MiR{0}}a-3خاموش کردن رسوب اگزالات کلسیم را در کلیه موش با فعال کردن محور UMOD/TRPV5 بهبود می‌بخشد.

حفظ تعادلمتابولیسم کلسیم (Ca{0}}).در کلیه بسیار مهم استجلوگیری از تشکیل سنگ کلیه. از نظر عملکردی، میکرو RNA (miRNA) شرکت کننده در این فرآیند باید رونمایی شود. ما آسیب سلولی NRK-52 را توسطدرمان اگزالات. نقش گیرنده گذرا کانال کاتیونی بالقوه زیرخانواده V عضو 5 (TRPV5) در سلول های القا شده با اگزالات توسط ترانسفکشن بیان بیش از حد TRPV5، qRT-PCR، وسترن بلات، MTT، و تشخیص چسبندگی کریستال مورد مطالعه قرار گرفت. پس از شناسایی بیان uromodulin (UMOD) در سلول‌های آسیب‌دیده، ما تعامل بین TRPV5 و UMOD را توسط هم‌ایمنی رسوب‌گذاری (CoIP) و سنجش بیوتینیلاسیون سطح سلول تأیید کردیم. اعتبارسنجی TRPV5 تنظیم‌کننده UMOD در زنده‌مانی، چسبندگی کریستال و غلظت کلسیم سلول‌های القا شده با اگزالات انجام شد. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک و سنجش لوسیفراز برای شناسایی UMOD هدف‌گیری miRNA مورد استفاده قرار گرفت. نقش محور UMOD/TRPV5 تنظیم‌کننده miR{12}}a{13}P توسط آزمایش‌های نجات شناسایی شد. ما یک مدل موش با تیمار اتیلن گلیکول (EG) ساختیم تا محور miR{16}a-3p/ UMOD/TRPV5 در داخل بدن با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E)، وسترن بلات، و ایمونوهیستوشیمی بررسی شود. (IHC). دگرگونی TRPV5 سلول های NRK{21}}E را از آسیب ناشی از اگزالات با افزایش زنده ماندن سلول و مهار چسبندگی CaOx محافظت می کند. UMOD در سلول های ناشی از اگزالات تخلیه شد و با TRPV5 تعامل مثبت داشت. خاموش کردن UMOD اثر بیان بیش از حد TRPV را بر روی سلول‌های ناشی از اگزالات معکوس کرد. miR{26}}a{27}} UMOD را هدف قرار داد و در تنظیم محور UMOD/TRPV5 در سلول‌های القا شده با اگزالات واسطه شد. کاهش تنظیم miR{30}}a{31}}p کاهش CaOx ناشی از EGرسوب در بافت کلیهin vivo با فعال کردن محور UMOD/TRPV5. خاموش کردن miR-103a-3 با فعال کردن محور UMOD/TRPV5، رسوب CaOx را در کلیه موش صحرایی بهبود بخشید.

فرمولاسیون گیاهی برایرسوب در بافت کلیه

1. مقدمه

سنگ های ادراری، یکی از بیشترینبیماری های شایع در اورولوژی، در اثر رسوب کریستال های بیش از حد اشباع از ادرار در کلیه ایجاد می شوند [1]. اگرچه سنگ های ادراری به اندازه تومورهای بدخیم تهاجمی نیستند، اما سنگ های ادراری به دلیل بروز و عود زیاد، مدت هاست که تأثیر جدی بر سلامت انسان داشته اند [2]. مطالعات تأیید کرده اند که شروع سنگ های ادراری چند عاملی است و شامل ژنتیک، متابولیسم، آب و هوای محیطی و عادات سبک زندگی می شود [3، 4]. سنگ‌های اگزالات کلسیم (CaOx) بیشتر موارد این بیماری را تشکیل می‌دهند و اکثر بیماران مبتلا به سنگ‌های حاوی کلسیم، ترکیبی از هیپرکلسیوری دارند [5]. مطالعات فیزیکوشیمیایی تأیید کرده‌اند که اشباع CaOx در ادرار به غلظت کلسیم مربوط می‌شود و افزایش کلسیم ادرار مستعد تشکیل نفرولیتیازیس حاوی کلسیم است یا آن را ترویج می‌کند [6]. سنگ کلیه می تواند منجر به فشار خون بالا، بیماری مزمن کلیه و بیماری کلیوی در مرحله نهایی شود. مطالعات گزارش کرده اند که اقدامات پیشگیرانه، از جمله مداخلات دارویی خاص و توصیه هایی برای تغییرات سبک زندگی و تغذیه، می تواند پس از ارزیابی متابولیک جامع دنبال شود [7، 8]. مطالعات مختلف انسانی نشان داده اند که رژیم های غذایی با مصرف بیشتر سبزیجات و میوه ها در پیشگیری از سنگ کلیه نقش دارند [9-11]. در حال حاضر، یک مطالعه عمیق باید در مورد مکانیسم مولکولی هیپرکلسیوری ناشی از متابولیسم غیرطبیعی کلسیم در تشکیل سنگ کلیه انجام شود.

TRPV5 یک پروتئین مهم است که حمل و نقل Ca{1}} را در غشای سلولی تنظیم می کند [12]. در بافت های کلیوی، TRPV5 عمدتاً در لوله پیچیده دیستال (DCT) و لوله جمع کننده (CNT) یافت می شود که مسئول تنظیم بازجذب Ca{4}} ادراری و حفظ هموستاز Ca{5}} در بدن است [13] . شواهد موجود نشان می‌دهد که بیان TRPV5 کاهش‌یافته ممکن است یک عامل بیماری‌زای حیاتی در تشکیل هیپرکلسیوری و کلسیم حاوی نفرولیتیازیس باشد [14].

جدول 1: توالی پرایمر مورد استفاده برای qRT-PCR.

Uromodulin (UMOD)، همچنین به عنوان پروتئین Tamm-Horsfall شناخته می شود، فراوان ترین گلیکوپروتئین در ادرار [15] است که عمدتاً در سلول های اپیتلیال لوله های کلیوی با انواع عملکردهای فیزیولوژیکی مانند متعادل کردن متابولیسم آب-الکترولیت، تنظیم ایمنی بیان می شود. ، جلوگیری از سنگ کلیه و محافظت در برابر عفونت های دستگاه ادراری [16-18]. در حال حاضر، گزارش های کمی در مورد مکانیسم مولکولی خاص UMOD در تشکیل سنگ کلیه وجود دارد.

MicroRNA ها (miRNAs) دسته ای از مولکول های RNA کوچک، غیر کدکننده و تک رشته ای با طول حدود 20 تا 22 نوکلئوتید هستند که به طور گسترده در پستانداران وجود دارند [19]. miRNA‌های بالغ می‌توانند بیان ژن‌های هدف پس از رونویسی را با اتصال کامل یا جزئی به طور مکمل به 3'-UTR mRNA هدف تنظیم کنند، که منجر به تخریب یا مهار سنتز ترجمه پروتئین می‌شود [20]. از آنجایی که miRNA ها به طور چشمگیری بر فعالیت های فیزیولوژیکی انسان مانند رشد و تکامل، آپوپتوز سلولی و متابولیسم تأثیر می گذارند، در نظر گرفته می شوند که برای پیشگیری و درمان بیماری ها نویدبخش هستند [21]. در سال های اخیر، تحقیقات در مورد نقش miRNA ها در شروع و ایجاد سنگ کلیه به یک موضوع داغ تبدیل شده است [22، 23].

بنابراین، این مطالعه به بررسی رابطه بین UMOD و TRPV5 در پیشگیری از تشکیل سنگ کلیه پرداخت و نقش miR{1}}a-3p را در هدف‌گیری و تنظیم UMOD روشن کرد و به درک عمیق‌تر از پاتوژنز سنگ کلیه و ارائه ایده های جدید برای پیشگیری و مدیریت بیماری.

2. مواد و روش ها

2.1. کشت سلولی و درمان اگزالات.

رده سلولی کلیه موش صحرایی اپیتلیوئیدی NRK{{0}}E (GNR 8) از مرکز چین برای مجموعه کشت نوع (CCTCC) (شانگهای، چین) به دست آمد. DMEM (12800017، Gibco، USA) مخلوط با آب مقطر، محلول NaHCO3 7.5% (25080094، Gibco، USA) و 5% سرم جنین گاوی (FBS) (BC-SE-FBS02، Bio channel، China) برای کشت آماده شد. سلول ها در انکوباتور (37 درجه سانتی گراد و 5٪ CO2). پس از کشت زیر کشت، سلول ها با اگزالات رقیق (75/0 میلی مول در لیتر، 135623، سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) به مدت 48 ساعت (ساعت)، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، القا شدند [24]. 2.2. انتقال سلولی برای مطالعه مکانیسم مولکولی، پلاسمید بیان بیش از حد TRPV{{21} (Bes-mR-001007572، Ber sinBio، Guangzhou، چین)، پلاسمید بیان بیش از حد UMOD (Bes-mR-001278605، BersinBio، Guangzhou، چین)، RNA تداخلی کوچک در برابر UMOD (siUMOD) (5'-CTCTTT TATCACACTTGATATGA{29}}'، GenePharma، شانگهای، چین)، مهارکننده miR{30}a{31}p (GenePharma، شانگهای، چین)، و miR{32}}a-3p mimic (BersinBio، Guangzhou، چین) تحت ترانسفکشن‌های مختلف در سلول‌های NRK{34} E قرار گرفتند، با کنترل‌های مربوطه در حال تنظیم. قبل از ترانسفکشن، سلول‌های NRK{35}}در یک صفحه چاهک (2 × 106 سلول در چاهک) کشت داده شدند. تا رسیدن به حدود 80 درصد تلاقی سلولی، پلاسمید بیان بیش از حد TRPV، پلاسمید بیان کننده بیش از حد UMOD، siUMOD، مهارکننده miR{41}}a{42}}p، یا تقلید به NRK{43}}E منتقل شد. سلول ها با استفاده از لیپوئیک تایم 2000 (11668019، اینویتروژن، ایالات متحده آمریکا) طبق پروتکل سازنده. پس از آن، سلول‌های NRK{46}}E ترانسفکت‌شده، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ (qRT-PCR) و وسترن بلات را برای ارزیابی کیفیت دریافت کردند و سپس با اگزالات تیمار شدند.

2.3. استخراج RNA و qRT-PCR.

کل RNA و miRNA از سلول‌های NRK{0}E با استفاده از کیت RNA سلول (19231ES50، Yeasen، چین) و کیت miRNA سلول/بافت MolPure® (19331ES50، Yeasen، چین) استخراج شد. سپس، کیت RT-PCR تک مرحله ای HiScript II (P612-01، Vazyme، چین) برای واکنش با عصاره به دنبال دستورالعمل های عملیاتی مورد استفاده قرار گرفت. شرایط تقویت به شرح زیر تنظیم شد: 50 درجه سانتیگراد برای 30 دقیقه، 94 درجه سانتیگراد برای 3 دقیقه، به دنبال آن 30 سیکل (94 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، و 72 درجه سانتیگراد برای 40 ثانیه). و 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه. qRT-PCR در سیستم ABI 7500 (Applied Biosystems, USA) انجام شد. عبارات mRNA نسبی با روش 2-ΔΔCt [25]، با استفاده از -اکتین یا U6 برای نرمال سازی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تمام توالی های آغازگر در جدول 1 نشان داده شده است.

2.4. وسترن بلات.

پروتئین کل نمونه ها (سلول های NRK{0}E و بافت کلیه موش صحرایی) با استفاده از بافر لیز RIPA (R0010، Solarbio، چین) لیز شد و توسط کیت سنجش پروتئین BCA (BI-WB005، Sbjbio، چین) تعیین شد. مقادیر مساوی پروتئین با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم-پلی آکریل آمید 10 درصد (P0690، Beyotime، چین) جدا و روی غشاهای PVDF (AR0136- 02، بوستر، چین) منتقل شد. پس از درمان با بافر مسدود کننده (P0252، Beyotime، چین)، غشاها با anti-TRPV5 (ab137028, 83 kDa, 1/10000)، anti-UMOD (ab207170, 110 kDa, 1/1000) و anti{1000 انکوبه شدند. {20}}آنتی‌بادی‌های اکتین (ab8226، 42 کیلو دالتون، 1/1000) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در طول شب. آنتی بادی های ثانویه شامل IgG ضد خرگوش (ab97051، 1/2000) و ضد IgG موش (ab205719، 1/2000) سپس برای انکوبه غشاها به مدت 2 ساعت در دمای اتاق استفاده شدند. تشخیص بلات پروتئین نسبی در سیستم تصویربرداری iBright (CL750، Invitrogen، USA) با استفاده از بافر ECL (WBKlS0100، Millipore، USA) برای تجسم اجرا شد. - اکتین به عنوان کنترل داخلی عمل کرد.

2.5. سنجش زنده ماندن سلولی

سوسپانسیون های سلولی همانطور که در این مطالعه توضیح داده شد تهیه شد [24]. سلول‌های NRK{1}}در 96-صفحه‌های کشت چاهک با تراکم 5000 سلول در چاه، و 10 میکرولیتر متیل تیازولیل دی‌فنیل، کاشته شدند. محلول تترازولیوم بروماید (MTT) (40201ES72، Yeasen، چین) برای درمان سلول‌ها در هر چاهک در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 ساعت و به دنبال آن تیمار SDS-HCL استفاده شد. برای ارزیابی بقای سلول، مقدار چگالی نوری (OD) در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه میکروپلیت ریدر (VL0L00D0، Thermo Fisher، USA) اندازه‌گیری شد.