پتانسیل محافظت کننده عصبی ایزوتیوسیانات ها در مدل in vitro التهاب عصبی

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

دریافت: 10 جولای 2020 / پذیرش: 25 ​​اکتبر 2020 / انتشار آنلاین: 16 نوامبر 2020

© نویسنده(های) 2020

عملکرد پودر گیاهی سیستانچ: بسیار خوب استاثر محافظت کننده عصبی

خلاصه

ایزوتیوسیانات ها (ITCs)، که به عنوان پیش سازهای گلوکوزینولات در سبزیجات چلیپایی وجود دارند، نشان داده اند.ضد التهابفعالیت های آنتی اکسیدانی و ضد سرطانی. در اینجا، ما اثرات سه ITC مختلف را بر تولید ROS و بیان ماتریکس متالوپروتئیناز (MMP)-2 و -9، که نشان‌دهنده عوامل بیماری‌زای مهم بیماری‌های عصبی مختلف هستند، مقایسه کردیم. کشت اولیه آستروسیت های موش توسط LPS فعال شد و به طور همزمان با دوزهای مختلف آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، 2-فن اتیل ایزوتیوسیانات (PEITC) و 2-سولفورافان (SFN) تیمار شد. نتایج نشان داد که SFN و PEITC قادر به مقابله با تولید ROS ناشی از H2O2 بودند. تجزیه و تحلیل زیموگرافی رویی کشت سلولی نشان داد که PEITC و SFN موثرترین مهارکننده های MMP{6}} بودند، در حالی که، تنها SFN به طور قابل توجهی فعالیت MMP{7}} را مهار کرد. تجزیه و تحلیل PCR نشان داد که تمام ITC های مورد استفاده به طور قابل توجهی هر دو بیان MMP-2 و MMP-9 را مهار کردند. بررسی مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) نشان داد که ITC ها رونویسی MMP را با مهار فعالیت پروتئین کیناز تنظیم شده خارج سلولی (ERK) تعدیل می کنند. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که ITCها می‌توانند عوامل تغذیه‌ای امیدوارکننده برای پیشگیری و درمان مکمل بیماری‌های عصبی مرتبط با درگیری MMP باشند.

کلید واژه هاآنتی اکسیدان · ضد التهاب · ایزوتیوسیانات · متالوپروتئینازهای ماتریکس · بیماری های عصبی

مقدمه

التهاب عصبی یک پاسخ پیچیده به آسیب مغزی است که شامل مجموعه ای از رویدادهای بیوشیمیایی است که منجر به فعال شدن سلول های ساکن سیستم عصبی مرکزی (CNS) می شود. فعال سازی نابجای آستروسیت ها نقش محافظت کننده عصبی آنها را به خطر می اندازد که منجر به آزادسازی واسطه های التهابی مانند گونه های فعال اکسیژن (ROS)، اکسید نیتریک (NO)، سیتوکین ها، کموکاین ها و متالوپروتئینازهای ماتریکس می شود.

(MMPs).

MMPها خانواده بزرگی از اندوپپتیدازهای خنثی و وابسته به Zn2 هستند که به عنوان اهداف اصلی اجزای ماتریکس خارج سلولی (ECM) مانند فیبرونکتین، کلاژن، الاستین و لامینین را دارند (Latronico and Liuzzi 2017).

تیزیانا لاترونیکو

tiziana.latronico@uniba.it

گروه علوم زیستی، بیوتکنولوژی و داروسازی زیستی، دانشگاه باری "آلدو مورو"،

باری، ایتالیا

گروه علوم، دانشگاه بازیلیکاتا، پوتنزا،

ایتالیا

در CNS، MMP ها در پاسخ های فیزیولوژیکی مختلف، مانند مورفوژنز، تغییر شکل، و بازسازی ECM، جنین زایی و ترمیم زخم نقش دارند. با این حال، هنگامی که MMP ها از مکانیسم های نظارتی فرار می کنند، مضر می شوند (روزنبرگ 2009؛ آگراوال و همکاران 2008).

از این نظر، مشخص شده است که تغییرات در بیان و فعالیت MMP رویدادهای پاتوژنتیک کلیدی در چندین اختلال عصبی هستند (Latronico and Liuzzi 2017؛ Mastroianni and Liuzzi 2007؛ Brkic et al. 2015). شواهد تجربی حاکی از آن است که در بین MMPها، ژلاتینازهای A (MMP{3}}) و B (MMP{4}}) به ویژه در التهاب عصبی دخیل هستند، زیرا تنظیم مثبت آنها ممکن است یکپارچگی سد خونی مغزی (BBB) ​​را به خطر بیندازد. این منجر به افزایش جذب و نفوذ سلول‌های خون محیطی ایمنی به داخل پارانشیم مغز می‌شود و روند التهابی را تداوم می‌بخشد که علت از دست دادن پیشرونده نورون و اختلال در عملکرد عصبی است (Rivest 2009). چندین مطالعه in vitro و in vivo نشان داده اند که تولید ROS یکی از عوامل دخیل در تنظیم افزایش بیان MMP{8}} در سلول های مغز از طریق مکانیسم های سیگنالینگ وابسته به مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) است (Hsieh و یانگ 2013).

بر اساس این شواهد، واضح است که کاهش عوامل عصبی، که منجر به کاهش پاسخ‌های التهابی عصبی می‌شود، ممکن است یک استراتژی درمانی مؤثر برای جلوگیری از شروع یا کاهش پیشرفت بیماری‌های مغزی باشد.

در سال‌های اخیر، علاقه زیست‌پزشکی در زمینه عصبی به طور فزاینده‌ای بر تحقیقات ترکیبات طبیعی که قادر به تعدیل فرآیندهای مرتبط با پاسخ‌های التهابی عصبی هستند متمرکز شده است. در این راستا، چندین مطالعه نشان داده است که ترکیبات فیتوشیمیایی، مانند پلی فنول ها، ایزوتیوسیانات ها (ITCs) و سایرین، دارای پتانسیل محافظت عصبی هستند که همچنین از توانایی آنها در مهار بیان MMPs و مقابله با تولید ROS ناشی می شود (Dinkova-Kostova و Kostov). 2012؛ لیوزی و همکاران 2007، 2011).

ایزوتیوسیانات ها متابولیت هایی هستند که توسط چندین گیاه متعلق به خانواده Brassicaceae به عنوان سیستم دفاعی در برابر حمله پاتوژن تولید می شوند (Bones and Rossiter 2006). آنها از تجزیه آنزیمی گلوکوزینولات ها (GSL) توسط آنزیم میروزیناز سرچشمه می گیرند. ITCها در سبزیجات چلیپایی معمولی مانند کلم بروکلی، کلم بروکسل، کلم، شلغم، ترب کوهی، سرمه، خردل، تربچه، شاهی و کلم پیچ وجود دارند. مقدار آنها در غذا بسیار متغیر است و به پردازش و آماده سازی غذا بستگی دارد.

اخیراً نشان داده شده است که ITCها دارای اثرات درمانی متنوعی از جمله اثر آنتی اکسیدانی، ضد باکتریایی، ضد التهابی و شیمی درمانی هستند (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

فعالیت محافظتی ITC ها از طریق مدولاسیون مسیرهای سیگنالینگ مختلف درگیر در سم زدایی، التهاب، آپوپتوز و تنظیم چرخه سلولی انجام می شود. شواهد متعددی نشان می‌دهد که خواص ضد سرطان‌زایی و ضد التهابی ITCها را می‌توان عمدتاً به توانایی آن‌ها در فعال کردن مسیر مرتبط با فاکتور هسته‌ای اریتروئید 2-(Nrf2) نسبت داد. Nrf2 یک فاکتور رونویسی حساس به ردوکس است که در حضور عوامل الکتروفیل و شرایط استرس اکسیداتیو به هسته منتقل می شود و در آنجا عناصر پاسخ آنتی اکسیدانی (ARE) را متصل می کند و باعث بیان ژن های محافظ سلولی درگیر در سم زدایی و تعدیل شرایط اکسیداتیو می شود. فرآیندهای التهابی (Heiss et al 2001). در این رابطه، گزارش شده است که ITCها قادرند ظرفیت آنتی اکسیدانی سلول های انسانی را با القای بیان آنزیم های سم زدایی فاز II و با تنظیم افزایش تولید GSH افزایش دهند (Wagner et al 2010). علاوه بر این، وجود یک گفتگوی متقابل بین Nrf2 و مسیر فاکتور هسته ای (NF)-kB گزارش شده است که منجر به تعدیل التهاب می شود (استورم و واگنر 2017؛ لی و جانسون 2004). در این رابطه، مدل‌های تجربی مختلف in vitro و in vivo التهاب عصبی نشان داده‌اند که ITC‌ها می‌توانند به طور قابل‌توجهی جابه‌جایی NF-kB را با مهار سیتوکین‌های پیش التهابی و MMPs کاهش دهند (لی و همکاران 2015؛ Subedi و همکاران 2017).

در این مقاله، ما تأثیر سه ITC یعنی آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، 2-فن اتیل ایزوتیوسیانات (PEITC) و 2-سولفورافان (SFN) را بر آزادسازی MMP-2 و -9 و همچنین در مورد تولید ROS توسط آستروسیت های فعال شده با LPS. نتایج ما نشان داد که PEITC، SFN، و AITC می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی بیان MMP{5}} و MMP-2 را در آستروسیت‌های فعال شده با LPS مهار کنند و با تولید ROS ناشی از H2O2 مقابله کنند. علاوه بر این، ما نشان دادیم که ITC ها بیان بیش از حد MMP ها را با مکانیسم های مربوط به مهار فعالیت پروتئین کیناز تنظیم شده خارج سلولی (ERK) تعدیل می کنند. این نتایج نشان می دهد که رژیم غذایی غنی از سبزیجات چلیپایی ممکن است مزایای بالقوه ای برای پیشگیری و درمان مکمل بیماری های عصبی داشته باشد.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، سرم جنین گاوی (FBS)، پنی سیلین و استرپتومایسین توسط GIBCO (Paisley، اسکاتلند) ارائه شد. ژلاتین، DNase 1، پلی ال-لیزین

(PLL)، تریپسین، لیپوپلی ساکارید (LPS)، تریپان بلو و 3-(4،5-دی متیل تیازول-2-ایل)-2.5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) آلیل ایزوتیوسیانات (AITC) [کد. 377430، خلوص 95 درصد (HPLC)]، 2-فن اتیل ایزوتیوسیانات (PEITC) [کد. 253731، خلوص 99 درصد )]، 2-سولفورافان (SFN) [کد. S6317، خلوص بیشتر یا مساوی 95 درصد (HPLC)] از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) ارائه شد. 2'،7'-دی کلروفلورسئین دی استات (DCFH-DA) از Calbiochem خریداری شد. پروتئین های استاندارد و R{20}} Coomassie Brilliant Blue از Bio-Rad (Hercules, CA, USA) بودند. آنتی بادی های پروتئین اسیدی فیبریلاری ضد گلیال (GFAP) (RRID: AB_2294571) از Serotec (آکسفورد، انگلستان) خریداری شد. آنتی بادی علیه پروتئین کینازهای تنظیم شده خارج سلولی (ERK) 1/2، و ERK فسفریله 1/2 (p-ERK 1/2) از بیوتکنولوژی سانتا کروز (سانتا کروز، کالیفرنیا) بود. غشاهای Hybond-P PVDF، سیستم آنالیز وسترن بلاتینگ افزایش یافته نورتابی شیمیایی (ECL) و آنتی بادی ثانویه ضد موش-HRP از GE بودند.

علوم زندگی مراقبت های بهداشتی (چالفونت کوچک، باکینگهامشر،

انگلستان). جفت پرایمرهای خاص برای MMP-2، MMP-9 و rRNA 18S از سیگما Genosys (کمبز، انگلستان) بودند. کیت کوچک RNeasy و کیت رونویسی معکوس QuantiTect از Qiagen (والنسیا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. معرفهای Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix برای PCR از شرکت Lucigen (Middleton، WI، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

بیانیه اخلاق

آزمایش‌های مربوط به حیوانات بر اساس توصیه‌های NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals و با تأیید کمیته سازمانی مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه باری، ایتالیا (شماره مجوز: 23-98-) انجام شد. آ).

تهیه کشت آستروسیت

آستروسیت‌ها از بافت‌های نئوکورتیکال {{0}}موش‌های یک روزه ویستار (RRID: RGD_737960، Harlan Laboratories srl، Udine، Italy) تهیه شدند. برای تهیه آستروسیت ها از 6 لیتر 12 نوزاد هر دو جنس استفاده شد. حیوانات با قرار گرفتن در معرض دی اکسید کربن (CO2) کشته شدند و با بریدن سریع سر کشته شدند. بافت‌های نئوکورتیکال تشریح شدند و برای خالص‌سازی کشت‌های سلولی گلیال اولیه به روش گزارش‌شده توسط Latronico و همکاران استفاده شدند. (2{9}}18). به طور خلاصه، پس از تشریح، مغز موش‌ها از مننژ و رگ‌های خونی تهی شد، به صورت مکانیکی چرخ‌کرده و با 25.25 درصد تریپسین در حضور 0}.01 درصد DNase هضم شد. پس از سانتریفیوژ و ارزیابی زنده ماندن سلول، سلول ها در فلاسک های پوشش داده شده با PLL (75 سانتی متر مربع) با تراکم 1.5 × 107 سلول در فلاسک در DMEM، 10 درصد FBS، 100 واحد بین المللی میلی لیتر -1 پنی سیلین، 100 میکروگرم میلی لیتر در سین-1 استرپتومی قرار گرفتند. و در دمای 37 درجه در 5 درصد CO2 نگهداری می شود. پس از 7 روز، فلاسک ها برای حذف الیگودندروسیت ها و میکروگلیاها تکان داده شدند. خلوص آستروسیت ها، به دست آمده توسط تریپسینیزاسیون (0.25 درصد تریپسین / 0.02 درصد EDTA)، با رنگ آمیزی ایمنی برای GFAP ارزیابی شد.

درمان آستروسیت های فعال شده با LPS با آلیل ایزوتیوسیانات، فنتیل ایزوتیوسیانات یا 2-سولفورافان

آستروسیت‌های هم‌آهنگ، که در 96 بشقاب خوب کاشته شدند، با 10 میکروگرم در میلی‌لیتر LPS تحریک شدند و به طور همزمان با غلظت‌های مختلف آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، 2-فن‌تیل ایزوتیوسیانات (PEITC) یا {{5}سولفورافان تیمار شدند. (SFN) در DMEM بدون سرم. آستروسیت‌ها در آستروسیت‌های بدون سرم DMEM و LPS فعال شده به ترتیب، کنترل‌های منفی و مثبت را نشان دادند. علاوه بر این، از آنجایی که محلول های ذخیره AITC (100 میکرومولار)، PEITC (67 میکرومولار)، و SFN (56.4 میکرومولار) در DMSO ساخته شدند، منحنی دوز-پاسخ به DMSO، در محیط کشت با همان غلظت حلال موجود در محیط کشت رقیق شده است. نمونه های آنالیز شده برای تخمین سمیت ترکیب اجرا شد. پس از 20 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه، 5 درصد CO2، مایع رویی جمع آوری و تا زمان استفاده در درجه {18}} نگهداری شد، در حالی که سلول ها برای ارزیابی زنده ماندن سلول ها تحت آزمایش MTT قرار گرفتند.

سنجش زنده ماندن سلول های MTT

سمیت سلولی AITC، PEITC، و SFN روی آستروسیت ها با استفاده از MTT [{0}}(4,{2}}dimethylthiazol-2-yl)- 2،{{5 شناسایی شد. سنجش }}دی فنیل تترازولیوم بروماید]. این سنجش بر اساس کاهش MTT توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندری در سلول‌های زنده، به یک محصول نامحلول آبی فرمازان است که می‌تواند به روش اسپکتروفتومتری اندازه‌گیری شود. به طور خلاصه، پس از درمان به مدت 20 ساعت با AITC، PEITC یا SFN، محیط کشت حذف شد و سلول ها با 0.5 میلی گرم در میلی لیتر MTT بارگذاری شدند. پس از انکوباسیون به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه، محیط CO2 5 درصد حذف و بلورهای فورمازان در سلول ها با اتانول 90 درصد حل شدند. پس از تکان دادن صفحات به مدت 15 دقیقه برای به دست آوردن انحلال کامل بلورها، مقدار محصول فورمازان با جذب نوری در 560 نانومتر با طول موج مرجع 690 نانومتر تعیین شد. زنده ماندن سلول به عنوان درصد کنترل (CTRL)، نشان داده شده توسط سلول های تیمار نشده، که در 100 درصد تنظیم شد، بیان شد. برای هر ترکیب، منحنی دوز-پاسخ زنده ماندن سلول به دست آمد.

تشخیص گونه های اکسیژن فعال

تشخیص گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) با بارگذاری آستروسیت‌ها با 10 میکرومولار 2'، 7'-دی کلروفلورسئین دی استات (DCFH-DA) در DMEM بدون فنل قرمز در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انجام شد. سپس DCFH-DA از چاهک ها خارج شد و سلول ها به مدت 1 ساعت با AITC (400 میکرومولار)، PEITC (10 میکرومولار) یا SFN (25 میکرومولار) در DMEM فاقد فنل قرمز در حضور H2O2 در غلظت نهایی 100 میکرومولار تیمار شدند. . سلول‌های تیمار شده فقط با DCFH-DA یا با H2O2 به ترتیب نشان‌دهنده کنترل‌های منفی (CTRL) و مثبت (H2O2) بودند. پس از انکوباسیون، سلول‌ها با PBS شسته و با آن لیز شدند

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X{2}}.5 درصد، pH 7.5،

سپس در 10،{1}}×g، 4 درجه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت جمع آوری شد و آنالیز اسپکتروفلوریمتری آنها در طول موج 525 نانومتر تحت تحریک در 485 نانومتر انجام شد. نتایج به محتوای پروتئین کل نرمال شد و تولید ROS به عنوان درصد نسبی شدت نورتابی (PL) در مقابل کنترل مثبت بیان شد.

تشخیص ژلاتینازها

فعالیت ژلاتیناز در سوپرناتانت های سلولی (SNs) با تجزیه و تحلیل زیموگرافی همانطور که توسط Latronico و همکاران گزارش شده است، شناسایی شد. (2013). به طور خلاصه، مقداری از SN، مربوط به حدود 10 میکروگرم از کل پروتئین، با 30 میکرولیتر نمونه بافر Laemmli بدون مرکاپتواتانول حل شد. نمونه ها در یک ژل پلی آکریل آمید 7.5 درصد کوپلیمر شده با 0.1 درصد (wt/v) ژلاتین اجرا شدند. پس از اجرای الکتروفورتیک، ژل‌ها دو بار با 2.5 درصد Triton X{10}}/10 میلی‌مولار CaCl2 در 50 میلی‌مولار Tris–HCl، pH 7.4 شستشو داده شدند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه در 1 درصد Triton X انکوبه شدند{19}} /50 میلی مولار Tris–HCl/10 میلی مولار CaCl2، pH 7.4. ژل‌ها با کوماسی برلیانت آبی R{25}} رنگ‌آمیزی شدند و در متانول/اسید استیک/H2O (4:1:5 v/v) رنگ‌آمیزی شدند. فعالیت ژلاتیناز به عنوان یک نوار هضم شفاف روی پس‌زمینه آبی ژل مشاهده شد و با تجزیه و تحلیل تصویر چگالی‌سنجی کامپیوتری با استفاده از نرم‌افزار Image LabTM (آزمایشگاه‌های Bio-Rad) اندازه‌گیری شد. ژلاتیناز

فعالیت به عنوان چگالی نوری (OD) × mm2 بیان شد، که نشان دهنده ناحیه اسکن زیر منحنی ها است که هم روشنایی و هم عرض منطقه لیز بستر را در نظر می گیرد. داده ها با استفاده از معادله زیر بیان شد: درصد بازداری=[100- (نمونه OD/OD مثبت) × 100].

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR)

آستروسیت‌هایی که در صفحات 6 چاهی کاشته شدند، با LPS (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) فعال شدند و به طور همزمان با ITCs در حداکثر غلظت غیر سمی تیمار شدند. پس از 20 ساعت انکوباسیون RNA کل از آستروسیت ها با استفاده از کیت مینی Qiagen RNeasy طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. DNA مکمل (cDNA) از 500 نانوگرم RNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس QuantiTect مطابق دستورالعمل سازنده سنتز شد. در مجموع 25 نانوگرم از محصولات رونویسی معکوس برای تقویت یک قطعه 591 جفت باز با استفاده از پرایمرهای خاص (sense 5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG{10}}'؛ آنتی سنس 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC استفاده شد. TGA-3') برای توالی MMP-2 موش و یک قطعه 541 جفت باز با استفاده از پرایمرهای خاص (sense 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3'; anti-sense 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) برای توالی MMP{23}} موش. به موازات آن، تکثیر قطعه 308 جفت باز از 18S rRNA موش صحرایی (sense 5'-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3'؛ آنتی سنس 5'-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3')، یک ژن مرجع داخلی نسبتاً متغیر، انجام شد. . مجموعه‌های پرایمر که قبلاً در مطالعات دیگر تأیید شده‌اند (Latronico و همکاران 2013؛ Liuzzi و همکاران 2004؛ Gramegna و همکاران 2011) به طور خاص تنها ژن‌های مورد علاقه را که با تقویت یک باند منفرد از اندازه مورد انتظار PCR نشان داده شده است، تشخیص می‌دهند. محصولات تکثیر PCR به مدت 25 سیکل شامل دناتوراسیون در 94 درجه , بازپخت در 59 درجه و گسترش در 72 درجه انجام شد . پس از تکثیر، محصولات در ژل آگارز 1.5 درصد آنالیز شدند. پس از تجزیه و تحلیل تراکم سنجی ژل ها، تکثیر ژن های هدف به بیان 18S rRNA نرمال شد و نتایج به عنوان درصد مهار در مقایسه با کنترل مثبت برای کمی سازی ژلاتیناز بیان شد.

تشخیص فسفوریلاسیون ERK 1/2 با آنالیز وسترن بلات

همانطور که در Latronico و همکاران گزارش شده است، ERK 1/2 با تجزیه و تحلیل ایمونوبلات شناسایی شد. (2018). به طور خلاصه، ابتدایی متقابل

آستروسیت‌های کاشته شده در {0}}صفحه‌های چاهکی، که به مدت 24 ساعت در محیط بدون سرم ساکن شدند، به مدت 1 ساعت با AITC (400 میکرومولار)، PEITC (10 میکرومولار) پیش تیمار شدند. یا SFN (25 میکرومولار) در DMEM بدون فنل قرمز. پس از تحریک به مدت 2 ساعت با 10 میکروگرم میلی‌لیتر LPS، سلول‌ها با 20 میلی‌مولار Tris-HCl، 150 میلی‌مولار NaCl، 2.5 میلی‌مولار Na-pyrophosphate، 1 میلی‌مولار -گلیسروفسفات 1 درصد تریتون X{19}}، 1 میلی‌مولار لیز شدند. فنیل متیل سولفونیل فووراید، 20 میکروگرم در میلی لیتر آپروتینین، 1 میلی مولار EGTA، 1 میلی مولار Na-fuoride، 1 میلی مولار Na3VO4، pH 7.5. 60 میکروگرم از کل پروتئین های هر نمونه با 10 درصد الکتروفورز ژل SDS-پلی آکریل آمید حل شد و پروتئین ها بر روی غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید ایمونبولت شدند. پس از مسدود شدن یک شبه در دمای 4 درجه با 0.05 درصد Tween 20، 1 درصد شیر، 1 درصد آلبومین سرم گاوی در 150 میلی مولار NaCl، 20 میلی مولار Tris-HCl (PH 7.5)، غشاها در طول شب در دمای 4 درجه با یک ضد p- مونوکلونال کاوش شدند. آنتی بادی ERK 1/2 (1:500). سپس غشاها سه بار با Tween 20 0.05 درصد در سالین بافر تریس شسته و با آنتی بادی ثانویه ضد موش ترب پراکسیداز (1:20،{56}}) به مدت 2- ساعت در دمای 24 درجه کاوش و شناسایی شدند. با لومینسانس شیمیایی افزایش یافته برای ارزیابی مقدار کل ERK، غشاها جدا شدند و با یک آنتی بادی اختصاصی برای ERK 1/2 غیر فسفریله (1:500) انکوبه شدند. با توجه به معادله زیر:

درصد pERK 1/2=(ODsample/ODpositive control) × 100.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از GraphPad Prism 5 انجام شد.{1}} (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شد. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) و پس از آن آزمون تعقیبی مقایسه چندگانه دانت انجام شد.

نتایج

اثر ترکیبات ایزوتیوسیانات بر زنده ماندن آستروسیت ها

آزمایش‌های اولیه برای ارزیابی سمیت سلولی AITC، PEITC یا SFN انجام شد. برای این منظور، آستروسیت های خالص شده به مدت 20 ساعت با ترکیبات ITC در غلظت های بین 5 تا 400 میکرومولار یا با DMSO رقیق شده در محیط کشت همانطور که در بخش روش توضیح داده شد، تیمار شدند. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، DMSO در تمام غلظت های استفاده شده که با محلول های ITC آزمایش شده مطابقت دارد سمی نبود. در میان ITCهای مورد بررسی، AITC

شکل 1 زنده ماندن سلولی آستروسیت های تیمار شده با ترکیبات ایزوتیوسیانات. آستروسیت‌های اولیه به مدت 20 ساعت با آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، 2-فن اتیل ایزوتیوسیانات (PEITC) یا 2-سولفورافان (SFN) در غلظت‌های نشان‌داده‌شده تیمار شدند و سپس در معرض سنجش MTT قرار گرفتند. علاوه بر این، از آنجایی که در محلول های موجود در دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل شده است، در هر آزمایش منحنی دوز-پاسخ به DMSO، رقیق شده در محیط کشت با همان غلظت حلال (درصد) موجود در نمونه های ITC اجرا شد تا به دست آید. یک تخمین قابل اعتماد از سمیت ITC کنترل (CTRL) دوباره ساخته شد

معطر از آستروسیت های درمان نشده در DMEM بدون سرم. نمودارها منحنی‌های دوز-پاسخ زنده‌مانی سلول را نشان می‌دهند که به صورت درصدی از بقای سلول در مقایسه با شاهد بیان می‌شوند. دوزهای ترکیباتی که زنده ماندن سلولی را بالای 60 درصد تعیین می کردند به عنوان حداکثر غلظت غیر سمی انتخاب شدند. مقادیر میانگین ± انحراف معیار از n=3 آزمایش انجام شده بر روی جمعیت های مختلف سلولی است. میکروگراف ها نتایج معرف مورفولوژی سلول را نشان می دهد که در زیر میکروسکوپ کنتراست فاز (بزرگنمایی 50 برابر) پس از درمان با ترکیبات مختلف مشاهده شده است.

سمی کمتری برای آستروسیت ها بود. به طور خاص، AITC برای سلول های تا 400 میکرومولار سمی نبود در حالی که PEITC و SFN به ترتیب در غلظت های بالاتر از 10 و 25 میکرومولار سمی بودند. مشاهدات میکروسکوپی نتایج سنجش MTT را تأیید کرد که نشان می‌دهد در غلظت‌های سمی PEITC و SFN، تعداد آستروسیت‌ها کاهش می‌یابد و آنهایی که باقی مانده‌اند تغییرات سیتوتوکسیک را در سیتوپلاسم خود نشان می‌دهند.

اثر حفاظتی ترکیبات ITC بر تولید ROS در آستروسیت های تیمار شده با پراکسید هیدروژن

برای ارزیابی اثر محافظتی ITC ها نسبت به استرس اکسیداتیو، آستروسیت ها با PEITC، AITC، و SFN در حداکثر غلظت غیر سمی پیش تیمار شدند و سپس با H2O2 تحریک شدند. تولید ROS داخل سلولی، ناشی از H2O2، توسط DCFH-DA مورد سنجش قرار گرفت. همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، قرار گرفتن در معرض H2O2 باعث افزایش سیگنال فلورسنت در

شکل 2 تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS) در آستروسیت های تیمار شده با ITCs. حضور ROS با اندازه‌گیری تغییرات سیگنال فلورسنت 2'،7'-dichlorofluorescein (DCFA) همانطور که در بخش مواد و روش‌ها گزارش شده است، مورد سنجش قرار گرفت. آستروسیت‌هایی که در صفحات 6 چاهی کاشته شده بودند، به مدت 3{24} دقیقه با DCFA پیش تیمار شدند سپس به مدت 1 ساعت با 10 میکرومولار PEITC، 400 میکرومولار AITC، یا 25 میکرومولار SFN در حضور H2O2 در غلظت نهایی 100 میکرومولار تیمار شدند. . آستروسیت های تیمار شده با DCFA به تنهایی (CTRL) یا با 100 میکرومولار H2O2 به ترتیب نشان دهنده کنترل منفی و مثبت بودند. سیگنال فلورسنت شناسایی شده در لیزات سلولی توسط فلورومتر در 525 نانومتر تحت تحریک در 485 نانومتر اندازه‌گیری شد. تولید ROS به عنوان درصد (درصد) شدت فوتولومینسانس (PL) در مقایسه با کنترل مثبت بیان شد. مقادیر میانگین ± انحراف معیار از n=3 آزمایش انجام شده بر روی جمعیت های مختلف سلولی است. کاهش معنی دار آماری در مقایسه با H2O2 با ستاره نشان داده می شود (ANOVA یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی Dunnet؛ *p <>

آستروسیت ها در مقایسه با کنترل (CTRL). همانطور که با کاهش شدت فلورسانس DCF مشهود است، پیش تیمار آستروسیت ها با ترکیبات ITC با تولید ROS ناشی از H2O2 مقابله کرد. در بین ITC های آزمایش شده، تنها PEITC و SFN توانستند به طور قابل توجهی تولید ROS را به ترتیب حدود 20 و 24 درصد در مقایسه با کنترل مثبت (H2O2) کاهش دهند.

ترکیبات ایزوتیوسیانات سطوح MMP-2 و MMP-9 را در آستروسیت های فعال شده با LPS مهار می کنند.

تأثیر ترکیبات ITC بر سطوح MMP-2 و MMP-9 بر روی آستروسیت‌های فعال شده با LPS، که به عنوان القا کننده بیان ژلاتینازها شناخته شده است، مورد ارزیابی قرار گرفت (Gottschall and Deb 1996) و به طور همزمان با AITC درمان می‌شود. PEITC یا SFN در محدوده غلظت‌هایی که برای سلول‌ها سمی نبودند. همانطور که در شکل 3a نشان داده شده است، دو نوار هضم شفاف 72 و 92 کیلو دالتون بر روی ژل وجود داشت که به ترتیب مربوط به MMP-2 و MMP-9 بود. فعال شدن آستروسیت ها با LPS باعث افزایش سطح MMP{8}} و القای سنتز MMP-9 شد. درمان با AITC (شکل 3b)، PEITC (شکل 3c)، یا SFN (شکل 3d) وابسته به دوز را تعیین کرد.

کاهش سطوح MMP{0}} که بسته به ترکیب مورد استفاده متفاوت است. به طور خاص، در میان ITC مورد استفاده، SFN مؤثرترین در مهار MMP{1}} بود زیرا 70 درصد مهار را در دوز 10 میکرومولار و 100 درصد مهار را در دوز 25 میکرومولار تعیین کرد. علاوه بر این، تنها SFN در حداکثر غلظت غیر سمی قادر به مهار قابل توجهی MMP-2 بود (شکل 2d).

ترکیبات ایزوتیوسیانات بیان ژن MMP-2 و MMP-9 را در آستروسیت های فعال شده با LPS مهار می کنند.

برای تعیین اینکه آیا ترکیبات ITC مورد مطالعه قادر به مهار بیان MMP-2 و MMP-9 هستند، RT-PCR بر روی آستروسیت‌های فعال شده با LPS که با حداکثر غلظت غیر سمی ITC تیمار شده بودند، انجام شد. همانطور که در ژل های نماینده در شکل 4a نشان داده شده است، درمان آستروسیت های فعال شده با LPS با ITC های منفرد قادر به مقابله با افزایش بیان mRNA-2 و MMP-9 بود. همانطور که در شکل 4b نشان داده شده است، تجزیه و تحلیل کمی نتایج نشان داد که در حداکثر غلظت غیر سمی، ترکیبات ITC، مهار آماری معنی‌داری از بیان MMP{11}} و MMP{12}} را در مقایسه تعیین کردند. به یک کنترل مثبت (LPS). به طور خاص، PEITC و SFN درصد بازداری یکسانی روی MMP{13}} (85 درصد ) و MMP{15}} (100 درصد) اعمال می کنند، در حالی که AITC کمتر از PEITC و SFN در مهار MMP مؤثر بود{17} } (65 درصد ) و MMP{19}} (90 درصد ) عبارت.

ERK 1/2 در مهار بیان MMP توسط ITC نقش دارد

از آنجایی که ERK 1/2 مسیر اصلی انتقال سیگنال است که در تنظیم بیان MMP-2 و MMP-9 در آستروسیت‌های فعال شده با LPS نقش دارد (لی و همکاران 2003)، تأثیر ترکیبات ITC بر روی فعال سازی پروتئین کینازهای تنظیم شده خارج سلولی (ERK) 1/2 مورد آزمایش قرار گرفت.

همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است LPS باعث افزایش معنی دار آماری در سطوح ERK 1/2 فسفریله (p-ERK) شد که با پیش تیمار با ترکیبات ITC خنثی شد.

بحث

به طور گسترده اعتقاد بر این است که راهبردهای اصلی دفاعی در برابر بسیاری از بیماری ها عمدتاً شامل اجتناب از عوامل خطر و اتخاذ یک سبک زندگی صحیح است. شواهد علمی متعددی از این فرضیه حمایت می‌کند که برخی از متابولیت‌های طبیعی که معمولاً توسط انواع مختلف میوه‌ها و سبزیجات تولید می‌شوند، قادر به تعدیل پدیده‌های پاتولوژیک مانند سرطان، بیماری‌های عصبی و سایر بیماری‌های چندعاملی هستند. در این سناریو، ایزوتیوسیانات ها (ITCs) با توجه به ضد قارچ، ضد باکتری خود، علاقه زیادی را برانگیختند.

شکل 3 اثر ترکیبات ایزوتیوسیانات بر سطوح MMP-2 و MMP-9 در آستروسیت های فعال شده با LPS. در یک ژل زیموگرافی نماینده تجزیه و تحلیل سوپرناتانت های کشت از آستروسیت های فعال شده با LPS (10 میکروگرم در میلی لیتر{5}}) و به طور همزمان به مدت 20 ساعت با AITC، PEITC، یا SFN در غلظت های مشخص شده (μM) گزارش شده است. کنترل های منفی و مثبت از آستروسیت های تحریک نشده و تیمار نشده در محیط بدون سرم (CTRL) و LPS- به دست آمد.

سلول های فعال (LPS)، به ترتیب. هیستوگرام‌های b–d نشان‌دهنده نتایج (میانگین ± انحراف معیار) از n {{0}} آزمایش انجام‌شده بر روی جمعیت‌های مختلف سلولی است که به عنوان درصد مهار MMP در مقایسه با LPS بیان می‌شود، که پس از چگالی‌سنجی اسکن و آنالیز رایانه‌ای ژل‌ها محاسبه می‌شود. . کاهش معنی دار آماری در مقایسه با LPS با ستاره نشان داده می شود (ANOVA یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی Dunnet؛ *p < 0.05،="" **p=""><>

خواص بیولوژیکی ضد سرطان، ضد جهش زا، آنتی اکسیدانی و ضد التهابی (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay and Fahey 2001). ایزوتیوسیانات ها از تجزیه آنزیمی گلوکوزینولات ها (GSL) منشاء می گیرند که متابولیت های ثانویه موجود در 15 خانواده گیاه شناسی از راسته Capparales هستند و در خانواده Brassicaceae بسیار فراوان هستند (Fahey et al. 2001). GSL توسط میروزیناز (-thioglucoside glucohydrolase e; EC 3.2.3.147) در اجزای مختلفی مانند ITCs، نیتریت ها، تیوسیانات ها، اپی تیونیتریل ها، SFGate، گلوکز و اگزازولیدین ها هیدرولیز می شوند (Li and Kushad 2005). اگرچه ITC ها به طور گسترده در زمینه شیمی درمانی مورد مطالعه قرار گرفته اند (Grundemann and Huber 2018)، تحقیقات اندکی در مورد پتانسیل درمانی آنها در بیماری های عصبی انجام شده است، علیرغم اینکه توانایی SFN و AITC برای عبور از BBB و تجمع در پارانشیم مغز نشان داده شده است. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). در این مقاله، ما اثرات سه ITC را مقایسه کردیم،

موجود در چندین سبزیجات چلیپایی که معمولاً مصرف می‌شوند، بر روی تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و بیان متالوپروتئیناز ماتریکس (MMP) در یک مدل in vitro التهاب عصبی که توسط آستروسیت‌های فعال شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) یا تیمار شده با H2O2 نشان داده می‌شود. آستروسیت‌ها، فراوان‌ترین نوع سلول‌های گلیال CNS، نقش مهمی در حفظ هموستاز مغز ایفا می‌کنند و نشانه‌های بیماری‌های عصبی مختلف هستند (Cekanaviciute و Buckwalter 2016؛ Colombo and Farina 2016). آن‌ها تنظیم‌کننده‌های حیاتی پاسخ ایمنی ذاتی در نظر گرفته می‌شوند و پاسخ آن‌ها به توهین‌های مضر، مانند استرس اکسیداتیو، ممکن است واکنش‌های التهابی و آسیب بافتی را تشدید کند یا باعث ترمیم بافت شود. به خوبی شناخته شده است که آستروسیت های فعال شده عوامل نوروتوکسیک مانند MMP ها را تولید می کنند که نقش کلیدی در ترویج التهاب عصبی و از دست دادن پیش رونده نورون در بیماری های عصبی دارند (Hsieh and Yang 2013). بنابراین، مدولاسیون از

شکل 4 اثر ترکیبات ITC بر بیان MMP-2 و MMP-9 در آستروسیت های فعال شده با LPS. آستروسیت‌هایی که در صفحات 6 چاهی کاشته شده بودند، با LPS (10 میکروگرم در میلی‌لیتر{6}}) فعال شدند و به طور همزمان به مدت 20 ساعت با AITC (400 میکرومولار)، PEITC (10 میکرومولار) یا SFN (25 میکرومولار) تحت درمان قرار گرفتند. RT-PCR. ژل‌های آگارز نماینده بیان MMP{12}} و MMP{13}} در (الف) گزارش شده‌اند. هیستوگرام در (ب) نتایج (میانگین ± انحراف معیار) n=3 آزمایش انجام شده بر روی سلول های مختلف را نشان می دهد.

رویدادهایی که به دنبال فعال شدن آستروسیت ها رخ می دهد می تواند پاسخ التهابی و آسیب عصبی را کاهش دهد.

نتایج این مطالعه نشان داد که در بین ITCهای مورد مطالعه، AITC سمیت کمتری داشت، زیرا در تمام غلظت‌های مورد استفاده باعث کاهش زنده‌مانی سلولی نشد. در مقابل، مشابه آنچه توسط سایر نویسندگان بر روی رده های مختلف سلول گلیال مشاهده شده است، PEITC و SFN سمیت سلولی را به ترتیب در غلظت های بیشتر از 10 و 25 میکرومولار نشان دادند (لی و همکاران 2015؛ ارن و همکاران 2018؛ سو و همکاران 2015).

در ادبیات علمی کنونی، داده‌های بحث‌برانگیز زیادی در مورد مکانیسم‌های مولکولی زیربنای اثرات ITCs بر زنده‌مانی سلول وجود دارد. از این نظر، اکثر مطالعات نشان داده اند که ITC ها آپوپتوز محرک رشد سلولی، توقف چرخه سلولی، تولید ROS را در سلول های سرطانی مهار می کنند اما در سلول های طبیعی نه (Fofaria et al. 2015; Qin et al. al. 2018؛ Sestili و Fimognari 2015). ما دریافتیم که SFN و PEITC، اما نه AITC، نقش محافظتی در برابر استرس اکسیداتیو در آستروسیت‌ها دارند، در واقع در حداکثر غلظت‌های غیر سمی آنها قادر به مقابله با تولید ROS ناشی از قرار گرفتن در معرض H2O2 بودند. CNS به دلیل مصرف بالای اکسیژن، سیستم های آنتی اکسیدانی ضعیف و محتوای بالای بیوماکرو مولکول های حساس به اکسیداسیون در برابر استرس اکسیداتیو آسیب پذیر است. اعتقاد بر این است که تولید ROS و آسیب اکسیداتیو در پاتوژنز اختلالات عصبی مانند بیماری آلزایمر (AD)، بیماری پارکینسون (PD)، اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) و مولتیپل اسکلروزیس (MS) نقش دارد (لی و همکاران). 2015). بنابراین، اگرچه در آزمایش‌های آزمایشگاهی ما SFN و PEITC تولید ROS را تا حد متوسطی خنثی کردند، ممکن است فرض کنیم که در داخل بدن، تجویز طولانی‌مدت ITCs می‌تواند منجر به کاهش چشمگیرتری در ROS شود که در طول زمان می‌تواند منجر به معنی‌دار شود. برای جمعیت ها به عنوان درصد مهار MMP در مقایسه با کنترل مثبت (LPS)، که پس از اسکن تراکم سنجی و تجزیه و تحلیل کامپیوتری ژل ها محاسبه می شود. کاهش معنی‌دار آماری بیان MMP-2 و MMP-9 در مقایسه با LPS با ستاره نشان داده می‌شود (ANOVA یک طرفه و به دنبال آن آزمون تعقیبی Dunnet؛ *p <>

پیشگیری و تعدیل بیماری های مغزی ROS به عنوان یک مولکول سیگنالینگ حیاتی عمل می کند تا آبشار پاسخ التهابی را در CNS ایجاد کند. از این نظر، به خوبی شناخته شده است که ROS بیان بسیاری از ژن‌های دخیل در التهاب عصبی را از طریق فعال‌سازی فاکتورهای رونویسی پیش‌التهابی مانند فاکتور هسته‌ای-κB (NF-κB) تنظیم می‌کند (Lee et al. 2015؛ Chiurchiù et al. 2016؛ مارتورانا و همکاران 2019). در این سناریو، نقش مهمی توسط MMP ها ایفا می شود که بیان آنها توسط ROS از طریق فعال سازی NF-kB تنظیم می شود (یان و بوید 2007).

از آنجایی که اختلال در تنظیم MMP به پاتوژنز بسیاری از بیماری‌های عصبی التهابی و عصبی کمک می‌کند، مهار آنها یک استراتژی درمانی مهم را نشان می‌دهد. به همین دلیل، علاقه رو به رشد در دهه گذشته بر روی پتانسیل داروها و ترکیبات طبیعی برای مهار MMPها متمرکز شده است. مطالعات متعدد در شرایط آزمایشگاهی نشان داده اند که اثر ضد التهابی و آنتی اکسیدانی چندین دارو و ترکیبات زیست فعال موجود در سبزیجات و موجودات دریایی با توانایی آنها در مهار بیان MMP ها مرتبط است (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. 2015). در این مطالعه، ما نشان دادیم که در بین ITC های آزمایش شده، SFN و PEITC در مهار سطوح و بیان MMP{4}} و MMP-9 در آستروسیت های فعال شده با LPS مؤثرترین بودند. مهار MMPs توسط ITCs در سایر مطالعات in vivo و in vitro گزارش شده است. به طور خاص، لی و همکاران. (2013) نشان داد که SFN قادر به کاهش آسیب BBB با مهار بیان MMP-9 در یک مدل in vivo آنسفالومیلیت خودایمنی تجربی است. سایر نویسندگان گزارش کردند که SFN قادر است بیان MMP-9 را به دنبال آسیب نخاعی در موش کاهش دهد (Mao et al. 2010a). علاوه بر این، مطالعات آزمایشگاهی نشان داد که سرکوب مهاجرت سلولی توسط ITCs و

شکل 5 کیناز 1/2 تنظیم شده با سیگنال خارج سلولی (ERK 1/2) در مهار بیان MMP توسط ترکیبات ITC نقش دارد. فیلم‌های اتورادیوگرافی نماینده تجزیه و تحلیل وسترن بلات از لیزات‌ها از آستروسیت‌ها به مدت 1 ساعت با AITC (400 میکرومولار)، PEITC (10 میکرومولار) یا SFN (25 میکرومولار)، و سپس به مدت 2 ساعت با LPS (10 میکرومولار میلی‌لیتر) فعال شدند. 13}}). سلول های درمان نشده و تحریک نشده نشان دهنده کنترل منفی (CTRL) هستند. هیستوگرام موجود در (b) نشان‌دهنده تهاجم سطوح pERK1/2 در سلول‌های گلیوما C6 با مهار بیان MMP{17}} با واسطه NF-kB بود (لی و همکاران 2015).

مکانیسم‌های مولکولی که توسط آن‌های ITCs MMPs را مهار می‌کنند، نامشخص است و هیچ مطالعه‌ای برای بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی ITCs در کشت‌های آستروسیت اولیه وجود ندارد. چندین مطالعه از این فرضیه حمایت می کنند که اثر بازدارندگی ITC ها نتیجه توانایی آنها در مسدود کردن NF-κB توسط مسیر سیگنالینگ Nrf2 است. در این راستا، یک مطالعه in vivo نشان داد که موش‌های حذفی Nrf2 نسبت به پاسخ التهابی با واسطه NF-kB نخاع و افزایش بیان ژن‌های وابسته به NFκB از جمله MMP-9 حساس‌تر بودند (Mao et al. 2010b). ). اگرچه مسیرهای NF-κB و Nrf2 می‌توانند با هم تداخل داشته باشند، ما نشان دادیم که تنظیم NF-kB نیز از طریق مدولاسیون مکانیسم‌های مولکولی مستقل توسط Nrf2 اتفاق می‌افتد. در واقع، ما دریافتیم که AITC، PEITC، و SFN از فعال شدن ERK1/2 که نقشی محوری در آبشار رویدادهای انتقال سیگنال ایفا می کند که در نهایت رونویسی ژن MMP را تنظیم می کند، مهار می کنند.

با این حال، شواهد تجربی مبنی بر اینکه SFN در حداکثر غلظت غیر سمی به طور کامل بیان و سطوح MMP-9 را مهار کرد در حالی که AITC و PEITC حداکثر بیان MMP-9 را مهار کردند، اما فقط MMP را کاهش دادند{{3} سطوح } تا حدود 50 درصد، ممکن است نشان دهد که این ترکیبات رونویسی MMP{5}} را با مکانیسم‌های عمل متفاوت تعدیل می‌کنند. در این رابطه، گزارش شده است که SFN، علاوه بر مهار فعال‌سازی NF-kB ناشی از LPS، با اتصال LPS به گیرنده TLR4 تداخل می‌کند (Koo et al 2013). اثر مهاری SFN روی TLR4 می‌تواند از فعال شدن آستروسیت‌ها توسط LPS جلوگیری کند و این ممکن است منجر به مهار بالادستی بیان MMP{11}} و در نتیجه عدم تولید MMP{12}} شود.

پس از اسکن چگالی سنجی فیلم های اتورادیوگرافی و نرمال سازی به ERK 1/2 غیر فسفریله به دست آمد. داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف معیار از n=3 آزمایش انجام شده بر روی جمعیت های مختلف سلولی است. ستاره‌ها مقادیری را نشان می‌دهند که از نظر آماری متفاوت از کنترل مثبت (آستروسیت‌های فعال شده با LPS) هستند، که روی 1{7}}0 درصد تنظیم شد (ANOVA یک طرفه و به دنبال آن تست تعقیبی مقایسه چندگانه Dunnett؛ *p <>

نتیجه گیری

به طور خلاصه، داده‌های ما نشان می‌دهد که درمان آستروسیت‌ها با ITC باعث کاهش تشکیل ROS و مهار آزادسازی MMP-2 و MMP-9 می‌شود که بینش جدیدی در مورد خواص آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی ITCs در گلیال ارائه می‌کند. سلول ها. این نتایج نشان می‌دهد که ITCها می‌توانند عوامل تغذیه‌ای امیدوارکننده‌ای برای توسعه مداخلات تغذیه‌ای عصبی، مبتنی بر استفاده از غذاهای سالم، برای پیشگیری و درمان مکمل بیماری‌های عصبی باشند.

تامین مالی بودجه دسترسی آزاد توسط دانشگاه Degli Studi di Bari Aldo Moro در توافقنامه CRUI-CARE ارائه شده است.

رعایت استانداردهای اخلاقی

تضاد منافع نویسندگان هیچ گونه تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

دسترسی آزاد این مقاله دارای مجوز Creative Commons Attribution 4 است.0 مجوز بین‌المللی، که اجازه استفاده، اشتراک‌گذاری، اقتباس، توزیع، و تکثیر را در هر رسانه یا قالبی می‌دهد تا زمانی که اعتبار مناسب را به نویسنده اصلی بدهید. (s) و منبع، پیوندی به مجوز Creative Commons ارائه دهید و نشان دهید که آیا تغییراتی ایجاد شده است یا خیر. تصاویر یا سایر مطالب شخص ثالث در این مقاله در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده شده است، مگر اینکه در خط اعتباری مطالب به شکل دیگری مشخص شده باشد. اگر مطالب در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده نشده است و استفاده مورد نظر شما توسط مقررات قانونی مجاز نیست یا از استفاده مجاز فراتر می رود، باید مستقیماً از دارنده حق نسخه برداری مجوز دریافت کنید. برای مشاهده یک کپی از این مجوز، به http://creativecommons.org/licenses/by/4 مراجعه کنید.{4}}/.