MiR{0}}پ بازسازی عضله را تقویت می کند و عضله پیر و دیستروفی عضلانی را بهبود می بخشد

لطفاً برای اطلاعات بیشتر با oscar.xiao@wecistanche.com تماس بگیرید

آزمایشات پارابیوز نشان می دهد که عوامل مولکولی مرتبط با جوان سازی و پیری در خون گردش می کنند. در اینجا، نشان می‌دهیم که miR{0}}p که به‌عنوان یک miRNA بدون سلول در خون گردش می‌کند، در خون موش‌های مسن در مقایسه با موش‌های جوان به طور قابل‌توجهی کاهش یافته است؛ و miR-199-3p این توانایی را دارد. برای تقویت تمایز میوژنیک و بازسازی عضلات. تجویز تقلیدهای miR-199، که miR-199-3p را به موش‌های مسن عرضه می‌کنند، منجر به هیپرتروفی فیبر عضلانی و تاخیر در کاهش قدرت عضلانی شد. تجویز سیستمیک miR{5}} به موش‌های mdx، یک مدل حیوانی شناخته شده دیستروفی عضلانی دوشن (DMD)، قدرت عضلانی موش‌ها را به‌طور چشمگیری بهبود بخشید. در مجموع، miR{8}} بدون سلول در خون ممکن است اثر ضد پیری مانند اثر هیپرتروفیک در فیبرهای عضلانی مسن داشته باشد و می‌تواند به عنوان یک RNA درمانی جدید برای DMD و همچنین بیماری‌های مرتبط با افزایش سن داشته باشد. این یافته ها بینش جدیدی را در مورد miRNA های در گردش خون به عنوان مولکول های مرتبط با سن به ما ارائه می دهد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

عملکردهای حیاتی مانند نیروی ماهیچه ای، عملکرد سیستم عصبی، عملکرد تنفسی، دفاع در برابر عفونت و مقاومت در برابر بیماری ها با افزایش سن کاهش می یابد. بیماری ها و اختلالات مرتبط با چنین کاهش عملکردی در حال افزایش است و به مشکلات عمده در جوامع پیر تبدیل می شود. تغییرات مختلفی مانند تغییرات متابولیک و تنظیم ژن در بدن با پیری رخ می دهد-3. و مطالعه چنین تغییراتی ممکن است به درک سالمندی و ارائه راهبردهایی برای مقابله با مشکلات پیش روی جوامع پیر کمک کند. مولکول‌های زیستی (از جمله ژن‌ها) مرتبط با پیری شناسایی شده‌اند و ممکن است در تحقیقات پیری مفید باشند. به عنوان مثال، بیان -گالاکتوزیداز و polnk4a با پیری سلولی مرتبط است4-6، و یک مدل موش فاقد ژن klotho به عنوان یک مدل پیری با تعدادی فنوتیپ، شبیه به پیری زودرس انسان شناخته می‌شود.

پارابيوز اتحاد بين دو فرد است كه يك سيستم عروقي مشترك دارند و مي تواند به صورت تجربي توسط جراحي ايجاد شود. آزمایش‌هایی با پارابیوز، که در آن جوندگان جوان و مسن به هم متصل شدند تا یک سیستم عروقی مشترک داشته باشند، نشان داد که روند پیری در حیوانات جوان تسریع شد، در حالی که حیوانات مسن جوان شدند9-12. یافته‌ها قویاً نشان می‌دهند که عوامل خاصی مرتبط با جوان‌سازی و پیری وجود دارند و همراه با خون در سیستم عروقی گردش می‌کنند؛ با این حال، این عوامل در گردش هنوز به طور کامل شناخته نشده‌اند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

MicroRNA ها (miRNAs) 21-23- RNA های کوچک غیرکدکننده با طول نوکلئوتیدی هستند که از رونوشت های طولانی تر (miRNA های اولیه) توسط هضم پردازش می شوند، با کمپلکس ریزپردازنده در هسته و دایسر در سیتوپلاسم، و در داخل سیتوپلاسم گنجانده می شوند. کمپلکس خاموش کننده القا شده با RNA (RISC) 14،15.MiRNA در RISC به عنوان یک واسطه در خاموش کردن ژن عمل می کند، جایی که ترجمه RNA های پیام رسان (mRNA ها) که مکملی جزئی با miRNA دارند مهار می شود یا mRNA هایی که توالی های تقریباً مکملی را برای miRNA حمل می کنند digestedl4،15.عصاره سیستانچ ضد تشعشعبنابراین، miRNA ها از طریق سرکوب بیان ژن هدف خود، نقش مهمی در تنظیم ژن ایفا می کنند. هزاران ژن miRNA در حیوانات و گیاهان یافت شده است [به پایگاه داده microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml مراجعه کنید. نمایه بیان miRNA ها مورد بررسی قرار گرفته است و بیان بافت و مرحله رشد و بیان مرتبط با بیماری miRNA ها شناسایی شده است6-21. تنظیم ژن مربوط به miRNA ها ارتباط نزدیکی با عملکردهای حیاتی مختلف و پدیده های حیاتی از جمله بیماری ها دارد14،16،{7}}

MiRNA ها در خارج و همچنین در داخل سلول ها وجود دارند. به عنوان مثال، miRNA ها به عنوان نوکلئوتیدهای بدون سلول در خون وجود دارند و در سیستم عروقی گردش می کنند2627. چنین miRNA‌های بدون سلول (cf-miRNAs) در وزیکول‌های کوچکی به نام وزیکول‌های خارج سلولی یا مرتبط با پروتئین‌ها ترکیب می‌شوند و در نتیجه از نوکلئازهای خارج سلولی محافظت می‌شوند. حضور برخی از cf-miRNA ها ممکن است قابل توجه باشد. به عنوان مثال، ارتباط قابل توجهی بین cf-miRNA ها و بیماری های خاص شناسایی شده است26،27،{13}}. Cf-miRNA ها ممکن است منعکس کننده تغییرات در شرایط فیزیکی باشند. بنابراین، چنین miRNA هایی ممکن است نشانگرهای زیستی بالقوه ای برای نظارت بر سیستم های حفظ حیات و همچنین بیماری ها باشند.

مطالعه حاضر به منظور بررسی ارتباط بین cf-miRNAs و پیری انجام شد و cf-miRNAs در خون موش‌های جوان و مسن مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تغییرات در cf-miRNA ها را بین خون موش جوان و مسن نشان داد. در میان چنین miRNA ها، miR{3}}به طور قابل توجهی در خون پیر در مقایسه با خون جوان کاهش یافت. جالب توجه است که miR{4}}p توانایی افزایش تمایز و بازسازی عضلانی را دارد و تجویز آن به موش های مسن منجر به گسترش فیبر عضلانی می شود. هنگامی که miR{5}} در موش‌های mdx معرفی شد، یک مدل حیوانی مبتلا به دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) قدرت عضلانی موش‌ها به طور قابل‌توجهی بهبود یافت. مطالعه حاضر بینش جدیدی در مورد cf-miRNA های گردش خون از نظر پیری، توانایی پنهان و کاربردهای پزشکی ارائه می دهد.

نتایج

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>موش های C57BL/6J 23-ماهه، با استفاده از ریزآرایه DNA برای شناسایی تفاوت های مرتبط با سن. مشخصات cf-miRNA ها تفاوت های مشخصی را بین موش های جوان و مسن نشان داد، به عنوان مثال، cf-miRNA هایی که به سمت خون موش جوان و مسن سوگیری دارند، شناسایی شدند (جدول 1). از میان چنین miRNA ها، miRNA های میوژنیک (مثلاً miR-1 و miR-133) 1833 در گروه miRNA که در خون جوان به وفور وجود دارد، وجود داشت. به عبارت دیگر، miRNA های میوژنیک به طور قابل توجهی در خون پیر کمتر بود (جدول 1).گیاه سیستانچتفاوت در miRNA ها بین خون جوان و مسن با واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی (qRT-PCR؛ شکل la) تأیید شد و با استفاده از منابع RNA استخراج شده از وزیکول های کوچک، به اصطلاح اگزوزوم، جدا شده از پلاسما، تکثیر شد. شکل تکمیلی 1).

از سوی دیگر، آزمایش‌های کشت سلولی نشان داد که سرم موش جوان توانایی القای تمایز میوژنیک را دارد و این توانایی قوی‌تر از موش‌های مسن است (شکل 1b). فاکتور رشد شبه انسولین I (IGF-I)، که یک عامل اصلی قادر به القای تمایز میوژنیک در خون است، مورد بررسی قرار گرفت. با این حال، تفاوت معنی داری بین خون جوان و مسن مشاهده نشد (شکل lc). بنابراین، عواملی غیر از IGF-I در خون جوان ممکن است در تمایز میوژنیک دخیل باشند.

miR{0}}p قادر است به شدت باعث ایجاد تفاوت میوژنیک شود. ما اثرات miRNA های فراوان در خون جوان را بر تمایز میوژنیک بررسی کردیم. تقلیدهای miRNA مصنوعی به سلول‌های C2C12، یک رده سلولی میوبلاست موش، معرفی شدند و بیان نشانگرهای تمایز میوژنیک، ژن‌های میوژنین (Myog) و میوزین زنجیره سنگین 1 (Myh1) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج غیرمنتظره بود و علاقه ما را به خود جلب کرد: miR-199-3p، که به دلیل اطلاعات اندک در مورد تمایز میوژنیک به عنوان یک miRNA منفی پیش‌بینی شده بود، به طور قابل توجهی بیان Myog و Myh1 را القا کرد (شکل 2a, b). علاوه بر این، القای miR{9}}p قوی‌تر از miRNA‌های myogenic معمولی بود: بیان زنجیره سنگین میوزین در حضور miR{10}}p به‌ویژه قابل توجه بود (شکل 2b، c).

برای روشن شدن رابطه بین miR{0}}p و تمایز myogenic، ما سلولی و خارج سلولی (exoso-mal) miR-199-3 را در طول تمایز میوژنیک و همچنین اثرات مهارکننده‌های miR{3}}p بررسی کردیم. در تمایز بیان درون زا (سلولی) miR{4}}p پس از شروع تمایز تنظیم مثبت شد. miR{5}}p اگزوزومی یک بار افزایش و پس از آن کاهش یافت (شکل تکمیلی 2a). درمان با مهارکننده بیان نشانگرهای تمایز میوژنیک، Myog، Myh1، و کراتین کیناز (Ckm) را سرکوب کرد (شکل تکمیلی 2b).رشد آلت تناسلی سیستانچیبنابراین، یافته ها نشان می دهد که miR{0}}p در تمایز myogenic شرکت می کند.

طراحی تقلیدهای miR-199. ما تقلیدهای miR-199 را طوری طراحی کردیم که تقلیدها بتوانند به طور مؤثر miR-199-3p را به عنوان یک واسطه عملکردی (رشته راهنما) در خاموش کردن ژن تولید کنند. تقلیدهای miRNA طراحی شده غربالگری شدند و miR199#4 به عنوان تقلید miR{6}} مناسب انتخاب شد (شکل تکمیلی 3). متعاقباً، miR199#4 در هر دو آزمایش in vivo و in vitro استفاده شد.

ژن‌های هدف miR{0}}p در تمایز میوژنیک. برای شناسایی ژن‌های هدف miR{1}}p تحت تمایز میوژنیک، ژن‌های کاندید را از پایگاه داده TargetScan جستجو کردیم و بر روی ژن‌های Lin28b و Suz12 تمرکز کردیم، که هر دو در میوبلاست‌های C2C12 بیان می‌شوند. Lin28b و Suz12 دارای توالی های اتصال فرضی miR{9}} در ناحیه ترجمه نشده 3 خود هستند (UTR؛ شکل 3a). با استفاده از ژن‌های گزارشگر لوسیفراز حامل توالی‌های اتصال و توالی‌های ناهماهنگ متناظر، نشان دادیم که توالی‌های فرضی مکان‌های اتصال معتبری برای miR{12}}p هستند (شکل 3a، b). ژن های لوسیفراز حامل توالی های اتصال فرضی به طور قابل توجهی توسط miR{14}}p [pLin28b-(81)، pLin{18}}(983) و pSuz{20}}(973) سرکوب شدند، در حالی که توالی‌های نامتناسب، که دارای جهش‌های جایگزینی پایه در ناحیه دانه هستند [pLin28b-(81)mut، منطقه، اثر سرکوبی آن را لغو کردند [pSuz{25}}(973)mut]. pLin28-(983)mut، و هنگامی که تقلیدهای miR{29}} به سلول‌های C2Cl2 معرفی شدند، بیان Lin28b و Suz12 به طور مداوم سرکوب شد (شکل 3c). برای ارزیابی اینکه آیا سرکوب Lin28b و/ یا Suz12 به طور مستقیم به تمایز myogenic کمک می کند، مهار خاص Lin28b و Suz12 با خاموش کردن ژن، با استفاده از تداخل RNA انجام شد (RNAi؛ شکل 3d، e). همانطور که انتظار می رفت، بیان نشانگرهای تمایز myo-genic، مانند Ckm، Myh1، و Myog تحت خاموش کردن ژن Lin28b و Suz12 تنظیم مثبت شد (شکل 3f، g).

از آنجایی که Lin28b یک پروتئین متصل به RNA است که در پردازش miRNAs3637 نقش دارد، ما اثرات تقلیدهای miR-19 از طریق Lin28b را بر روی پردازش miRNA myogenic بررسی کردیم. سطح miR-1، یک miRNA myogenic اصلی، مورد بررسی قرار گرفت زیرا پردازش پیش ساز آن توسط Lin28b37 تنظیم می شود. miR بالغ{8}} به طور قابل توجهی با درمان تقلید miR-199 افزایش یافت (شکل 3h)، نشان می‌دهد که miR{11}}p می‌تواند بیان عملکردی miR-1 را از طریق سرکوب تنظیم کند. از هدف خود Lin28b. در مجموع، یافته‌ها نشان می‌دهند که miR{15}}p در تمایز میوژنیک از طریق سرکوب ژن‌های هدف آن، Lin28b و Suz12 نقش دارد.

تقویت بازسازی عضلانی توسط miR199#4 در موش های آسیب دیده عضلانی.فواید سالسا سیستانچما اثرات تقلید miR-199 (miR199#4) را در داخل بدن با استفاده از مدل‌های آسیب عضلانی بررسی کردیم (شکل 4a, b). موش‌های هشت هفته‌ای C57BL/6J با BaClz به تیبیالیس قدامی (TA) تزریق شدند تا آسیب عضلانی ایجاد کنند، و miR19#4 24 ساعت بعد به محل‌های آسیب‌دیده تزریق شد. دو روز پس از تجویز miR199#4، بیان ژن‌های نشانگر myogenic مورد بررسی قرار گرفت. بیان Myog به طور قابل توجهی افزایش یافت و تمایز میوژنیک 1 (Myod1) و فاکتور میوژنیک 5 (Myf5) نیز با تجویز miR199#4 تنظیم مثبت شد (شکل 4c). داده ها با نتایج in vitro که در بالا توضیح داده شد مطابقت دارند (شکل 2).

آنالیز ایمونوهیستوشیمی عضلات در حال بازسازی 9 روز پس از تجویز miR199#4 انجام شد. نواحی مقطعی فیبرهای عضلانی در حال بازسازی (میوفیبرها)، که با هسته مرکزی مشخص می شود، مورد بررسی قرار گرفت (شکل 4b). میانگین سطح مقطع مایوفیبرهای بازسازی‌شده تیمار شده با miR199#4 بزرگ‌تر از میوفیبرهای کنترلی بود که با یک دوبلکس RNA کنترل غیرخاموش (nsCont؛ شکل 4d) تیمار شده‌اند، با این تفاوت که به اهمیت آماری نزدیک می‌شود. علاوه بر میانگین سطح مقطع، هیستوگرام تقسیم شده بر حسب اندازه سطح مقطع، افزایش میوفیبرهای بزرگ شده را در حضور miR199#4 نشان داد (شکل 4e).

اثر هیپرتروفیک miR199#4 بر فیبرهای عضلانی پیر. ما اثرات miR199#4 را روی موش‌های مسن (24 ماهه) بررسی کردیم. موش‌های مسن کاهش قابل‌توجهی در miR{6}}p عضلانی (شکل 5a)، مانند cf-miR{10}}p در گردش خون، در مقایسه با موش‌های جوان نشان دادند. ما miR199#4 را به عضلات TA موشهای مسن تزریق کردیم و 2 روز بعد عضلات TA با آنالیز ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 5b). میانگین سطح مقطع مایوفیبرهای تیمار شده با miR199#4 به طور قابل توجهی بزرگتر از سطح مقطع میوفیبرهای کنترل شده با nsCont بود (شکل 5c). مطابق با این، تجزیه و تحلیل هیستوگرام تقسیم شده با اندازه افزایش قابل توجهی در مایوفبرهای بزرگ شده در حضور miR199#4 را نشان داد (شکل 5d).

از آنجایی که گردش خون cf-miR-199-3p در موش‌های مسن کاهش می‌یابد، ما miR199#4 را از طریق دم واین وارد خون در گردش موش‌های مسن کردیم. پس از تجویز داخل وریدی miR19#4، سطح مقطع مایوفیبرها همانطور که در بالا توضیح داده شد مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج، همانطور که در شکل 5e نشان داده شده است، با نتایج تجویز موضعی miR199#4 به عضلات پیر مطابقت دارد (شکل 5c, d).

لازم به ذکر است که تفاوتی در فیبرهای عضلانی بزرگ شده بین مدل آسیب عضلانی و موش های مسن وجود دارد. هسته های مرکزی در فیبرهای عضلانی در حال بازسازی دیده می شوند (شکل 4b)، اما چنین میوفیبرهایی به سختی در موش های مسن تحت درمان با miR199#4 (شکل 5b) شناسایی شدند. این نشان می دهد که فیبرهای عضلانی موجود ممکن است در موش های مسن پس از درمان miR199#4 بزرگ شوند. ما فرض کردیم که مکانیسم دیگری متفاوت از بازسازی عضله ممکن است در بزرگ شدن میوفیبر در موش های مسن دخیل باشد و دخالت مسیر آتروفی عضلانی را پیشنهاد کردیم.دوز cistanche tubulosa redditژن‌های Atroginl و MuRFI ارتباط نزدیکی با آتروفی عضلانی دارند و سطح بیان آنها در ماهیچه‌های مسن در مقایسه با عضلات جوان به طور قابل‌توجهی افزایش می‌یابد (شکل 6a). ما سطح Atroginl و MuRFI را در عضلات موش های مسن پس از تجویز سیستمیک miR199#4 بررسی کردیم. آتروژینل و MuRFI با تجویز miR19#4 بطور قابل توجهی در عضلات مختلف کاهش یافتند (شکل 6b)، که نشان می‌دهد سرکوب مسیر آتروفی عضلانی توسط miR199#4 ممکن است باعث گسترش میوفیبر در موش‌های مسن شود.

MiR199#4 از دست دادن قدرت عضلانی را در موش های مسن به تاخیر می اندازد. اثر miR199#4 بر عملکرد عضلات در موش های مسن مورد توجه است. تست قدرت گرفتن بر روی موش های مسن قبل و بعد از تجویز سیستمیک miR199#4 انجام شد. این آزمایش به روش دوسوکور انجام شد؛ تزریق RNA و آزمایش 100 درصد گرفتن توسط آزمایش‌کنندگان مختلف بدون اشتراک‌گذاری اطلاعات i انجام شد. موش‌های نر C57BL/6 ({10}}هفته‌ای) تحت آزمایش گریپ قرار گرفتند، سپس 1 هفته بعد، miR199#4 و nsCont به صورت داخل وریدی به آنها تزریق شد و مجدداً آزمایش گرفت. تغییر در قدرت عضلانی پس از تزریق miR199#4 به صورت MiR199#4 بود که قدرت عضلانی موش‌های mdx را بهبود می‌بخشد. از آنجایی که miR199#4 تأثیر مثبتی بر عضلات دارد، آزمایشی را برای ارزیابی تأثیر تجویز miR199#4 در موش‌های mdx، یک مدل حیوانی معروف DMD انجام دادیم. به موش‌های mdx هشت هفته‌ای، miR199#4 (1.6 میلی‌گرم/کیلوگرم) دو بار (فاصله یک هفته) به صورت داخل وریدی تزریق شد و تست گرفتن یک هفته پس از آخرین تزریق انجام شد. آزمایش به روش دوسوکور همانطور که در شکل 7 نشان داده شده است انجام شد. نتایج (شکل 8a) بهبود قابل توجهی در قدرت عضلانی در موش‌های mdx تحت درمان با miR199#4 در مقایسه با موش‌های mdx تحت درمان با nsCont نشان می‌دهد. علاوه بر این، کاهش قابل توجهی در فعالیت کراتین کیناز (CK) و miR بدون سلول-1 در خون موش‌های mdx تحت درمان با miR199#4 (شکل 8b, c) مشاهده شد که نشانه‌های احتمالی بیماری است. بهبود

به عنوان یک معرف دارورسانی، آتلوکلاژن چسبناک است و کنترل آن دشوار است و به نظر می‌رسد موش‌هایی که با آتلوکلاژن درمان شده‌اند، اثرات منفی ناشی از وسیله نقلیه را متحمل می‌شوند. بنابراین، ما به دنبال جایگزین هایی برای آتلوکلاژن برای بهبود سیستم دارورسانی خود (DDS) بودیم و لیپوزوم های کاتیونی DC-CHOL/DOPE را به عنوان یک معرف جدید DDS یافتیم که برابر یا برتر از آتلوکلاژن است (شکل تکمیلی 4). توزیع داروی miR199#4 با لیپوزوم های کاتیونی نشان داد که miR19#4 تجویز شده به عضله تحویل داده شده و به طور مداوم در مقادیر زیادی در کبد جذب می شود (شکل تکمیلی 5). miR199#4 خارج سلولی که به عضله تحویل داده می شود ممکن است به عنوان یک واسطه در خاموش کردن ژن عمل کند و به تنظیم ژن درگیر در بهبود قدرت عضلانی کمک کند.

ما سعی کردیم مولکول‌های زیستی مرتبط با بهبود را پس از تجویز miR199#4 شناسایی کنیم. پلی پپتیدهای مختلف مرتبط با DMD توسط وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفتند، با این حال، سیگنال های متمایز مربوط به بهبود در این مطالعه شناسایی نشد (شکل تکمیلی 6). در بخش بعدی بیشتر به این موضوع خواهیم پرداخت.

بحث

مولکول‌های زیستی با افزایش سن از نظر کیفی و کمی تغییر می‌کنند--3. ثبت چنین تغییراتی و مطالعه آنها برای درک سالمندی حیاتی است و ممکن است راهبردهایی را برای مقابله با مشکلات در جوامع پیر نشان دهد. مطالعات پارابیوز که در آن حیوانات جوان و مسن به هم متصل شده اند تا یک سیستم عروقی مشترک داشته باشند، بینش های مهمی در مورد پیری و جوان سازی ارائه کرده است9-l2. یافته ها قویاً نشان می دهد که عوامل جوان کننده و پیری به ترتیب در خون در گردش جوان و سالخورده وجود دارد. مطالعات قبلی مولکول‌های مختلفی را به عنوان کاندیدای جوان‌سازی و پیری گزارش کرده‌اند، اما نتایج بحث‌برانگیز هستند.

آزمایش‌های کشت سلولی آزمایشگاهی ما با استفاده از سرم‌های جوان و مسن شبیه آزمایش‌های پارابیوز (شکل lb) است و ما miR-199-3p را که با افزایش سن تغییر می‌کند، در خون در گردش یافتیم. مشخص شد که miRNA به طور قابل توجهی در خون پیر کاهش می یابد (جدول 1 و شکل la). علاوه بر این، بیان عضله (سلولی) miR{2}}p به طور قابل توجهی در عضلات پیر در مقایسه با عضلات جوان کاهش می یابد (شکل. 5a)؛ بنابراین، cf-miR{6}}p در خون ممکن است با miR عضله-199-3p مرتبط باشد. کاهش بیان miR{8}}p با افزایش سن در سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان رزوس ماکاک نیز مشاهده می شود. بنابراین، بیان miR{10}}p سلولی ممکن است تحت کنترل مرتبط با سن باشد. بر خلاف miR{12}}p، بیان miRNA های میوژنیک سلولی، مانند miR-1 و miR-133، در عضلات جوان و مسن بدون تغییر باقی می‌ماند (شکل 5a)، اما سطح miRNA های خارج سلولی آنها در خون به طور قابل توجهی در موش های مسن کاهش می یابد (شکل la). تفاوت بین miR{16}}p و miRNA های myogenic (miR{17}} و-133) ممکن است منعکس کننده تفاوت در پردازش cf-miRNA و/یا کنترل مرتبط با سن cf-miRNA بین آنها باشد. . برای روشن شدن این تفاوت، باید مطالعات بیشتری در آینده انجام شود.

مطالعات قبلی نشان داد که miR{0}}p در عملکردهای مختلف سلولی و پدیده‌های حیاتی از طریق سرکوب ژن‌های هدف خود شرکت می‌کند. به عنوان مثال، miRNA ممکن است تکثیر و مهاجرت سلول‌های نوک اندوتلیال را تقویت کرده و شروع بلوغ را تعدیل کند، به ترتیب، از طریق کاهش سمافورین{1}} ژن 40 هدفمند و از طریق سرکوب ژن‌های هدف (Cdc42، Map3k2، Map3k4، و Taok1) در مسیر p38MAPK41 دخالت دارد. مطالعه حاضر نشان داده است که miR{11}}p در تمایز میوژنیک از طریق سرکوب ژن‌های هدف آن، Lin28b و Suz12 نقش دارد (شکل 3). Lin28b یک پروتئین متصل‌کننده به RNA است و بلوغ miRNA‌ها را مهار می‌کند، از جمله miR{17}}، که یک miRNA خاص عضلانی است و باعث میوژنز می‌شود. سرکوب Lin28b توسط miR-19-3p باعث افزایش miR بالغ-1 می‌شود (شکل 3)، که ممکن است به تمایز میوژنیک اجازه ادامه دهد.

Suzl2 یک زیرواحد اصلی از کمپلکس سرکوب کننده پلی کمب 2 (PRC2) است که در سرکوب کروماتین42 شرکت می کند. تنظیم ژن PRC2 در نگهداری سلول‌های بنیادی، رشد جنینی، تکثیر و تمایز سلولی، از جمله تمایز میوژنیک، نقش دارد. از چنین جایگاه هایی در میوتوب های متمایز43. خاموش کردن ژن در برابر Suz12 توسط RNAi باعث افزایش بیان ژن myogenic می شود (شکل 3). سرکوب تقویت کننده پروتئین همولوگ zeste 2 (Ezh2)، یکی دیگر از زیرواحدهای اصلی PRC2، نیز باعث تمایز میوژنیک می شود. این یافته ها نشان می دهد که مهار تشکیل PRC2 به دلیل سرکوب زیرواحدهای اصلی آن ممکن است باعث ایجاد یک حالت ژنومی برای تمایز عضلانی شود. بنابراین، سرکوب Suz12 توسط miR{17}} ممکن است باعث تمایز میوژنیک شود. روی هم، miR{18}p ممکن است نقش مهمی در تمایز میوژنیک از طریق مهار دو مسیر مستقل شامل Lin28b و Suzl2 ایفا کند، که هر کدام در حفظ حالت تمایز نیافته میوبلاست‌ها نقش دارند.

اثر miR{0}}p بر تمایز میوژنیک نیز در داخل بدن نشان داده شده است (شکل 4). آسیب عضلانی به دلیل بازسازی عضلانی باعث افزایش رشد و تمایز سلولی می شود. معرفی miR199#4، که miR-199-3p را به محل‌های آسیب‌دیده عرضه می‌کند، بازسازی ماهیچه‌ها را افزایش داد و مایوفبرهای بازسازی‌کننده را گسترش داد (شکل 4). بیان ژن میوژنیک به طور مداوم تحت درمان miR199#4 تنظیم مثبت شد (شکل 4). از نقطه نظر عملی، miR199#4 ممکن است برای درمان های جراحی موثر و مفید باشد.

هنگامی که miR199#4 به موش‌های مسن فاقد miR{3}}p در گردش خون تجویز شد، موش‌ها به‌طور قابل‌توجهی الیاف میوفی منبسط شده را نشان دادند (شکل 5) و کاهش قدرت عضلانی با افزایش سن را به تاخیر انداختند (شکل 7). مایوفبرهای منبسط شده در موش‌های مسن با میوفیبرهای احیاکننده متفاوت است که در حضور miR199#4 بزرگ می‌شوند. اولی از میوفیبرهای از قبل موجود مشتق شده است، و دومی از نئو میوفیبرها (میوفیبرهای تازه متولد شده) است. بنابراین، مکانیسم های متفاوت و مستقلی در بزرگ شدن فیبرهای عضلانی وجود دارد. مطالعه ما نشان می دهد که (1) در مورد اول، مهار آتروفی عضلانی به دلیل سرکوب آتروژینل و MuRFI توسط درمان miR199#4 باعث بزرگ شدن مایوفبرهای پیر می شود و (ii) در مورد دوم، سرکوب ژن های هدف، Lin28b. و Suz12 باعث بزرگ شدن مایوفبرهای احیا کننده می شود. در مجموع، ژن‌های مختلف (چندین) تنظیم‌شده توسط miR{13}}p ممکن است در موقعیت‌های مختلف در هیپرتروفی عضلانی دخیل باشند. یافته‌ها همچنین نشان می‌دهند که miR{14}}p ممکن است حداقل یک اثر ضد پیری روی عضله داشته باشد، و miR199#4 که miR{17}}p را تامین می‌کند ممکن است به عنوان یک داروی جدید RNA برای بیماری‌های عضلانی مرتبط با افزایش سن، پتانسیل داشته باشد. مانند سارکوپنی.

بر اساس اثربخشی بالای miR199#4 بر روی عضلات، ما miR199#4 را به موش‌های mdx، یک مدل معروف DMD، تزریق کردیم و نتایج قابل‌توجهی به دست آوردیم: تجویز سیستمیک miR199#4 باعث بهبود قدرت عضلانی در موش‌ها تا 20 درصد شد. شکل 8 الف). برای درک مکانیسم بازیابی قدرت عضلانی، ما سعی کردیم مولکول‌های زیستی را شناسایی کنیم که توسط miR{9}}p بهبود یافته (یا تحت تأثیر قرار گرفته‌اند). با این حال، به استثنای بهبودهای CK خون و cf-miR{11}} (شکل 8b، c)، ما قادر به تشخیص چنین پیشرفت‌هایی در سطح مولکولی نبودیم. این مشکل در تشخیص ممکن است به دلیل جمعیت سلولی پیچیده باشد که از ترکیبی از سلول‌های عضلانی در حال بازسازی و از هم گسیختگی در موش‌های mdx تشکیل شده است. حتی اگر miR199#4 منجر به بهبود شود، نویز بالای پس‌زمینه ناشی از جمعیت سلولی پیچیده شواهدی از بهبود را پنهان می‌کند. برای حل این مشکل، باید مطالعات گسترده‌تری با استفاده از یک جمعیت سلولی عضلانی همگن مشتق شده از موش‌های mdx یا تمرکز بر بافت‌های مختلف از جمله ماهیچه انجام شود.

اگرچه مکانیسم مولکولی بازیابی قدرت عضلانی توسط miR199#4 ناشناخته باقی مانده است، دوز miR19#4 برای بهبود قدرت عضلانی قابل توجه است. تجویز دو بار ~1.6 mg/kg miR199#4 قدرت عضلانی را در موش mdx بهبود بخشید. به نظر می رسد دوز موثر کمتر از الیگونوکلئوتیدهای آنتی سنس برای حذف اگزون در برابر ژن های دیستروفین جهش یافته در داخل بدن است{10}}. دلیل اینکه miR199#4 قادر به بهبود قدرت عضلانی در چنین دوزهای کمتری است ممکن است به دلیل مکانیسم اثر متفاوت آن در مقایسه با الیگونوکلئوتیدهای آنتی سنس باشد. مکانیسم اثر miR19#4 خاموش کردن ژن کاتالیزوری است. در مقابل، مکانیسم اولی گونوکلئوتیدهای آنتی سنس بر اساس هیبریداسیون فیزیکی است. بنابراین، تفاوت در دوزهای مناسب برای نشان دادن اثربخشی دارو ممکن است به مکانیسم های مختلف اثر نسبت داده شود.

مکانیسمی که توسط آن اندام‌ها، بافت‌ها یا سلول‌ها miRNA‌ها را در خون در گردش آزاد می‌کنند هنوز به طور کامل شناخته نشده است، و مقررات مربوط به سن در آزادسازی چنین miRNA‌هایی نیز نامشخص است. مطالعه حاضر نشان داد که cf-miR-NAهای میوژنیک از جمله cf-miR{4}}p همراه با خون در سیستم عروقی گردش می‌کنند و با افزایش سن کاهش می‌یابند. چنین cf-miRNA هایی ممکن است در اگزوزوم ها وجود داشته باشند، یعنی miRNA های اگزوزومی هستند.

miRNA های میوژنیک در تمایز میوژنیک، بازسازی عضلات و حفظ هموستاز عضلانی شرکت می کنند. مطالعات قبلی گزارش کردند که miRNA های میوژنیک، مانند miR-1 و miR-133، در پاسخ به تمرینات بدنی در خون افزایش یافتند4849. بر اساس این گزارش‌ها، موش‌های جوان فعال ممکن است miRNA‌های میوژنیک بیشتری را نسبت به موش‌های آهسته‌ی مسن در خون آزاد کنند و چنین miRNA‌های خارج سلولی، از جمله cf-miR-199-3p ممکن است از طریق عملکرد اتوکرین در حفظ هموستاز عضلانی در موش‌های جوان نقش داشته باشند. . با این حال، سطح miRNA خارج سلولی (اگزوزومی) همیشه با سطح miRNA سلولی همبستگی ندارد و تفاوت‌هایی در miRNA‌های myogenic و miR{7}} بین موش‌های جوان و مسن (شکل‌های la و 5a) و در طول مشاهده شده است. تمایز میوژنیک (شکل تکمیلی 2a). بنابراین، به عنوان یک احتمال دیگر، می توان تصور کرد که تنظیم مرتبط با سن و تمایز تشکیل اگزوزوم ممکن است بر تولید cf-miRNA تأثیر بگذارد. به طور خاص، ممکن است تفاوت هایی در تشکیل اگزوزوم بین موش های جوان و مسن وجود داشته باشد. در زمینه این فرضیه ها، مطالعات بیشتری برای روشن شدن انتشار miRNA های myogenic در خون مربوط به سن مورد نیاز است.

جدای از مکانیسم آزادسازی، زمانی که cf-miRNA های جوان میوژنیک حاوی cf-miR{2}}p توسط پارابیووز به سیستم گردش خون پیر از یک سیستم عروقی جوان جریان می یابد، cf-miRNA ها می توانند باعث فعال شدن عضله و مهار عضله شوند. آتروفی در سمت پیر؛ این مفهوم با شواهدی از موش‌های مسن که به صورت داخل وریدی miR19#4 در این مطالعه تزریق شده‌اند، پشتیبانی می‌شود (شکل‌های 5-7). Cf-miRNA های موجود در خون ممکن است به عملکرد هموستاتیک مرتبط با سن مرتبط باشد و می تواند نشان دهنده هموستاز تغییر یافته باشد. هنگامی که چنین cf-miRNA هایی به صورت نابجا وجود دارند، به عنوان مثال، هنگامی که cf-miRNA ها در خون جوان به سیستم گردش خون پیر منتقل می شوند، برخی از cf-miRNA ها ممکن است اثرات جوان کنندگی در سمت پیر نشان دهند، به عنوان مثال، ممکن است اثرات ضد پیری ایجاد کنند. در مقابل، cf-miRNA ها در خون پیر ممکن است نشان دهنده هموستاز تغییر یافته با افزایش سن باشد. هنگامی که چنین cf-miRNA ها به سیستم گردش خون جوان منتقل می شوند، برخی از cf-miRNA ها ممکن است باعث زوال مرتبط با افزایش سن شوند و ممکن است باعث پیری زودرس در سمت جوان شوند. Cf-miRNA هایی که به طور قابل توجهی در خون پیر افزایش یافته اند، نامزدهایی هستند که برای درک و جلوگیری از پیری به تجزیه و تحلیل مکانیکی دقیق نیاز دارند.

در نتیجه، مطالعه فعلی ما بینش های جدیدی را در مورد cf-miRNA ها به عنوان مولکول های مرتبط با سن ارائه کرده است، و یک جهت تحقیقاتی جدید برای روشن کردن رابطه بین پیری و RNA های عملکردی بدون سلول، از جمله cf-miRNA ها، نشان داده است.

این مقاله از COMUNICATIONS BIOLOGY استخراج شده است (2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio