فعال سازی ماکروفاژها توسط ساکاریدهای با وزن مولکولی کم از سیستانش دسرتیکولا

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

انتزاعراکت

بررسی اثر فعال سازی ایمنی و مکانیسم ساکاریدهای با وزن مولکولی پایین ازCistanche deserticola(LMSC) روی ماکروفاژهای صفاقی موش، RAW264. 7 سلول. RAW264. 7 سلول به گروه کنترل نرمال، گروه کنترل مثبت LPS و گروه درمان LMSC تقسیم شدند. RAW264. 7 سلول با غلظت‌های مختلف LMSC از 3. 91 تا 62. 5 g·L تا 1 تیمار شدند. از روش قرمز خنثی برای تشخیص فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها استفاده شد. انتشار NO با استفاده از کیت NO و سطوح بیان پروتئین مرتبط با فعال سازی ماکروفاژ (TNF-، IL{12}}، IKK، p-IKK، IκB، p-IκB، NF-kB، و p-NF-kB) شناسایی شد. توسط وسترن بلات شناسایی شدند. نتایج نشان داد که LMSC اثر فعال سازی بر روی ماکروفاژها دارد. می تواند به طور قابل توجهی انتشار NO را در RAW264 افزایش دهد. 7 سلول و ترویج بیان سیتوکین های TNF- و IL{21}}. علاوه بر این، LMSC به طور قابل توجهی فسفوریلاسیون IKK، IκB، و NF-kB p65 را افزایش داد. علاوه بر این، مانیتول یکی از اجزای اصلی در LMSC به طور قابل توجهی فعالیت فاگوسیتی ماکروفاژها را افزایش داد. این نتایج نشان داد که LMSC می تواند ماکروفاژها را با تنظیم کردن مسیر سیگنالینگ NF-kB فعال کند و مانیتول ممکن است یکی از اجزای اصلی فعال در LMSC باشد.

［کلمات کلیدی］ ساکاریدهای با وزن مولکولی کم. Cistanche deserticola; فعال سازی سیستم ایمنی؛ ماکروفاژ؛ عامل التهابی؛ NF-kB

Cistanche deserticola YC Maگیاهی است متعلق به تیرهCistanche deserticolaYC Ma. از ساقه گوشتی آن می توان به عنوان دارو استفاده کرد. عملکردهای تغذیه کننده یانگ کلیه، تغذیه کننده جوهر و خون و مرطوب کننده روده ها است. به نام "جین سینگ صحرا" معروف است. ترکیبات شیمیایی سیستانچ شامل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، گلیکوزیدهای ایریدوئید، قندها، لیگنان ها و بسیاری از انواع دیگر است. مطالعات فارماکولوژیک مدرن نشان داده‌اند که سیستانچ دارای فعالیت‌های بیولوژیکی زیادی مانند محافظت عصبی، ضد تومور، تنظیم ایمنی، ضد التهاب و آنتی‌اکسیدان است [1]. مطالعات نشان داده است که جوشانده سیستانچ و پلی ساکاریدها می تواند به طور قابل توجهی توانایی فاگوسیتی و عملکرد ترشح ماکروفاژها را بهبود بخشد [2-3]. با این حال، هیچ گزارشی در مورد تحقیقات فعالیت کربوهیدرات های با وزن مولکولی پایین آن وجود ندارد. بنابراین، در این مطالعه از سیستم کشت آزمایشگاهی RAW264 استفاده شد. 7 ماکروفاژ صفاقی موش برای کشف فعالیت تعدیل کننده ایمنی و مکانیسم های مرتبط کربوهیدرات های کم وزن مولکولی Cistanche. این تحقیق می تواند شواهد تجربی بیشتری برای درک جامع ازاثر تعدیل کننده سیستم ایمنی سیستانچدر آینده، به منظور هدایت بیشتر کاربرد بالینی آن.

Cistanche deserticola اثرات زیادی دارد، برای اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مواد

RAW264. 7 سلول از مرکز سلولی آکادمی علوم پزشکی چین خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS) از PAN Biotech، آلمان خریداری شد. آنتی بیوتیک ها و محیط DMEM از Zhongke Machen Technology Co., Ltd. لیپوپلی ساکارید از Escherichia coli O55:B5 (LPS) از شرکت Sigma، ایالات متحده خریداری شد. یک کیت اکسید نیتریک (NO) از موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ خریداری شد. کیت نورتابی شیمیایی ECL از Thermo Fisher، ایالات متحده آمریکا خریداری شد. آنتی بادی از Cell Signaling Technology، ایالات متحده آمریکا خریداری شد. گلیکوزیدهای کل سیستانش، قندهای با وزن مولکولی کم سیستانش و پلی ساکاریدهای سیستانش توسط گروه تحقیقاتی ما ساخته شده بودند. کسر جرمی گلیکوزید کل سیستانش 76/78 درصد بود. کسر جرمی قندهای با وزن مولکولی کم ازCistanche deserticola58. 00 درصد و کسر جرمی استCistanche deserticolaپلی ساکاریدها 65.24 درصد است. تانون-5200سیستم اسپلیت تصویربرداری مولتی ژل از شرکت فناوری Tianneng شانگهای خریداری شد. میکروپلیت خوان Sunrise-Basic از شرکت TECAN خریداری شده است.

2. روش

2. 1 روش قرمز خنثی برای اندازه گیری فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها

ماکروفاژهای صفاقی موش را در مرحله رشد لگاریتمی بردارید، پس از تریپسینیزاسیون، سلول ها را بشمارید، تعداد سلول ها را به 5 × 104 سلول در میلی لیتر تنظیم کنید و آنها را در یک 96-صفحه کشت سلول چاه، 100 میکرولیتر در چاه تلقیح کنید. در دمای 37 درجه کشت تحت شرایط 5 درصد CO2، پس از چسبیدن سلول ها به دیواره، مایع رویی کشت را دور بیندازید، محیط کشت DMEM (10 درصد FBS به اضافه 1 درصد P/S)، LPS (1 میلی گرم در لیتر الی 1) و سیستانچ را اضافه کنید. سیستانچ به ترتیب گلیکوزیدهای کل،سیستانچپلی ساکاریدهای کل، و قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ (به ترتیب 3.91 ~ 62.5 g·L -1، قبل از تجویز با یک غشای فیلتر فیلتر شده) کشت داده شدند. پس از کشت به مدت 48 ساعت، 10 0 میکرولیتر محلول نمک فیزیولوژیکی قرمز خنثی 0.075 درصد به هر چاهک اضافه کنید، کشت را به مدت 4 ساعت ادامه دهید، مایع رویی را آسپیره کنید، 3 بار با PBS بشویید، لیزات سلولی (اسید استیک یخبندان) را اضافه کنید. اتانول 1:1) 100 میکرولیتر، آن را به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه قرار دهید و پس از لیز شدن سلول ها، جذب (A540 نانومتر) را اندازه گیری کنید.

2. 2 تشخیص مقدار آزادسازی NO در مایع رویی سلول

RAW264 را تلقیح کنید. 7 سلول در یک صفحه چاهی (1 × 105 سلول در میلی لیتر، 500 میکرولیتر در چاه)، محیط کشت سلولی را پس از انکوباسیون یک شبه آسپیره کنید، محیط DMEM (10 درصد FBS به اضافه 1 درصد P/S) را اضافه کنید، 500 میکرولیتر هر یک از LPS (1 میلی گرم در لیتر -1) و گلیکوزید کل سیستانچ سیستانچ، پلی ساکارید کل، و قندهای با وزن مولکولی کم (به ترتیب 3.91 ~ 62.5 g·L -1). پس از 24 ساعت کشت القایی، مایع رویی جمع آوری شد. غلظت NO را در مایع رویی سلولی هر گروه با کیت NO تعیین کنید، دستورالعمل ها را دنبال کنید و در نهایت میزان جذب (A570 نانومتر) را با میکروپلیت خوان تشخیص دهید.

2. 3. وسترن بلات

RAW264 را تلقیح کنید. 7 سلول در یک صفحه چاهک، محیط کشت سلولی را پس از انکوباسیون یک شبه آسپیره کنید، محیط کشت DMEM (10 درصد FBS به اضافه 1 درصد P/S)، LPS (1 mg·L 1) و اضافه کنید.سیستانچپلی ساکاریدهای کل و قندهای با وزن مولکولی کم (3.91 ~ 62.5 g·L -1) هر کدام 2 میلی لیتر بودند، و مایع رویی پس از 24 ساعت کشت القایی دور انداخته شد. سلول ها دو بار با PBS شسته و دور ریخته شدند. پس از تریپسینیزاسیون، سلول ها به پایین پیپت می شوند. سانتریفیوژ کنید، مایع رویی را بردارید، 100 میکرولیتر NP40 Lysis Buffer اضافه کنید و به مدت 40 دقیقه روی یخ لیز کنید. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی گرفته شد و غلظت پروتئین با روش BCA تعیین شد و غلظت پروتئین هر هیستون به طور یکنواخت تنظیم شد. همان مقدار از نمونه های پروتئین را بردارید و روی 12 درصد SDS-PAGE تحت فشار ثابت جدا کنید. سپس با استفاده از مخزن الکتروفورز انتقال Bio-Rad غشا را با جریان ثابت 350 میلی آمپر به مدت 1 ساعت انتقال داده و پروتئین را به غشاء PVDF انتقال دهید (پیش تصفیه غشاء PVDF: خیساندن در متانول و تعادل با بافر انتقال). پس از مسدود کردن با شیر بدون چربی 5 درصد (پیکربندی شده با TBST حاوی 0.1 درصد توئین{20}}) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق، غشاء 3 بار با TBST شسته شد و غشاء در رقیق کننده آنتی بادی اولیه پروتئین در 4 انکوبه شد. درجه یک شبه غشا یک روز در میان 3 بار با TBST شسته شد و رقیق کننده مربوطه به مدت 1 ساعت انکوبه شد. غشاء 3 بار با TBST شسته شد و نوارها با توسعه دهنده نورتابی شیمیایی ECL توسعه یافتند.

2. 4 تجزیه و تحلیل داده ها

داده ها به صورت x ± s بیان می شوند و معنی داری تفاوت با استفاده از نرم افزار آماری GraphPad Prism 6 برای تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه مورد آزمایش قرار می گیرد. P را بگیرید<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. نتایج

3. 1. اثرات قندهای کم وزن مولکولی Cistanche cistanche، گلیکوزیدهای کل و پلی ساکاریدهای کل بر فعالیت فاگوسیتی RAW264. 7 سلول

تحقیقات بر روی ترکیبات شیمیایی سیستانچ نشان می دهد کهسیستانچعمدتا شاملگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی، گلیکوزیدهای ایریدوئید و کربوهیدرات ها. در این آزمایش، کل گلیکوزیدهای سیستانچ (شامل گلیکوزیدهای فنتیل الکل و گلیکوزیدهای ایریدوئید)، قندهای کم مولکولی و قندها انتخاب شدند. سه سایت فعال پلی ساکارید کل برای اثرات آنها بر فعال سازی RAW264 مورد بررسی قرار گرفت. 7 سلول. هم پلی ساکارید Cistanche cistanche و هم قند با وزن مولکولی کم cistanche می توانند به طور قابل توجهی فعالیت فاگوسیتی RAW264 را افزایش دهند. 7 سلول، اما فعالیت فاگوسیتی از گروه تجویز گلیکوزید کل به طور قابل توجهی تغییر نمی کند. علاوه بر این، داروی کنترل مثبت LPS نیز به طور قابل توجهی فعالیت فاگوسیتیک RAW264 را بهبود بخشید. 7 سلول، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است. نتایج فوق نشان می دهد که قندها و پلی ساکاریدهای با وزن مولکولی کم سیستانچ ممکن است اثر فعال کردن RAW264 را داشته باشند. 7 سلول.

3. 2. اثر گلیکوزیدهای کل سیستانچ، قندهای مولکولی کم و پلی ساکاریدهای کل بر محتوای اکسید نیتریک (NO) در مایع رویی سلول

به منظور بررسی بیشتر اثر فعال سازی سه سایت فعال Cistanche در RAW264. 7 سلول، محتوای NO در رویی سلول تحریک شده توسط داروهای مختلف تعیین شد. نتایج نشان داد که آزادسازی NO در گروه LPS به طور معنی داری بیشتر از گروه شاهد خالی بود (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">سیستانچتاثیر قابل توجهی نداشت. نتایج فوق نشان می دهد که هم پلی ساکاریدها و هم قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ می توانند آزادسازی NO از RAW264 را افزایش دهند. 7 سلول. در میان آنها، همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، تأثیر قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ بسیار مهم است.

3. 3. تأثیر قند سیستانچ با وزن مولکولی کم بر بیان پروتئین TNF- و IL{5}} در RAW264. 7 سلول

TNF- یک واسطه التهابی مهم است که در فرآیند فعال سازی RAW264 ظاهر می شود. 7 سلول، که می توانند سنتز و آزادسازی سایر سیتوکین ها (مانند IL{3}}) را تقویت کنند. نتایج نشان داد که بیان TNF- و IL{5}} پس از تحریک قند با وزن مولکولی کم سیستانچ سیستانچ به طور قابل توجهی افزایش یافت، که نشان می‌دهد قند با وزن مولکولی پایین سیستانچ ممکن است بیان TNF را افزایش دهد. - و IL{11}} در RAW264. 7 سلول، در نتیجه فعال کردن ایمنی سلولی فاگوسیتوز، به شکل 3 مراجعه کنید.

3. 4. اثر تنظیمی قند سیستانچ با وزن مولکولی کم بر مسیر سیگنالینگ IKK/IκB/NF-kB

به منظور بررسی مکانیسم بالقوه قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ در فعال کردن RAW264. 7 سلول، نویسندگان اثرات تنظیمی آن را روی مسیر سیگنالینگ کلاسیک IKK/IκB/NF-kB بررسی کردند. قند سیستانچ با وزن مولکولی کم می تواند فسفوریلاسیون NF-kB و فسفوریلاسیون پروتئین های سیگنال کلیدی بالادست آن IKK و IκB را به میزان قابل توجهی افزایش دهد و بیان کل پروتئین IκB را کاهش دهد، که نشان می دهد اثر فعال کننده ای بر IKK / دارد. مسیر سیگنالینگ IκB / NF-κB. داروی کنترل مثبت LPS نیز اثر تنظیمی مشابهی دارد. به طور خلاصه، قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ ممکن است مسیر سیگنالینگ IKK /IκB /NF-kB را فعال کرده و در نتیجه باعث سنتز و آزادسازی سایتوکین هایی مانند TNF- و IL{13}} و در نهایت باعث ایجاد ایمنی شود. فعال سازی RAW264 7 سلول، شکل 4 را ببینید.

3. 5. غربالگری مواد فعال با اثر فعال کننده ماکروفاژ در قندهای با وزن مولکولی کم Cistanche

آزمایشگاه ما قندهای کم مولکولی موجود در آن را تجزیه و تحلیل کرده استسیستانچدر مراحل اولیه مشخص شد که عمدتاً حاوی مانیتول (53/16 درصد)، ساکارز (34/8 درصد)، فروکتوز (38/25 درصد) و گلوکز (75/7 درصد) و سایر مواد است. بنابراین نویسنده از روش قرمز خنثی برای غربالگری اثر فعال سازی اجزای فوق بر روی ماکروفاژها استفاده کرد. مانیتول می تواند به طور قابل توجهی فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها را به صورت وابسته به دوز افزایش دهد، در حالی که اثرات سایر اجزا قابل توجه نیست. این نشان می دهد که مانیتول ممکن است یکی از اجزای فعال کلیدی در قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ سیستانچ برای فعال کردن ماکروفاژها باشد، همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است.

4. بحث

سیستانچ سیستانچ، گیاه انگلی از خانواده Lydanaceae، گزارش شده است که دارای اثرات تعدیل کننده سیستم ایمنی است، بنابراین باید حاوی مواد تعدیل کننده ایمنی باشد. در این آزمایش، نویسنده فعالیت فاگوسیتی ماکروفاژهای صفاقی موش را بر روی قسمت های مختلف خالص شده غربال کرد.سیستانچو دریافتند که قندها و پلی ساکاریدهای با وزن مولکولی کم سیستانچ اثر فعال شدن ماکروفاژها را دارند، اما کل گلیکوزیدهای سیستانچ مشخص نیست. در همان زمان، نویسنده دریافت که قندهای با وزن مولکولی پایین می توانند ماکروفاژها را در غلظت های پایین تر فعال کنند، بنابراین نویسندگان این مقاله را انتخاب کردند.سیستانچقندهای با وزن مولکولی پایین به عنوان تمرکز تحقیقات بعدی.

نویسندگان با بررسی اثر قند سیستانش با وزن مولکولی کم بر بیان سیتوکین‌های TNF- و IL{1}} دریافتند که قند سیستانش با وزن مولکولی پایین به طور قابل توجهی بیان TNF- و IL-6 را افزایش می‌دهد. همچنین ثابت کرد که قند سیستانچ با وزن مولکولی کم بر روی موش ها تأثیر دارد. ماکروفاژهای صفاقی اثر فعال کنندگی دارند. بنابراین نویسنده مکانیسم عمل بالقوه آن را بیشتر بررسی کرد. تحقیق داشته باشید

نشان داده شده است که لیپوپلی ساکارید باکتریایی (LPS) می تواند از طریق مسیرهای سیگنالی مانند JAK2/STAT3، NF-κB، p38/ERK و MAPK [4-8] باعث فعال شدن ماکروفاژهای موش و سلول های گلیال موش شود. مسیر NF-kB به عنوان یک مسیر کلاسیک شناخته شده است، بنابراین پروتئین های سیگنال در این مسیر در این آزمایش مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج نشان داد که قندهای با وزن مولکولی کم سیستانچ می توانند به طور قابل توجهی فسفوریلاسیون NF-kB و فسفوریلاسیون پروتئین های سیگنال دهنده کلیدی بالادست IKK و IκB را افزایش دهند، که نشان می دهد قندهای با وزن مولکولی پایینسیستانچممکن است غول های صفاقی موش را از طریق مسیر سیگنالینگ IKK /IκB /NF-kB فعال کند. سلول های فاژ سیتوکین های التهابی را آزاد می کنند و سپس در فعال سازی ایمنی سلولی نقش دارند.

در مراحل اولیه آزمایشگاه، ترکیب شیمیایی عصاره قندی با وزن مولکولی کم ازCistanche deserticolaبه طور سیستماتیک تجزیه و تحلیل شد. مشخص شده است که قندهای با وزن مولکولی پایین عمدتاً حاوی مونومرهایی مانند مانیتول، ساکارز، فروکتوز و گلوکز هستند. تحقیقات بیشتر نشان داد که مانیتول می تواند به طور قابل توجهی فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها را بهبود بخشد. بنابراین، حدس زده می شود که مانیتول ممکن است جزء کلیدی قندهای با وزن مولکولی پایین باشد که عملکرد ایمنی سلولی را فعال می کند.

به طور خلاصه، این مطالعه از ماکروفاژها در سیستم کشت آزمایشگاهی استفاده کرد و دریافت که قندهای با وزن مولکولی پایینسیستانچاثر فعال کننده قابل توجهی بر روی ماکروفاژها دارد و ممکن است ماکروفاژهای صفاقی موش را از طریق مسیر سیگنالینگ NF-kB فعال کند و سپس نقش داشته باشد. مانیتول موجود در قندهای با وزن مولکولی پایین ممکن است نقش مهمی در فعال کردن فعالیت فاگوسیتیک ماکروفاژها داشته باشد.

منابع

[1] تو پنگفی، گو یوهای. تکنیک های کشت سیستانچه بیابانی و میزبان آن تاماریکس [M]. پکن: انتشارات علمی، 2015:31.

[2] گائو شیائوکسیا، چن جون، پنگ یانلی. مروری بر تحقیقات اثرات فارماکولوژیکCistanche deserticolaپلی ساکارید [J]. غذا و دارو، 2015، 17(2):136.

[3] وانگ شیانگیان، چی یون، کای روسلان، و همکاران. فعال سازی ماکروفاژی پلی ساکارید سیستانش [J]. بولتن دارویی چینی، 2009، 25 (6): 787.

[4] لیو ژونگ یوان، لی یانپینگ. فعالیت بیولوژیکی و مکانیسم لیپوپلی ساکارید باکتریایی [J]. بررسی علوم پزشکی، 2010، 16(2):166.

[5] فو ژیهوی، زو لینگ، هوانگ جیائو و همکاران. LPS از طریق مسیر p38 /MAPK و فعال‌سازی NF-kB بیان HIF{3}} را در RAW264 القا می‌کند. 7 سلول [J]. مجله دانشگاه پزشکی چونگ کینگ، 2016، 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong، Chen Chunhai، Yang Xuesen و همکاران. مسیر سیگنالینگ JAK2/STAT3 در فعال شدن میکروگلیا (J］) ناشی از قند لیپو پلی دخیل است. مجله سومین دانشگاه علوم پزشکی نظامی، 1388، 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin، Liao Lixi، Dong Xin، و همکاران. گلیکوزیدهای مولباسکوم التهاب ناشی از لیپوپلی ساکارید میکروگلیاهای BV-2 و مکانیسم آن [J] را مهار می‌کنند. مجله چینی طب سنتی چینی، 2016، 41(13): 2506.