="" دهنده="" تعداد="" تکرارهای="" بیولوژیکی="">

افزایش کاتابولیسم BCAA، سلول‌های HK-2 را با BT2 درمان کردیم، که BCKDK را مهار می‌کند، بنابراین فسفوریلاسیون مهاری BCKDH را مسدود می‌کند. تحت شرایط محدود انرژی، تیمار با BT2 OCR را در سلول‌های تیمار شده با DMSO افزایش داد، که پس از مهار گلیکولیز حفظ شد و به دلیل تغییر FAO یا OCR غیرمیتوکندریایی نبود (شکل 5 G و H). این یافته‌ها نشان می‌دهد که سرکوب کاتابولیسم BCAA با واسطه KLF، تولید ATP میتوکندریایی را کاهش می‌دهد، که احتمالاً آسیب PT را در تنش سلولی تشدید می‌کند، که در آن شرایط مشابه با انرژی محدود به دلیل به خطر افتادن FAO وجود دارد.

بیان ژن BCAA در انواع مختلف موش و انسان کاهش می یابدآسیب های کلیوی. برای تعیین اینکه آیا از دست دادن بیان ژن BCAA قبل از از دست دادن PT و افزایش سطح کراتینین در آسیب ناشی از AAI رخ می دهد، ما qRT-PCR را در موش های C57BL/6 انجام دادیم که با یک دوز AAI تحت درمان قرار گرفتند و پس از 24 ساعت کشته شدند. Bckdhb، Hibch، و Mccc2 قبلاً در این زمان به طور قابل توجهی کاهش یافته بودند، با ژن‌های دیگر (به عنوان مثال، Acadm) روند قوی به سمت تنظیم پایین را نشان می‌دادند (شکل 6A). برای مطالعه بیان ژن BCAA در موش های دیگرآسیب کلیهمدل‌ها، ما qRT-PCR را در موش‌های تحت درمان با سیس پلاتین (شکل 6B) یا تحت درمان با UUO (شکل 6C) انجام دادیم. در هر دو مدل، بیان Klf6 در مقایسه با وسایل نقلیه/کنترل‌ها بسیار تنظیم‌شده بود. در موش های تحت درمان با سیس پلاتین، چندین ژن BCAA آزمایش شده به طور قابل توجهی کاهش یافتند، با روند رو به پایین تنظیم ژن های دیگر (شکل 6B). در موش‌هایی که در معرض UUO قرار گرفتند، تمام ژن‌های آزمایش‌شده به طور قابل‌توجهی در ۳ و ۷ روز پس از UUO کاهش یافتند (شکل 6C)، که نشان می‌دهد تنظیم پایین ژن‌های BCAA در اوایل پس از آسیب اتفاق می‌افتد.

شکل 5. بیان بیش از حد KLF6 بیان ژن BCAA، تولید ATP و استفاده از BCAA را در شرایط آزمایشگاهی سرکوب می کند. (الف) بیان ژن‌های متابولیک KLF6 و BCAA در سلول‌های HK{3}} که به طور پایدار پلاسمیدهای کنترل (Con) یا بیان بیش از حد KLF6 (OE) را بیان می‌کنند، تیمار شده با DMSO یا AAI. n=4 در هر گروه; *P < 0.05،="" **p="">< {{10}}.01،="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" در="" مقابل="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}5،="" $$p="">< 0.01،="" $$$p=""><0.001 در="" مقابل="" همان="" خط="" سلولی="" با="" dmso;="" anova="" دو="" طرفه="" با="" تصحیح="" tukey="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" (b)="" تعیین="" کمیت="" کل="" bcaa="" در="" سلول="" های="" con="" و="" oe="" تیمار="" شده="" با="" dmso="" یا="" aai.="" n="6" در="" هر="" گروه؛="" $p=""><0.05 در="" مقابل="" con="" dmso.="" anova="" یک="" طرفه="" با="" تصحیح="" sidak="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" (c)="" درصد="" تغییر="" در="" میزان="" تولید="" atp="" میتوکندری="" در="" سلول‌های="" con="" و="" oe="" تیمار="" شده="" با="" aai="" در="" مقابل="" dmso.="" n="27" تا="" 30="" در="" هر="" گروه؛="" *p=""><0.05، ***p=""><0.001 در="" مقابل="" dmso،="" $p=""><0.05 در="" مقابل="" con="" aai.="" anova="" یک="" طرفه="" با="" تصحیح="" sidak="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" (د)="" اندازه="" گیری="" ocr="" برای="" سلول="" های="" con="" و="" oe="" در="" محیط="" های="" محدود.="" در="" جایی="" که="" نشان="" داده="" شد،="" 2-dg،="" اتوموکسیر="" (eto)="" و="" ترکیبی="" از="" روتنون/آنتی‌مایسین="" a="" (پوسیدگی)="" اضافه="" شد.="" n="16" در="" هر="" گروه.="" (e)="" کمیت="" ocr="" میتوکندری="" پایه="" (ocr="" شروع="" منهای="" ocr="" پس="" از="" پوسیدگی)،="" ocr="" غیرمیتوکندری="" (ocr="" پس="" از="" پوسیدگی)،="" و="" تغییرات="" در="" ocr="" پس="" از="" افزودن="" 2-dg="" (جبران="" میتوکندری="" بعد="" از="" 2-dg)="" و="" اتوموکسیر="" (fao).="" n="16" در="" هر="" گروه;="" **="" p=""><0.01 در="" مقابل="" con;="" anova="" دو="" طرفه="" با="" تصحیح="" tukey="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" (f)="" میزان="" تولید="" atp="" میتوکندری="" در="" سلول="" های="" bckdhb-scr="" و="" bckdhb-sh.="" n="14" در="" هر="" گروه;="" **="" p=""><0.05، آزمون="" t="" جفت="" نشده.="" (g)="" اندازه‌گیری="" ocr="" در="" سلول‌های="" hk{48}}="" در="" محیط‌های="" محدود="" در="" غیاب="" یا="" حضور="" bt2.="" در="" جایی="" که="" مشخص="" شد،="" 2-dg،="" eto،="" و="" rot="" اضافه="" شدند.="" (h)="" کمیت="" ocr="" میتوکندری="" پایه،="" ocr="" غیرمیتوکندری،="" و="" تغییرات="" ocr="" پس="" از="" افزودن="" 2-dg="" و="" اتوموکسیر="" در="" سلول‌های="" hk-2="" در="" غیاب="" یا="" حضور="" bt2.="" n="8" در="" هر="" گروه;="" *p=""><0.05 در="" مقابل="" بدون="" bt2.="" anova="" دو="" طرفه="" با="" تصحیح="" tukey="" برای="" آزمایش="" چندگانه.="" داده="" ها="" میانگین="" ±="" sem="" با="" n="" نشان="" دهنده="" تعداد="" تکرارهای="" بیولوژیکی="">

به طور مشابه، داده کاوی یک آرایه بیان قبلا گزارش شده از محفظه توبولو بینابینی 36 بیمار CKD انسانی (پرفشاری خون و دیابتی)بیماری های کلیوی) در مقایسه با بیماران کنترل (6) نشان داد که چندین ژن BCAA به روشی مشابه موش های تحت درمان با AAI تنظیم می شوند (شکل 6D). برای روشن شدن بیشتر رابطه بینعملکرد کلیه، بیان KLF6 و بیان ژن‌های BCAA در بیماری مزمن کلیه انسان، ما از یک آرایه بیان منتشر شده از محفظه بینابینی توبو از یک سری از 164 بیمار با انواع مختلف استفاده کردیم.بیماری های کلیوی (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>9 0 mL/min/1.73m2) (P <0.001 برای="" همه="" ژن="" ها)،="" نشان="" می="" دهد="" که="" این="" تغییرات="" در="" بیان="" ژن="" ممکن="" است="" در="" اوایل="" تغییرات="" عملکردی="" رخ="" دهد.="" در="" مجموع،="" این="" داده="" ها="" نشان="" می="" دهد="" که="" سرکوب="" با="" واسطه="" klf6-="" ژن="" های="" حیاتی="" برای="" کاتابولیسم="" bcaa="" ممکن="" است="" نقش="" مهمی="" در="" تشدید="" داشته="">آسیب کلیهدر مدل های موشی ازکلیهفیبروز و همچنین در CKD انسان.

بحث

در این مطالعه، ما نقش in vivo KLF6 خاص PT را در تنظیم نشان می‌دهیمآسیب کلیهKLF6 به شدت و به طور مداوم در اوایل PT در پاسخ به تنظیم می شودآسیب کلیهاما این یک پاسخ ناسازگار است، همانطور که با اثر محافظتی از دست دادن PT Klf6 پس از درمان با سم بالینی مرتبط و بسیار خاص PT AAI نشان داده شده است. علاوه بر این، ما اهمیت بالقوه متابولیسم بی‌نظم BCAA را در PT آسیب دیده به‌عنوان عامل احتمالی AKI و فیبروز متعاقب آن نشان می‌دهیم. از دست دادن Klf6 منجر به حفظ بیان آنزیم کاتابولیک BCAA شد، با چندین ژن کد کننده این آنزیم ها دارای مکان های اتصال KLF6 در مجاورت TSS های خود هستند، که نشان می دهد KLF6 ممکن است یک سرکوب کننده رونویسی BCAAکاتابولیسم باشد. اگرچه یکی دیگر از اعضای خانواده KLF، KLF15، قبلا نشان داده شده بود که بیان آمینوترانسفراز 2 (30) زنجیره شاخه دار ماهیچه های اسکلتی را تنظیم می کند (30)، تنظیم سایر آنزیم های BCAA گزارش نشده بود. ما فرض می کنیم که KLF6 برای سرکوب بیان ژن های متعددی که آنزیم های BCAA را کد می کنند عمل می کند.

در PT بدون آسیب، بیان Klf6 کم است و به طور متغیر در برخی از سلول های PT بیان می شود و در برخی دیگر بیان نمی شود. تنظیم سریع و قوی که پس از چندین نوع آسیب رخ می دهد، نقش مهم فیزیولوژیکی KLF6 را نشان می دهد. در فیبروبلاست‌ها، اخیراً نشان داده شد که KLF6 در پاسخ به استرس انکوژن و اکسیداتیو تنظیم می‌شود و منجر به پیری سلولی می‌شود، در حالی که خاموش کردن KLF6 منجر به تجمع نشانگرهای آسیب DNA و بی‌ثباتی ژنومی می‌شود (31). بنابراین، نقش فیزیولوژیکی KLF6 در آسیب ممکن است القای پیری سلولی باشد، که اجازه ترمیم آسیب DNA را می دهد که ممکن است ناشی از توهین های سمی یا اکسیداتیو/ایسکمیک باشد. با این حال، در سلول‌های PT آسیب‌دیده، به نظر می‌رسد دومین پیامد افزایش تنظیم Klf6، سرکوب کاتابولیسم BCAA است که به‌ویژه در سلول‌های PT احتمالاً مضر است. جالب توجه است، علیرغم نابودی نسبی Klf6 اختصاصی PT در ابتدا در موش‌های Klf6PTKD، این همچنان می‌توانست یک اثر محافظتی واضح پس از آسیب ایجاد کند. این پیامدهای درمانی مهمی دارد، زیرا نشان می‌دهد که تنها یک دستکاری کوچک در سطوح یا فعالیت KLF6 (مثلاً از طریق استفاده از یک مهارکننده مولکول کوچک) می‌تواند اثربخشی درمانی را نشان دهد. در واقع، عوامل رونویسی بیشتر از سایر خانواده های ژنی هستند

در ژنوم انسان حساسیت دوز داشته باشد (32). به طور مشابه، یکی از محدودیت‌های مدل موشی بیان بیش‌ازحد KLF6 القایی ما این است که سلول‌های PT محدود نیست، و به این ترتیب، مطالعات آینده باید بر روی استفاده از یک مدل القایی خاص سلول برای روشن کردن نقش وابسته به بافت سلولی KLF6 تمرکز کنند.

ما قبلاً نشان دادیم که از دست دادن Klf6 در پودوسیت‌های گلومرولی به دلیل نقش آن در فعال‌سازی رونویسی سنتز سیتوکروم c اکسیداز 2 (Sco2) در تنظیم FSGS مضر بود. از دست دادن Klf6 در FSGS منجر به فیبروز بدتر، با افزایش فعال شدن مسیر آپوپتوز ذاتی شد (15). بازجویی از مجموعه داده های RNA-seq تک سلولی موجود نشان می دهد که در موش سالمکلیه ها،Klf6 در نسبت بسیار بیشتری از سلول‌های podo نسبت به سلول‌های PT و در سطح بسیار بالاتری بیان می‌شود (مراجعه 33؛ https://susztaklab.com/). بنابراین احتمالاً KLF6 نقش فیزیولوژیکی مهم تری در پودوسیت‌های طبیعی نسبت به سلول‌های PT ایفا می‌کند، در حالی که سایر تنظیم‌کننده‌های اصلی میتوکندریایی (مثلاً Ppara) در سلول‌های PT بسیار بیشتر از پادوسیت‌ها بیان می‌شوند. بنابراین، از دست دادن Klf6 در پودوسیت ها احتمالاً اثر مضر بیشتری نسبت به سلول های PT دارد. نقش متضاد KLF6 در انواع مختلف سلول درکلیهبه موازات یافته های قبلی از اثرات اختصاصی سلول در قلب و کبد است. بنابراین، از بین رفتن Klf6 در میوسیت‌های قلبی در موش‌ها، فیبروز قلبی را پس از بارگذاری بیش از حد آنژیوتانسین II تضعیف کرد، که نشان‌دهنده نقش KLF6 در انتشار فیبروز است، اما کوبیدن Klf6 در میوفیبروبلاست‌های قلبی هیچ تأثیری بر فیبروز نداشت (14). برعکس، در کبد، از بین رفتن Klf6 در سلول‌های کبدی موش هیچ تأثیری بر فیبروز کبدی پس از تجویز مزمن CCl4 نداشت، اما بیان بیش از حد KLF6 در سلول‌های ستاره‌ای کبد منجر به کاهش فیبروز شد که نشان می‌دهد KLF6 محافظ است (13).

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

از دست دادن فائو در طولآسیب کلیهدر حال حاضر به عنوان یک رویداد مهم در آسیب شناسی شناخته شده استآسیب کلیهو در واقع می تواند به طور مستقیم به فیبروز کمک کند. در غیاب FAO، که منبع اصلی انرژی برای PT بدون آسیب است، سایر منابع انرژی بالقوه ممکن است اهمیت بیشتری پیدا کنند. BCAA از طریق تولید استیل-CoA و سوکسینیل-CoA به چرخه TCA کمک می کند. یک مطالعه اخیر نشان داد که نه تنها BCAA نشاندار شده با 13C به واسطه های چرخه TCA درکلیهاماکلیهپس از پانکراس، عضله و بافت چربی سفید، چهارمین بالاترین ادغام 13C را در میانی‌های چرخه TCA در اندام‌های مورد آزمایش داشت (34)، که نشان می‌دهد BCAA به طور بالقوه نقش مهمی در چرخه TCA دارد. با این حال، اهمیت کاتابولیسم BCAA در کمک به چرخه TCA، چه در حالت عادی یا آسیب دیدهکلیه ها، قبلا مورد بررسی قرار نگرفته است. به عنوان مثال، مشخص نیست که آیا از دست دادن کاتابولیسم PT BCAA به تنهایی باعث تغییرات در هموستاز و/یا ترمیم PT می شود یا خیر، و این مطالعات به تولید مدل های جدید موش مانند موش های Bckdhb اختصاصی PT نیاز دارد. در تنظیمکلیهآسیب، زمانی که FAO به شدت سرکوب شود، سرکوب اضافی

ژن‌های کدکننده آنزیم‌های متابولیک BCAA ممکن است سلول‌های لوله‌ای را از یک منبع انرژی بالقوه جایگزین مهم محروم کنند. توجه به این نکته مهم است که بیان ژن BCAA 24 ساعت پس از یک بار تزریق، قبل از هرگونه تغییر در کراتینین سرم یا از دست دادن PT کاهش یافته بود، که نشان می‌دهد این کاهش‌ها پیامد خاصی از آسیب PT بوده و با کاهش تقاضای انرژی PT مرتبط نیست. از کاهش GFR و در نتیجه کاهش نیاز به جذب املاح. این مسیرها در موش‌های Klf6PTKD که از آسیب محافظت شده بودند حفظ شد و در موش‌های hKLF6OE که آسیب بدتری داشتند سرکوب شد. علاوه بر این، سلول‌های KLF{3}}OE تولید ATP میتوکندریایی را پس از درمان AAI در مقایسه با سلول‌های KLF{4}Con کاهش دادند، و در حالی که BCAA داخل سلولی در سلول‌های KLF{5}Con مطابق با کاتابولیسم آنها کاهش یافت. ، این کاهش در سلول های KLF6-OE شناسایی نشد. علاوه بر این، نابودی BCKDHB در سلول‌های HK{7}} منجر به کاهش تولید ATP میتوکندری شد. بنابراین، بیان حفظ شده ژن‌های BCAA در موش‌های Klf6PTKD ممکن است با تأمین واسطه‌های حیاتی چرخه TCA در محیط اکسیداسیون FA به شدت کاهش یافته، در برابر آسیب محافظت کند. مطالعات آینده با استفاده از موش‌های دارای دستکاری ژنتیکی کاتابولیسم BCAA و/یا درمان با BT2، ما را قادر می‌سازد تا پویایی بین کاتابولیسم BCAA و FAO را بررسی کنیم.آسیب کلیه.

ما نشان داده‌ایم که از دست دادن بیان ژن‌های BCAA منجر به کاهش تنفس میتوکندری و تولید ATP می‌شود و این نشان‌دهنده مکانیزمی است که از طریق آن از دست دادن کاتابولیسم BCAA ممکن است بهآسیب کلیه. یک مکانیسم جایگزین می تواند از طریق تجمع BCAA باشد که ممکن است اثر سمی داشته باشد. در واقع، این در تنظیم IRI قلبی نشان داده شده است. نشان داده شد که تجمع BCAA به دلیل از دست دادن کاتابولیسم، استفاده از پیرووات میتوکندریایی را با غیرفعال کردن پیروات دهیدروژناز پس از ترجمه مهار می کند، بنابراین منبع انرژی سلولی بیشتری را حذف می کند و آسیب را تشدید می کند (35). این یا با افزایش کاتابولیسم BCAA با درمان موش ها با BT2 یا با افزایش متابولیسم گلوکز با بیان بیش از حد GLUT1 معکوس شد. یک مطالعه اخیر همچنین تشدید IRI قلبی را با از دست دادن کاتابولیسم BCAA در موش های دیابتی نشان داد. این با افزایش استرس اکسیداتیو همراه بود و دوباره با فعال شدن مجدد کاتابولیسم BCAA معکوس شد (36). BCAA و به ویژه لوسین به عنوان فعال کننده سیگنالینگ راپامایسین (mTOR) کمپلکس 1 (mTORC1) در پستانداران شناخته شده است. در مدل موش پلی کیستیکبیماری کلیوی،که در آن سلول های اطراف کیست دارای فعال سازی mTOR هستند

سیگنالینگ، مکمل با BCAA سیگنالینگ mTORC1 را بیشتر فعال کرد و منجر به افزایش تکثیر شد (37). پروفایل رونویسی کارسینوم های کبدی کاهش بیان ژن BCAA را نشان داد که منجر به تجمع BCAA در بافت تومور شد. این با افزایش سیگنال دهی و تکثیر mTORC1 همراه بود که با محدود کردن BCAA یا درمان با BT2 کاهش یافت و در موش هایی که از رژیم غذایی BCAA بالا تغذیه می کردند تشدید شد (38). سیگنالینگ mTORC1 برای عملکرد PT مورد نیاز است، و مطالعات با استفاده از مهارکننده‌های mTOR درآسیب کلیهنتایج متناقضی را نشان داده‌اند، احتمالاً به دلیل رژیم‌های دوز متفاوت، زمان‌بندی درمان‌ها و مدل‌های آسیب (39-42). سیگنال دهی mTORC1 منجر به بسیاری از پاسخ های سلولی، از جمله رشد و تکثیر سلولی، سنتز لیپید، سنتز میتوکندری و سرکوب اتوفاژی می شود (43). این احتمال وجود دارد که فعال شدن کم یا بیش از حد سیگنال دهی mTORC1 می تواند مضر باشد و برای عملکرد صحیح سلولی تعادل لازم است. به عنوان مثال، فعال شدن بیش از حد سیگنال دهی mTORC1 در آسیب PT ممکن است منجر به سرکوب مضر اتوفاژی شود، که برای حذف میتوکندری آسیب دیده لازم است، و نشان داده شده است که برای بهبودی پس از PT مهم است.آسیب دیدگی (39، 42، 44، 45). بنابراین، تجمع لوسین ممکن است نقش مضری داشته باشدآسیب کلیهبا فعال شدن بیش از حد سیگنالینگ mTORC1 و سرکوب اتوفاژی. در نتیجه، ما نشان دادیم که تنظیم قوی Klf6 که در آن اتفاق می افتدآسیب کلیهمضر است، که در آن از دست دادن Klf6 اختصاصی PT باعث حفظ بیان ژن BCAA و کاهش AKI و فیبروز نهایی می شود. برعکس، القای KLF6 در موش، بیان ژن BCAA را سرکوب کرد و باعث شدکلیهحساس بهآسیب کلیهعلاوه بر این، ژن‌هایی که چندین آنزیم BCAA را کد می‌کنند دارای مکان‌های اتصال KLF6 هستند، که نشان می‌دهد KLF6 ممکن است یک تنظیم‌کننده رونویسی کاتابولیسم BCAA باشد. کاهش تنظیم کاتابولیسم BCAA در شرایط آزمایشگاهی با بیان بیش از حد KLF6 و درمان با AAI، یا با از بین بردن BCKDHB، منجر بهکاهش تولید ATP میتوکندریایی در مجموع، اینهاداده ها نشان می دهد که از نظر درمانی حفظ و نگهداریکاتابولیسم BCAA ممکن است یک میتوکندری جایگزین ایجاد کندمنبع انرژی در تنظیمآسیب کلیهکه در آن فائوکاهش می یابد.