ایمونوتراپی مبتنی بر لیپوزوم با آگونیست TLR و CD47-مسدود کننده ایست بازرسی SIRP برای درمان موثر سرطان روده بزرگ

خلاصه:

ایمنی ضد تومور جزء ضروری درمان سرطان است و در درجه اول توسط پاسخ ایمنی ذاتی، که نقش مهمی در شروع و شکل‌دهی پاسخ ایمنی تطبیقی ​​ایفا می‌کند، واسطه می‌شود. شواهد نوظهور نقاط بازرسی ایمنی ذاتی و گیرنده های تشخیص الگو، مانند CD47 و گیرنده Toll مانند 7 (TLR7) را به عنوان اهداف درمانی امیدوارکننده برای درمان سرطان شناسایی کرده است. بر اساس پروتئین فیوژن Fc-CV1، که شامل یک نوع SIRP با میل ترکیبی بالا (CV1) و قطعه Fc آنتی بادی IgG1 انسانی است، ما از آماده‌سازی استفاده کردیم که Fc-CV1 را به لیپوزوم‌های بارگذاری شده با ایمیکیمود (آگونیست TLR7) متصل کرد. CILPs) برای هدف قرار دادن فعال CT26. مدل‌های تومور کولون سیژنیک WT مطالعات آزمایشگاهی نشان داد که CILPها خواص رهش پایدار و کارایی جذب سلولی را در مقایسه با ایمیکیمود آزاد نشان می‌دهند. در داخل بدن، سنجش ها ثابت کردند که CILP ها تجمع کارآمدتری در تومورها و اثر سرکوب تومور قابل توجه تری نسبت به گروه های کنترل نشان می دهند. این آماده سازی ایمونوتراپی دارای مزایای دوز کم و سمیت کم بود. این نتایج نشان داد که ترکیبی از درمان محاصره ایست بازرسی (ICB) و آگونیست‌های ایمنی ذاتی، مانند آماده‌سازی لیپوزوم Fc-CV1 و ایمیکیمود مورد استفاده در این مطالعه، می‌تواند یک استراتژی بسیار مؤثر برای درمان تومور باشد.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

کلید واژه ها:

imiquimod; لیپوزوم؛ Fc-CV1; ایمونوتراپی؛ سرطان روده بزرگ

1. معرفی

بروز جهانی سرطان سالانه به افزایش خود ادامه می دهد و تهدیدی جدی برای سلامت جمعیت جهان محسوب می شود و بار سنگینی را بر دوش سیستم های مراقبت های بهداشتی وارد می کند. بر اساس گزارش سازمان بهداشت جهانی، در سال 2020، 19.29 میلیون مورد جدید سرطان و 9.96 میلیون مرگ ناشی از سرطان در سراسر جهان رخ داده است [1]. با این حال، با پیشرفت مداوم در تشخیص بالینی، جراحی، رادیوتراپی و شیمی درمانی، بقای کلی و کیفیت زندگی بیماران سرطانی به طور قابل توجهی بهبود یافته است. قابل ذکر است، ایمونوتراپی، که با واکسن کولی در دهه 1890 [2] ابداع شد، هم قبل از رادیوتراپی و هم شیمی درمانی بوده و در دهه گذشته پیشرفت قابل توجهی داشته است و به نفع بیماران سرطانی بوده است.

ایمونوتراپی تومور به دلیل زیست سازگاری عالی و ویژگی بالای آن شناخته شده است و قادر به القای پاسخ های ایمنی برای از بین بردن سلول های تومور است [3-5]. دو استراتژی اصلی برای ایمونوتراپی تومور، تقویت سیستم ایمنی و نرمال‌سازی سیستم ایمنی است [6]. الگوهای تقویت سیستم ایمنی عمدتاً شامل سیتوکین درمانی، واکسن های درمانی تومور و آنتی بادی های مونوکلونال است. گیرنده های شبه تلفن (TLRs) به دلیل نقش آنها در فعال سازی سیستم ایمنی ذاتی، اهداف بالقوه ای برای ایمونوتراپی سرطان در نظر گرفته می شوند. آگونیست های TLR به عنوان یک ادجوانت ایمنی ایجاد شده اند و انواع آگونیست های TLR تحت آزمایشات بالینی هستند [7]. مونوفسفوریل لیپید A و آگونیست های ایمیکوئیمود، TLR4 و TLR7 به ترتیب از سازمان غذا و دارو برای کاربرد بالینی تاییدیه دریافت کرده اند [7-9]. Imiquimod، آگونیست TLR7 [9]، پاسخ های ایمنی را فعال می کند و فعالیت ضد توموری را با تحریک TLR7 افزایش می دهد [10،11]. استراتژی نرمال‌سازی ایمنی با داروهای مسدودکننده ایست بازرسی ایمنی (ICB) نشان داده می‌شود که پاسخ ایمنی تومور تطبیقی ​​معیوب را تنظیم می‌کند. از زمانی که اولین مهارکننده ایست بازرسی، ipilimumab برای کاربرد بالینی در ایالات متحده در سال 2011 تأیید شد، مهارکننده‌های ایمون بازرسی، مانند مهارکننده‌های PD1/PDL1، پیشرفتی در ایمونوتراپی سرطان ایجاد کردند [12-14]. به جز نقاط بازرسی ایمنی سازگار مشابه با PD1/PDL1، برخی از نقاط بازرسی ایمنی ذاتی مانند SIRP -CD47 نیز توجه زیادی را به خود جلب کرده و به مناطق مورد علاقه در توسعه داروهای آنتی بادی تبدیل شده اند [15-17].

ایست بازرسی SIRP -CD47 اولین بار در سال 1999 شناسایی شد [18،19]. SIRP یک گیرنده CD47 است که در نورون های سیستم عصبی مرکزی [20] و سلول های میلوئیدی از جمله مونوسیت ها، ماکروفاژها، گرانولوسیت ها و سلول های دندریتیک بیان می شود. CD47 یک مولکول خودبرچسب‌دار است که در تقریباً تمام سلول‌های طبیعی بیان می‌شود و در اکثر سلول‌های تومور بیش از حد بیان می‌شود [21]. در سطح سلول‌های تومور، CD47 به SIRP متصل می‌شود و فاگوسیتوز با واسطه ماکروفاژها را مهار می‌کند، که وسیله مهمی برای فرار ایمنی تومور است [22]. نشان داده شده است که فاگوسیتوز ماکروفاژها در ریزمحیط تومور زمانی که اتصال CD47 و SIRP مسدود می شود، می تواند افزایش یابد [20-25]. بنابراین، مهارکننده‌های ایمن بازرسی که مسیر CD47/SIRP را مسدود می‌کنند، توسعه یافته و در درمان سرطان استفاده شده‌اند [26].

cistanche tubulosa - سیستم ایمنی را بهبود می بخشد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

در این مطالعه، ما از ترکیبی از ایمیکیمود و پروتئین فیوژن (Fc-CV1) برای درمان سرطان روده بزرگ استفاده کردیم. CV1 یک پروتئین SIRP نوترکیب انسانی است که میل ترکیبی 50 برابری برای CD47 نسبت به پروتئین اصلی دارد [27]. Fc-CV1 با استفاده از فناوری "Knobs-into-holes" بر اساس مونومر CV1 و قطعه Fc IgG1 انسانی ساخته شد. برای غلبه بر محدودیت‌های اثربخشی درمانی ضعیف و سمیت سیستمیک مرتبط با ایمیکیمود [28،29]، ما نانولیپوزوم‌ها را از طریق روش تزریق اتانول تهیه کردیم. نانولیپوزوم ها دارای ویژگی سمیت کم در تحویل دارو هستند [30،31]. پس از آن، imiquimod در لیپوزوم هایی که سطح Fc-CV1 کونژوگه شده بودند، محصور شد. در نهایت، این نانو آماده سازی جدید می تواند به طور فعال آگونیست های TLR7 را به بافت های تومور برساند و عملکرد دوگانه ای به عنوان یک داروی ICB و یک آگونیست TLR دارد. برای درمان مدل تومور کولون سیژنیک CD{21} CT26.WT [32] استفاده شد.

2. نتایج و بحث

2.1. خصوصیات LPs (لیپوزوم‌های خالی)، ILPs (لیپوزوم‌های غیر CD{3}}لیپوزوم‌های هدفمند محصور شده با Imiquimod)، CLPs (لیپوزوم‌های هدفمند CD47) و CILPs (همراه Fc-CV1 به Imiquimod (TLR7-Liposome)

CILP ها با تزریق اتانول و روش گرادیان سولفات آمونیوم با موفقیت تهیه شدند. شکل 1A فرآیند سنتز CILP ها را نشان می دهد. تجزیه و تحلیل TEM نشان داد که CILP ها کروی و شکل یکنواخت هستند (شکل 1B). علاوه بر این، نتیجه DLS نشان داد که اندازه ذرات چهار لیپوزوم توزیع یک‌وجهی بود (شکل 1C). نرخ اتصال (BR) توسط SDS-PAGE تأیید شد که در شکل 1D، E نشان داده شده است. BR از طریق چگالی سنجی روبشی باندهای الکتروفورتیک توسط Image J 10/37 ± 13/67 درصد محاسبه شد (شکل 1E) که امکان هدف قرار دادن سلول‌های تومور CD{14} را فراهم می‌کند.

شکل 1. (الف) تصویر شماتیک از سنتز CILPs. (ب) تصویر TEM از CILPها

HPLC برای تشخیص کارایی کپسولاسیون (EE) imiquimod استفاده شد (شکل S1 تکمیلی). همانطور که در شکل تکمیلی S1A نشان داده شده است، imiquimod آزاد یک پیک منفرد قابل توجه را نشان داد، در حالی که CLPs هیچ پیکی را در شرایط آزمایش مشابه نشان ندادند (شکل تکمیلی S1B). بنابراین، تشخیص CILP ها به طور مستقیم تحت شرایط آزمایش امکان پذیر است. همانطور که انتظار می رفت، مقادیر تشخیص CILPs قبل و بعد از دیالیز به ترتیب به عنوان محتوای کل دارو و محتوای دارو در لیپوزوم ها در نظر گرفته شد (شکل تکمیلی S1C، D). EE imiquimod 4.11 ± 85.44 محاسبه شد. در مقایسه با سیستم تحویل دارو با بارگیری غیرفعال [33-35]، این مطالعه به راندمان کپسولاسیون بالاتر و فرآیند آماده‌سازی راحت‌تر دست یافت.

DLS نشان داد که قطر LPs 111.567 ± 0.655 نانومتر است، در حالی که CLPs، ILPs، و CILPs اندازه کمی بزرگتر از 117.467 ± 0.34{{10} را نشان دادند. } نانومتر، 120.233 ± 0.776 نانومتر، و 13{{3{0}}.0به ترتیب 0.974 ± 33 نانومتر (جدول 1). تغییرات در اندازه این لیپوزوم ها ممکن است به اصلاح Fc-CV1 و imiquimod نسبت داده شود. PDI نزدیک به 0.1 بود (جدول 1)، که نشان می دهد این وسایل نقلیه تحویل دارو در توزیع خود بسیار همگن بودند. علاوه بر این، مقادیر پتانسیل زتا LPs، CLPs، ILPs و CILPs 0.167 ± 2.231- میلی ولت، 0.033 ± 2.492- میلی ولت، 0.070 ± 2.383- ± mV، 0.070 ± mV، و 0.7±mV، و 0.7±mV اندازه گیری شد. ، نشان می دهد که Fc-CV1 کونژوگه شده با سطح و ایمیکیمود کپسوله شده تأثیر کمی بر بار لیپوزوم ها دارند.

جدول 1. قطر، پتانسیل زتا، PDI و EE به ترتیب LPs، CLPs، ILPs و CILPs.

2.2. راندمان جذب سلولی در شرایط آزمایشگاهی

راندمان جذب سلولی CILP ها از طریق شدت فلورسانس Cy5 گرفته شده توسط سلول های CT26.WT با استفاده از یک سیستم تصویربرداری با محتوای بالا ارزیابی شد. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، در مقایسه با گروه های Cy5 و ILP-Cy5 آزاد، گروه های CILPs-Cy5 ظرفیت جذب سلولی قوی تری را پس از 30 دقیقه انکوباسیون نشان دادند. این نتایج استنباط کردند که Fc-CV1 توانایی تحویل درون سلولی لیپوزوم‌های بارگذاری شده با ایمیکیمود را به دلیل تمایل خاص به گیرنده Fc-CV1 افزایش می‌دهد و منجر به اثر ضد توموری قوی‌تری می‌شود.

شکل 2. تصاویر سلول های CT26.WT پس از انکوباسیون با Cy5 آزاد، ILPs-Cy5، و CILPs-Cy5 (قرمز) به مدت 0.5 ساعت، و رنگ آمیزی با DAPI (آبی). نوار مقیاس: 5{11}} میکرومتر. (n {{10}}). * p <0.05; **** p < 0.0001

2.3. منحنی های آزادسازی لیپوزوم ها

منحنی‌های انتشار دارو imiquimod آزاد، ILPs و CILPs در یک محیط شبیه‌سازی شده در داخل بدن اندازه‌گیری شدند. شکل 3 نشان می دهد که ایمیکیمود آزاد به طور کامل پس از 1 ساعت منتشر شد، در حالی که نرخ رهاسازی (RR) imiquimod که با ILP ها و CILP ها کپسوله شده بودند، تنها 4 ± 54.75 بود.{8}}8٪ و 0.05 ± 39.70٪ در 12 ساعت. ، به ترتیب. علاوه بر این، آزادسازی آهسته ایمیکویمود در ILPها و CILPها را می توان با خاصیت آزادسازی دارو کنترل شده لیپوزوم ها بسته شد. RR imiquimod در ILPs و CILPs در 96 ساعت تفاوت معنی‌داری نشان نداد، که نشان می‌دهد «پس از درج» تأثیر ناچیزی بر پایداری غشای لیپوزوم‌ها نشان می‌دهد.

شکل 3. منحنی های آزادسازی ایمیکیمود از ایمیکوئیمود آزاد، ILP ها و CILP ها در PBS در دمای 37 درجه سانتیگراد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (n=3) ارائه می شوند. * p < 0.05، ** p <0.01

2.4. مطالعه سمیت سلولی

برای بررسی سمیت سلولی CILPs در شرایط آزمایشگاهی، سنجش CCK{{0}} روی سلول‌های CT26.WT انجام شد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، CILP ها در غلظت های پایین (0.1-1 میکروگرم بر میلی لیتر) سمیت سلولی را نشان ندادند، که با ایمنی درمان ایمن سازی مطابقت دارد. زنده ماندن سلولی پس از درمان 5 میکروگرم بر میلی لیتر ایمیکیمود اندکی کاهش یافت، احتمالاً به دلیل ROS و مرگ سلولی ایمونوژنیک با واسطه شبکه آندوپلاسمی ناشی از ایمیکیمود [36]. علاوه بر این، CILP ها منجر به کاهش قابل توجهی در زنده ماندن سلولی در مقایسه با گروه های کنترل می شود که به اثر هم افزایی ایمیکویمود و Fc-CV1 نسبت داده می شود.

شکل 4. زنده ماندن سلول های تیمار شده با Fc-CV1، imiquimod، CLPs، ILPs و CILPs به مدت 24 ساعت. غلظت Fc-CV1 و imiquimod هر دو 0-10 میکروگرم در میلی لیتر بود. * p < 0.05، ** p <0.01، ns=هیچ تفاوت معنی‌داری وجود ندارد

2.5. مطالعه توزیع زیستی

توزیع و تجمع فرمولاسیون های مختلف در تومورها و اندام های اصلی به طور مستقیم بر اثر درمانی تأثیر می گذارد. پس از تزریق داخل وریدی، سیگنال های فلورسانس با استفاده از یک سیستم vivisection مادون قرمز نزدیک برای ارزیابی توزیع و تجمع فرمول های مختلف در تومورها و اندام های اصلی پس از 24 ساعت بررسی شدند. همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است، شدت فلورسانس کل ILPs-Cy5 و CILPs-Cy5 بیشتر از Cy5 آزاد بود، که نشان می دهد لیپوزوم ها دارای خاصیت گردش طولانی در داخل بدن هستند. علاوه بر این، شدت فلورسانس گروه درمان CILPs-Cy5 در بافت تومور بالاترین میزان بود، که می‌توان آن را به اثر هدف‌گیری تومور لیگاندهای Fc-CV1 نسبت داد، در نتیجه اثر ضد توموری را افزایش داد. به طور قابل توجهی، شدت فلورسانس کبد و طحال نسبت به سایر اندام ها قوی تر بود، که احتمالاً به دلیل فاگوسیتوز لیپوزوم ها توسط سیستم رتیکولواندوتلیال (RES) در کبد و کلیه است [37].

شکل 5. توزیع Cy{1}}فلورسانس در تومورها و اندام های اصلی در 24 ساعت پس از تزریق داخل وریدی. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (n=3) نشان داده می شوند. **** p < 0.0001

2.6. مطالعه In Vivo مهار تومور

برنامه درمانی (شکل 6A) و اثرات آماده سازی های مختلف در شکل 6 نشان داده شده است. در مقایسه با گروه های PBS و LP، سایر گروه های درمانی اثرات سرکوبگر تومور خاصی را نشان دادند. قابل توجه است که حجم تومور پس از درمان با CILPs حداقل بود، که نشان می‌دهد CILPها دارای اثر سرکوب‌کننده تومور عالی هستند (شکل 6B).

شکل 6. (الف) تصویر شماتیک از درمان ضد سرطان کولون در مدل تومور CT26.WT. (ب) منحنی های رشد حجم تومور در طول دوره درمان. (C) عکس‌های تومور نسبی و (D) وزن تومور جمع‌آوری‌شده از گروه‌های درمانی مختلف در روز 17. (E) نسبت وزن بدن نسبی وزن بدن در مقایسه با 0 روز. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (n=5) ارائه می شوند. * p < 0.05، ** p < 0.01، *** p <0.001.

در پایان آزمایش، موش‌ها قربانی شدند و تومورهای آن‌ها برداشته شد، عکس‌برداری و وزن شد تا اثربخشی درمانی فرآورده‌های مختلف مشخص شود. همانطور که در شکل 6C، D نشان داده شده است، گروه درمانی CILPها کوچکترین و سبکترین تومورها را در مقایسه با سایر گروهها داشتند که نشان می دهد CILPها دارای بیشترین اثرات سرکوبگر تومور هستند. جدول 2 نشان می دهد که نرخ مهار رشد تومور CILPs 84.35 درصد محاسبه شده است. علاوه بر این، نرخ سرکوب تومور 84.35 درصد به طور قابل توجهی بالاتر از گروه های CLPs و ILPs بود، و این بدان معنی است که یک اثر هم افزایی از مسدود کردن محور "مرا نخور" و فعال شدن پاسخ ایمنی وجود دارد. . در مقایسه با آماده سازی معادل در شرایط آزمایشگاهی (2.5-5 میکروگرم در میلی لیتر)، نرخ مهار بالاتر ارتباط نزدیکی با پاسخ ایمنی فعال شده با فرمول داشت و مکانیسم فرار ایمنی را در داخل بدن مسدود کرد، که در شرایط آزمایشگاهی در دسترس نبود.

جدول 2. داده های وزن تومور و مهار رشد تومور (TGI) گروه های مختلف درمانی.

2.7. CILPs نفوذ سلول T و ترشح IFN را افزایش داد

برای کشف محیط سلول های ایمنی تومورها، سلول ایمنی القا شده توسط CILPs در پایان سنجش ضد تومور به صورت ایمونوهیستوشیمی تجزیه و تحلیل شد. سلول‌های CD{1}} و CD{2}} در بخش‌های توموری گروه‌های CILPs افزایش یافتند (شکل 7). تحویل همزمان Fc-CV1 و درمان با ایمیکیمود منجر به نفوذ قابل توجهی به سلول های CD4+ و CD8+ T شد. علاوه بر این، ترشح IFN قابل توجهی در تومورهای تحت درمان با CILPs وجود داشت که به این دلیل بود که CILPs گیرنده Toll مانند 7 را تحریک می کرد و پاسخ ایمنی را فعال می کرد.

شکل 7. ایمونوهیستوشیمی بافت تومور موش. سلول های مثبت قهوه ای رنگ می شوند. نوار مقیاس، 50 میکرومتر (n=5).

2.8. ارزیابی امنیت زیستی CILPs

ایمنی زیستی درمان با واسطه CILPs نیز از نظر دسترسی به ارزیابی درمانی شاخص مهمی بود. در طول مطالعه مهار تومور در داخل بدن، CILPها کاهش وزن قابل توجهی را در دوره درمان ایجاد نکردند (شکل 6D). پارامترهای بیوشیمیایی کبد و کلیه مطابق با محدوده مرجع استاندارد موش ها (جدول 3) همه در محدوده نرمال قرار داشتند و بافت شناسی اندام هیچ تغییر قابل توجهی نشان نداد که نشان می دهد CILP ها ایمنی زیستی عالی دارند (شکل 8). این یافته ها در ارزیابی پتانسیل CILPs به عنوان یک عامل ایمنی درمانی ایمن و موثر برای درمان سرطان بسیار مهم هستند.

جدول 3. پارامترهای بیوشیمیایی کبد و کلیه

شکل 8. رنگ آمیزی H&E (هماتوکسیلین و ائوزین) اندام های اصلی. نوار مقیاس، 50 میکرومتر (n=3)

3. مواد و روشها

3.1. مواد

Imiquimod از MedChem Express (شانگهای، چین) خریداری شد. Fc-CV1 توسط آزمایشگاه کلیدی دولتی داروهای آنتی بادی و درمان هدفمند ارائه شده است. کلسترول، لسیتین هیدروژنه (HSPC)، DSPE-PEG2000، DSPE-PEG2000-NHS، و DSPE-PEGCy5 از شرکت فناوری بیولوژیکی Xi'an Ruixi (Xi'an، چین) خریداری شد. 40،6-دیامیدینو{10}}فنیلندول (DAPI) از Keygen Biotech (نانجینگ، چین) به دست آمد. سولفات آمونیوم از سینوفارم (شانگهای، چین) به دست آمد. متانول (درجه کروماتوگرافی) و استونیتریل (گرید کروماتوگرافی) از شرکت معرف علاءالدین (شانگهای، چین) خریداری شد. سایر معرف ها همگی از درجه آنالیتیک داخلی هستند. رده سلولی سرطان روده بزرگ موش CT26. WT توسط بانک سلولی آکادمی علوم چین ارائه شد. سلول ها در یک انکوباتور سلولی در محیط RPMI 1640 حاوی 10٪ FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) در 5٪ CO2 و 95٪ هوا رشد کردند. موش های ماده BALB/c 4-6 هفته ای توسط شرکت پرورش حیوانات آزمایشگاهی Pengyue (جینان، چین) عرضه شدند.

3.2. تهیه لیپوزوم های خالی

ابتدا 13.455 میلی گرم HSPC، 4.3595 میلی گرم DSPE-PEG2{8}}00 و 4.7095 میلی گرم کلسترول به طور دقیق وزن شده و در 0.1 میلی لیتر اتانول (HSPC: DSPE-PEG2000: کلسترول:{12}}5) حل شد. نسبت مولی 5.05:39.3). ثانیا، محلول اتانول به سرعت از طریق یک سرنگ به محلول سولفات آمونیوم از قبل گرم شده (250 میلی‌مولار، 1 میلی‌لیتر، دمای 65 درجه سانتیگراد) تزریق شد و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد با هم زدن مغناطیسی انکوبه شد. پس از آن، محلول آماده شده به طور متوالی از طریق غشاهای پلی کربنات (Avanti، Alabaster، AL، USA) اکسترود شد. اندازه به ترتیب 200 نانومتر، 100 نانومتر و 50 نانومتر بود. در نهایت، محلول به دست آمده لیپوزوم های خالی (LPs) با غلظت لیپید 22.5 میلی گرم بر میلی لیتر بود.

3.3. تهیه لیپوزوم های هدفمند با ایمیکیمود در محصور شده CD47

ابتدا DSPE-PEG2000-NHS در ddH2O (60 ◦C) حل شد و سپس با Fc-CV1 مخلوط شد و در یک میز تکان دهنده در دمای اتاق به مدت 5 ساعت انکوبه شد (Fc-CV1:DSPEG2000- NHS=12:1 نسبت مولی). مکانیسم واکنش شیمیایی اتصال بین Fc-CV1 و DSPE-PEG{15}}NHS درگیر واکنش استر NHS با آمین اولیه روی Fc-CV1 و تشکیل یک پیوند آمین جدولی بود. محلول تهیه شده به طور متناسب با LPs مخلوط شد و در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت انکوبه شد تا Fc-CV1 در لیپوزوم ها وارد شود که به آن "پس از درج" نامگذاری شد [38]. نسبت مخلوط این بود که 2.25 میلی گرم Fc-CV1 در هر 22.5 میلی گرم لیپوزوم اصلاح شد. سپس لیپوزوم هدف CD47 (CLPs) بدست آمد.

متعاقباً، CLP ها در یک کیسه دیالیز (300 کیلو دالتون) قرار داده شدند و برای حذف سولفات آمونیوم و باقیمانده Fc-CV1 در فاز آبی بیرونی، در برابر HEPES (10 میلی‌مولار، pH=7}.4) به مدت 1 ساعت دیالیز شدند. CLP های دیالیز شده با محلول ایمیکیمود (5 میلی گرم بر میلی لیتر) با نسبت 1 میلی گرم به 7 میکرومول کل فسفولیپیدها در دمای اتاق به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس در برابر PBS (300 کیلو دالتون) سه بار دیالیز شدند تا ایمیکیمود بدون کپسول حذف شود. تکنیک گرادیان سولفات آمونیوم [39]. سپس CILP ها به دست آمد. علاوه بر این، لیپوزوم‌های غیر CD{14}}ایمیکویمود کپسوله‌شده (ILP) آماده شدند. CLP و ILP به عنوان کنترل برای CILP در نظر گرفته شد.

3.4. تعیین مشخصات

مورفولوژی این لیپوزوم ها با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM، Joel، توکیو، ژاپن) عکسبرداری شد. اندازه، پتانسیل زتا و شاخص پراکندگی پلیمری (PDI) این لیپوزوم ها با پراکندگی نور دینامیکی (DLS) و پراکندگی نور الکتروفورتیک (ELS) با استفاده از سایزر زتا مالورن ZSE (مالورن، انگلستان) تعیین شد. سرعت اتصال (BR) Fc-CV1 وارد شده به لیپوزوم ها با الکتروفورز ژل لوریل سولفات-پلی آکریل آمید سدیم 15% (SDS-PAGE) و نرم افزار Image J (Bethesda, MD, USA) اندازه گیری شد. راندمان کپسولاسیون (EE) imiquimod توسط کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC، Thermo Fisher Scientific، نیویورک، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) شناسایی شد.

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

3.5. مطالعه جذب سلولی در شرایط آزمایشگاهی

جذب سلولی در شرایط آزمایشگاهی این لیپوزوم ها با شدت فلورسانس تجمعی Cy5 در CT26 تعیین شد. سلول های WT DSPE-PEG-Cy5 با CILPs و ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs یا ILPs=1:5 نسبت جرمی) به ترتیب در دمای 60 ◦C به مدت 1 ساعت و سپس لیپوزوم های فلورسنت انکوبه شد. به نام های CILPs-Cy5 و ILPs-Cy5 به دست آمد. سلول‌های CT26.WT در 96-صفحه‌های چاهک کاشته شدند و به‌طور تصادفی به سه گروه (1 × 104 سلول در چاه، n=3) تقسیم شدند. پس از اینکه غلظت سلولی به 50 تا 70 درصد رسید، هر گروه به ترتیب با Cy5، ILPs-Cy5 و CILPs-Cy5 آزاد به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند، که در آن غلظت نهایی Cy5 1 میکروگرم در میلی لیتر بود. 0.1 میلی لیتر RPMI 1640 متوسط. پس از آن، سلول ها پس از دو بار شستشو با PBS به مدت 15 دقیقه توسط پارافورمالدئید 4 درصد بی حرکت شدند و سپس با 10 میکرولیتر DAPI (1 میکروگرم بر میکرولیتر) پس از دو بار شستشو با PBS به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. در نهایت، جذب هر گروه از سلول ها توسط یک سیستم تصویربرداری با محتوای بالا (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) پس از دو بار شستشو با PBS ثبت شد.

3.6. مطالعه انتشار Imiquimod

منحنی‌های آزادسازی لیپوزوم‌های مختلف بارگذاری شده با دارو با استفاده از روش دیالیز (3{2}}0 کیلو دالتون) انجام شد و نتایج با محلول رایگان imiquimod مقایسه شد. به طور خلاصه، 0.6 میلی‌لیتر ILPs، CILPs و محلول ایمیکیمود به طور جداگانه در کیسه‌های دیالیز بسته‌بندی شدند و سپس در 500 میلی‌لیتر محلول PBS (pH=7.4، 37 ◦C) قرار گرفتند. حجم مساوی از نمونه ها در بازه های زمانی از پیش تعیین شده (0، 0.5، 1، 2، 4، 6، 8، 10، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت) و سرعت رهاسازی (RR) از کیسه ها استخراج شد. imiquimod با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

جایی که Sund و Sd به ترتیب در زمان‌های مختلف (n=3) منطقه اوج HPLC imiquimod را در آماده‌سازی‌های پیش دیالیز شده و دیالیز شده نشان دادند.

3.7. سمیت سلولی CILPs

سلول‌های CT{{0}}. سلول‌های WT در 96-صفحه چاهک (1 × 104/چاه، n=3) کاشته شدند و در 100 میکرولیتر محیط کشت RPMI 1640 تا زمان تلاقی کشت شدند. نزدیک به 70 درصد رسیده است. به منظور تعیین سمیت سلولی CILPs، محیط RPMI 1640 از هر چاه برداشته شد و با محلول پیچیده ای از CILPs و محیط RPMI 1640، با غلظت Fc-CV1 و imiquimod در محدوده 0 تا 10 میکروگرم بر میلی لیتر جایگزین شد. سلول ها با محلول کمپلکس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. علاوه بر این، سلول هایی که با Fc-CV1، CLPs، محلول ایمیکیمود و ILPs در غلظت مشابه تیمار شدند، گروه کنترل در نظر گرفته شدند. سلول‌های زنده‌مانده با آزمایش CCK{17}} پس از 24 ساعت شناسایی شدند و زنده‌مانی سلول‌های تیمار نشده 100 درصد در نظر گرفته شد.

3.8. مطالعه توزیع زیستی

نه موش ماده BALB/c به صورت زیر جلدی CT26 تزریق شد. سلول های WT (5×105) در سمت راست و این موش های حامل تومور به طور تصادفی به سه گروه (n=3) تقسیم شدند. حجم تومور با استفاده از کولیس اندازه گیری شد و با فرمول زیر محاسبه شد:

هنگامی که حجم تومور به 1{8}}0 میلی‌متر مکعب رسید، Cy5 آزاد، ILP-Cy5 و CILPs-Cy5 به صورت داخل وریدی با دوز Cy5 mg/kg 4/0 تزریق شد. بیست و چهار ساعت پس از تزریق داخل وریدی، تومور، قلب، کبد، طحال، ریه و کلیه خارج شد. سیگنال های فلورسانس تومورها و اندام های اصلی توسط سیستم تصویربرداری نوری IVIS (IVIS Lumina LT III، PerkinElmer، Waltham، MA، ایالات متحده آمریکا) شناسایی شد.

3.9. مطالعه In Vivo مهار تومور

سی و پنج موش ماده BALB/c به طور تصادفی به هفت گروه (n=5) و 5 × 105 CT26 تقسیم شدند. سلول های WT به صورت زیر جلدی به سمت راست هر موش تزریق شد. هنگامی که اندازه تومور موش حدود 100 میلی متر مکعب بود، درمان شروع شد. PBS، LPs، imiquimod، Fc-CV1، ILPs، CLPs و CILPs در روزهای 0، 4، 8 و 12 به صورت داخل وریدی تزریق شدند. دوز ایمیکیمود 2.5 mg/kg در تزریق اول و دوم و mg/kg 5 بود. در تزریق سوم و چهارم در تمام تزریقات، دوز Fc-CV1 mg/kg 5 بود. در این دوز، غلظت دارو در بدن 5/2 تا 5 میکروگرم بر میلی لیتر بود که در یک آزمایش آزمایشگاهی سمیت سلولی را روی سلول ها اعمال کرد. قطر تومور و وزن بدن هر روز در طول درمان اندازه گیری شد. در روز 17، تومورهای موش‌ها خارج و وزن آنها اندازه‌گیری شد. مهار رشد تومور (TGI) طبق فرمول زیر محاسبه شد:

3.10. ایمونوهیستوشیمی

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی CD4، CD8 و IFN در بافت تومور طبق یک پروتکل استاندارد انجام شد. پس از پارافین زدایی و آبگیری مجدد بخش پارافینی بخش های بافت تومور، 3% BSA به دایره اضافه شد تا بافت را بپوشاند و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق مهر و موم شد. بخش ها با آنتی بادی های CD4، CD8 و IFN (Servicebio، ووهان، چین) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد رنگ آمیزی شدند و سپس با یک آنتی بادی ثانویه (HRP نشاندار شده، Servicebio، ووهان، چین) در دمای اتاق به مدت 50 دقیقه انکوبه شدند. بعد از دو بار شستشو با PBS در پایان، مقاطع زیر میکروسکوپ (Nikon، E100، توکیو، ژاپن) پس از واکنش با عامل کروموژنیک DAB مشاهده شدند.

cistanche tubulosa - سیستم ایمنی را بهبود می بخشد

3.11. ارزیابی امنیت زیستی CILPs

در پایان مطالعه مهار تومور، تمام تومورها جمع آوری و وزن این تومورها اندازه گیری شد. پارامترهای بیوشیمیایی، از جمله آلانین ترانس آمیناز (ALT)، آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، کراتینین (CREA) و اوره (UREA)، در خون موش ها شناسایی شد. بافت‌های تازه تومور و اندام‌های اصلی با 4% پارافورمالدئید تثبیت شدند و با استفاده از دستگاه جاسازی در پارافین جاسازی شدند (Wuhan Junjie Electronics، JB-P5، ووهان، چین). برش های بافت با ضخامت 5 میکرومتر از طریق میکروتوم (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, China) بریده شد و سپس طبق پروتکل با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شد. پس از آن، برش های رنگ آمیزی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد (Nikon، E100، توکیو، ژاپن).

3.12. تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± SD بیان می شوند. سطح معنی داری بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه با استفاده از Graphpad Prism 8 مورد آزمون قرار گرفت.{2}}.2. p < 0.05 به عنوان یک تفاوت معنی دار تعریف شد.

3.13. اخلاق حیوانات

همه رویه‌ها و توصیه‌های مربوط به حیوانات توسط کمیته ویژه اخلاق تحقیقات علمی دانشگاه لیائوچنگ با پیروی از دستورالعمل‌های ملی برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی تأیید شد (کد تأیید: 2022111010؛ تاریخ تأیید: 1 نوامبر 2022).

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

4. نتیجه گیری

به طور خلاصه، لیپوزوم‌های هدف‌دار CD{1}} محصور شده با ایمیکیمود با موفقیت توسعه یافتند و نتایج آزمایشگاهی ثابت کرد که CILP‌ها دارای رهایش پایدار بهتر و اثر هدف‌گیری خاص هستند. نتایج in vivo نشان داد که این آماده سازی می تواند به طور موثر توسط سلول های تومور جذب شود و به دلیل عملکرد دوگانه پاسخ ایمنی و محاصره ایست بازرسی ایمنی ذاتی، کارایی و ایمنی زیستی عالی درمان تومور را نشان می دهد. بنابراین، به نظر می‌رسد لیپوزوم‌های محصور شده با ایمی‌کویمود همراه با Fc-CV1، نانوپزشکی جدید امیدوارکننده‌ای برای بهبود درمان تومور بیان CD47 باشد. ایمونوتراپی مبتنی بر ایمنی ذاتی ممکن است به عنوان یک استراتژی کلی در برابر رشد تومور برای ترکیبات هم افزایی با ICB در آینده عمل کند.

منابع

1. سونگ، اچ. فرلی، جی. Siegel, RL; لاورسان، ام. سورجوماتارام، آی. جمال، ع. Bray, F. آمار جهانی سرطان 2020: برآوردهای گلوبوکان از بروز و مرگ و میر در سراسر جهان برای 36 سرطان در 185 کشور. CA Cancer J. Clin. 2021، 71، 209-249. [CrossRef] [PubMed]

2. کارلسون، RD; Flickinger, JC, Jr. Snook، AE Talkin' Toxins: from Coleys to Modern Cancer Immunotherapy. Toxins 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. باربری، ج. فونتین، تی. پاراجولی، پ. لامیچه خانه، ن. یاکوبسکی، اس. لامیخانه، پ. Deshmukh، RR ایمونوتراپی و استراتژی های ترکیبی برای ایمونوآنکولوژی. بین المللی جی. مول. علمی 2020، 21، 5009. [CrossRef]

4. هگده، ص. چن، DS 10 چالش برتر در ایمونوتراپی سرطان. مصونیت 2020، 52، 17-35. [CrossRef]

5. جین، KK شخصی ایمونوآنکولوژی. پزشکی پرنس تمرین کنید. 2021، 30، 1-16. [CrossRef]

6. Sanmamed, MF; چن، ال. تغییر پارادایم در ایمونوتراپی سرطان: از بهبود به عادی سازی. Cell 2018, 175, 313-326. [CrossRef]

7. حسین، WM; لیو، تی. اسکوارچینسکی، م. توث، I. آگونیست‌های گیرنده‌های مشابه تلفات: بررسی ثبت اختراع (2011-2013). نظر کارشناس آنجا پت. 2014، 24، 453-470. [CrossRef]

8. چی، ح. لی، سی. ژائو، FS؛ ژانگ، ال. Ng، TB; جین، جی. Sha, O. فعالیت ضد توموری آگونیست های گیرنده 7 شبه عوارض. جلو. داروسازی 2017, 8, 304. [CrossRef] [PubMed]

9. وانگ، ی. ژانگ، اس. لی، اچ. وانگ، اچ. ژانگ، تی. هاچینسون، ام آر. یین، اچ. وانگ، ایکس. تعدیل‌کننده‌های مولکول کوچک گیرنده‌های تلفن مانند. Acc. شیمی. Res. 2020، 53، 1046-1055. [CrossRef] [PubMed]

10. لو مرسیه، آی. پوژول، دی. سانلاویل، ا. سیسیرک، وی. گوبرت، ام. دیورند، من. دوبوا، بی. Treilleux, I.; مارول، جی. ولاچ، ج. و همکاران ارتقای تومور توسط سلول های دندریتیک پلاسماسیتوئید داخل توموری با درمان لیگاند Tlr7 معکوس می شود. سرطان Res. 2013، 73، 4629-4640. [CrossRef]

11. ما، ف. ژانگ، جی. ژانگ، جی. Zhang, C. آگونیست های Tlr7 Imiquimod و Gardiquimod ایمونوتراپی مبتنی بر DC را برای ملانوما در موش ها بهبود می بخشند. سلول. مول. ایمونول. 2010، 7، 381-388. [CrossRef]

12. بیلان، اس. Kaidar-Person، O.; Gil, Z. درمان پس از پیشرفت در عصر ایمونوتراپی. Lancet Oncol. 2020، 21، e463–e476. [CrossRef] [PubMed]

13. داروین، پ. Toor, SM; ساسیدهران نیر، وی. Elkord، E. بازدارنده‌های ایمونوئن بازرسی: پیشرفت اخیر و نشانگرهای زیستی بالقوه. انقضا مول. پزشکی 2018، 50، 1-11. [CrossRef] [PubMed]

14. لی، بی. چان، اچ ال. چن، P. بازدارنده‌های ایمن بازرسی: مبانی و چالش‌ها. Curr. پزشکی شیمی. 2019، 26، 3009–3025. [CrossRef] [PubMed]

15. جیا، X. یان، بی. تیان، ایکس. لیو، کیو. جین، جی. شی، ج. Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway واسطه گریز ایمنی سرطان و ایمونوتراپی است. بین المللی جی بیول. علمی 2021، 17، 3281-3287. [CrossRef]

16. سوبودا، دی.م. Sallman، DA وعده مهار کننده های پست بازرسی هدایت شده توسط ماکروفاژها در بدخیمی های میلوئید. بهترین روش و تحقیق. کلین هماتول. 2020, 33, 101221.

17. لنتز، RW; کلتون، MD; میترا، اس.اس. مسرسمیت، WA مهارکننده های ایست بازرسی ذاتی ایمنی: پیشرفت بعدی در انکولوژی پزشکی؟ مول. سرطان وجود دارد. 2021، 20، 961-974. [CrossRef]

18. جیانگ، پی. Lagenaur، CF; نارایانان، V. پروتئین مرتبط با اینتگرین یک لیگاند برای مولکول چسبندگی عصبی P84 است. جی بیول. شیمی. 1999، 274، 559-562. [CrossRef]

19. سیفرت، م. کانت، سی. چن، ز. راپلد، آی. بروگر، دبلیو. کانز، ال. براون، EJ; اولریچ، ا. پروتئین تنظیم‌کننده سیگنال انسانی Buhring، HJ بر روی زیرمجموعه‌های سلول‌های میلوئیدی لوسمیک بیان می‌شود، اما نه در زیرمجموعه‌های سلول‌های میلوئیدی لوسمیک و واسطه چسبندگی سلولی شامل ضد گیرنده Cd47 آن است. Blood 1999، 94، 3633-3643. [CrossRef]

20. Matlung، HL; سیلاگی، ک. بارکلی، NA; ون دن برگ، TK Cd47-محور سیگنال دهی سیرپالفا به عنوان یک نقطه بازرسی ایمنی ذاتی در سرطان. ایمونول. Rev. 2017, 276, 145-164. [CrossRef] [PubMed]

21. اولدنبورگ، PA; ژلزنیاک، آ. نیش، YF; Lagenaur، CF; گرشام، HD; لیندبرگ، نقش FP Cd47 به عنوان نشانگر خود در گلبول های قرمز خون. Science 2000, 288, 2051-2054. [CrossRef]

22. لی، ز. لی، ی. گائو، جی. فو، ی. هوآ، پی. جینگ، ی. کای، م. وانگ، اچ. Tong, T. نقش Cd47-ایمنی سرپالفا در فرار ایمنی تومور و ایمونوتراپی ذاتی. زندگی علمی. 2021, 273, 119150. [CrossRef]

23. حیات، اس ام جی; بیانکونی، وی. پیررو، م. جعفری، محمدرضا; حاتمی پور، م. صاحبکار، A. Cd47: نقش در سیستم ایمنی و کاربرد در درمان سرطان. سلول. اونکول. 2020، 43، 19-30. [CrossRef]

24. هوانگ، ی. ممکن است.؛ گائو، پی. Yao, Z. هدف گیری Cd47: دستاوردها و نگرانی های مطالعات فعلی در مورد ایمونوتراپی سرطان. جی. توراک. دیس 2017، 9، E168–E174. [CrossRef]

25. ژانگ، دبلیو. هوانگ، Q. شیائو، دبلیو. ژائو، ی. پی، جی. خو، اچ. ژائو، اچ. خو، جی. ایوانز، CE; جین، اچ. پیشرفت در درمان های ضد تومور با هدف قرار دادن محور Cd47/Sirpalpha. جلو. ایمونول. 2020، 11، 18. [CrossRef] [PubMed]

26. لیو، ایکس. Pu، Y. کرون، ک. دنگ، ال. کلاین، جی. Frazier، WA; خو، اچ. پنگ، اچ. فو، YX; Xu, MM Cd47 Blockade باعث تخریب تومورهای ایمنی با واسطه سلول T می شود. نات پزشکی 2015، 21، 1209-1215. [CrossRef] [PubMed]

27. ویسکوپف، ک. حلقه، AM; هو، سی سی; Volkmer، JP; لوین، AM; Volkmer، AK; اوزکان، ای. فرنهوف، NB; ون دی راین، م. وایزمن، ایلنا؛ و همکاران انواع سیرپالفای مهندسی شده به عنوان کمک های ایمنی درمانی برای آنتی بادی های ضد سرطان. علوم 2013، 341، 88-91. [CrossRef]

28. Xiong، Z. Ohlfest, JR موضعی Imiquimod دارای اثرات درمانی و تعدیل کننده ایمنی در برابر تومورهای داخل جمجمه است. J. Immunother. 2011، 34، 264-269. [CrossRef]

29. کامات، ص. داروین، ای. آرورا، اچ. نوری، ک. مروری بر درمان Imiquimod و بحث در مورد مدیریت بهینه کارسینوم سلول بازال. کلین بررسی مواد مخدر 2018، 38، 883-899. [CrossRef]

30. لیو، ی. کاسترو براوو، KM; لیو، جی. تحویل داروی لیپوزومی هدفمند: دیدگاه نانو علم و بیوفیزیکی. هوریز در مقیاس نانو. 2021، 6، 78-94. [CrossRef] [PubMed]

31. فرجادیان، ف. قاسمی، ع. گوهری، ا. Roointan، A. کریمی، م. هامبلین، نانوداروها و نانوداروها در حال حاضر در بازار: چالش ها و فرصت ها. نانوپزشکی 2019، 14، 93-126. [CrossRef]

32. ژو، ایکس. جیائو، ال. کیان، ی. دونگ، کیو. سان، ی. ژنگ، دبلیو. ژائو، دبلیو. ژای، دبلیو. کیو، ال. وو، ی. و همکاران تغییر موقعیت آزلنیدیپین به عنوان یک مهارکننده دوگانه که مسیرهای Cd47/Sirpalpha و Tigit/Pvr را برای ایمونوتراپی سرطان هدف قرار می دهد. Biomolecules 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. نی، ک. لو، تی. کولبرت، ا. کافمن، ام. جیانگ، ایکس. Lin, W. Framework Metal-Organic Nanoscale آگونیست‌های Tlr-7 و آنتی‌بادی‌های ضد Cd47 را برای تعدیل ماکروفاژها و هماهنگ‌سازی ایمنی درمانی سرطان ارائه می‌کند. مربا. شیمی. Soc. 2020، 142، 12579–12584. [CrossRef]

34. چن، ق. خو، ال. لیانگ، سی. وانگ، سی. پنگ، آر. Liu, Z. فوتوترمال درمانی با نانوذرات کمکی ایمنی همراه با محاصره نقطه بازرسی برای ایمونوتراپی موثر سرطان. نات اشتراک. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. وی، جی. لانگ، ی. گوا، آر. لیو، ایکس. تانگ، ایکس. رائو، جی. یین، اس. ژانگ، ز. لی، ام. او، Q. شیمی ایمونوتراپی مبتنی بر میسل پلیمری چندمنظوره با محاصره نقاط بازرسی ایمنی برای درمان موثر سرطان پستان ارتوتوپیک و متاستاتیک. اکتا فارم. گناه B 2019, 9, 819–831. [CrossRef]

36. هوانگ، سوئد; وانگ، ST; چانگ، SH; چوانگ، KC; وانگ، هی. کائو، جی کی. لیانگ، اس ام. وو، سی. کائو، SH; چن، YJ; و همکاران Imiquimod با القای مرگ سلولی ایمنی زا اثرات ضد توموری دارد و توسط مهارکننده گلیکولیتیک 2-دئوکسی گلوکز تقویت می‌شود. ج. تحقیق. درماتول. 2020، 140، 1771-1783.e6. [CrossRef] [PubMed]

37. وانگ، بی. او، X. ژانگ، ز. ژائو، ی. Feng, W. متابولیسم نانومواد در داخل بدن: گردش خون و پاکسازی اندام. Acc. شیمی. Res. 2013، 46، 761-769. [CrossRef]

38. اختری، ج. رضایت، س.م. تیموری، م. علوی زاده، ش. غیبی، ف. بدیعی، ع. جعفری، MR Targeting، Bio Distributive و Tomor Growth Growth Inhibiting of Anti-Her2 Affibody Coupling to Liposomal Doxorubicin Using Balb/C Mice Bearing Tubo Tubo. بین المللی جی. فارم. 2016، 505، 89-95. [CrossRef]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos، D. آماده سازی لیپوزوم و تعیین اندازه. روش ها آنزیمول. 1989، 171، 193-217. [PubMed]