MTHFD2 یک عامل کنترل کننده ایست بازرسی متابولیک و تنظیم کننده سرنوشت و عملکرد سلول T است.

چکیده گرافیکی

نویسندگان:

آیاکا سوگیورا، گابریلا آندریوا، کلسی ووس، ...، آشوتوش کی. منگالام، جاشوا دی. رابینوویتز، جفری سی راتمل

مکاتبه:

jeff.rathmell@vumc.org

به طور خلاصه :

سنتز نوکلئوتید برای حمایت از تکثیر سریع سلول های T مورد نیاز است. سوگیورا و همکاران نشان می دهد که متابولیسم پورین de novo سیگنال های مستقیم تمایز و عملکرد سلول های T می دهد و MTHFD2 را به عنوان یک نقطه بازرسی متابولیک و هدف درمانی برای بیماری های التهابی شناسایی می کند.

نکات برجسته

• MTHFD2 برای سلول های CD4 T فعال شده برای حفظ سنتز جدید پورین حیاتی است

• MTHFD2 ناکافی باعث افزایش فنوتیپ های سلول مانند Treg و متابولیسم در سلول های Th17 می شود. مهار MTHFD2 سیگنال دهی mTORC1 را سرکوب می کند و متیلاسیون هیستون را تغییر می دهد.

• MTHFD2 را می توان برای محافظت در برابر التهاب و خودایمنی در داخل بدن هدف قرار داد

MTHFD2 یک ایست بازرسی متابولیک است که تأثیرگذار و تنظیم کننده سرنوشت و عملکرد سلول T است

آیاکا سوگیورا،¹گابریلا آندریوا،¹کلسی ووس،¹دارن آر. هاینتزمن،¹شینچنگ خو،⁵متیو ز. مدن،¹شیانگ یه،¹کاترین ال بییر،¹Nowrin U. Chowdhury،²ملیسا ام ولف،²آریسا سی یانگ،¹دالتون ال. گرینوود،¹آلیسون ای. سوول،¹شیلش ک. شاهی،³سامانتا ان. فریدمن،³آلانا ام. کامرون،⁴پاتریک فورچ،⁴تیم بورن،⁴خوان سی. گارسیا-کاناوراس،⁵جان کاریولیچ،¹داون سی. نیوکمب،²آشوتوش ک. منگالام،³جاشوا دی. رابینوویتز،⁵و جفری سی راتمل^1,6,*

¹مرکز ایمونوبیولوژی واندربیلت، گروه پاتولوژی، میکروبیولوژی و ایمونولوژی، مرکز پزشکی دانشگاه وندربیلت، نشویل، TN 37232، ایالات متحده آمریکا

²گروه پزشکی، بخش هماتولوژی و انکولوژی، مرکز پزشکی دانشگاه واندربیلت، نشویل، TN 37232، ایالات متحده آمریکا

³گروه آسیب شناسی، دانشگاه آیووا، شهر آیووا، IA 52242، ایالات متحده آمریکا

⁴Sitryx Therapeutics Limited، مرکز Magdalen، پارک علمی آکسفورد، آکسفورد، انگلستان

⁵گروه شیمی، موسسه تحقیقات سرطان لودویگ، شعبه پرینستون، موسسه لوئیس-سیگلر برای ژنومیک یکپارچه، دانشگاه پرینستون، پرینستون، NJ 08544، USA6 تماس با ما

*مطابقات: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

خلاصه

تحریک آنتی ژنی برنامه‌ریزی مجدد متابولیک سلول‌های T را برای پاسخگویی به نیازهای بیوسنتزی، بیوانرژیک و سیگنالینگ افزایش می‌دهد. ما نشان می‌دهیم که آنزیم متابولیسم یک کربن (1C) متیلن تتراهیدروفولات دهیدروژناز 2 (MTHFD2) سنتز و سیگنال‌دهی جدید پورین را در سلول‌های T فعال تنظیم می‌کند تا تکثیر و تولید سیتوکین‌های التهابی را تقویت کند. در سلول‌های T helper{4}} (Th17)، MTHFD2 از تنظیم نابجای فاکتور رونویسی FoxP3 همراه با افزایش نامناسب ظرفیت سرکوب‌کننده جلوگیری کرد. کمبود MTHFD2 همچنین تمایز سلولی تنظیمی T (Treg) را ارتقا داد. از نظر مکانیکی، مهار MTHFD2 منجر به تخلیه استخرهای پورین، تجمع واسطه‌های بیوسنتزی پورین و کاهش سیگنال‌دهی حسگر مواد مغذی mTORC1 شد. MTHFD2 همچنین برای تنظیم متیلاسیون DNA و هیستون در سلول های Th17 حیاتی بود. نکته مهم این است که کمبود MTHFD2 شدت بیماری را در مدل‌های متعدد بیماری التهابی in vivo کاهش می‌دهد. بنابراین MTHFD2 یک نقطه بازرسی متابولیک برای ادغام متابولیسم پورین با سیگنال‌دهی سلول‌های عامل بیماری‌زا است و یک هدف درمانی بالقوه در مسیرهای متابولیسم 1C است.

مقدمه

بسیج موثر پاسخ ایمنی تطبیقی ​​نیازمند فعال سازی قوی سلول های CD4 به علاوه T برای رشد و تکثیر سریع سلولی است. این شامل برنامه ریزی مجدد متابولیک است که توسط حسگر ماده مغذی mTORC1 هدایت می شود، از حالت استراحت کاتابولیک به حالت رشد آنابولیک با افزایش نیازهای بیوسنتزی، بیوانرژیک و سیگنالینگ. بسته به محیط سیتوکین، سلول‌های CD4 به علاوه T به عوامل مؤثر و همچنین زیرمجموعه‌های تنظیمی تمایز می‌یابند که دارای برنامه‌های متابولیکی متمایز هستند که عملکردهای مؤثر خود را هدایت می‌کنند (بانتوگ و همکاران، 2018؛ باک و همکاران، 2015). تعادل این زیرمجموعه ها برای ایمنی طبیعی در عین جلوگیری از بیماری های التهابی و خودایمنی حیاتی است. به عنوان مثال، مولتیپل اسکلروزیس (MS) با افزایش سلول های T کمک کننده (Th17) تولید کننده اینترلوکین-17 (IL{- 17) و سلول های T تنظیم کننده سرکوب کننده (Treg) کاهش یافته یا بی اثر است. (دندرو و همکاران، 2015). هدف قرار دادن برنامه های متابولیک خاص این زیرمجموعه های سلول T یک رویکرد جایگزین برای ایمونوتراپی ارائه می دهد.

درمان مبتنی بر متابولیسم سلولی در سال 1948 آغاز شد، زمانی که عوامل شیمی درمانی ضد فولات در کودکان مبتلا به لوسمی لنفوبلاستیک حاد مؤثر بودند (Farber et al., 1948). فولات به متابولیسم یک کربن (1C) برای بیوسنتز پورین، تولید دهنده متیل و حفظ تعادل ردوکس سلولی کمک می کند (داکر و رابینوویتز، 2017؛ یانگ و ووسدن، 2016). بسیاری از داروها، از جمله متوترکسات (MTX)، فلوئورواوراسیل (5-FU)، و مرکاپتوپورین (6-MP)، از آن زمان برای هدف قرار دادن این مسیر توسعه یافته اند. سلول‌هایی که به سرعت تکثیر می‌شوند، از جمله سلول‌های سرطانی و سلول‌های T فعال شده، وابستگی‌های مشترکی به این مسیرها برای سنتز DNA و RNA دارند. MTX معمولاً برای درمان بیماری های خود ایمنی مانند آرتریت روماتوئید (RA) استفاده می شود (براون و همکاران، 2016). با این حال، به دلیل بیان گسترده آنزیم های هدف، این عوامل درمانی با عوارض جانبی رایج و بالقوه شدید همراه هستند. شناسایی اهداف آنزیمی متابولیک که به طور انتخابی در جمعیت‌های سلولی مورد علاقه مهم هستند، می‌تواند منجر به توسعه ایمن‌درمانی‌های ایمن‌تر و مؤثرتر شود.

متابولیسم 1C شامل چرخه های فولات و متیونین با انتقال واحدهای کربنی است. سرین به عنوان یک اهداکننده 1C برای فعال کردن تتراهیدروفولات (THF) به 5،{3}}متیلن THF، با تولید همزمان گلیسین عمل می کند. 5، 10-متیلن THF را می توان با استفاده از NAD(P) برای تولید پیش ساز پورین 10- فرمیل THF اکسید کرد. متناوبا، 10-formylTHF را می توان از فرمت و THF به روشی وابسته به ATP سنتز کرد. در مسیر سیتوزولی، 10-تولید fomylTHF توسط متیلن THF دهیدروژناز 1 (MTHFD1) واسطه می شود. از دست دادن MTHFD1 باعث گرسنگی سلول‌ها برای 10-formylTHF سیتوزولی، حذف ظرفیت بیوسنتزی پورین، و جهش در MTHFD1 باعث کمبود شدید ایمنی ترکیبی (SCID) می‌شود (Field et al., 2015). مسیر میتوکندریایی متکی به MTHFD2 و MTHFD{17}}میتوکندری (MTHFD1L) است.

شکل 1. متابولیسم 1C و MTHFD2 در CD4 فعال شده تنظیم می شوند^{به علاوه}سلول های T و در زمینه EAE

(الف) تغییر در گونه های متابولیسم نوکلئوتیدی در CD4 تمایز یافته آزمایشگاهی^{به علاوه}زیر مجموعه‌های سلول T در مقایسه با سلول‌های ساده که با طیف‌سنجی جرمی اندازه‌گیری شده‌اند (n=3 تکرار بیولوژیکی).

(B) گردش کار برای غربالگری هدفمند CRISPR در مدل التهاب ریه in vivo.

(C) تغییر در فراوانی gRNA از متابولیسم 1C غربالگری CRISPR in vivo در CD4 اولیه^{به علاوه}سلول های T (تحلیل آماری انجام شده توسط MAGeCK، n=3 تکرار بیولوژیکی).

(D) بیان mRNA ژن‌های شناسایی شده در (C) در طول توسعه و فعال‌سازی سلول T (داده‌های مرورگر داده ImmGen RNA-seq).

(E) بیان پروتئین ژن های شناسایی شده در (C) در CD4 ساده و فعال شده^{به علاوه}سلول های T (داده های منبع پروتئوم ایمونولوژیک [ImmPRes]).

(F) بیان mRNA ژن های شناسایی شده در (C) در خون کامل افراد دارای اختلالات التهابی مشخص شده نسبت به افراد سالم (Aune et al., 2017). RA-MTX، RA تحت درمان MTX. SLE، لوپوس اریتماتوز سیستمیک؛ MS-Tx ساده لوح، MS ساده در درمان در زمان تشخیص؛ MS ایجاد شده، MS تحت درمان و در حال بهبودی بیماری. n=3–۸ اهداکننده.

(G) IHC رنگ‌آمیزی CD3 و MTHFD2 را در بخش دم اسبی نخاع موش‌ها با EAE علامت‌دار در بزرگنمایی 2003 (بالا؛ نوار مقیاس، 100 میلی‌متر) و 4003 (پایین؛ نوار مقیاس، 50 میلی‌متر) نشان می‌دهد (داده‌ها نماینده هستند. از دو آزمایش مستقل).

(H و I) نسبی (H) میانگین شدت فلورسانس (MFI) و (I) بیان mRNA ژن MTHFD2 در CD4^{به علاوه}سلول های T از طحال و نخاع موش های دارای EAE علامت دار و طحال موش های کنترل (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، داده ها نماینده دو آزمایش مستقل با 6 تکرار بیولوژیکی هستند).

(J) بیان mRNA ژن MTHFD2 در CD4 تمایز نیافته^{به علاوه}سلول های T 0، 5 و 24 ساعت پس از فعال شدن با آنتی بادی های ضد CD3 و ضد CD28 (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، n=3 تکرار بیولوژیکی).

(K) MTHFD2 MFI نسبی طی 5 روز پس از فعال‌سازی در زیرمجموعه‌های سلول‌های CD4 به علاوه T، به سلول‌های در حال استراحت نرمال شد (میانگین ± SD، n=3 تکرار بیولوژیکی). شکل S1 را نیز ببینید. نتایج از نظر آماری معنی‌دار برچسب‌گذاری شده‌اند (* p < 0.05،="" **="" p="">< 0.01،="" ***="" p=""><0.001، ****="" p="" درصد="">

MTHFD2 یکی از ژن های بسیار القا شده و بیش از حد در همه تومورها است (Nilsson et al., 2014). اگرچه در طول جنین زایی به طور گسترده تنظیم می شود، اما MTHFD2 در اکثر بافت های بالغ بیان کمی دارد یا اصلاً بیان نمی شود (نیلسون و همکاران، 2014). در درمان ضد سرطان (Zhu and Leung، 2020)، مهار MTHFD2 ممکن است منجر به افزایش استرس اکسیداتیو شود (جو و همکاران، 2019؛ وان و همکاران، 2020)، وابستگی به گلایسین (کوفاریس و همکاران، 2016)، و ناکافی بودن سنتز پورین (بن صحرا و همکاران، 2016؛ پیکمن و همکاران، 2016). کمبود MTHFD2 همچنین می‌تواند فعالیت mTORC1 را از طریق مکانیسم‌های متعدد، از جمله از طریق تخلیه گوانین و مهار متعاقب آن mTORC{15}}فعال‌کننده GTPase Rheb سرکوب کند (Emmanuel et al., 2017). کمبود MTHFD2 همچنین باعث تجمع واسطه‌های مسیر سنتز پورین می‌شود، از جمله آنالوگ آدنوزین مونوفسفات (AMP) {{18}آمینو ایمیدازول کربوکسامید ریبونوکلئوتید (AICAR) (Ducker et al., 2016)، که می‌تواند AMP-activated protein-kinkin را فعال کند. برای مهار mTORC1 (سو و همکاران، 2019).

از آنجا که متابولیسم 1C چندین ورودی مواد مغذی را ادغام می کند و از نظر درمانی قابل تحمل است، ما نقش متابولیسم 1C را در CD4 بررسی کردیم.^{به علاوه}زیر مجموعه های T effector (Teff) و سلول Treg. از طریق غربالگری هدفمند بی‌طرفانه in vivo CRISPR-Cas{1} در سلول‌های T اولیه موش، ما MTHFD2 را به‌عنوان ضربه‌ای شناسایی کردیم که در افراد مبتلا به اختلالات التهابی نیز به طور مداوم تنظیم می‌شد. نکته قابل توجه، کمبود MTHFD2 تکثیر و عملکرد سلول های Teff را مختل کرد. کمبود MTHFD2 همچنین بیان نابجای FoxP3 و فعالیت سرکوب‌کننده را در سلول‌های Th17 در حالی که تمایز سلول‌های Treg را تقویت می‌کند، افزایش داد. این اثرات با تجمع AICAR، کاهش غلظت پورین، کاهش سیگنال دهی mTORC1، افزایش متابولیسم میتوکندری، و تغییر DNA و متیلاسیون هیستون همراه بود. در داخل بدن، هدف قرار دادن MTHFD2 در برابر چندین مدل بیماری التهابی محافظت می کند. این داده ها نشان می دهد که MTHFD2 به عنوان یک نقطه بازرسی متابولیک در سلول های Th17 و Treg عمل می کند و پتانسیل این آنزیم را به عنوان یک هدف برای ایمونوتراپی ضد التهابی برجسته می کند.

نتایج

متابولیسم 1C و سنتز پورین به طور متفاوت در CD4 فعال است^{به علاوه}زیر مجموعه های سلول T

ما فرض کردیم که سنتز نوکلئوتید ممکن است در CD4 متفاوت باشد^{به علاوه}زیر مجموعه های سلول T CD4^{به علاوه}سلول های T در شرایط آزمایشگاهی به سلول های Th1، Th17 و Treg تمایز داده شدند و پس از 72 ساعت برای طیف سنجی جرمی جمع آوری شدند. مقادیر گونه های نوکلئوتیدی به طور کلی در تمام زیرمجموعه ها در مقایسه با سلول های ساده بالا بود (شکل 1A). قابل ذکر است، واسطه های سنتز پورین به طور متفاوت فراوان بودند، با بالاترین تجمع گلیسین آمید ریبونوکلئوتید (GAR)، 1-(فسفریبوزیل) ایمیدازول کربوکسامید (SAICAR)، و AICAR در سلول های Th17 (شکل S1A).

برای آزمایش وابستگی CD4^{به علاوه}سلول‌های T بر روی آنزیم‌ها در متابولیسم 1C، ما یک غربالگری مبتنی بر CRISPR-Cas{2}}در داخل بدن در CD4 اولیه انجام دادیم.^{به علاوه}سلول های T (شکل 1B). یک کتابخانه راهنمای سفارشی RNA (gRNA) برای هدف قرار دادن آنزیم‌ها در متابولیسم 1C، همراه با کمپلکس توبروس اسکلروزیس 2 (TSC2) به عنوان یک کنترل مثبت و کنترل‌های منفی غیر هدفمند (NTCs) ساخته شد. CD4^{به علاوه}سلول‌های T جدا شده از موش‌های تراریخته OT-II Cas9 با گیرنده سلول T اختصاصی (TCR) با این کتابخانه انتقال داده شدند و به صورت داخل وریدی به Rag1 منتقل شدند.^{__ /__}میزبان ها سپس موش ها با OVA داخل بینی ایمن شدند تا التهاب ریه را القا کنند. سلول‌های T بازیافت‌شده از ریه‌های این موش‌ها توالی‌یابی شدند و غنی‌سازی یا کاهش gRNA‌ها نسبت به فرکانس‌های ورودی ایجاد شد. TSC2 gRNA غنی شد و از نقش مهاری این پروتئین در سلول های T حمایت کرد. در مقابل، gRNA های PPAT، AHCY، MAT2A و MTHFD1 به طور قابل توجهی کاهش یافتند و GART، DHFR، DNMT1، MTRR، MTR، SHMT2 و MTHFD2 به میزان کمتری کاهش یافتند که نشان می دهد این ژن ها در تکثیر سلول های T و عملکرد التهابی نقش دارند. in vivo (شکل 1C و S1B).

ما در مرحله بعد نمایه بیان ژن های شناسایی شده از صفحه را بررسی کردیم. اگرچه همه به طور هماهنگ در تیموسیت‌های در حال رشد تنظیم شدند، mRNA و پروتئین MTHFD2 به شدت در سلول‌های T محیطی تحریک‌شده القا شدند (شکل‌های 1D و 1E). علاوه بر این، در مجموعه داده توالی RNA منتشر شده جداگانه (RNA-seq) از خون کامل افراد مبتلا به انواع بیماری های التهابی و خودایمنی (Aune و همکاران، 2017)، MTHFD2 به طور مداوم در شرایط مختلف، از جمله کولیت اولسراتیو، بیماری کرون بیان شد. ، بیماری سلیاک، RA، لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE)، پسوریازیس، آرتریت پسوریاتیک، سندرم Sjo¨ گرن، و MS (شکل 1F). قابل ذکر است، افراد مبتلا به ام اس که اخیراً تشخیص داده شده است، بیان MTHFD2 را نسبت به اهداکنندگان سالم یا افراد مبتلا به ام اس که تحت درمان با بهبودی بیماری قرار می گیرند، به طور قابل توجهی افزایش داده بودند (شکل S1C). بنابراین، CD4^{به علاوه}تکثیر و بقای سلول های T وابسته به ژن های خاصی از متابولیسم 1C است و بیان این ژن ها در مراحل رشد، فعال سازی و تمایز سلول T و همچنین در محل التهاب پاتولوژیک متفاوت است.

شکل 2. کمبود MTHFD2 CD4 را مختل می کند^{به علاوه}تکثیر و عملکرد سلول های T

(A-D) تکثیر اندازه‌گیری شده با (A) رقیق‌سازی CellTrace Violet (CTV)، (B) زنده‌مانی، (C) بیان CD25، و (D) بیان TF در CD4^{به علاوه}زیر مجموعه های سلول T تحت درمان با MTHFD2i به مدت 72 ساعت پس از فعال سازی (میانگین ± انحراف معیار، ANOVA یک طرفه، داده ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی کل هستند).

MTHFD2 در CD4 نفوذ کننده CNS به شدت تنظیم می شود^{به علاوه}سلول های T در آنسفالومیلیت خود ایمنی تجربی (EAE) و در CD4 فعال شده^{به علاوه}سلول های T در شرایط آزمایشگاهی

تنظیم MTHFD2 در سلول های CD4 به علاوه T به خوبی توصیف نشده است. برای اندازه گیری بیان MTHFD2 در ضایعات التهابی in vivo، CD4^{به علاوه}سلول‌های T از موش‌های تراریخته 2D2 TCR اختصاصی میلین فعال شدند و به صورت تطبیقی ​​به Rag1 منتقل شدند.^{__ /__}موش ها برای القای EAE. پس از اینکه موش ها شروع به فلج پای عقبی کردند، بخش دم اسبی نخاع با روش ایمونوهیستوشیمی (IHC) آنالیز شد. موش هایی که سلول های T 2D2 دریافت کردند، غنی سازی MTHFD2 و CD3 را نشان دادند^{به علاوه}سلول هایی که در کنترل وجود نداشت (شکل 1G). برای تعیین مستقیم اینکه آیا CD4^{به علاوه}سلول‌های T MTHFD2 را در ضایعات ملتهب تنظیم کردند، سلول‌های T از طحال و نخاع موش‌ها در معرض گلیکوپروتئین الیگودندروسیت میلین (MOG) و مدل EAE القاء شده با سم سیاه سرفه (PTX) برای تجزیه و تحلیل جمع‌آوری شدند. CD4 نفوذ کننده به CNS^{به علاوه}سلول های T در مقایسه با CD4 طحال همسان، MTHFD2 را بیش از حد بیان کردند^{به علاوه}سلول های T از موش های کنترل و EAE، همانطور که با فلوسیتومتری (شکل 1H) و qRT-PCR (شکل 1) اندازه گیری شد. سینتیک بیان MTHFD2 در CD4^{به علاوه}سلول های T در شرایط آزمایشگاهی در مرحله بعدی اندازه گیری شدند. تنظیم مثبت mRNA ژن MTHFD2 پس از 5 ساعت تحریک شناسایی شد و تا 24 ساعت شروع به کاهش کرد (شکل 1J)، در حالی که CD4 متمایز شد.^{به علاوه}زیرمجموعه های سلول T بالاترین بیان پروتئین MTHFD2 را 48 ساعت پس از فعال سازی به دست آوردند (شکل 1K). این داده ها نشان می دهد که MTHFD2 در CD4 تنظیم مثبت شده است^{به علاوه}سلول های T با فعال شدن در شرایط آزمایشگاهی و در محل التهاب در داخل بدن.

CD4^{به علاوه}زیرمجموعه‌های سلول T به طور متفاوتی برای فعال‌سازی، تکثیر، بقا و تولید سیتوکین به MTHFD2 نیاز دارند.

ما در مرحله بعد نقش MTHFD2 را در فعال سازی، تمایز، تکثیر و عملکرد سلول های CD4 به علاوه سلول های T آزمایش کردیم. CD4^{به علاوه}سلول‌های T در شرایط آزمایشگاهی در حضور سیتوکین‌ها برای تمایز بهینه سلول‌های Th1، Th17 و Treg و وسیله نقلیه یا یک مهارکننده MTHFD2 (MTHFD2i؛ DS18561882) فعال شدند (Kawai et al., 2019). پس از 72 ساعت، همه زیر مجموعه‌ها تکثیر (شکل 2A) و تعداد سلول‌های دوچرخه‌سوار زنده (شکل‌های S2A و S2B) را کاهش دادند. زنده ماندن در سلول های Th1 و Th17 کاهش یافت (شکل 2B)، و فعال سازی، همانطور که با بیان CD25 اندازه گیری شد، در همه زیر مجموعه ها کاهش یافت (شکل 2C). بیان فاکتور رونویسی مشخص کننده اصل و نسب (TF) در سلول های Th1 کاهش یافت (T-bet^{به علاوه}) اما در سلول های Th17 بدون تغییر (ROR t^{به علاوه}) و در سلول های Treg (FoxP3) حداقل تغییر کرد^{به علاوه}) (شکل 1D). برای اندازه گیری عملکرد سلول Teff، سلول ها با 12-میریستات 13-استات (PMA) و یونومایسین مجدداً تحریک شدند. سلول های Th1 به طور قابل توجهی کمتر اینترفرون-g (IFNg) و سلول های Th17 کمتری IL{7}} را در حضور MTHFD2i بیان کردند (شکل 2E). این به دلیل اختلال در فعال‌سازی اولیه نبود، زیرا این فنوتیپ‌ها زمانی که قرار گرفتن در معرض دارو تا 24 ساعت پس از فعال‌سازی به تعویق افتاد، حفظ شدند، اگرچه بیان TF مشخص‌کننده سن در این تنظیم بدون تغییر بود (شکل‌های S2C-S2F). بنابراین MTHFD2 برای حداکثر CD4 مورد نیاز است^{به علاوه}فعال سازی، تکثیر، بقا و تولید سیتوکین سلول T.

برای تایید ژنتیکی این اثرات دارویی، ما یک Mthfd2 تولید کردیم^fl/flسویه موش و تلاقی آن با موش های تراریخته Cd4- cre برای دستیابی به حذف ژنتیکی مشروط. همانطور که پیش بینی می شد، CD4 فعال شد^{به علاوه}سلول های T از Mthfd2^fl/flCD{0}}cre plus (CD4^ΔMthfd2) موش ها بیان MTHFD2 کمتری در مقایسه با سلول های Mthfd2 داشتند^fl/flسی دی4-cre^{به علاوه}(شکل وحشی [WT]) همزاد (شکل 2F). در ابتدا، موش های CD4DMthfd2 CD4 کمی کمتر داشتند^{به علاوه}سلول های T در طحال در مقایسه با WT (شکل 2G). پس از فعال سازی و تمایز آزمایشگاهی، تعداد سلول ها و زنده ماندن CD4^ΔMthfd2سلول های Th17 و به میزان کمتر سلول های Treg به طور قابل توجهی پایین تر بودند (شکل 2H). علاوه بر این، بیان CD25 در سلول‌های Th17 و Treg کاهش یافت و در سلول‌های Th1 روند کمتری داشت (شکل 2I). در نهایت CD4^ΔMthfd2سلول های Th1 و Th17 به ترتیب بیان کمتری از T-bet و ROR t داشتند. با این حال، FoxP3 در سلول‌های Treg بدون تغییر بود (شکل 2J). علیرغم تغییرات در بیان TF، سلول های Teff که تمایز پیدا کردند، مقادیر طبیعی سیتوکین تولید کردند (شکل 2K). تفاوت در نتایج بین رویکردهای دارویی و ژنتیکی ممکن است به زمان و کامل از دست دادن عملکرد آنزیم در طول توسعه و مکانیسم‌های جبرانی بالقوه نسبت داده شود.

MTHFD2i بیان FoxP3 را در سلول های Th17 القا می کند و تمایز سلولی Treg را افزایش می دهد.

با توجه به وابستگی سلول های Teff به MTHFD2، ما تنظیم MTHFD2i سلول های FoxP3 و Treg را آزمایش کردیم. قابل‌توجه، تنظیم نابجای FoxP3 در Th1 و به‌طور برجسته‌تر در سلول‌های Th17 به روشی وابسته به دوز ناشی از درمان MTHFD2i است (شکل 3A). این همچنین زمانی رخ داد که درمان تا 24 ساعت پس از فعال سازی به تعویق افتاد (شکل 3B). روند مشابهی در سلول های CD4DMthfd2 Th17 مشاهده شد (شکل 3C). این تنظیم مثبت FoxP3 عملکردی بود زیرا سلول‌های Th17 تیمار شده با MTHFD2i در هنگام کشت همزمان با CD8 ظرفیت سرکوب‌گری به دست آوردند.^{به علاوه}سلول های T (شکل 3D). بنابراین MTHFD2i می تواند فنوتیپ های سلول مانند FoxP3 و Treg را در سلول های Th17 ترویج کند. MTHFD2i همچنین تمایز سلول های Treg القایی را افزایش داد. سلول های Treg با طیف وسیعی از غلظت های فاکتور رشد تبدیل کننده b (TGF-b) در حضور MTHFD2i متمایز شدند. در هر غلظت آزمایش شده به جز بالاترین، بیان FoxP3 با تیمار MTHFD2i افزایش یافت (شکل 3E و 3F). این فنوتیپ همچنین با درمان تاخیری MTHFD2i حفظ شد (شکل 3G).

شکل 3. کمبود MTHFD2 بیان FoxP3 را القا می کند و باعث تغییر به سمت فسفوریلاسیون اکسیداتیو می شود.

(الف) بیان FoxP3 در سلول‌های Th1 و Th17 تیمار شده با MTHFD2i 72 ساعت پس از فعال‌سازی (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(B) بیان FoxP3 در سلول‌های Th1 و Th17 به مدت 24 ساعت فعال شد و سپس با وسیله نقلیه یا 500 نانومولار MTHFD2i به مدت 48 ساعت تیمار شد (میانگین ± SD، آزمون t جفت‌نشده، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(C) بیان FoxP3 در سلول‌های Th1 و Th17 از همزادهای WT و CD4DMthfd2 72 ساعت پس از فعال‌سازی (میانگین ± SD، آزمون t جفت نشده، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(د) سنجش سرکوب که ظرفیت سرکوب نابجای سلول‌های Th17 تیمار شده با MTHFD2i را اندازه‌گیری می‌کند. سلول‌های Th17 از قبل تیمار شده با سلول‌های CD8 به علاوه T رنگ‌آمیزی شده با CTV برای اندازه‌گیری تکثیر پس از فعال‌سازی با آنتی‌بادی‌های ضد CD3 و ضد CD28 (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، n=3 تکرار بیولوژیکی) کشت شدند. .

(E) بیان FoxP3 در سلول‌های Treg که با طیف وسیعی از غلظت‌های TGF-b تمایز یافته و با MTHFD2i تیمار شده‌اند (میانگین ± SD، آزمون t جفت نشده، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(F) نمودارهای فلوسیتومتری برای داده های جدول بندی شده در (E).

(G) بیان FoxP3 در سلول‌های Treg فعال و تمایز یافته با غلظت‌های پایین TGF-b به مدت 24 ساعت و سپس تحت درمان با MTHFD2i به مدت 48 ساعت (میانگین ± انحراف معیار، آزمون t غیر جفت، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند. ).

(H) تست استرس Seahorse XF Cell Mito بر روی سلول‌های Th17 و Treg تیمار شده با MTHFD2i (میانگین ± SD، n=3 تکرار بیولوژیکی) انجام شد. (I) ECAR پایه، OCR پایه، حداکثر OCR، و OCR/ECAR پایه نسبت اندازه گیری شده در (H) (میانگین ± انحراف معیار، آزمون t جفت نشده، داده ها نماینده دو آزمایش مستقل با 6 تکرار بیولوژیکی کل هستند). ** p < 0.01، *** p <0.001، **** p درصد 0.001).

سلول های Treg متابولیسم میتوکندریایی بیشتری نسبت به سلول های Th17 دارند (Michalek و همکاران، 2011). برای تعیین پیامدهای متابولیکی درمان MTHFD2i، سلول‌های Th17 و Treg با آنالیز شار خارج سلولی مورد ارزیابی قرار گرفتند. MTHFD2i نرخ مصرف پایه و حداکثر اکسیژن (OCR) سلول های Th17 را افزایش داد تا نشان دهنده تغییر به سمت تنفس میتوکندری باشد (شکل 3H). برعکس، سلول‌های Th17 و Treg با تیمار MTHFD2i، نرخ اسیدی شدن خارج سلولی پایه (ECAR) کاهش یافته‌اند که نشان‌دهنده کاهش گلیکولیز است (شکل 3I). نسبت پایه OCR به ECAR در سلول های Th17 و Treg به طور قابل توجهی افزایش یافت زیرا MTHFD2i برنامه متابولیک را از گلیکولیز به سمت فسفوریلاسیون اکسیداتیو تغییر داد. این داده‌ها نشان می‌دهند که MTHFD2i بیان FoxP3 را در سلول‌های Th17 و سلول‌های Treg تمایز یافته تحت شرایط TGF-b پایین افزایش می‌دهد و سلول‌های Th17 را به متابولیسم سلول‌مانندتر Treg تغییر می‌دهد.

کمبود MTHFD2 در سلول های CD4 به علاوه T انسان، تکثیر و زنده ماندن سلول Th17 را کاهش می دهد در حالی که بیان FOXP3 را افزایش می دهد و فعالیت mTORC1 را کاهش می دهد.

برای آزمایش قابلیت ترجمه یافته های فوق به سلول های انسانی، CD4^{به علاوه}سلول‌های T جدا شده از خون محیطی اهداکنندگان سالم در شرایط آزمایشگاهی به سلول‌های Th1، Th17 و Treg تمایز داده شدند و از زمان فعال‌سازی با وسیله نقلیه یا MTHFD2i تیمار شدند. تکثیر به طور قابل توجهی در سلول های Th17 و Treg تیمار شده با MTHFD2i کاهش یافت (شکل 4A)، و سلول های Th17 نیز افزایش آپوپتوز را نشان دادند (شکل 4B). کاهش تکثیر در سلول های Th17 با یک رویکرد ژنتیکی با استفاده از RNA مداخله گر کوچک (siRNA) خلاصه شد (شکل 4C و S2G). مشابه سلول های موش، بیان FOXP3 در سلول های Th17 انسانی تیمار شده با MTHFD2i بیشتر بود و در سلول های Treg انسانی تیمار شده با MTHFD2i روند بالاتری داشت (شکل های 4D و S2H). با توجه به اینکه محور mTORC{20}AMPK برای تمایز سلولی Th17 و Treg حیاتی است، فسفوریلاسیون پروتئین ریبوزومی هدف mTORC1 S6 (فسفو-S6) نیز اندازه‌گیری شد. این کاهش فعالیت mTORC1 را در سلول های Th17 با MTHFD2i یا siMTHFD2 نشان داد (شکل 4E). بنابراین، از دست دادن ظرفیت تکثیر و القای بیان FOXP3 در سلول‌های Th17 و Treg می‌تواند در CD4 اولیه انسان خلاصه شود.^{به علاوه}سلول های T.

شکل 4. کمبود MTHFD2 تکثیر را مختل می کند و بیان FOXP3 را در سلول های Th17 انسان القا می کند.

(الف) تکثیر اندازه‌گیری شده با رقت CTV در زیرمجموعه‌های CD4 به علاوه سلول T انسانی تحت درمان با وسیله نقلیه یا 2 میلی‌مولار MTHFD2i به مدت 72 ساعت پس از فعال‌سازی با آنتی‌بادی‌های ضد CD3 و ضد CD28 (تست زوجی، داده‌ها نشان‌دهنده سه آزمایش مستقل با 5 است. -6 اهداکننده سالم).

(ب) آپوپتوز اندازه‌گیری شده توسط Annexin V در سلول‌های CD4 به علاوه T انسانی تحت درمان با MTHFD2i به مدت 72 ساعت (تست زوجی، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 5-6 اهداکننده سالم هستند).

(C) بیان Ki{0}} در سلول‌های CD4 به علاوه T انسانی که با NTC یا siMTHFD2 تبدیل شده‌اند (آزمون t زوجی، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 4 اهداکننده بیمار سالم هستند).

(د) بیان FOXP3 در سلول‌های CD4 به علاوه T انسانی تحت درمان با MTHFD2i به مدت 72 ساعت (آزمون t زوجی، داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با 6 تا 10 اهداکننده سالم هستند).

(E) تغییر در بیان فسفو-S6 در سلول‌های CD4 به علاوه T انسانی که با MTHFD2i به مدت 72 ساعت تیمار شده یا با siMTHFD2 تبدیل شده‌اند (میانگین ± SD، آزمون t یک نمونه، داده‌های سه آزمایش مستقل با 4-6 اهداکننده سالم). نتایج از نظر آماری معنی‌دار برچسب‌گذاری شده‌اند (* p < 0.="" p="" درصد="">

سلول های T به عملکرد آنزیمی MTHFD2 متکی هستند و فنوتیپ ها را می توان با محصول نجات داد.

MTHFD2 برای نگهداری از استخر فرمات میتوکندری برای سنتز پورین مورد نیاز است (Ma et al., 2017) اما ممکن است نقش های غیر آنزیمی را نیز ایفا کند. با حمایت از فعالیت آنزیمی ضروری، تیمار MTHFD2i منجر به جذب جبرانی فورمات از محیط در زیرمجموعه های CD4 به علاوه سلول T شد (شکل 5A). واحد 1C مورد استفاده برای سنتز فرمت با تبدیل سرین به گلیسین و سرین داخل سلولی انباشته می شود در حالی که گلیسین با تیمار MTHFD2i در همه زیر مجموعه ها تخلیه می شود (شکل 5B). غلظت متیونین نیز اندکی افزایش یافت که نشان دهنده مهار چرخه متیونین است. همانطور که انتظار می رفت، با توجه به اینکه مرحله تبدیل سرین گلیسین در بالادست MTHFD2 است، این تغییرات با ارائه فرمت در محیط نجات پیدا نکردند.

شکل 5. اثرات MTHFD2i روی زیرمجموعه های سلول T توسط فرمت اگزوژن نجات می یابد.

(الف) جذب فرمت اندازه‌گیری شده توسط طیف‌سنجی رزونانس مغناطیسی 1H (MRS) در زیر مجموعه‌های CD4 به علاوه سلول T تحت درمان با وسیله نقلیه یا 500 نانومولار MTHFD2i به مدت 72 ساعت پس از فعال‌سازی (میانگین ± SD، آزمون t غیر جفت، داده‌ها نماینده دو آزمایش مستقل هستند. با 6 تکرار بیولوژیکی).

(ب) تغییر در غلظت سرین، گلیسین و متیونین در سلول‌های CD4 به علاوه T تیمار شده با 500 نانومولار MTHFD2i یا 500 نانومولار MTHFD2i به اضافه 1 میلی‌مولار فرمت به مدت 4 تا 6 ساعت در مقایسه با وسیله نقلیه، اندازه‌گیری شده با طیف‌سنجی جرمی (میانگین ± SD، n{ {8}} تکرارهای بیولوژیکی).

(C) تعداد سلول های زنده، زنده ماندن و بیان CD25 در سلول های CD4 به علاوه T تیمار شده با MTHFD2i که با 1 میلی مولار فرمت یا 60 میلی مولار محلول پورین آدنین و گوانین به مدت 72 ساعت پس از فعال سازی نجات یافتند (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، داده ها نماینده سه آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی).

(د) تعداد سلول‌های زنده، زنده ماندن و بیان CD25 در سلول‌های CD4 به علاوه T از همزادهای WT یا CD4DMthfd2 که با فرمت یا پورین به مدت 72 ساعت پس از فعال‌سازی نجات یافتند (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، n=3 تکرار بیولوژیکی ).

ما بعداً آزمایش کردیم که آیا افزودن فرمت یا محلول پورین آدنین و گوانین می تواند عملکرد آنزیمی ناقص را نجات دهد و اثرات پایین دست کمبود MTHFD2 را معکوس کند. در واقع، فرمت 1 میلی مولار تکثیر، زنده ماندن و فعال سازی را در سلول های تیمار شده با MTHFD2i بازیابی کرد (شکل 5C). مکمل پورین تکثیر در همه زیر مجموعه‌ها و فعال‌سازی در سلول‌های Th1 و Th17 را نجات داد، اما زنده ماندن در همه زیر مجموعه‌ها و فعال‌سازی در سلول‌های Treg را نداشت. فرمت همچنین تکثیر، زنده ماندن و فعال شدن در CD4 را نجات داد^ΔMthfd2سلول های T (شکل 5D). تولید سیتوکین مختل در سلول های Th1 و Th17 تیمار شده با MTHFD2i به مقادیر وسیله نقلیه با افزودن فرمت یا پورین برگردانده شد (شکل 5E). قابل ذکر است که تنظیم نابجای FoxP3 در سلول‌های Th17 با افزودن پورین اما نه با فرمت نجات یافت، در حالی که افزودن فرمت و پورین بیان FoxP3 را به سطح پایه در سلول‌های Treg تمایز یافته با غلظت‌های پایین TGF-b کاهش داد (شکل 5F). به نظر می رسد فنوتیپ های MTHFD2i به نگهداری MTHFD2 فرمت میتوکندری یا استخرهای پورین وابسته باشند.

MTHFD2 فعالیت mTORC1 و متیلاسیون DNA و هیستون را در CD4 تنظیم می کند^{به علاوه}سلول های T

در سلول های سرطانی جاودانه شده، کمبود MTHFD2 می تواند منجر به تجمع واسطه های سنتز پورین GAR، SAICAR و AICAR شود که در بالادست مراحل فرمیلاسیون با واسطه فرمیل THF هستند (داکر و همکاران، 2016). CD4^{به علاوه}زیر مجموعه های سلول T به مدت 72 ساعت قبل از قرار گرفتن در معرض MTHFD2i برای 4-6 ساعت کشت داده شدند. این چارچوب زمانی کوتاه برای جلوگیری از هرگونه اثرات ثانویه، از جمله تغییرات جبرانی، انتخاب شد. درمان گذرا با MTHFD2i منجر به تجمع GAR، SAICAR و AICAR در همه زیر مجموعه‌ها شد (شکل 6A). این اثر به طور کامل با افزودن 1 میلی مولار فرمت نجات یافت و از نقش آنزیمی MTHFD2 حمایت کرد. نوکلئوتیدها و نوکلئوبازها، از جمله گوانین، نیز توسط MTHFD2i تخلیه شدند و توسط فرمت در سلول های Th17 و Treg نجات یافتند (شکل 6B).

شکل 6. MTHFD2i منجر به تجمع واسطه های سنتز پورین می شود که فعالیت mTORC1 را کاهش داده و DNA و متیلاسیون هیستون را تغییر می دهد.

(الف) تغییر در غلظت‌های GAR، SAICAR و AICAR در سلول‌های CD4 به علاوه T تیمار شده با 500 نانومولار MTHFD2i یا 500 نانومولار MTHFD2i به‌علاوه 1 میلی‌مولار فرمت به مدت 4 تا 6 ساعت نسبت به وسیله نقلیه، اندازه‌گیری شده با طیف‌سنجی جرمی (میانگین ± SD، یک- way ANOVA، n=3 تکرار بیولوژیکی).

(B) تغییر در گونه‌های متابولیسم نوکلئوتیدی در سلول‌های Th17 و Treg تیمار شده با MTHFD2i با یا بدون فرمت به مدت 4 تا 6 ساعت نسبت به وسیله نقلیه، اندازه‌گیری شده با طیف‌سنجی جرمی (n=3 تکرار بیولوژیکی).

(C) ایمونوبلات فسفو-S6، S6، Rheb، phospho-ACC، ACC، HIF{4}}a و b-اکتین در سلول‌های CD4 به علاوه T تیمار شده با MTHFD2i با یا بدون فرمت به مدت 72 ساعت پس از فعال‌سازی (داده‌ها نماینده سه آزمایش مستقل با n=3 تکرار بیولوژیکی).

(D) تغییر در متابولیت های چرخه TCA در سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i با یا بدون فرمت به مدت 6 ساعت نسبت به وسیله نقلیه، اندازه گیری شده با طیف سنجی جرمی (میانگین ± SD، ANOVA یک طرفه، n=3 تکرار بیولوژیکی).

(E) نقشه‌های حرارتی نسبت کنترل H3K27me3 به IgG در مناطق ±10-kb در اطراف پروموترهای ژن‌های شناخته شده UCSC در سلول‌های Th17 و Treg تیمار شده با MTHFD2i، اندازه‌گیری شده با CUT&RUN (داده‌های ادغام شده از 3 تکرار بیولوژیکی).

(F) نقشه حرارتی فرکانس متیلاسیون DNA میانه منبع Foxp3 توسط سایت CpG در سلول‌های Th1 و Th17 تیمار شده با وسیله نقلیه یا 500 نانومولار MTHFD2i و در سلول‌های nTreg از WT یا CD4DMthfd2 littermates (آزمون Mood، n=3 تکرار بیولوژیکی).

(G) جدول بندی (F) توسط پروموتر پروگزیمال، پروموتر دیستال و TSDR (آزمون t زوجی). شکل های S3 و S4 را نیز ببینید. نتایج از نظر آماری معنی‌دار برچسب‌گذاری شده‌اند (* p < 0.05،="" **="" p="">< 0.01،="" ***="" p=""><0.001، ****="" p="" درصد="">

AICAR و نوکلئوتیدها تنظیم‌کننده‌های تعیین‌کننده محور mTORC1-AMPK هستند (امانوئل و همکاران، 2017؛ کیم و همکاران، 2016). در واقع، بیان فسفو-S6 با تیمار MTHFD2i در تمام زیر مجموعه‌ها کاهش یافت و با افزودن فرمت به طور کامل بازسازی شد (شکل‌های 6C و S3A). پروتئین متصل شونده به GTP Rheb، یک فعال کننده اجباری mTORC1، می تواند به در دسترس بودن گوانین درون سلولی حساس باشد (Emmanuel et al., 2017) و بیان Rheb با درمان MTHFD2i کاهش یافت (شکل 6C و S3B). AICAR یک آنالوگ آدنوزین و فعال کننده AMPK است (Rae and Mairs, 2019; Su et al., 2019). با این حال، 72 ساعت پس از فعال‌سازی، فسفوریلاسیون AMPK یا اهداف آن، استیل کوآنزیم A(CoA) کربوکسیلاز (phospho-ACC) و Unc{19}}مانند کیناز فعال کننده اتوفاژی (phospho-ULK1)، با درمان MTHFD2i تغییری نکرد. (شکل های 6C، S3C و S3D). فعالیت mTORC1 باعث افزایش Th17 می شود و تمایز سلولی Treg را تا حدی از طریق القای متابولیسم گلیکولیتیک وابسته به HIF کاهش می دهد (Shi et al., 2011). مطابق با این، یک بیان HIF در سلول‌های تیمار شده با MTHFD2i و سلول‌های CD4DMthfd2 Th17 کاهش یافت (شکل‌های 6C، S3E، و S3F). این تغییرات در فعالیت mTORC1 با هیچ نقصی در سیگنال دهی TCR همراه نبود، همانطور که با بیان Nur77 با و بدون تحریک مجدد اندازه گیری شد (شکل S3G). مبدل سیگنال و فعال‌کننده فعالیت رونویسی 3 (STAT3) که برای رشد سلول Th17 حیاتی است، با درمان MTHFD2i تغییری نکرده یا نسبتاً افزایش یافته است (شکل S3H). کاهش فعالیت mTORC1 و تغییر از گلیکولیز به سمت فسفوریلاسیون اکسیداتیو با درمان MTHFD2i تغییراتی را در فراوانی نسبی متابولیت‌های چرخه اسید تری کربوکسیلیک (TCA) پیشنهاد می‌کند. غلظت سوکسینات و فومارات به طور قابل توجهی توسط MTHFD2i کاهش یافت اما با فرمت نجات یافت (شکل 6D).

متابولیت‌های TCA مهارکننده‌های شناخته شده DNA و هیستون دمیلازها هستند (Su et al., 2016)، و کاهش مخازن سوکسینات و فومارات ممکن است از حالت هیپومتیله پشتیبانی کند. تری متیلاسیون H3K27 (H3K27me3) در سراسر ژنوم با توالی یابی CUT&RUN (شکاف در زیر اهداف و رهاسازی با استفاده از نوکلئاز) اندازه گیری شد (Skene and Henikoff، 2017). در واقع، سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i H3K27me3 را در مقایسه با وسیله نقلیه کاهش داده بودند (شکل 6E و S4A). متیلاسیون DNA در جایگاه Foxp3 نیز با توالی‌یابی بی سولفات اندازه‌گیری شد تا مشخص شود که آیا متیلاسیون دیفرانسیل به تنظیم دخل و تصرف FoxP3 ناشی از MTHFD2i کمک می‌کند یا خیر. اگرچه چندین جایگاه CpG در فرکانس متیلاسیون بین شرایط وسیله نقلیه و MTHFD2i متفاوت بود، هیچ الگوی قابل تشخیصی در منطقه دی متیله اختصاصی سلول Treg (TSDR) وجود نداشت. همچنین هیچ تفاوتی بین سلول های nTreg (CD4 به علاوه CD25 پلاس) جدا شده از موش های WT و CD4DMthfd2 (شکل 6F) وجود نداشت، اگرچه خلوص هر جمعیت غنی شده کم بود (شکل S4B). با این حال، کاهش قابل توجهی در فرکانس متیلاسیون DNA در ناحیه پروموتر پروگزیمال Foxp3 در سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i در مقایسه با وسیله نقلیه (شکل 6G) وجود داشت که نشان دهنده افزایش احتمالی رونویسی با MTHFD2i است.

فعالیت MTHFD2 علاوه بر حفظ مخزن فرمت درون سلولی، از طریق تبدیل NAD به تعادل ردوکس سلولی کمک می کند.^{به علاوه}به NADH و NADP^{به علاوه}به NADPH (شین و همکاران، 2017) و پشتیبانی از مسیر ترانس سولفوراسیون و متعاقب آن سنتز گلوتاتیون. سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i غلظت NAD را کاهش دادند^{به علاوه}، NADH، NADP^{به علاوه}و NADPH که با فرمت نجات یافت (شکل S4C). با این حال، NAD^{به علاوه}/NADH و NADP^{به علاوه}نسبت / NADPH در شرایط بدون تغییر بود. این، همراه با عدم تغییر در گونه‌های اکسیژن فعال سلولی (ROS) و سوپراکسید میتوکندری (شکل S4D)، نشان می‌دهد که تغییرات در حالت ردوکس بعید است که عامل اصلی فنوتیپ MTHFD2i باشد.

کمبود MTHFD2 در داخل بدن، شدت بیماری های التهابی متعدد را کاهش می دهد

اثربخشی MTHFD2 به‌عنوان یک هدف درمانی بعداً در یک مدل حساسیت بیش از حد تاخیری (DTH) وابسته به سلول T در داخل بدن مورد آزمایش قرار گرفت. موش ها ایمن سازی شدند و با هموسیانین سوراخ کلید (KLH) برای القای التهاب موضعی و با وسیله نقلیه خوراکی یا MTHFD2i تحت درمان قرار گرفتند. درمان هیچ سمیت آشکاری نشان نداد زیرا حیوانات وزن خود را حفظ کردند (شکل S5A). به طور مهمی، ضخامت و وزن گوش در موش‌های کنترل DTH افزایش یافت، اما در حیوانات تحت درمان با مهارکننده افزایش یافت، که نشان‌دهنده محافظت از التهاب در درمان با MTHFD2i است (شکل‌های 7A، 7B، و S5B). ایمونوگلوبولین G اختصاصی KLH (IgG) نیز در بالاترین دوز مهارکننده کاهش یافت که نشان دهنده اثرات بالقوه گسترش عملکرد سلول B است (شکل 7C).

شکل 7. هدف قرار دادن MTHFD2 in vivo، شدت بیماری را در مدل های DTH، EAE و IBD کاهش می دهد.

(A و B) گوش (A) ضخامت نسبی و (B) وزن بیوپسی 10 روز پس از KLH با ایمن سازی CFA و 3 روز پس از چالش KLH برای القای DTH (ANOVA یک طرفه). موش ها دو بار در روز با 0، 100 یا 300 میلی گرم بر کیلوگرم MTHFD2i خوراکی (میانگین ± SEM، n=8 تکرار بیولوژیکی) تحت درمان قرار گرفتند.

(C) غلظت IgG اختصاصی KLH در روز 10 DTH القا شده با KLH (میانگین ± SEM، آزمون کروسکال-والیس، n=8 تکرار بیولوژیکی).

(د) میانگین امتیاز بالینی در طول زمان در نوزادان WT و CD4DMthfd2 ایمن‌سازی شده با MOG با CFA و PTX برای القای EAE (میانگین ± SEM، آزمایش‌های متعدد من ویتنی، داده‌ها نشان‌دهنده دو آزمایش مستقل هستند، هر کدام با 5 تکرار بیولوژیکی).

(E) تعداد سلول و فراوانی سلول‌های CD4 به علاوه T در نخاع موش‌های EAE در اوج شدت بیماری (میانگین ± SEM، تست t جفت نشده، داده‌ها نماینده دو آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(F) بیان CD25 و CD44 در سلول‌های CD4 به علاوه T از نخاع موش‌های EAE (میانگین ± SEM، تست t جفت نشده، n=4 تکرار بیولوژیکی).

(G و H) تعداد سلولهای (G) T-bet plus، RORgt plus، FoxP3 plus، FoxP3 plus /T-bet plus، FoxP3 plus /RORgt + نسبت و (H) IL-17 plus، IFNg پلاس، و IL-17 به علاوه IFNg به علاوه سلول‌های CD4 به علاوه T از نخاع موش‌های EAE (میانگین ± SEM، آزمون t جفت نشده، داده‌ها نماینده دو آزمایش مستقل با 9 تکرار بیولوژیکی هستند).

(I) رنگ‌آمیزی H&E، ضد CD3 IHC و Luxol Fast Blue (LFB) برای میلین در طناب نخاعی موش WT بدون ایمن‌سازی و WT و CD4DMthfd2 با EAE در اوج بیماری (درشت‌نمایی 2003، نماینده 5 تکرار بیولوژیکی) ).

(J) تغییر وزن بدن در طول زمان Rag1^__/__موش‌ها برای القای کولیت IBD (میانگین ± SEM، تست‌های t متعدد، n=8 تکرار بیولوژیکی) سلول‌های CD4 ساده به‌علاوه T WT یا CD4DMthfd2 تزریق کردند.

(K و L) تعداد سلول (K) کل سلول‌های CD4 به علاوه T و (L) T-bet plus، RORgt پلاس، و FoxP3 به علاوه CD4 به علاوه سلول‌های T از MLN موش‌های IBD (میانگین ± SEM، آزمون t غیرجفت‌شده n{ {4}} تکرار بیولوژیکی). شکل های S5 و S6 را نیز ببینید. نتایج آماری معنی‌دار برچسب‌گذاری شده‌اند (* p < 0.05،="" **="" p="">< 0.01،="" ***="" p=""><0.001، ****="" p="" درصد="">

به طور مشابه، بازدارنده دوگانه MTHFD1/2 LY345899 (گوستافسون و همکاران، 2017) در بهبود بیماری در مدل EAE مؤثر بود. EAE با MOG و PTX القا شد و موش ها روزانه با تزریق داخل صفاقی (IP) DMSO یا LY345899 تحت درمان قرار گرفتند. درمان با مهارکننده منجر به کاهش قابل توجهی از شدت بیماری و امتیاز بالینی تجمعی در مقایسه با وسیله نقلیه شد (شکل S5C و S5D). موش ها در روز 26 قربانی شدند و سلول های نفوذ کننده به نخاع برای پروفایل ایمنی جمع آوری شدند. قابل توجه، CD45 به میزان قابل توجهی کمتر است^{به علاوه}، CD4^{به علاوه}و CD8^{به علاوه}سلول‌ها به نخاع موش‌های تحت درمان با LY345899- نفوذ کردند (شکل‌های S5E–S5G). هیچ تغییری در فرکانس ROR t وجود نداشت^{به علاوه}یا FoxP3^{به علاوه}سلول ها در میان CD4 نفوذ می کنند^{به علاوه}سلول های T (شکل S5H). با این حال، کاهش فراوانی سلول‌های IFNg به‌علاوه IL-17 و افزایش سلول‌های IL-17 پلاس (شکل S5I) وجود داشت که نشان‌دهنده تغییر احتمالی به یک فنوتیپ کمتر بیماری‌زا است.

برای آزمایش مستقیم وابستگی ذاتی سلول T به MTHFD2 در داخل بدن، نوزادان WT و CD4DMthfd2 تحت سه مدل مختلف قرار گرفتند: EAE، بیماری التهابی روده (IBD)، و بیماری آلرژیک راه هوایی. EAE دوباره با MOG و PTX القا شد، و مشابه آزمایش بازدارنده، موش‌های CD4DMthfd2 به‌طور قابل‌توجهی شدت بیماری را طی 26 روز کاهش دادند (شکل 7D). یک گروه جداگانه در اوج بیماری در روز 15 پس از القای فنوتیپ سلول T کشته شدند (شکل S6A و S6B). اگرچه CD4^{به علاوه}یا CD8^{به علاوه}تعداد سلول های T در طحال بدون تغییر بود (شکل S6C)، نفوذ سلول های CD4 به علاوه T به نخاع به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 7E). سلول های CD4 به علاوه T نفوذ کننده به نخاع در موش های CD4DMthfd2 بیان CD25 مشابه WT داشتند، اما بیان CD44 را کاهش دادند که به فعال سازی تا حدی مختل اشاره دارد (شکل 7F). اعداد T-bet^{به علاوه}سلول‌های ROR t plus و FoxP3 plus (شکل 7G)، و همچنین سلول‌های IL-17 پلاس و IFNg پلاس (شکل 7H)، همچنین در نخاع موش‌های CD4DMthfd2 نسبت به WT کاهش یافتند. قابل توجه است که نسبت FoxP3 پلاس به سلول‌های T-bet plus و RORgt پلاس در موش‌های CD4DMthfd2 در مقایسه با WT در اوج بیماری افزایش یافته است، که منعکس کننده یافته‌های in vitro افزایش بیان FoxP3 با کمبود MTHFD2 است (شکل 7G). اگرچه فرکانس سلول های بیان کننده TF در بین سلول های نفوذی به طور کلی روند بالاتری داشت، فرکانس بیان سیتوکین بدون تغییر بود (شکل های S6D و S6E). بافت شناسی نخاع موش های کنترل بدون EAE و WT و CD4^ΔMthfd2همانطور که با رنگ آمیزی Luxol Fast Blue نشان داده شده است، موش های دارای EAE افزایش سلولی و CD3 مثبت را در نخاع در موش های WT نشان دادند که با دمیلیناسیون مرتبط بود (شکل 7). این تغییرات در کنترل بدون EAE و CD4 وجود نداشت^ΔMthfd2موش.

نقش MTHFD2 بعدی در مدل های بیماری IBD و آلرژیک راه هوایی مورد آزمایش قرار گرفت. WT و CD4DMthfd2 سلول های CD4 به علاوه T ساده به Rag1 / گیرندگان برای شروع IBD منتقل شدند. اگرچه موش هایی که سلول های WT دریافت کردند با پیشرفت IBD شروع به کاهش وزن کردند، گیرندگان سلول های T CD4DMthfd2 به افزایش وزن خود ادامه دادند (شکل 7J). تعداد و فرکانس های قابل توجهی کمتری از سلول های T CD4DMthfd2 در طحال (شکل S6F) و غدد لنفاوی مزانتریک (MLNs) که کولون را تخلیه می کنند، یافت شد (شکل 7K و S6G). تعداد سلول های T-bet plus، ROR t plus، و FoxP3 به علاوه CD4DMthfd2 T نیز در MLN ها کاهش یافت، اما فرکانس سلول های FoxP3 پلاس افزایش یافت (شکل های 7L و S6H). با این حال، هیچ تفاوتی در نسبت‌های تعداد سلول‌های FoxP3/T-bet و FoxP3/RORgt در MLN‌ها در این نقطه زمانی پایانی وجود نداشت (شکل S6I). مشابه یافته‌های MTHFD2 به عنوان یک ضربه متوسط ​​در صفحه CRISPR التهاب راه‌های هوایی in vivo (شکل 1C)، موش‌های CD4DMthfd2 که در معرض بیماری آلرژیک آلرژیک ناشی از آلترناریا قرار گرفتند، روند کاهش فراوانی نوتروفیل‌ها در مایع شستشوی برونش آلوئولار (BALF) را داشتند، اگرچه هیچ‌گونه نبود. تغییرات در تعداد لنفوسیت‌های BALF، ائوزینوفیل و ماکروفاژها مشاهده شد (شکل S7A).

در نهایت، اثر MTHFD2i بر فعالیت ایمنی عمومی مورد آزمایش قرار گرفت. OT-II CD45.2 اختصاصی OVA^{به علاوه}CD4^{به علاوه}سلول های T به طور پذیرفته شده به CD45.1 منتقل شدند^{به علاوه}موش‌هایی که سپس به صورت زیر جلدی با امولسیون OVA با مکمل فروندز کامل (CFA) واکسینه شدند و روزانه با وسیله‌ای خوراکی یا MTHFD2i تحت درمان قرار گرفتند. وزن بدن تحت همه شرایط بدون تغییر بود (شکل S7B). گسترش OT-II CD45.2 منتقل شده^{به علاوه}سلول‌ها در موش‌های واکسینه‌شده تحت درمان با MTHFD2i اندکی به تأخیر افتادند، اما در روز 7 به تعداد وسیله نقلیه رسیدند (شکل‌های S7C-S7E). با این حال، فرکانس سلول های IFNg به علاوه در تخلیه LN کاهش یافت (شکل S7F). این داده‌ها نشان می‌دهند که درمان in vivo MTHFD2i امکان گسترش سلول‌های T اختصاصی آنتی‌ژن را به دنبال تحریک حاد می‌دهد، اگرچه با تولید سیتوکین‌های التهابی کاهش‌یافته.

بحث

فعال‌سازی، تمایز و عملکرد سلول‌های T به برنامه‌ریزی مجدد متابولیک مناسب برای پاسخگویی به نیازهای فزاینده سلول‌ها برای انرژی، بلوک‌های ساختمانی بیوسنتزی و مولکول‌های سیگنال‌دهنده نیاز دارد. در این مطالعه، ما عملکرد متابولیسم 1C را در سلول‌های CD4 به علاوه T اولیه بررسی کردیم. با استفاده از ترکیبی از غربالگری CRISPR بر اساس سلول T اولیه و داده‌های بیان ژن، MTHFD2 به عنوان یک هدف بالقوه برای درمان‌های ضد التهابی شناسایی شد. مهار یا کمبود MTHFD2 به طور کلی منجر به کاهش تکثیر سلول های CD4 به علاوه T شد. قابل توجه، این با القای بیان FoxP3 و عملکرد سرکوب کننده در سلول های Th17 و همچنین افزایش تمایز سلولی Treg همراه بود. این داده‌ها نشان می‌دهند که MTHFD2 ممکن است به‌عنوان یک نقطه بازرسی متابولیک در محور سلول‌های Th{10}}Treg عمل کند، با درمان MTHFD2i که تعادل را از یک فنوتیپ بیماری‌زا به یک فنوتیپ ضدالتهابی‌تر می‌سازد. در واقع، مهار MTHFD2 یا کمبود ژنتیکی، شدت بیماری را در مدل‌های متعدد خودایمنی و حساسیت بیش از حد در داخل بدن بهبود می‌بخشد.

متابولیسم 1C شامل متابولیسم سرین-گلیسین، چرخه فولات و چرخه متیونین است و در چندین فرآیند از جمله سنتز de novo پورین، تولید دهنده متیل و تنظیم ردوکس نقش اساسی دارد (Yang and Vousden, 2016). متابولیسم 1C به شدت با تحریک TCR درگیر است (تان و همکاران، 2017) و برای حمایت از گسترش سلول های T مورد نیاز است (Ma et al., 2017). چرخه فولات به اجزای سیتوزولی و میتوکندری تقسیم می شود. در سیتوزول، MTHFD1 5،{8}}متیلن THF، 10-فرمیل THF و فرمت را به هم تبدیل می کند. در میتوکندری، واکنش های مشابه توسط MTHFD2 و MTHFD1L انجام می شود. این واسطه های حاصل برای حمایت از مراحل فرمیلاسیون در سنتز de novo پورین استفاده می شود. MTHFD1 و MTHFD2 همچنین می توانند حالت ردوکس را از طریق تولید NAD(H) و NADP(H) تعدیل کنند (داکر و رابینوویتز، 2017). اگرچه برخی از انواع سلول در تغییر به منبع سیتوزولی تحت تنظیمات اختلال عملکرد مسیر میتوکندری انعطاف‌پذیری نشان می‌دهند (داکر و همکاران، 2016)، سلول‌های T قبلاً پیشنهاد شده‌اند که عمدتاً به مسیر میتوکندری برای ارائه واحدهای 1C و گونه‌های کاهش‌دهنده وابسته هستند (رون- هارل و همکاران، 2016). سلول‌های T همچنین بر جذب سرین متکی هستند و پاسخ‌های ایمنی درون تنی را می‌توان با مقادیر سرین رژیم غذایی تعدیل کرد. اثرات گرسنگی سرین با محدود کردن بیوسنتز پورین حتی در حضور مسیرهای نجات دست نخورده انجام می شود و می توان با تهیه گلیسین و فرمت از آن عبور کرد (Ma et al., 2017). داده‌های ما به این یافته‌ها می‌افزایند و به MTHFD2 به‌عنوان یک تنظیم‌کننده حیاتی که بر CD4 تأثیر می‌گذارد اشاره می‌کنند^{به علاوه}تکثیر و تمایز سلول های T.

Echanicoside

اگرچه متابولیسم 1C نقش گسترده ای در متابولیسم سلول ایفا می کند، ما دریافتیم که برخی از عملکردها برای انتخاب زیر مجموعه های سلول T متمایز هستند. تمام سلول های T انسان و موش با کمبود MTHFD2 به میزان کمتری تکثیر شدند، که نشان دهنده عملکرد مشترک MTHFD2 برای حمایت از رشد و تقسیم سلول های T است. اثرات کمبود MTHFD2 بر تمایز سلول های T و عملکرد موثر، با این حال، در هر زیر مجموعه آزمایش شده متفاوت است. سلول های Th1 با کاهش القای T-bet و کاهش تولید سیتوکین، تمایز مختل را نشان دادند. سلول های Th17 نیز تمایز تغییر یافته و تولید سیتوکین را کاهش دادند. اگرچه ROR t تغییری نکرد، سلول‌های Th17 کمبود MTHFD، سلول Treg TF FoxP3 را تنظیم مثبت کردند و توانایی سرکوب تکثیر سلول‌های CD8 به علاوه T فعال شده را به دست آوردند. سلول های Treg تمایز افزایش یافته را تحت شرایط TGF-b پایین نشان دادند. اکنون به خوبی ثابت شده است که هر یک از این زیر مجموعه‌ها می‌توانند نیازمندی‌های متابولیکی مشخصی داشته باشند (بانتوگ و همکاران، 2018؛ باک و همکاران، 2015). داده‌های ما نشان می‌دهد که MTHFD2 همچنین به طور انتخابی برای سلول‌های Teff مورد نیاز است و در عین حال سرنوشت و عملکرد سلول Treg را ارتقا می‌دهد. قابل توجه است که این نتایج با کمبودهای GLUT1، GLS، یا ASCT2 که تمایز سلولی Teff را مختل یا تغییر می‌دهد، در حالی که اثرات متوسطی برای ترویج مستقیم تمایز سلول‌های Treg یا تمایز بین سلول‌های Th17 به سلول‌های Treg دارند، متفاوت است (جانسون و همکاران، 2018؛ Macintyre et al. .، 2014؛ ناکایا و همکاران، 2014).

به نظر می رسد که این سرنوشت سلول های T متمایز به فعالیت آنزیمی MTHFD2 بستگی دارد زیرا اثرات کمبود MTHFD2 با فورمات یا نوکلئوبازهای پورین نجات یافت. اگرچه ما هیچ اثر قابل توجهی از تغییر تعادل ردوکس با کمبود MTHFD2 پیدا نکردیم، به نظر می رسد تغییر سنتز پورین de novo حیاتی باشد. درمان با MTHFD2i منجر به کاهش غلظت پورین، به ویژه گوانین شد و در عین حال باعث تجمع واسطه‌های سنتز پورین GAR، SAICAR و AICAR شد. این واسطه‌ها برای بیوسنتز بیشتر به فرمیلاسیون نیاز دارند، و اثرات زمانی که فرمت متابولیت مشتق شده از MTHFD{4}} به محیط اضافه شد، حفظ شد و از یک مکانیسم بیوشیمیایی روی هدف برای MTHFD2i پشتیبانی کرد. سنتز نوکلئوتیدهای نو برای حمایت از سنتز DNA و RNA برای تکثیر سلول های T ضروری است (Que'me'neur et al., 2003, 2004). بنابراین، به نظر می رسد یکی از اجزای مکانیسمی که توسط آن MTHFD2i گسترش سلول T را مختل می کند، تولید ناکافی نوکلئوتیدها باشد.

فلاونوئید

شکست در سنتز نوکلئوتیدهای کافی ممکن است سلول های T موثر را از طریق مکانیسم های متعدد سرکوب کند. AMPK و mTORC1 محرک های اصلی برنامه ریزی مجدد متابولیک با نقش های متضاد در سلول های Teff و Treg هستند (Bantug و همکاران، 2018؛ باک و همکاران، 2015). ما نشان می‌دهیم که درمان MTHFD2i در سلول‌های T منجر به تجمع حاد AICAR، یک متابولیت قابل توجه به عنوان آنالوگ آدنوزین و فعال‌کننده AMPK شد (Rae and Mairs, 2019؛ Su et al., 2019). با این حال، هیچ مدرکی دال بر افزایش فعالیت AMPK در نقاط زمانی انتخاب شده وجود نداشت. این ممکن است منعکس کننده مقررات اضافی AMPK باشد، اما AICAR همچنین می تواند اثرات مستقل از AMPK داشته باشد (Dembitz et al., 2019). mTORC1 همچنین به غلظت پورین حساس است زیرا کاهش در دسترس بودن گوانین فعالیت فعال کننده mTORC1 Rheb را سرکوب می کند (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). بنابراین تجمع AICAR و کاهش فعالیت mTORC1 ممکن است منجر به اختلال در تولید سلول‌های Th1 و Th17 تیمار شده با MTHFD2i و افزایش تولید سلول‌های Treg شود. سرکوب سیگنال دهی mTORC1 ممکن است به تغییر برنامه متابولیک از گلیکولیز به تنفس میتوکندری و تغییر فراوانی متابولیت TCA در سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i کمک کند. مسیر mTORC1 نقش اصلی را در ارتقاء متابولیسم آنابولیک ایفا می کند و می تواند باعث تجمع TF ATF4 شود که به نوبه خود می تواند بیان MTHFD2 را القا کند (بن-صحرا و همکاران، 2016).

شار متابولیک با تنظیم اپی ژنتیکی مرتبط است زیرا متابولیت ها در بسیاری از تغییرات اپی ژنتیکی نقش دارند (شارما و راندو، 2017)، از جمله متابولیسم 1C برای تولید متیل دهنده جهانی S-adenosyl methionine (SAM) برای متیلاسیون پروتئین و DNA. با این حال، آزمایش‌های ردیابی کربن در سلول‌های T فعال نشان می‌دهد که واحدهای 1C مشتق‌شده از سرین مشتق‌شده از گلوکز و سرین اگزوژن به‌طور معنی‌داری در چرخه متیونین و متیلاسیون کمک نمی‌کنند (Ma et al., 2017). شار متابولیک همچنین ممکن است از طریق تغییر در فراوانی متابولیت های TCA، از جمله آلفا-کتوگلوتارات، فومارات و سوکسینات، بر الگوهای متیلاسیون تأثیر بگذارد. به طور خاص، فومارات و سوکسینات DNA و هیستون دی متیلازها را مهار می کنند (Su et al., 2016). مطابق با کاهش این متابولیت ها در سلول های Th17 تیمار شده با MTHFD2i، H3K27me3 به طور گسترده ای در سراسر ژنوم کاهش یافت، و متیلاسیون DNA به طور خاص در پروموتر پروگزیمال Foxp3 کاهش یافت، که ممکن است به فنوتیپ تمایز بینجامد کمک کند. فنوتیپ تمایز سلولی Th17 با مکمل‌سازی فرمت نجات پیدا نکرد، که نشان می‌دهد مسیرهای اضافی احتمالاً به تنظیم FoxP3 کمک می‌کنند، مانند فعالیت سایر مکانیسم‌های سنجش غلظت نوکلئوتید.

اکتئوزید (ورباسکوزید)

همچنین گزارش شده است که MTHFD2 نقش های غیر آنزیمی ایفا می کند که ممکن است به اقدامات پیش التهابی این آنزیم کمک کند. در سلول‌های سرطانی، MTHFD2 می‌تواند عملکردهای هسته‌ای داشته باشد و با مکان‌های تکثیر DNA به منظور ارتقای پیشرفت چرخه سلولی هم‌زمان شود (گوستافسون شپرد و همکاران، 2015). در سلول های بنیادی موش، نشان داده شده است که MTHFD2 ترمیم DNA را برای حفظ ثبات ژنومی تعدیل می کند (Yue et al., 2020). در کارسینوم سلول کلیه، MTHFD2 برای برنامه ریزی مجدد متابولیک از طریق متیلاسیون mRNA بسیار مهم است (گرین و همکاران، 2019). اگرچه این نقش ها برای MTHFD2 با یافته های ما متقابلاً منحصر به فرد نیستند، توانایی فرمت برای نجات بسیاری از فنوتیپ های کمبود MTHFD2 در سلول های T نشان می دهد که فعالیت آنزیمی MTHFD2 محرک اصلی تکثیر و سرنوشت سلول های T است.

MTHFD2 تا حد زیادی به عنوان یک هدف دارویی در تنظیمات ضد سرطان در نظر گرفته شده است. همچنین ممکن است یک هدف ضد التهابی امیدوارکننده باشد و در مقایسه با آنتی فولات‌های موجود در حال حاضر، اثرات نامطلوب کمتری داشته باشد، با توجه به بیان کم در اکثر بافت‌های بالغ. به عنوان مثال، یک هدف MTX، DHFR، به طور گسترده در بافت های بالغ بیان می شود (نیلسون و همکاران، 2014). بنابراین، MTX می تواند با انواع اثرات نامطلوب از جمله سمیت گوارشی همراه باشد. علاوه بر این، مکانیسم عمل MTX علیرغم تاریخچه گسترده آن به خوبی شناخته نشده است (Cronstein and Aune, 2020). بیان بسیار تنظیم شده MTHFD2 و پتانسیل افزونگی با مسیر سیتوزولی MTHFD1 ممکن است منجر به وابستگی انتخابی جمعیت های سلولی خاص به MTHFD2 شود. یافته های ما MTHFD2 را به عنوان یک ایست بازرسی متابولیک حیاتی در CD4 شناسایی می کند^{به علاوه}سلول های T. اگرچه همپوشانی گسترده‌ای بین زیست‌شناسی سلول‌های سرطانی و زیست‌شناسی سلول‌های T به سرعت در حال تکثیر وجود دارد، اما متوجه شدیم که زیرمجموعه‌های سلول‌های CD4 به علاوه T از طریق تعدیل تمایز و عملکرد سلولی، حساسیت بیشتری نشان می‌دهند. این احتمال وجود دارد که هدف قرار دادن MTHFD2 در درمان های سرطان ممکن است ایمنی ضد تومور را محدود کند. با این حال، تنظیماتی مانند کارسینوم کولورکتال، که در آن التهاب با واسطه سلول Th17 به بیماری کمک می کند، ممکن است برای MTHFD2is مناسب باشد. حساسیت سلول های T به MTHFD2is ممکن است شکل موثری از ایمونوتراپی در تنظیمات CD4 باشد^{به علاوه}التهاب ناشی از سلول های T فراتر از سرطان و منجر به عوارض جانبی کمتری نسبت به عوامل درمانی موجود می شود.

محدودیت های مطالعه

MTHFD2i مورد استفاده در این مطالعه دارای مقدار IC50 0.0063 میلی‌مولار برای MTHFD2 و 0.57 میلی‌مولار برای MTHFD1 است. بنابراین، اثرات جزئی خارج از هدف مهار دوگانه MTHFD2 و MTHFD1 را نمی توان حذف کرد. با توجه به اینکه تنظیم نابجای FoxP3 در سلول‌های Th17 با ارائه فرمت نجات پیدا نکرد، اما فعالیت mTORC1 نجات یافت، مکانیسم زیربنایی این فنوتیپ نیاز به بررسی بیشتر دارد. علاوه بر این، همه مدل‌های in vivo با درمان MTHFD2i یا فرسایش ژنتیکی از زمان القای بیماری انجام شدند و فنوتیپ سلول‌های T در یک نقطه زمانی واحد انجام شد. برای مشخص کردن بهتر اثر کمبود MTHFD2 بر پاتوژنز بیماری، مطالعات بیشتر باید شامل آزمایش‌های دوره زمانی با خصوصیات سریالی جمعیت‌های سلول T باشد تا مشخص شود که آیا زیرمجموعه‌های CD4 به علاوه سلول T به طور متفاوت در داخل بدن تحت تأثیر قرار می‌گیرند یا خیر. در نهایت، برای بهبود ارتباط این مطالعه با کاربردهای بالینی، اثربخشی درمان با MTHFD2i که پس از شروع بیماری شروع شده است، باید آزمایش شود.

STAR★روش ها

روش های تفصیلی در نسخه آنلاین این مقاله ارائه شده است و شامل موارد زیر است:

• جدول منابع کلیدی

• در دسترس بودن منابع

• B تماس سرب

• B در دسترس بودن مواد

• B در دسترس بودن داده ها و کدها

  
  

• مدل آزمایشی و جزئیات موضوع

• B موش B سلول T انسان

• خطوط سلول B

  
  

• جزئیات روش

• B CD4 موش آزمایشگاهی^{به علاوه}فعال سازی و تمایز سلول های T

• سنجش سرکوب سلول B Th17

• B CD4 انسان در شرایط آزمایشگاهی^{به علاوه}شرایط کشت سلول T

• B غربالگری CRISPR B متابولومیک طیف سنجی جرمی

• طیف‌سنجی رزونانس مغناطیسی هسته‌ای پروتون B (1H-MRS)

• B ایمونوبلات

• B CUT&RUN B EpigenDx Targeted NextGen Bisulfifite Sequencing

• B مدل های EAE In vivo برای IHC و فلوسیتومتری

• B درمان In vivo LY345899 در مدل EAE

• B درمان In vivo DS18561882 در DTH مدل B مدل In vivo IBD با WT و CD4^ΔMthfd2همزاد

• B مدل بیماری آلرژیک راه هوایی در داخل بدن با WT و CD4^ΔMthfd2همزاد

• B درمان In vivo DS18561882 در مدل ایمن سازی OVA

  
  

• کمی و تجزیه و تحلیل آماری

اطلاعات تکمیلی

اطلاعات تکمیلی را می توانید به صورت آنلاین در https://doi.org/10.1016/j پیدا کنید. immuni.2021.10.011.

قدردانی

ما از اعضای آزمایشگاه Rathmell برای مشارکت در این پروژه تشکر می کنیم. از توماس آون برای ارائه داده های RNA-seq و J. Cools (VIB) برای ارائه ساختار pMx-U6-gRNA-GFP تشکر می کنیم. ما از Max R. Van Belkum برای طراحی پرایمرهای MTHFD2 qPCR تشکر می کنیم. ما از Nello Mainolfifi، Vipin Suri، Adam Friedman و Mark Manfredi از Raze Therapeutics, Inc. (بوستون، MA) برای ارائه ترکیب Raze 1459 که برای تأیید یافته‌ها استفاده شد (داده‌ها نشان داده نشده است) تشکر می‌کنیم. نمودارها با BioRender ایجاد شدند. ما منبع مشترک آسیب شناسی ترجمه را تأیید می کنیم که توسط NCI/NIH Cancer Center اعطای پشتیبانی 5P30 CA68485-19 و کمک هزینه ابزار دقیق S10 OD{10}}A1 برای Leica Bond RX پشتیبانی می شود. این اثر توسط جایزه مبتکر برجسته ویلیام ای پل برای اتحاد تحقیقات لوپوس (به JCR)، R01s DK105550 (به JCR)، HL136664 (به JCR و DCN)، CA217987 (به JCR)، AI153167 (به JCR)، پشتیبانی شد. AI137075 (به AKM)، T32 DK101003 (KV) و T32 GM007347 (به AS).

مشارکت های نویسنده

AS، GA و JCR این تحقیق را طراحی کردند. AS، GA، KV، DRH، XX، MZM، XY، KLB، NC، MMW، ACY، DLG، AES، SKS، SNF، AMC، PF، TB، و JCG-C. تحقیق را انجام داد. AS، GA، XY، JK، DCN، AKM، JDR و JCR داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. AS و JCR مقاله را با مشارکت سایر نویسندگان نوشتند.

اعلام منافع

JCR بنیانگذار، عضو هیئت علمی مشاور و سهامدار Sitryx Therapeutics است. عضو هیئت مشاوره علمی و سهامدار Caribou Biosciences. عضو هیئت مشاوره علمی NirogyTherapeutics. در 3 سال گذشته برای مرک، فایزر و میتوبریج مشاوره کرده است. و پشتیبانی تحقیقاتی را از Incyte Corp.، CalitheraBiosciences و Tempest Therapeutics دریافت کرده است. JDR یکی از بنیانگذاران و سهامدار Raze Therapeutics، Toran، Serien Therapeutics، و Farber Partners و مشاور و سهامدار Agios Pharmaceuticals، Kadmon Pharmaceuticals، Bantam Pharmaceuticals، Colorado Research Partners، RafaelHoldings، BarericalsLEAF Institute، و او هزینه های مشاوره و بودجه تحقیقاتی را از فایزر و رافائل دریافت کرده است و مخترع اختراعات ثبت شده توسط دانشگاه پرینستون است. AMC، PF، و TB کارمندان Sitryx Therapeutics هستند.

گنجاندن و تنوع

ما برای اطمینان از تعادل جنسی در انتخاب افراد غیرانسانی کار کردیم. یک یا چند نفر از نویسندگان این مقاله خود را به عنوان یک اقلیت قومی کمتر در علم معرفی می کنند. ضمن استناد به منابع علمی مرتبط با این کار، ما همچنین فعالانه برای ترویج تعادل جنسیتی در فهرست مرجع خود تلاش کردیم. فهرست نویسنده این مقاله شامل مشارکت کنندگانی از محل انجام پژوهش است که در جمع آوری داده ها، طراحی، تجزیه و تحلیل و/یا تفسیر کار مشارکت داشته اند.

منابع

Anderson، GR، Winter، PS، Lin، KH، Nussbaum، DP، Cakir، M.، Stein، EM، Soderquist، RS، Crawford، L.، Leeds، JC، Newcomb، R.، و همکاران. (2017). چشم انداز همکاری درمانی در سرطان های جهش یافته KRAS اصول کنترل تکامل تومور را آشکار می کند. Cell Rep. 20، 999-1015.

Aune، TM، Crooke، PS، 3، Patrick، AE، Tossberg، JT، Olsen، NJ، و Spurlock، CF، سوم (2017). بیان RNA های طولانی غیر کد کننده در خودایمنی و پیوند با عملکرد تقویت کننده و انواع ژنتیکی خطر بیماری خودایمنی. J. خود ایمنی. 81، 99-109.

Bantug، GR، Galluzzi، L.، Kroemer، G.، و Hess، C. (2018). طیف متابولیسم سلول T در سلامت و بیماری نات. کشیش ایمونول. 18، 19-34. بن صحرا، آی.، هجاج، جی.، ریکولت، اس جی اچ، آسارا، جی ام، و منینگ، بی دی (2016). mTORC1 سنتز پورین را از طریق کنترل چرخه تتراهیدروفولات میتوکندری القا می کند. علوم 351، 728-733.

براون، PM، پرت، AG، و ایزاکس، JD (2016). مکانیسم اثر متوترکسات در آرتریت روماتوئید و جستجو برای نشانگرهای زیستی نات. کشیش روماتول. 12، 731-742.

باک، MD، O'Sullivan، D.، و پیرس، EL (2015). متابولیسم سلول T باعث ایمنی می شود. J. Exp. پزشکی 212، 1345-1360.

Cantor، JR، Abu-Remaileh، M.، Kanarek، N.، Freinkman، E.، Gao، X.، Louissaint، A.، Jr.، Lewis، CA، و Sabatini، DM (2017). محیط فیزیولوژیک متابولیسم سلولی را دوباره سیم کشی می کند و اسید اوریک را به عنوان یک مهارکننده درون زا UMP سنتاز نشان می دهد. سلول 169، 258-272.e17.

Cronstein، BN، و Aune، TM (2020). متوترکسات و مکانیسم های اثر آن در آرتریت التهابی نات. کشیش روماتول. 16، 145-154.

Dembitz، V.، Tomic، B.، Kodvanj، I.، Simon، JA، Bedalov، A.، و Visnjic، D. (2019). ریبونوکلئوزید AICAR با فعال کردن ATR/Chk1 از طریق تخلیه پیریمیدین باعث تمایز لوسمی میلوئیدی می شود. جی. بیول. شیمی. 294، 15257-15270.

دندرو، کالیفرنیا، فوگر، ال.، و فریز، MA (2015). ایمونوپاتولوژی مولتیپل اسکلروزیس. نات. کشیش ایمونول. 15، 545-558.

داکر، جی اس، و رابینوویتز، جی دی (2017). متابولیسم تک کربن در سلامت و بیماری. سلول متاب. 25، 27-42.

داکر، جی اس، چن، ال.، مورشر، آر جی، گرگوروویچ، جی ام، اسپوزیتو، ام.، تنگ، ایکس.، کانگ، ی.، و رابینوویتز، جی دی (2016). معکوس شدن سیتوزولی یک شار کربنی برای از دست دادن مسیر فولات میتوکندری جبران می کند. سلول متاب. 23، 1140-1153.

امانوئل، ن.، راگوناتان، اس.، شان، کیو، وانگ، اف.، جیاناکو، ا.، هوسر، ن.، جین، جی.، مایرز، جی.، آبراهام، آر.تی، و اونسال-کاچماز، ک (2017). در دسترس بودن نوکلئوتید پورین فعالیت mTORC1 را از طریق Rheb GTPase تنظیم می کند. Cell Rep. 19، 2665-2680.

Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF, and Wolff, JA (1948). بهبودی موقت در لوسمی حاد در کودکان تولید شده توسط آنتاگونیست اسید فولیک، 4-آمینوپتروئیل-گلوتامیک اسید. N. Engl. جی. مد. 238، 787-793.

فیلد، ام اس، کامینینا، ای.، واتکینز، دی، روزنبلات، دی اس، و استوور، پی جی (2015). بینش جدید در مورد عوامل متابولیک و تغذیه ای نقص ایمنی ترکیبی شدید دیس کمیاب 3, e1112479.

Fuseini، H.، Yung، JA، Cephus، JY، Zhang، J.، Goleniewska، K.، Polosukhin، VV، Peebles، RS، Jr.، و Newcomb، DC (2018). تستوسترون التهاب راه هوایی ناشی از گرد و غبار خانگی نوع 2 و IL را کاهش می دهد. J. Immunol. 201، 1843-1854.

گوویندارجو، وی.، یانگ، ک.، و مادزلی، AA (2000). تغییرات شیمیایی پروتون NMR و ثابت های جفت شدن متابولیت های مغز NMR Biomed. 13، 129-153.

گرین، NH، Galvan، DL، Badal، SS، Chang، BH، LeBleu، VS، Long، J.، Jonasch، E.، و Danesh، FR (2019). MTHFD2 متیلاسیون RNA را به برنامه ریزی مجدد متابولیک در کارسینوم سلول کلیه پیوند می دهد. Oncogene 38، 6211-6225.

Gustafsson، R.، Jemth، A.-S.، Gustafsson، NMS، F€ arnega˚rdh، K.، Loseva، O.، Wiita، E.، Bonagas، N.، Dahllund، L.، Llona-Minguez، S.، H € aggblad، M.، و همکاران. (2017). ساختار کریستالی هدف سرطان در حال ظهور MTHFD2 در مجتمع با یک بازدارنده مبتنی بر بستر. سرطان Res. 77، 937-948.

گوستافسون شپرد، ن.، جارل، ال.، ماهادسیان، دی.، استریت ماتر، ال.، اشمیت، آ.، مادوسودان، ن.، تگنر، جی.، لوندبرگ، ای.کی.، آسپلوند، ا.، جین، م. و نیلسون، آر (2015). آنزیم همراه با فولات MTHFD2 یک پروتئین هسته ای است و تکثیر سلولی را تقویت می کند. علمی Rep. 5, 15029.

Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I., and Manning, BD (2017). شبکه سیگنالینگ mTORC1 تغییرات در سطوح نوکلئوتید پورین سلولی را حس می کند. Cell Rep. 21, 1331-1346.

جانسون، MO، Wolf، MM، Madden، MZ، Andrejeva، G.، Sugiura، A.، Contreras، DC، Maseda، D.، Liberti، MV، Paz، K.، Kishton، RJ، و همکاران. (2018). تنظیم متمایز تمایز سلولی Th17 و Th1 توسط متابولیسم وابسته به گلوتامیناز. Cell 175, 1780-1795.e19.

Ju، H.-Q.، Lu، Y.-X.، Chen، D.-L.، Zuo، Z.-X.، Liu، Z.-X.، وو، Q.-N.، Mo، H.-Y.، Wang، Z.-X.، Wang، D.-S.، Pu، H.-Y.، و همکاران. (2019). تعدیل هوموستاز ردوکس با مهار MTHFD2 در سرطان کولورکتال: مکانیسم ها و پیامدهای درمانی. J. Natl. Cancer Inst. 111، 584-596.

کاوایی، جی.، توکی، تی، اوتا، م.، اینو، اچ، تاکاتا، ی.، آساهی، تی، سوزوکی، م.، شیمادا، تی، اونو، ک.، سوزوکی، ک.، و همکاران (2019). کشف یک مهارکننده قوی، انتخابی و خوراکی در دسترس MTHFD2 (DS18561882) با فعالیت ضد تومور در Vivo. جی. مد. شیمی. 62، 10204-10220.

کیم، جی.، یانگ، جی.، کیم، ی.، کیم، جی.، و ها، جی. (2016). فعال کننده های AMPK: مکانیسم های عمل و فعالیت های فیزیولوژیکی انقضا مول. پزشکی 48, e224.

Kofaris، C.، Gallage، S.، Yang، T.، Lau، C.-H.، Valbuena، GN، و Keun، HC (2016). سرکوب MTHFD2 در سلول های سرطان سینه MCF{3}} باعث افزایش گلیکولیز، وابستگی به گلایسین اگزوژن و حساسیت به کاهش فولات می شود. J. Proteome Res. 15، 2618–2625.

Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M., and Liu, XS (2014). MAGeCK شناسایی قوی ژن های ضروری را از صفحه نمایش های حذفی CRISPR/Cas9 در مقیاس ژنومی امکان پذیر می کند. ژنوم بیول. 15، 554.

Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). سرین یک متابولیت ضروری برای گسترش سلول های T Effector است. سلول متاب. 25، 345-357.

Macintyre، AN، Gerriets، VA، Nichols، AG، Michalek، RD، Rudolph، MC، Deoliveira، D.، Anderson، SM، Abel، DE، Chen، BJ، Hale، LP، و همکاران. (2014). انتقال دهنده گلوکز Glut1 به طور انتخابی برای فعال سازی سلول های CD4 T و عملکرد موثر ضروری است. سلول متاب. 20، 61-72.

Michalek، RD، Gerriets، VA، Jacobs، SR، Macintyre، AN، MacIver، NJ، Mason، EF، Sullivan، SA، Nichols، AG، و Rathmell، JC (2011). پیشرو: برنامه‌های متابولیک اکسیداتیو گلیکولیتیک و لیپید متمایز برای زیرمجموعه‌های سلول‌های CD4 به‌علاوه T تأثیرگذار و تنظیم‌کننده ضروری هستند. J. Immunol. 186، 3299-3303.

ناکایا، ام.، شیائو، ی، ژو، ایکس، چانگ، جی.-اچ.، چانگ، م.، چنگ، ایکس.، بلونسکا، ام.، لین، ایکس، و سان، اس.-سی . (2014). پاسخ‌های سلول‌های T التهابی بر تسهیل جذب گلوتامین و فعال‌سازی کیناز mTORC1 ASCT2 متکی است. مصونیت 40، 692-705.

نیلسون، آر.، جین، ام.، مادوسودان، ن.، شپرد، NG، استریت ماتر، ال.، کامپف، سی.، هوانگ، جی.، آسپلوند، ا.، و موتا، وی کی (2014). بیان آنزیم متابولیک نقش کلیدی را برای MTHFD2 و مسیر فولات میتوکندری در سرطان برجسته می کند. نات. اشتراک. 5, 3128.

Palmer، LD، Maloney، KN، Boyd، KL، Goleniewska، AK، Toki، S.، Maxwell، CN، Chazin، WJ، Peebles، RS، Jr.، Newcomb، DC، و Skaar، EP (2019). پروتئین ایمنی ذاتی S100A9 از التهاب آلرژیک راه هوایی نوع سلول T-Helper محافظت می کند. صبح. J. Respir. سلول مول. Biol. 61، 459-468.

Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). هدف قرار دادن MTHFD2 در لوسمی میلوئید حاد. J. Exp. پزشکی 213، 1285-1306.

Que'me' neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., and Genestier, L. (2003). کنترل افتراقی چرخه سلولی، تکثیر و بقای لنفوسیت های T اولیه توسط نوکلئوتیدهای پورین و پیریمیدین. J. Immunol. 170، 4986-4995.

Que'me' neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., and Marvel, J. (2004). محدودیت بیوسنتز نوکلئوتیدی نوکلئوتیدی با گسترش کلونال و تمایز به سلول‌های CD8 T موثر و حافظه تداخل می‌کند. J. Immunol. 173، 4945-4952.

Rae, C., and Mairs, RJ (2019). فعال سازی AMPK توسط AICAR سلول های سرطانی پروستات را به رادیوتراپی حساس می کند. Oncotarget 10، 749-759.

رون هارل، ن.، سانتوس، دی، گرگوروویچ، جی.ام.، سیج، پی تی، ردی، آ.، لویچ، اس بی، دفور، ن.، ساترستروم، اف.کی.، شفر، ام.، اسپینلی، جی بی، و همکاران. (2016). بیوژنز میتوکندری و بازسازی پروتئوم متابولیسم تک کربنی را برای فعال سازی سلول های T ترویج می کند. سلول متاب. 24، 104-117.

Shahi، SK، Freedman، SN، Murra، AC، Zarei، K.، Sompallae، R.، Gibson Corley، KN، Karandikar، NJ، Murray، JA، و Mangalam، AK (2019). Prevotella histicola، A Human Gut Commensal، به اندازه COPAXONE در مدل حیوانی مولتیپل اسکلروزیس قوی است. جلو. ایمونول. 10، 462.

Shalem، O.، Sanjana، NE، Hartenian، E.، Shi، X.، Scott، DA، Mikkelson، T.، Heckl، D.، Ebert، BL، Root، DE، Doench، JG، و Zhang، F. (2014). غربالگری حذفی CRISPR-Cas9 در مقیاس ژنوم در سلول های انسانی. علوم 343، 84-87.

شارما، یو.، و راندو، OJ (2017). ورودی های متابولیک به اپی ژنوم سلول متاب. 25، 544-558.

Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, and Chi, H. (2011). مسیر گلیکولیتیک وابسته به HIF1alpha یک نقطه بازرسی متابولیک را برای تمایز سلول های T H17 و Treg تنظیم می کند. J. Exp. پزشکی 208، 1367–1376.

Shin, M., Momb, J., and Appling, DR (2017). MTHFD2 میتوکندری انسانی یک متیلن تتراهیدروفولات دهیدروژناز/ متیل تتراهیدروفولات سیکلوهیدرولاز مخصوص کوفاکتور ردوکس دوگانه است. متاب سرطان. 5، 11.

Skene، PJ، و Henikoff، S. (2017). یک استراتژی نوکلئاز هدفمند کارآمد برای نقشه برداری با وضوح بالا از سایت های اتصال DNA. eLife 6, e21856.

سو، سی.-سی.، هسیه، ک.-ال.، لیو، پی.-ال.، یه، اچ.-سی.، هوانگ، اس.-پی.، نیش، اس.-ا.، چنگ، W.-C.، Huang، K.-H.، Chiu، F.-Y.، Lin، I.-L.، و همکاران. (2019). AICAR آپوپتوز را القا می کند و مهاجرت و تهاجم به سلول های سرطانی پروستات را از طریق یک مسیر وابسته به AMPK/mTOR مهار می کند. بین المللی جی. مول. علمی 20، 1647.

Su، X.، Wellen، KE، و Rabinowitz، JD (2016). کنترل متابولیک متیلاسیون و استیلاسیون. Curr. نظر. شیمی. Biol. 30، 52-60.

تان، اچ، یانگ، کی، لی، ی.، شاو، تی، وانگ، ی.، بلانکو، دی بی، وانگ، ایکس، چو، جی.-ا.، وانگ، اچ، رنکین، اس. ، و همکاران (2017). یکپارچه سازی پروتئومیکس و فسفوپروتئومیکس، شبکه های سیگنالینگ پویا و مسیرهای انرژی زیستی زیربنایی فعال سازی سلول T را نشان می دهد. مصونیت 46، 488-503.

Toffalini، F.، Kallin، A.، Vandenberghe، P.، Pierre، P.، Michaux، L.، Cools، J.، و Demoulin، J.-B. (2009). پروتئین های همجوشی TEL-PDGFR و FIP1L{4}}PDGFR از ubiquitination و تخریب فرار می کنند. Haematologica 94، 1085-1093.

وان، ایکس، وانگ، سی، هوانگ، زی، ژو، دی، شیانگ، اس، چی، کیو، چن، ایکس، آربلی، ای.، لیو، سی.-ای.، دو، P. و Yu, W. (2020). سیس پلاتین SIRT{2}}داستیلاسیون MTHFD2 را مهار می کند تا تعادل ردوکس سلولی را در سلول سرطان کولورکتال بر هم بزند. سلول مرگ دیس. 11، 649.

وانگ، ال.، زینگ، ایکس، چن، ال.، یانگ، ال.، سو، ایکس.، رابیتس، اچ.، لو، دبلیو. و رابینوویتز، جی دی (2019). پیک حاشیه نویسی و موتور تأیید برای LC-MS Metabolomics بدون هدف. مقعدی شیمی. 91، 1838-1846.

یانگ، ام.، و ووسدن، KH (2016). متابولیسم سرین و تک کربن در سرطان نات. Rev. Cancer 16، 650-662.

یو، ال.، پی، ی.، ژونگ، ال.، یانگ، اچ، وانگ، ی.، ژانگ، دبلیو.، چن، ن.، ژو، کیو، گائو، جی.، ژی، م.، و همکاران (2020). Mthfd2 عملکرد میتوکندری و ترمیم DNA را برای حفظ پرتوانی سلول های بنیادی موش تعدیل می کند. گزارش های سلول های بنیادی 15، 529-545.

زو، زی، و لئونگ، GKK (2020). فراتر از یک آنزیم متابولیک: MTHFD2 به عنوان یک هدف جدید برای درمان ضد سرطان؟ جلو. اونکول. 10، 658.

STAR★روش ها

جدول منابع کلیدی

در دسترس بودن منابع

تماس سرب

اطلاعات بیشتر و درخواست‌ها برای منابع و معرف‌ها باید به آن ارسال شود و پس از تکمیل MTA مناسب توسط مسئول تماس، دکتر جفری راتمل (jeff.rathmell@vumc.org) انجام خواهد شد.

در دسترس بودن مواد

پلاسمیدها و خطوط موش تولید شده در این مطالعه پس از تکمیل MTA مناسب در صورت درخواست در دسترس قرار خواهند گرفت.

در دسترس بودن داده ها و کدها

داده‌های توالی‌یابی CUT&RUN در GEO ذخیره شده‌اند و از تاریخ انتشار (GSE180356) برای عموم در دسترس هستند. داده های میکروسکوپی و تصاویر اصلی وسترن بلات گزارش شده در این مقاله، در صورت درخواست توسط مخاطب اصلی به اشتراک گذاشته خواهد شد. هر گونه اطلاعات اضافی مورد نیاز برای تجزیه و تحلیل مجدد داده های گزارش شده در این مقاله، در صورت درخواست، از مخاطب اصلی در دسترس است.

برای مصونیت روی Cistanches کلیک کنید