متابولیسم فلاونول کامپفرول در سلول های کلیه

مخاطب: emily.li@wecistanche.com

متابولیسم فلاونول کامپفرول در سلول های کلیه، حلقه B را آزاد می کند تا وارد بیوسنتز کوآنزیم Q شود.

لوسیا فرناندز دل ریو¹، و همکاران

خلاصهچکیده: کوآنزیم Q (CoQ) یک جزء ضروری از زنجیره انتقال الکترون میتوکندری و یک آنتی اکسیدان مهم موجود در تمام غشای سلولی است. کمبود CoQ در پیری و در بیماری‌های مرتبط با افزایش سن مکرر است و درمان‌های فعلی محدود به مکمل CoQ است. استراتژی هایی که بر مکمل CoQ متکی هستند از جذب و قاچاق ضعیف این مولکول بسیار آبگریز رنج می برند. در یک مطالعه قبلی، گزارش شده بود که فلاونول کامپفرول غذایی به عنوان پیش ساز حلقه CoQ عمل می کند و محتوای CoQ را افزایش می دهد.کلیهسلول ها، اما نه بخشی از مولکول که وارد بیوسنتز CoQ می شود و نه مکانیسم آن توضیح داده شد. در این مطالعه، کامفرول به طور خاص در حلقه B از گیاهان آرابیدوپسیس جدا شد.کلیهسلول هاتیمار شده با این ترکیب، حلقه B کامفرول را در CoQ تازه سنتز شده گنجانده است، که نشان می‌دهد حلقه B از طریق مکانیسمی که در سلول‌های گیاهی توصیف شده است متابولیزه می‌شود. کامفرول یک فلاونوئید طبیعی موجود در میوه ها و سبزیجات است و دارای خواص درمانی آنتی اکسیدانی، ضد سرطانی و ضد التهابی است. درک بهتر نقش کامفرول به عنوان پیش ساز حلقه CoQ، این ترکیب زیست فعال را به یک کاندید بالقوه برای طراحی مداخلاتی با هدف افزایش بیوسنتز CoQ درون زا تبدیل می کند و ممکن است فنوتیپ های کمبود CoQ را در پیری و بیماری بهبود بخشد.

کلید واژه ها فلاونوئیدها; فلاونول؛ کامفرول؛ کوآنزیم Q;کلیهسلول ها؛ پیش ساز

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

1. مقدمه

کوآنزیم Q (CoQ یا یوبی کینون) یک مولکول چربی دوست کوچک است که در همه جا در غشای سلولی یافت می شود. از نظر ساختاری، از یک حلقه بنزوکینون و یک دم پلی ایزوپرنوئید تشکیل شده است که طول آن بین گونه ها متفاوت است [1]. در پستانداران، CoQ9 (دم نه ایزوپرن) و CoQ10 (دم ده ایزوپرن) وجود دارد که CoQ9 در جوندگان و CoQ10 در انسان غالب است [1]. سنتز CoQ در داخل میتوکندری از طریق چندین مرحله انجام می شود که توسط حداقل 14 پروتئین شناخته شده به عنوان پروتئین COQ [1،2] انجام می شود. CoQ در چندین عملکرد سلولی نقش دارد [3،4]. با این حال، عملکرد اولیه CoQ پذیرش الکترون ها و پروتون ها از کمپلکس های تنفسی I و II و اهدای آنها به کمپلکس III است [1،4]. این ظرفیت ردوکس به CoQ اجازه می دهد بین سه حالت مختلف چرخه کند: ubiquinone (اکسید شده)، semiquinone (نیمه اکسید شده) و ubiquinol (کاهش یافته) [1،5]. در شکل ubiquinol خود، CoQH2 نقش آنتی اکسیدانی مهمی ایفا می کند و از DNA، پروتئین ها و لیپیدها در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند [6،7].

محتوای CoQ با افزایش سن در انواع بافت‌های پستانداران کاهش می‌یابد که با کاهش نرخ بیوسنتز منعکس می‌شود [8-10]. امکان افزایش محتوای CoQ10 از طریق مکمل های غذایی به طور گسترده در دهه های اخیر مورد بررسی قرار گرفته است [6،9]. اگرچه مطالعات کنترل شده بیشتری برای تعیین اثربخشی CoQ10 به عنوان یک داروی ضد پیری در انسان مورد نیاز است [11]، قبلا گزارش شده بود که سطوح پلاسمایی CoQ در افراد مسن با افزایش فعالیت بدنی و آسیب اکسیداتیو لیپید کمتر مرتبط است. و اینکه مکمل CoQ10 سرزندگی، عملکرد فیزیکی و کیفیت زندگی را در افراد مسن بهبود می بخشد [9]. موارد اثرات مفید مکمل CoQ10 برای تعدادی از بیماری‌های مرتبط با سن مانند بیماری‌های قلبی عروقی، نوروپاتی‌ها، التهاب، سندرم متابولیک، آرتریت، سرطان‌زایی، دیابت، پوکی استخوان و کلسترول بالا قوی‌تر است [3،8،11]. نشان داده شده است که مکمل CoQ10 نشانگرهای التهابی را کاهش می دهد، که معمولاً در سطوح بالایی در بیماری های مرتبط با افزایش سن وجود دارند [12-14].

با این حال، زنجیره پلی ایزوپرنوئید طولانی CoQ10 را بسیار چربی دوست و جذب آن دشوار می کند. مکمل های غذایی CoQ10 چالش های متعددی از جمله جذب ویژه از طریق دستگاه گوارش [5]، جذب سلولی در غشای پلاسمایی، انتقال از طریق غشاهای داخل سلولی و جذب توسط میتوکندری را به همراه دارند. همه این مراحل قاچاق، فرآیند مکمل CoQ10 خارجی را بسیار ناکارآمد می کند [3،9]. در این راستا، وسایل نقلیه جایگزین برای تجویز CoQ10 (به عنوان مثال، کپسول‌های مبتنی بر روغن، نانوذرات) [3،15،16]، و همچنین استراتژی‌های جدیدی که می‌توانند سنتز درون‌زای CoQ را تقویت کنند، تحت مطالعه هستند [2،3]. قبلاً، توانایی کامفرول، فلاونول موجود در میوه‌ها و سبزیجات را برای افزایش محتوای CoQ با عمل به عنوان پیش‌ساز CoQ جدید در موش و انسان شرح دادیم.کلیهسلول ها[17]. با این حال، مسیر متابولیکی دقیقی که توسط آن کامفرول در بیوسنتز CoQ شرکت می‌کند، شناسایی نشد. دو فرضیه پیشنهاد شد: (1) Kaempferol می‌تواند سوبسترای مستقیم COQ2 در مسیر بیوسنتزی CoQ باشد و متعاقباً توسط پروتئین‌های مختلف COQ متابولیزه شود تا زمانی که به ساختار نهایی CoQ برسد. یا به طور متناوب، (2) کامفرول می تواند در سلول متابولیزه شود تا یک پیش ساز حلقه CoQ بالقوه تولید کند، که سپس در مسیر بیوسنتزی CoQ ادغام می شود [17]. در یک مطالعه اخیر، Soubeyrand و همکارانش [18] توضیح دادند که در گیاهان، مسیرهای بیوسنتزی فلاونوئیدها و CoQ در واقع به هم مرتبط هستند و کامفرول می تواند به عنوان پیش ماده ای برای سنتز CoQ عمل کند. آنها ثابت کردند که حلقه B کامپفرول در معرض شکاف پراکسیداتیو قرار می گیرد تا 4-هیدروکسی بنزوئیک اسید (4HB)، یک پیش ساز رایج حلقه بنزوکینون CoQ [18] تولید کند.

هدف از کار حاضر توصیف بیشتر رابطه بین کامفرول و CoQ در سلول‌های پستانداران است. نتایج ما نشان می دهد که درکلیهسلول‌ها، حلقه B کامفرول بخشی از مولکول است که وارد بیوسنتز CoQ می‌شود، که نشان می‌دهد مکانیسم توصیف شده برای گیاهان احتمالاً در مهره‌داران حفظ می‌شود.

2. نتایج

برای درک بیشتر نحوه عملکرد کامفرول به عنوان پیش ساز CoQ در سلول های پستانداران، تصمیم گرفتیم آزمایش کنیم که آیا حلقه B کامفرول بخشی از مولکول است که وارد مسیر بیوسنتزی CoQ می شود، همانطور که در گیاهان گزارش شده است [18]. تلاش‌های ما برای سنتز شیمیایی کامفرول به‌طور خاص با برچسب 13C در حلقه B (13C6-[B-ring]-kaempferol) ناموفق بود. به‌عنوان یک استراتژی جایگزین، ما انتخاب کردیم که 13C{10}}[B-ring]-kaempferol را از کشت‌های گیاه Arabidopsis thaliana جدا کنیم. چنین سنتز in vivo از کامپفرول با حلقه B ممکن است زیرا گیاهان حلقه B کامپفرول را منحصراً از قسمت فنیل فنیل آلانین بدست می‌آورند [19]. در مقابل، حلقه A و حلقه C از مالونیل-CoA [19] سرچشمه می گیرند. بنابراین با تغذیه 13C6-ال-فنیل آلانین (13C6- Phe) به گیاهان آرابیدوپسیس که در شرایط استریل رشد کرده‌اند، می‌توان کامفرول را که به‌طور خاص روی حلقه B نشان‌گذاری شده است، بدست آورد [18]. علاوه بر این، برای تقویت تجمع کامفرول، تغذیه 13C{28}Phe با استفاده از فلاونوئید{29}هیدروکسیلاز آرابیدوپسیس انجام شد، که نمی‌تواند کامپفرول را بیشتر به آنتوسیانین متابولیزه کند [20]. باید توجه داشت که کامفرول به‌دست‌آمده با چنین روشی شامل مخلوطی از 13C6-[B-ring]-kaempferol و همچنین کامپفرول بدون برچسب است که قبل از تغذیه با 13C در بافت‌های گیاه وجود داشت{36 }}ف. غنی‌سازی ویژه 13C{38}[رینگ B]-کمپفرول در مخلوط مورد استفاده برای آزمایش‌های ما تقریباً 10 درصد از کل مجموعه کامپفرول بود (یعنی بدون برچسب به علاوه برچسب‌دار).

با استفاده از 13C6-[B-ring]-kaempferol استخراج شده و خالص شده از Arabidopsis، ما موش را درمان کردیمکلیهسلول های اپیتلیال توبول پروگزیمال (TKPTS) و مقدار نو و کل CoQ اندازه گیری شد (شکل 1). کامفرول بدون برچسب، کامفرول با برچسب جهانی 13C (13C-kaempferol)، و 13C نشاندار 4HB(13C{9}}HB) به عنوان تیمارهای مکمل استفاده شد (شکل 1a). سلول های تیمار شده با وسایل نقلیه اتانول به عنوان شاهد وارد شدند. مشاهده کردیم که از نظر CoQ کل (CoQ به اضافه 13C{12}CoQ)، هر دو محتوای CoQ9 و CoQ10 با درمان با کامفرول (مستقل از برچسب) و 4HB (شکل 1b,c) افزایش یافتند، همانطور که قبلا برایکلیهسلول ها [17]. 13C6-CoQ در سلول های تیمار شده با 13C-kaempferol و 13C6-4HB شناسایی شد که با نقش این ترکیبات به عنوان پیش سازهای حلقه CoQ مطابقت دارد [17،21]. قابل ذکر است، درمان با 13C{10}}[B-ring]-kaempferol همچنین منجر به سنتز 13C{14}}CoQ (شکل 1b,c) شد، که نشان می‌دهد حلقه B کامپفرول بخشی از مولکولی که وارد بیوسنتز CoQ می شود. همانطور که انتظار می‌رفت، برچسب‌گذاری ویژه پایین‌تر حلقه B در مخلوط 13C6-[B-ring]-kaempferol/kaempferol منجر به مقدار کمتری از 13C6-CoQ شد (شکل 1b,c)

3. بحث

کامفرول یک فلاونوئید طبیعی از نوع فلاونول است که در چای و همچنین در بسیاری از سبزیجات و میوه ها مانند کلم بروکلی، انگور، کلم پیچ، گوجه فرنگی و مرکبات وجود دارد [22،23]. شناخته شده ترین خواص کامفرول اثرات ضد التهابی آن در التهاب حاد و مزمن و نقش آن در پیشگیری از انواع مختلف سرطان است [24-26]. علاوه بر این، نشان داده شده است که از عملکرد کبد و قلب محافظت می کند و از بیماری های متابولیک و نورودژنراتیو جلوگیری می کند [24،26]. تصور می شود که کامفرول از طریق تنظیم مسیرهای سلولی زیادی به اثرات مفید خود دست می یابد [24،26]، اما عملکرد آنتی اکسیدانی آن نیز ممکن است مهم باشد. کامفرول به طور قابل توجهی استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش می دهد و می تواند فعالیت دفاعی آنتی اکسیدانی را بهبود بخشد [26]. گروه هیدروکسیل C{12} به ویژه برای این فعالیت آنتی اکسیدانی مهم در نظر گرفته شده است [27].

در سال 2015، زی و همکاران. [21] توضیح داد که ترکیب رژیم غذایی رسوراترول، که با فواید سلامتی متعدد مرتبط است [28]، می تواند به عنوان پیش ساز حلقه ای در بیوسنتز CoQ در اشریشیا کلی، ساکارومایسس سرویزیه و سلول های پستانداران عمل کند. در مطالعه بعدی، کامفرول به عنوان پیش ساز حلقه CoQ و افزایش محتوای CoQ در سلول های پستانداران توضیح داده شد [17]. ثابت شد که افزایش CoQ ناشی از کامفرول قوی تر از اثر اعمال شده توسط سایر پلی فنول ها از جمله رسوراترول است. در واقع کورستین، نارینژنین، لوتئولین و پیسه‌آتانول هیچ اثری از خود نشان ندادند [17]. این مطالعات محصولات طبیعی را که عموماً در رژیم غذایی وجود دارند با بیوسنتز CoQ مرتبط می‌کند، اگرچه مکانیسم مسئول ترکیب مشخص نشده است. اخیراً توضیح داده شده است که سنتز فلاونوئیدها در واقع با سنتز CoQ در گیاهان مرتبط است [18]. علاوه بر این، نویسندگان نشان دادند که در گیاهان، حلقه B کامپفرول توسط پراکسیدازهای ناشناخته تولید 4HB که مستقیماً وارد مسیر بیوسنتز CoQ می‌شود، شکافته می‌شود[18].

در اینجا، ما تأیید کردیم که آنزیم‌های مشابه ممکن است در پستانداران وجود داشته باشند، سلول‌هایی که امکان وقوع مکانیسم مشابهی را فراهم می‌کنند. اگرچه مطالعات بیشتری برای تعیین اینکه آیا برش کامفرول در پستانداران باعث تولید 4HB می شود، ضروری است، نتایج ما ثابت می کند که حلقه B فلاونول بخشی از مولکول است که وارد مسیر بیوسنتزی CoQ می شود (شکل 2). این آنزیم‌های خاص باید در گیاهان و سلول‌های پستانداران مشترک باشند، اما به نظر می‌رسد که در S. cerevisiae وجود ندارند، حداقل در زمینه ژنتیکی BY4741، زیرا مخمر توصیف شده است که 13C-kaempferol را به میزان بسیار کمی ترکیب می‌کند [17]. در گیاهان، شیمی واکنش مستلزم حضور همزمان یک پیوند دوگانه بین C-2 و C-3 و یک گروه هیدروکسیل در C-3 [18] است، زیرا دی هیدروکامپفرول (خیر C{11}}پیوند دوگانه C3) و نارینژنین (بدون پیوند دوگانه C{13}}C3 و C{15}} -OH) نتوانستند بسترهای شکاف پراکسیداتیو باشند. مشاهدات مستقل قبلی مبنی بر اینکه آپیژنین (بدون پیوند دوگانه C2-C3) و نارینگنین نتوانستند محتوای CoQ را درکلیهسلول ها [17] از این فرضیه حمایت می کند که گیاهان و پستانداران مکانیسم مشابهی را به اشتراک می گذارند.

با توجه به فراهمی زیستی محدود مکمل‌های CoQ10، تحریک سنتز درون‌زای CoQ تمرکز چندین مطالعه بوده است [1،9]. درک اینکه چگونه کامفرول مسیر بیوسنتزی CoQ را تقویت می کند از اهمیت فوق العاده ای برخوردار است زیرا ظرفیت آن برای افزایش محتوای CoQ درون زا دارای پتانسیل قوی برای بهبود کمبودهای CoQ مرتبط با پیری یا بیماری است. علاوه بر این، بیماران می‌توانند مزایای بیشتری پیدا کنند زیرا مصرف منظم فلاونوئیدها با کاهش خطر بیماری‌های مرتبط با افزایش سن، همانطور که در بالا توضیح داده شد، مرتبط است [24-26]. اگرچه فراهمی زیستی کامفرول بسیار کم است [29]، افزایش CoQ درکلیهسلول هادر دوزهایی مشاهده شد که از نظر فیزیولوژیکی، با مکمل های خوراکی یا با مصرف مواد غذایی حاوی فلاونوئیدها قابل دستیابی بود [27]، و حتی مقدار کمی مکمل از پیش سازهای CoQ می تواند شار متابولیک را به نفع سنتز CoQ حرکت دهد.

تحقیقات بیشتری برای توصیف کامفرول به عنوان یک ترکیب کارآمد برای درمان کمبود CoQ مورد نیاز است. مطالعات in vitro و in vivo بیشتر برای درک کامل رابطه بین کامفرول و CoQ، یافتن مناسب‌ترین فرمول ترکیب فعال زیستی و شناسایی آنزیم(های) مسئول برش پراکسیداتیو ضروری است.

4. مواد و روش ها

4.1. مواد شیمیایی و معرف ها

کامفرول بدون برچسب از سانتا کروز بیوتکنولوژی، شرکت (دالاس، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. 13C6-4HB از آزمایشگاه ایزوتوپ کمبریج، شرکت (Tewksbury، MA، ایالات متحده); و 13C-kaempferol از Isolife (واگنینگن، هلند). استانداردهای CoQ9 و CoQ1{56}} از سیگما آلدریچ (سن لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. Dipropoxy-CoQ10 اساساً همانطور که توسط Edlund [30] برای دیتوکسی-Q10 توضیح داده شد، سنتز شد، به جز اینکه 1-پروپانول جایگزین اتانول شد در حالی که سایر واکنش‌ها و شرایط را حفظ کرد. 13C6-[B-ring]-kaempferol از کشت‌های آزمایشگاهی گیاهان فلاونوئید{18}هیدروکسیلاز آرابیدوپسیس تالیانا در شرایط آزمایشگاهی تهیه شد که به مدت 48 ساعت با دوزهای 250 میکرومولار 13C6-L- فنیل آلانین تغذیه شدند. آزمایشگاه ایزوتوپ کمبریج، شرکت، توکسبری، MA، ایالات متحده آمریکا) [18]. برگها (~1.5 گرم) با استفاده از آسیاب بافت پیرکس در 900 × 5 میکرولیتر متانول همگن شدند و عصاره ها به مدت 10 دقیقه در دمای 18، × گرم سانتریفیوژ شدند. مواد رویی (5 × ~ 800 میکرولیتر) ادغام و به حجم مساوی 2 مولار هیدروکلراید مخلوط شدند و در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 40 دقیقه انکوبه شدند تا ترکیبات گلیکوزیل-کمپفرول هیدرولیز شوند. مقدار کمی هیدرولیز (200 میکرولیتر) با حجم مساوی متانول 100 درصد مخلوط و در 18،{40}}× گرم به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. نمونه‌ها (هر یک 100 میکرولیتر) روی یک ستون Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 × 100 میلی‌متر، 3.5 میکرومتر؛ Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) کروماتوگرافی شدند. از 10 میلی مولار فرمت آمونیوم pH 3.5 تا 100 درصد متانول با سرعت جریان 0.8 میلی لیتر در دقیقه. Kaempferol (18.7 دقیقه) با نظارت بر جذب در 365 نانومتر جمع‌آوری شد، با گاز نیتروژن تا خشک شدن تبخیر شد و سپس برای تعیین کمیت با استفاده از ضریب خاموشی مولی 21242 M-1cm-1 در 100 درصد متانول معلق شد. تجزیه و تحلیل MS/MS نشان داد که این آماده سازی از 10 درصد کامپفرول نشاندار شده با 13C (M به علاوه 6) و 90 درصد از کامپفرول بدون برچسب تشکیل شده است.

4.2. شرایط کشت سلولی و درمان

موشکلیهسلول های اپیتلیال توبول پروگزیمال (TKPTS) [31] توسط دکتر السا بلو-ریس (مرکز علوم بهداشتی دانشگاه فناوری تگزاس، لوبوک، TX، ایالات متحده آمریکا) و دکتر جودیت ک. ماگیسی (دانشگاه علوم پزشکی آرکانزاس، لیتل راک، AR، ایالات متحده). سلول های TKPTS در DMEM/F12 حاوی 4.5 گرم در لیتر گلوکز رشد کردند و با 1{35}} درصد سرم جنین گاو (FBS)، 2 میلی مولار ال-گلوتامین و جنتامایسین-آمفوتریسین B (125 میکروگرم در میلی لیتر و 5 میلی گرم) تکمیل شدند. / میلی لیتر، به ترتیب). کشت ها در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2 نگهداری شدند. برای تعیین CoQ، سلول‌ها در 12-صفحه‌های چاهک با مقدار اولیه 60،000 سلول/چاه کاشته شدند و با 5 میکرومولار کامفرول، 13C-کمپفرول، 13C{20}[B] تیمار شدند. -ring]-kaempferol یا 1 میکرومولار 4HB به مدت 48 ساعت. در انتشار قبلی که در آن کامفرول را به عنوان یک پیش ساز CoQ جدید توصیف کردیم، آزمایش هایی با 10 میکرومولار 13C-kaempferol انجام شد [17]. با این حال، مقدار محدود 13C{31}}[B-ring]-kaempferol موجود، ما را به کاهش غلظت مورد استفاده سوق داد، اگرچه شرایط هنوز در محدوده‌ای است که کامپفرول محتوای CoQ را افزایش می‌دهد [17]. اتانول به کنترل اضافه شد زیرا وسیله نقلیه زیر 0.05 درصد حجم نهایی نگه داشته شد. سلول ها در شرایط کشت استاندارد (37◦C، 5 درصد CO2) انکوبه شدند. پس از زمان تعیین شده، سلول ها دو بار با 1X بافر فسفات سالین (PBS) شسته شدند، با استفاده از تریپسین-EDTA (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) از صفحات کشت جدا شدند و با سانتریفیوژ با سرعت پایین (تقریباً 1000×) پلت شدند. ز). مایع رویی برداشته شد و گلوله های سلولی تا زمان استفاده در دمای 20- درجه نگهداری شدند.

4.3. استخراج لیپید

گلوله های سلولی مجدداً در 100 میکرولیتر 1X PBS معلق شدند. قبل از استخراج لیپید، مقدار 10 میکرولیتر برای تعیین کمیت غلظت پروتئین با استفاده از روش برادفورد [32] ذخیره شد. سپس، دی پروپوکسی-CoQ10 به عنوان استاندارد داخلی به 90 میکرولیتر باقیمانده اضافه شد. برای شروع استخراج، دو میلی لیتر متانول اضافه شد. سوسپانسیون سلولی گرداب شد و دو میلی لیتر پترولیوم اتر به آن اضافه شد. لایه بالایی پترولیوم اتر (حاوی تمام لیپیدهای غیر صابونی‌سازی، از جمله CoQ) به یک لوله تمیز منتقل شد. دو میلی لیتر دیگر نفت اتر به لایه متانول اصلی اضافه شد و نمونه ها دوباره گرداب شدند. لایه بالایی برداشته شد و با لایه قبلی ترکیب شد و فاز آلی ترکیب شده در زیر جریان گاز نیتروژن خشک شد. مجموعه‌ای از استانداردهای CoQ9 و CoQ10 حاوی ایزوپروپوکسی-CoQ10 تهیه و همزمان با نمونه‌های سلولی لیپید استخراج شد تا منحنی‌های استاندارد CoQ9 و CoQ10 ساخته شود.

4.4. تجزیه و تحلیل CoQ

محتوای CoQ9 و CoQ10 نشاندار و بدون نشاندار از عصاره های لیپیدی با استفاده از HPLC-MS/MS همانطور که قبلاً توضیح داده شد تجزیه و تحلیل شد [17]. به طور خلاصه، نمونه‌ها در 200 میکرولیتر اتانول حاوی 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بنزوکینون به منظور اکسیده شدن تمام لیپیدها قبل از تجزیه و تحلیل مجدد معلق شدند. یک طیف سنج خطی MS/MS 4000 QTRAP از Applied Biosystems (Foster City، CA، USA) استفاده شد. برای جمع آوری و پردازش داده ها از نرم افزار Applied Biosystem، Analyst نسخه 1.4.2 استفاده شد. جداسازی کروماتوگرافی بر روی یک ستون Luna 5 میکرومتر PFP(2) 100A (100 × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر؛ Phenomenex، تورنس، CA، ایالات متحده آمریکا) با استفاده از یک فاز متحرک متشکل از 90 درصد حلال A (مخلوط 95:5 متانول: ایزوپروپانول حاوی 2.5 میلی مولار فرمت آمونیوم) و 10 درصد حلال B (ایزوپروپانول حاوی 2.5 میلی مولار فرمت آمونیوم) با سرعت جریان ثابت 1 میلی لیتر در دقیقه. همه نمونه ها در حالت های نظارت بر واکنش چندگانه آنالیز شدند. انتقال های مورد استفاده عبارت بودند از: m/z 795.6/197.08 (CoQ9 به علاوه H)، m/z 812.6/197.08 (CoQ9 به علاوه NH3)، m/z 801.6/203.08 (13C-CoQ9 به علاوه H)، m/z 818.6/203.0 -CoQ9 به علاوه NH3)، m/z 863.6/197.08 (CoQ10 به علاوه H)، m/z 880.6/197.08 (CoQ10 به علاوه NH3)، m/z 869}.6/203.08 (13C -CoQ10 به علاوه H)، m/z 886.6/203.08 (13C-CoQ10 به علاوه NH3)، m/z 919.7/253.1 (دی پروپوکسی-CoQ10 به علاوه H)، m/z 936.7/253.1 (دی پروپوکسی-CoQ10 به علاوه NH3). مساحت هر پیک، نرمال شده با منحنی استاندارد متناظر و استاندارد داخلی، به عنوان مقدار اولیه پروتئین نامیده شد.

4.5. تحلیل آماری

داده های نشان داده شده در این کار نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار (SD) است. تجزیه و تحلیل های آماری و گرافیک با Graphpad Prism 8 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) انجام شد. تفاوت در محتوای CoQ در مقایسه با کنترل با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه پارامتریک، تصحیح مقایسه‌های چندگانه با پس‌آزمون دانت، تحلیل شد. تفاوت‌های قابل‌توجهی به عنوان * p < 0="" ذکر="" شد.05،="" **="" p=""><0.01، ***="" p=""><0.001 و="" ****="" p=""><>

5. نتیجه گیری ها

نتایج ما این را نشان می دهدسلول های کلیهمی تواند حلقه B فلاونول کامپفرول غذایی را برای تولید پیش سازهای حلقه بالقوه بیوسنتز CoQ، به احتمال زیاد 4HB، شکافت. این متابولیسم کامفرول بیوسنتز CoQ را افزایش می دهد و محتوای CoQ را افزایش می دهد. این توانایی کامفرول به طور بالقوه می تواند در طراحی مکمل های کارآمدتر برای کاهش علائم کمبود CoQ در پیری و بیماری استفاده شود. مطالعات فیزیولوژیکی اضافی برای تایید اثربخشی مکمل کامفرول برای تقویت بیوسنتز یوبی کینون در سطح کل ارگانیسم ضروری خواهد بود.

مشارکت نویسنده:مفهوم سازی، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. روش، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. نرم افزار، LF-d.-R.; اعتبارسنجی، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. تحلیل رسمی، LF-d.-R.; تحقیق، LF-d.-R.، و ES. منابع، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. مدیریت داده، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. نوشتن - آماده سازی پیش نویس اصلی، LF-d.-R.; نوشتن-بررسی و ویرایش، LF-d.-R.، GJB، و CFC. تجسم، LF-d.-R.، ES، GJB، و CFC. نظارت، GJB و CFC. مدیریت پروژه، GJB و CFC. تأمین مالی، GJB، و CFC همه نویسندگان نسخه منتشر شده نسخه خطی را خوانده و با آن موافقت کرده اند.

منابع مالی:این کار توسط بنیاد ملی علوم Grant MCB-1330803 (CFC) و MCB-1712608 (GJB) پشتیبانی شد.

قدردانی ها:ما از Anish Nag برای سنتز dipropoxy-CoQ10 تشکر می کنیم. السا بلو-ریوس (مرکز علوم بهداشتی دانشگاه فناوری تگزاس، لوبوک، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) و جودیت ک. ماگیسی (دانشگاه علوم پزشکی آرکانزاس، لیتل راک، AR، ایالات متحده آمریکا) با مهربانی این ماوس را فراهم کردند.کلیهسلول های اپیتلیال لوله پروگزیمال (TKPTS). ما از خورخه تورس برای فراهم کردن امکانات کشت سلولی تشکر می کنیم. ما از تاسیسات پروتئومیکس هسته ای ابزار دقیق مولکولی UCLA تشکر می کنیم. یو چن، برای استفاده از QTRAP4000 برای تجزیه و تحلیل چربی. و Anna Block در USDA-ARS-CMAVE برای تجزیه و تحلیل MS/MS.

تضاد علاقه: نویسندگان هیچ گونه تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

---Journal Molecules (Basel, Switzerland), 25(13) ISSN 1420-3049 نویسندگان: Fernández-Del-Río et al.
DOI 10.3390/molecules25132955

منابع

1. وانگ، ی. حکیمی، س. پیچیدگی ساخت یوبی کینون. گرایش های اندوکرینول. متاب. 2019، 30، 923–943.[CrossRef] [PubMed]

2. عوض، AM; بردلی، ام سی; فرناندز-دل-ریو، ال. ناگ، ا. تسویی، اچ. کمبودهای کلارک، CF کوآنزیم Q10: مسیرها در مخمر و انسان. مقالات بیوشیمی. 2018، 62، 361-376. [CrossRef] [PubMed]

3. Gutierrez-Mariscal، FM; Yubero-Serrano، EM; ویلالبا، جی.ام. لوپز-میراندا، جی. کوآنزیم Q10: از نیمکت تا کلینیک در بیماری های پیری، بررسی ترجمه ای. کریت علوم غذایی کشیش. Nutr. 2018، 59، 2240–2257. [CrossRef] [PubMed]

4. بنتینگر، م. تکل، م. Dallner، G. کوآنزیم Q-بیوسنتز، و توابع. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 2010، 396، 74-79. [CrossRef]

5. Stefely، JA; Pagliarini، DJ بیوشیمی بیوسنتز کوآنزیم میتوکندری Q. Trends Biochem. علمی 2017، 42، 824-843. [CrossRef]

6. دیاز-کاسادو، ME; Quiles، JL; Barriocanal-Casado، E.; گونزالس-گارسیا، پی. باتینو، ام. لوپز، ال سی؛ وارلا-لوپز، A. پارادوکس کوآنزیم Q10 در پیری. مواد مغذی 2019، 11، 2221. [CrossRef]

7. بنتینگر، م. بریسمار، ک. Dallner, G. نقش آنتی اکسیدانی کوآنزیم q. میتوکندری 2007، 7، S41–S50.[CrossRef]

8. Barcelos، IP; هاس، RH CoQ10 و پیری. زیست شناسی (بازل) 2019، 8، 28. [CrossRef]

9. هرناندز-کاماچو، JD; برنیر، ام. لوپز-لوچ، جی. مکمل ناواس، پی کوآنزیم Q10 در پیری و بیماری. جلو. فیزیول. 2018، 9، 1-11. [CrossRef]

10. کالن، ا. Appelkvist، EL; دالنر، جی. تغییرات مرتبط با سن در ترکیبات لیپیدی بافت‌های موش و انسان. لیپیدها 1989، 24، 579-584. [CrossRef]

11. Varela-López، A. جیامپیری، اف. باتینو، ام. کویلز، جی کوآنزیم کیو و نقش آن در رژیم درمانی علیه پیری. Molecules 2016, 21, 373. [CrossRef] [PubMed]

12. فن، ال. فنگ، ی. چن، جی سی; Qin، LQ; فو، CL; چن، LH اثرات مکمل کوآنزیم Q10 بر نشانگرهای التهابی: یک مرور سیستماتیک و متاآنالیز کارآزمایی‌های تصادفی‌سازی و کنترل‌شده. داروسازی Res. 2017، 119، 128-136. [CrossRef] [PubMed]

13. ژای، ج. پسر.؛ لو، ی. لیو، سی. Zhang، L. اثرات کوآنزیم Q10 بر نشانگرهای التهاب: یک بررسی سیستماتیک و متاآنالیز. PLoS ONE 2017, 12, e0170172. [CrossRef] [PubMed]

14. شارما، ا. فونارو، جی سی. باتلر، جی. ازکوویتز، جی. Felker، GM Coenzyme Q10 و نارسایی قلبی: یک بررسی پیشرفته دور نارسایی قلبی. 2016, 9, e002639. [CrossRef]

15. لی، جی اس; سو، جی دبلیو. کیم، ES؛ لی، HG تهیه و شناسایی نانوذرات چسبنده برای افزایش جذب سلولی کوآنزیم Q10. جی. آگریک. مواد شیمیایی مواد غذایی 2017، 65، 8930–8937. [CrossRef]

16. لوپز-لوچ، جی. دل پوزو-کروز، جی. سانچز-کوستا، آ. کورتس رودریگز، AB; فراهمی زیستی مکمل های کوآنزیم Q10 به لیپیدهای حامل و محلول شدن بستگی دارد. تغذیه 2018، 57، 133-140. [CrossRef]

17. فرناندز-دل-ریو، ال. ناگ، ا. گوتیرز کاسادو، ای. آریزا، ج. عوض، AM; جوزف، هوش مصنوعی؛ کوون، او. وردین، ای. دی کابو، آر. اشنایدر، سی. و همکاران Kaempferol سطح کوآنزیم Q را در سلول های کلیه افزایش می دهد و به عنوان یک پیش ساز حلقه بیوسنتزی عمل می کند. رادیک آزاد. Biol. پزشکی 2017، 110، 176-187. [CrossRef]

18. سوبیرند، ای. جانسون، تی اس؛ لاتیمر، اس. بلوک، ا. کیم، جی. Colquhoun، TA; بوتلی، ای. مارتین، سی. ویلسون، MA; Basset, G. برش پراکسیداتیو کامفرول به بیوسنتز بخش بنزنوئیدی یوبی کینون در گیاهان کمک می کند. گیاه. Cell 2018, 30, 2910–2921. [CrossRef]

19. کروزالر، ف. Hahlbrock، K. سنتز آنزیمی ترکیبات معطر در گیاهان عالی: تشکیل نارینژنین (5،7،{3}}تری هیدروکسی فلاوانون) از کوآنزیم p-کوماروئیل a و مالونیل کوآنزیم a. FEBS Lett. 1972، 28، 69-72. [CrossRef]

20. شونبوهم، سی. مارتنز، اس. ادر، سی. فورکمن، جی. وایشار، ب. شناسایی ژن 3'-هیدروکسیلاز فلاونوئید Arabidopsis thaliana و بیان عملکردی آنزیم کدگذاری شده p450. Biol. شیمی. 2000، 381، 749-753. [CrossRef]

21. Xie، LX; ویلیامز، کی جی. او، CH; ونگ، ای. Khong، S. رز، TE; کوون، او. بنسینگر، اس جی. Marbois، BN; کلارک، CF رسوراترول و پارا کومارات به عنوان پیش سازهای حلقه ای برای بیوسنتز کوآنزیم Q عمل می کنند. J. Lipid Res. 2015، 56، 909-919. [CrossRef] [PubMed]

22. Calderon-Montano، JM; بورگوس-مورون، ای. پرز-گوئررو، سی. لوپز-لازارو، ام. مروری بر فلاونوئید رژیمی کامپفرول. Mini Rev. Med. شیمی. 2011، 11، 298-344. [CrossRef] [PubMed]

23. دیوی، ک.پ. مالار، DS; نبوی، س.ف. سوردا، ع. شیائو، جی. نبوی، س.م. Dahlia، M. Kaempferol، و التهاب: از شیمی تا پزشکی. Pharmacol Res. 2015، 99، 1-10. [CrossRef] [PubMed]

24. رن، ج. لو، ی. کیان، ی. چن، بی. وو، تی. جی، جی. پیشرفت های اخیر در مورد کامفرول برای درمان بیماری های مختلف. انقضا آنجا پزشکی 2019، 18، 2759–2776. [CrossRef] [PubMed]

25. عمران، م. صالحی، ب. شریفی راد، ج. اسلم گوندال، تی. سعید، ف. عمران، ع. شهباز، م. Tsouh Fokou، PV; عمیر ارشد، م. خان، اچ. و همکاران Kaempferol: تاکید کلیدی بر پتانسیل ضد سرطانی آن. Molecules 2019,24, 2277. [CrossRef]

26. عمران، م. رئوف، ع. شاه، ز. سعید، ف. عمران، ع. ارشد، MU; احمد، بی. باوازیر، اس. عاطف، م. پیترز، دی جی؛ و همکاران اثر شیمیایی پیشگیرانه و درمانی فلاونوئید رژیم غذایی کامپفرول: یک بررسی جامع. Phytother Res. 2019، 33، 263-275. [CrossRef]

27. کوزلوفسکا، ا. Szostak-Wegierek، D. فلاونوئیدها – منابع غذایی و مزایای سلامتی. Rocz. Panstw. زکل. هیگ 2014، 65، 79-85.

28. Kursvietiene, L. استانویسین، آی. Mongirdiene، A. برناتونین، J. چندگانگی اثرات و مزایای سلامتی رسوراترول. پزشکی (کاوناس) 2016، 52، 148-155. [CrossRef]

29. زابله، وی. سمپات، سی. اوفیر، م. مرادی افراپلی، ف. باتروک، وی. همبرگر، M. فارماکوکینتیک کامپفرول غذایی و متابولیت آن 4-هیدروکسی فنیل استیک اسید در موش صحرایی. فیتوتراپیا 2016، 115، 189-197. [CrossRef]

30. Edlund، PO تعیین کوآنزیم Q10، آلفا توکوفرول، و کلسترول در نمونه‌های بیولوژیکی با کروماتوگرافی مایع با ستون کوپل شده با تشخیص کولومتری و اشعه ماوراء بنفش. J. کروماتوگر. بیومد. علمی Appl. 1988، 425، 87-97. [CrossRef]

31. ارنست، اس. Bello-Reuss, E. بیان و عملکرد p-گلیکوپروتئین در رده سلولی کلیه موش. صبح. جی. فیزیول. 1995، 269، C323–C333. [CrossRef] [PubMed]

32. Stoscheck، CM کمیت پروتئین. روش ها آنزیمول. 1990، 182، 50-68. [CrossRef] [PubMed] در دسترس بودن نمونه: در دسترس نیست.