موش های ناک اوت Nlrc3 پس از عفونت HTNV تغییرات پاتولوژیک کلیه را نشان دادند

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

ویروس هانتان (HTNV) انسان را آلوده می کند و باعث تب خونریزی دهنده می شودکلیهسندرم(HFRS). توسعه مدل‌های حیوانی با مشخصه HFRS می‌تواند آزمایش نامزدهای واکسن و عوامل درمانی را تسریع کند و ابزار مفیدی برای مطالعه پاتوژنز HFRS ارائه دهد. از آنجا که NLRC3 نقش های تنظیم کننده ایمنی متعددی دارد، ما حساسیت موش های Nlrc3-/- به عفونت HTNV را به منظور ایجاد یک مدل جدید از HFRS بررسی کردیم. موش های Nlrc3-/- کاهش وزن داشتند،خونریزی کلیه,و گشاد شدن لوله پس از عفونت HTNV، که بسیاری از علائم بالینی HFRS انسانی را خلاصه می کند. علاوه بر این، موش‌های آلوده Nlrc3-/- بارهای ویروسی بیشتری را در سرم، طحال و کلیه نسبت به موش‌های نوع وحشی C57BL/6 (WT) نشان دادند و برخی از آنها اختلالات خونی و تغییرات پاتولوژیک قابل‌توجهی را در اندام‌های متعدد نسبت به موش‌های WT نشان دادند. نتایج ما نشان می‌دهد که موش‌های Nlrc3-/- آلوده به HTNV می‌توانند علائم بالینی و تغییرات پاتولوژیک شبیه بیماران مبتلا به HFRS را ایجاد کنند، که مدل جدیدی را برای مطالعه پاتوژنز و آزمایش واکسن‌ها و درمان‌های کاندید پیشنهاد می‌کند.

کلید واژه ها:HFRS، HTNV، NLRC3، خونریزی کلیه، گشاد شدن توبول کلیه

مقدمه

تب هموراژیک باکلیهسندرم (HFRS) نفروپاتی بینابینی حاد را پس از انتقال مشترک انسان و دام هانتاویروس از جوندگان به انسان نشان می دهد. این بیماری عمدتاً در آسیا و اروپا رخ می دهد (1، 2). شایع ترین پاتوژن های ایجاد کننده HFRS عبارتند از ویروس Dobrava (DOBV)، ویروس Puumala (PUUV)، ویروس سئول (SEOV) و ویروس Hantaan (HTNV) که هر کدام باعث ایجاد شدت HFRS متفاوتی می شوند. ویژگی های بیماری در آمریکای شمالی و جنوبی متفاوت است، جایی که عفونت هانتاویروس باعث سندرم ریوی هانتا ویروس (HPS) می شود که عمدتاً توسط ویروس آند (ANDV) و ویروس Sin Nombre (SNV) ایجاد می شود (3).

HFRS با ویژگی های تب بالا، افت فشار خون،نارسایی کلیه و خونریزی(4). می توان آن را به پنج مرحله بالینی تقسیم کرد: تب، شوک فشار خون، اولیگوریک، ادرارآور و نقاهت. یک دوره حاد عفونت HTNV که منجر به HFRS می شود اغلب با ترومبوسیتوپنی، لکوسیتوز، کم خونی، افزایش کراتینین سرم و آنزیم های کبدی همراه است (5). این علائم و نشانه‌های بالینی را می‌توان تا حدی با این واقعیت توضیح داد که HTNV اساساً به کلیه حمله می‌کند و باعث آسیب کلیه می‌شود که مشخصه آن نفریت حاد توبولو اینترستیشیال است که شامل نفوذ سلول‌های التهابی است (6) و در نتیجه چندین اندام دیگر را تحت تأثیر قرار می‌دهد (7).

جوندگان مخازن طبیعی برای هانتاویروس ها هستند که به طور مداوم حیوانات را بدون ایجاد بیماری آلوده می کنند (8). فضولات آنها مانند بزاق، ادرار و مدفوع به آلاینده‌های بالقوه‌ای تبدیل می‌شوند که می‌توانند انسان‌هایی را که ذرات کوچک ذرات معلق در هوا را استنشاق می‌کنند، آلوده کنند. هانتاویروس ها عموماً باعث عفونت بدون علامت در موش های بالغ BALB/c و C57BL/6 می شوند (9)، اما بیماری عصبی کشنده یا عفونت پایدار در موش های شیرخوار و نوزادان (10، 11). اگرچه ناهنجاری‌های نفروپاتی در ماکاک‌های cynomolgus (Macaca fascicularis) آلوده به PUUV نشان داده شد، اما این حیوانات فقط پروتئینوری خفیف، نفوذ سلول‌های ایمنی و آسیب لوله‌ای به کلیه‌ها را نشان دادند، مشابه یک مورد خفیف HFRS (12). علاوه بر این، همسترهای آلوده به HTNV از طریق بینی منجر به عفونت بدون علامت مداوم شد که با ویرمی پراکنده مشخص می شود اما سطوح بالایی از نسخه های ژنوم ویروسی در ریه ها، مغز و کلیه ها مشخص می شود. موش‌های آلوده به HTNV با دوز بالا از طریق تزریق عضلانی کاهش تدریجی وزن بدن را نشان دادند ({7}} درصد در طول زمان) اما دست نخوردهعملکرد کلیه،عدم وجود ویرمی و عدم انتقال ویروس به اندام ها. در مارموست‌ها، تزریق عضلانی HTNV منجر به درجه بالایی از تبدیل سرمی و تولید آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده شد. به طور مداوم، این حیوانات هیچ آسیب کلیوی، ویرمی، یا انتقال ویروس به اندام ها نداشتند (13).

با وجود ناقص بودن، مدل‌های حیوانی با استفاده از موش‌ها و موش‌ها به طور گسترده برای مطالعه پاتوژنز هانتاویروس مورد استفاده قرار گرفتند (14). یوشیماتسو و همکاران نشان داد که عفونت موش‌های SCID با HTNV باعث بیماری اتلاف کشنده با ادم ریوی می‌شود (15، 16)، و کاهش نوتروفیل‌ها از ایجاد ادم ریوی جلوگیری می‌کند، اما هیچ ضایعات خون‌ریزی مشخصی از HFRS یافت نشد (15). شیمیزو و همکاران دریافتند که HTNV جدا شده از بیماران HFRS می‌تواند موش‌های ماده BALB/c یک هفته‌ای را به‌صورت داخل وریدی آلوده کند و باعث ویرمی برای 6-9 روز شود، علائم بیماری از جمله کاهش وزن موقت، چین‌وچروک مو، ترشح کلیه را نشان دهد (17). ). در همان مدل موش، خونریزی ماکروسکوپی در مرز بین وجود داشتقشر کلیهو مدولا، اما اینکه آیا تغییرات هیستوپاتولوژیک مشاهده شده با کاهش عملکرد کلیه مرتبط است، بررسی نشده بود. در موش های انسانی شده، عفونت HTNV منجر به کاهش وزن، کاهش فعالیت، خز ژولیده و آسیب ریه می شود که به نظر می رسد ریه ارگان هدف اصلی عفونت ویروسی است (18). بنابراین، یک مدل حیوانی مناسب از عفونت HTNV که اکثر ویژگی‌های بیماری HFRS را دربرگیرد، هنوز مورد نیاز است.

بررسی های cistancheبرایگشاد شدن توبول کلیه

NLR ها برجسته ترین خانواده گیرنده های ایمنی ذاتی درون سلولی هستند و عملکردهای متفاوتی را در تنظیم ایمنی ذاتی انجام می دهند. اگرچه شناخته شده ترین NLR ها (به عنوان مثال، NLRP3) عملکرد تنظیمی مثبتی را در فعال سازی التهابی و ایمنی از خود نشان می دهند، یک گروه فرعی غیرمعمول از NLR ها، که به عنوان NLR های مهاری تعریف می شوند، عملکرد مهاری را در پاسخ های التهابی نشان می دهند. برای درک مکانیسم سرکوب ایمنی ذاتی با واسطه NLR، لیگاندهای NLR های مهاری مانند NLRC3 و NLRX1 مورد بررسی قرار گرفته اند (19). NLRC3 یک تنظیم کننده منفی است که پاسخ اینترفرون نوع I (IFN-I) را با جداسازی و تضعیف تحریک کننده ژن های اینترفرون (STING) کاهش می دهد (19). NLRX1، به عنوان یک دروازه بان هوموستاتیک مرکزی بین زیست شناسی میتوکندری و پاسخ ایمنی، در طیف گسترده ای از بیماری ها، هم ناشی از پاتوژن و هم از موارد دیگر نقش دارد (20). از آنجایی که بیماری HTNV اختلال زیادی در التهاب و فعال‌سازی سیستم ایمنی نشان می‌دهد، ما موش‌های Nlrc3-/- را برای بررسی مکانیسم‌های مولکولی بیماری انتخاب کردیم.

این مطالعه نشان داد که مدل موش Nlrc3-/- شبیه آسیب سیستماتیک مشاهده شده در بیماران مبتلا به HFRS است که با ترومبوسیتوپنی مشخص می شود.گشاد شدن لوله های کلیوی و خونریزی.تجزیه و تحلیل بار ویروسی نشان داد که موش‌های Nlrc3-/- بارهای ویروسی بالاتری در بافت‌های مختلف از جمله سرم، طحال و کلیه ارائه کردند. مطالعات ما یک مدل موش را برای عفونت HTNV ایجاد می‌کند که برای ارزیابی واکسن‌ها و درمان‌های کاندید مفید است.

مواد و روش ها

سهام VVirus

سویه HTNV {{0}} توسط Changshou Hang (مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری های چین) اهدا شد و سپس در آزمایشگاه ما نگهداری و گسترش یافت. سلول‌های Vero E6 برای انتشار ویروس مورد استفاده قرار گرفتند و تیترهای عفونی با استفاده از دوز عفونی کشت بافت 50 درصد (TCID50) با سنجش ایمونوفلورسانس (IFAs) اندازه‌گیری شدند. تبدیل بین TCID50 و واحدهای تشکیل پلاک (PSUs) بر اساس محاسبه زیر بود: 1 PFU ≈0.7×TCID50 (21).

نسل Nlrc3 Knockout Mouse Model

موش های نوع وحشی C57BL/6J و مدل های ناک اوت Nlrc3 (Nlrc3-/-) توسط مرکز ارگانیسم های مدل شانگهای (شانگهای، چین) طراحی و توسعه داده شدند. برای به دست آوردن Nlrc3-/- موش، Cas9 mRNA و sgRNA با رونویسی آزمایشگاهی تهیه شد. دو sgRNA هدف حذف اگزون‌های 2-3 ژن Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}'، 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. زیگوت‌های موش‌های C57BL/6J دریافت و با mRNA و sgRNA Cas9 رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی تزریق شد و به گیرنده‌های حامله شبه منتقل شد. ژنوتیپ موش‌های F{26}} به‌دست‌آمده با PCR و تعیین توالی با استفاده از جفت‌های آغازگر شناسایی و تأیید شد: F{18}}'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R{21}}'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. با تلاقی با موش های C57BL/6J، موش های F0 مثبت برای به دست آوردن موش های حذفی Nlrc3 هتروزیگوت F1 انتخاب شدند. PCR و تجزیه و تحلیل توالی موش های F1 به دست آمده را تایید کرد. برای به دست آوردن موش Nlrc3-/- هتروزیگوت، موش های هتروزیگوت ماده و نر F1 به طور تصادفی متقابل شدند. موش‌های 6 تا 8 هفته‌ای برای همه مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند.

آلودگی حیوانات و تهیه نمونه

در مجموع 5×1{5}}5 PFU HTNV در 50 ul از محیط از طریق مسیر داخل صفاقی تلقیح شد. موش های گروه کنترل مقادیر یکسانی از PBS دریافت کردند. از بیست تا بیست و پنج موش Nlrc3-/- یا WT استفاده شد. هر نوع موش برای نمونه گیری در 0، 3، 6، 9 و 12 روز پس از آلودگی به پنج گروه تقسیم شد. وزن بدن و دمای مقعد روزانه ثبت شد. در هر نقطه زمانی، چهار تا پنج حیوان از هر دو گروه برای آزمایش کشته شدند. برای تجزیه و تحلیل ویروس‌شناسی، نمونه‌های بافت تازه از قلب، کبد، طحال، ریه، کلیه و مغز جمع‌آوری شد و بلافاصله در درجه -80 منجمد شد. موش ها با PBS سرد پرفیوژن شدند و اندام ها در 4 درصد پارافورمالدئید به مدت 4 ساعت برای تجزیه و تحلیل بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی تثبیت شدند. نمونه خون برای آزمایش بار ویروسی و معاینه معمول خون جمع‌آوری شد و سرم برای آنالیز بیوشیمی جدا شد.

سنجش سیتوکین

در مجموع 25 میلی لیتر سرم از هر موش برای 13 سیتوکین مختلف با پنل پاسخ ضد ویروس موش LEGENDplex™ (13-plex) (BioLegend) مطابق دستورالعمل سازنده مورد سنجش قرار گرفت. سیتومتر FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA) برای تشخیص استفاده شد. داده ها با استفاده از LEGENDplex v8 تجزیه و تحلیل شدند.{5}}. نرم افزار.

سنجش زمان واقعی RT-PCR

نمونه‌های بافت از هر موش توزین و در PBS غوطه‌ور شدند و با هموژنایزر خودکار TissueLyser II (QIAGEN، آلمان)، با استفاده از فرکانس 3{24}}/s و زمان 5 دقیقه همگن شدند. برای استخراج RNA کل، 200 میلی‌لیتر هموژن بافتی به 500 میلی‌لیتر معرف TRIzol و سپس استخراج کلروفرم و رسوب ایزوپروپانول منتقل شد. 140 میلی‌لیتر از نمونه‌های سرم به بافر 560 میلی‌لیتری AVL حاوی RNA حامل (Qiagen، UK) برای استخراج RNA با استفاده از کیت QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen، UK) منتقل شد. در نهایت، RNA در آب بدون RNase حل شد. یک روش RT-PCR در زمان واقعی HTNV برای تشخیص RNA ویروسی از هر نمونه انجام شد. دنباله‌های آغازگر که به‌طور خاص برای بخش HTNV مورد هدف قرار می‌گیرند، به‌صورت زیر اتخاذ شدند: F{10}}'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA{12}}' و R{13}}'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. کیت One-step TB Green PrimeScript™ RT-PCR II (Perfect Real Time) (Takara، ژاپن) برای سنجش qRT-PCR استفاده شد. ترکیب اصلی نهایی (20 میلی‌لیتر) شامل 2 میلی‌لیتر RNA، 6/5 میلی‌لیتر dH2O بدون RNase، 8/0 میلی‌لیتر پرایمر فورواردینگ و معکوس (10 میلی‌مولار)، 8/0 میلی‌لیتر PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2، و 10 میلی‌لیتر 2×One Step بود. TB Green RT-PCR Buffer 4. شرایط چرخه استفاده شده 42 درجه به مدت 5 دقیقه، 95 درجه به مدت 10 ثانیه، سپس 40 سیکل 95 درجه برای 0 ثانیه، 65 درجه برای 15 ثانیه و 95 درجه برای 0 ثانیه به دنبال داشت. واکنش ها بر روی پلت فرم LightCycler (Roche Diagnostics، ایالات متحده آمریکا) اجرا و تجزیه و تحلیل شدند.

کمی سازی مطلق بار ویروسی

الیگونوکلئوتیدهای RNA ویروسی به عنوان استاندارد RNA با رونویسی در شرایط آزمایشگاهی از DNA با استفاده از کیت MAXIscript (Thermo Scientific، UK)، که شامل 562 باز از RNA HTNV هدف‌گیری شده توسط سنجش (22) بود، به‌دست آمد و سپس توسط یک اسپکتروفتومتر میکروپلیتی اولترا میکروسکوپ تعیین شد. BioTek Epoch، ایالات متحده)، غلظت ذخایر استاندارد RNA 8{18}} ng/mL 0 بود. برای ارزیابی بار ویروسی در هر نمونه، RNA استاندارد با رقت سریال {{5} برابر، از 1010 نسخه تا 103 نسخه در هر واکنش تهیه شد. RNA استاندارد ما دارای محدودیت تشخیص 1010 کپی تا 101 کپی در هر واکنش است و بنابراین آستانه تشخیص برای این سنجش را 100 نسخه ژنومی در هر واکنش تعیین می کنیم. تجزیه و تحلیل در حین اجرا، منحنی‌های استاندارد با شیب -3.6624، یک قطع Y 41.68 سیکل و مقدار R2 0.9996 ایجاد شد.

تجزیه و تحلیل سطوح پروتئین با وسترن بلاتینگ

لیزهای بافتی از نمونه بافت موش تهیه شد. کیت سنجش پروتئین بیسینکونیک اسید (BCA) (Thermo Scientific، UK) برای تشخیص غلظت پروتئین استفاده شد. برای آنالیز پروتئین، 30 میلی گرم پروتئین کل از هر نمونه بر روی ژل SDS-پلی آکریل آمید بارگذاری شد و به غشاهای NC منتقل شد. سپس از محلول 5 درصد شیر بدون چربی برای انسداد در دمای اتاق به مدت 2 ساعت استفاده شد. سپس، 1:1000 آنتی بادی مونوکلونال 1A8 رقیق شده علیه HTNV-NP (تهیه و خالص شده توسط آزمایشگاه ما) (23، 24) اضافه شد و در 4 درجه یک شبه انکوبه شد. در نهایت، غشاها با آنتی بادی‌های ثانویه، IgG ضد موش خرگوش با HRP کونژوگه، یا IgG ضد خرگوش موش با HRP کونژوگه در دمای اتاق به مدت 2 ساعت انکوبه شدند. سپس بستر شیمیایی HRP برای شناسایی پروتئین ها اضافه شد. تجزیه و تحلیل تراکم سنجی شدت باند پروتئین با استفاده از نرم افزار Image J (NIH, USA) انجام شد. b-actin به عنوان یک کنترل بارگذاری برای نرمال سازی استفاده شد.

سنجش ایمونوهیستوشیمی

نمونه های بافت در پارافین جاسازی شده و برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی به 4 میلی متر برش داده شدند. بخش ها تحت پارافینیزاسیون و آبرسانی مجدد و غیرفعال سازی پراکسیدازهای درون زا قرار می گیرند. مقاطع تحت بازیابی آنتی ژن در بافر سیترات (PH{1}}) در دمای 95 درجه به مدت 10 دقیقه قرار گرفتند. سپس سرم 5 درصد طبیعی بز برای انسداد در دمای اتاق به مدت 40 دقیقه استفاده شد. mAb 1A8 به عنوان آنتی بادی اولیه برای آنتی ژن HTNV NP مورد استفاده قرار گرفت و با مقاطع بافتی در دمای 4 درجه یک شبه انکوبه شد. پس از آن رنگ آمیزی با IgG ضد موش FITC (Invitrogen) در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و سپس DAPI به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انجام شد. 3DHISTECH (مجارستان) برای اکتساب تصویر و CaseViewer2.4 برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده شد.

معاینه بافت شناسی

به منظور حفظ مورفولوژی سلولی و بافتی، از فرمالین بافر خنثی 4 درصد برای تثبیت نمونه‌های بافت برای آنالیز هیستوپاتولوژیک استفاده شد. این بافت ها در برش های 5 میلی متری پردازش و سپس با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند. در نهایت، مقاطع با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتند و تصاویر توسط 3DHISTECH (مجارستان) گرفته شد که توسط CaseViewer2.4 تجزیه و تحلیل شد. درجه ضایعات به صورت بصری با استفاده از یک سیستم درجات از پیش تعیین شده 4- امتیازدهی شد: در محدوده نرمال مانند 0، حداقل 1، خفیف تا 2، متوسط ​​به عنوان 3، شدید به عنوان 4.

مطالعات موضوع حیواناتتمام آزمایشات حیوانی توسط کمیته آزمایشات آزمایشگاهی مرکز حیوانات دانشگاه علوم پزشکی چهارم ارتش تایید شد. (شماره 20210403).

آمارداده ها با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 9 تجزیه و تحلیل شد. مگر اینکه در غیر این صورت مشخص شده باشد، تمام داده ها به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد (SD) ارائه شد. از آزمون های t یا ANOVA یک طرفه همانطور که در افسانه های شکل مشخص شده است استفاده شد. مقدار P کمتر از 0.05 معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

تشخیص بار ویروسی در اندام های مختلف Nlrc3-/- موش پس از عفونت داخل صفاقی با HTNV

برای مشخص کردن حساسیت موش های Nlrc3-/- به عفونت HTNV، گروهی از موش های Nlrc3-/- به صورت داخل صفاقی با 5 × 1{26}} 5 PFU HTNV در هر موش، با استفاده از موش های WT به عنوان شاهد، آلوده شدند. همه حیوانات روزانه از نظر علائم بالینی، دما و تغییرات وزن بدن تحت نظر قرار گرفتند. موش‌ها در روزهای 3، 6، 9 و 12 پس از عفونت (dpi) برای تجزیه و تحلیل پارامترهای آزمایشگاهی مختلف، بارهای ویروسی و آسیب‌شناسی قربانی شدند. موش‌های Nlrc3-/- شروع به کاهش وزن در 4 نقطه در اینچ کردند و با 6 نقطه در اینچ، کاهش وزن بیش از 5 درصد از وزن اولیه بدن آنها ثبت شد. در مقایسه، موش‌های WT کاهش وزنی را نشان ندادند (شکل 1A). هیچ تبی در هر دو گروه ثبت نشد (شکل 1B). به منظور ارزیابی انتشار و تکثیر HTNV در موش‌های به چالش کشیده ویروسی، سرم و اندام‌های اصلی (از جمله قلب، کبد، طحال، ریه، کلیه و مغز) برای تعیین کمیت مطلق تعداد کپی RNA ویروسی جمع‌آوری شد. نتایج نشان داد که ویرمی در 3 نقطه در اینچ در هر دو گروه رخ داد (موش Nlrc3-/-: 140 ± 943 نسخه معادل در هر میلی لیتر؛ موش WT: 803 ± 277 نسخه در هر میلی لیتر). قابل ذکر است، بارهای ویروسی سرم موش‌های WT در 3dpi به اوج خود رسید و پس از آن به سرعت کاهش یافت، در حالی که در موش‌های Nlrc3-/-، بار ویروسی یک سطح متوسط ​​را تا 6 dpi حفظ کرد و سپس به تدریج به سطح پایین 9 dpi کاهش یافت (شکل 1C). علاوه بر این، خون کامل موش‌های آلوده به HTNV را در روزهای 0، 3، 6 و 9 پس از آلودگی جمع‌آوری کردیم تا تکثیر ویروس در خون مشخص شود. نتایج نشان داد که بار ویروسی در dpi 3 افزایش و سپس کاهش یافت که نشان دهنده تکثیر ویروس در سلول های خونی است. همانطور که در شکل تکمیلی 1 نشان داده شده است، تعداد نسخه های ویروسی در موش های Nlrc{33}}/- بیشتر از موش های WT بود (Nlrc3-/- موش: 502 ± 5752 کپی در هر میلی لیتر؛ موش WT: 3589 ± 869 کپی در هر میلی لیتر) در 3 نقطه در اینچ. علاوه بر این، بارهای ویروسی برابر بیشتر در طحال موش‌های Nlrc3-/- (3033 ± 175 نسخه در هر میلی‌گرم) نسبت به موش‌های WT (425 ± 1520 کپی در میلی‌گرم) در 6 dpi شناسایی شد. همین الگو در کلیه ها روی 9 dpi مشاهده شد (موش Nlrc3-/-: معادل 500 ± 87 نسخه در هر میلی گرم؛ موش WT: 40 ± 270 کپی در هر میلی گرم) (شکل 1C). به طور کلی، بارهای ویروسی متوسطی در موش های Nlrc3-/- نسبت به موش های WT شناسایی شد.

سپس، سطوح نوکلئوپروتئین HTNV (NP) را بررسی کردیم. همانطور که در شکل 2A، C نشان داده شده است، موش های Nlrc3-/- سطوح آنتی ژن ویروسی بالاتری نسبت به موش های WT در طحال و کلیه داشتند. تجزیه و تحلیل آماری آنتی ژن های ویروسی در کلیه و طحال به ترتیب در شکل 2B، D نشان داده شده است. سطوح پایین آنتی ژن های ویروسی در قلب، کبد، ریه و مغز موش های Nlrc3-/- شناسایی شد (شکل تکمیلی 2). سطح پروتئین NP ویروسی در قلب، ریه و مغز موش‌های Nlrc3-/- کمتر از موش‌های WT در سطح پروتئین بود (شکل‌های تکمیلی 2B، F، H)، اما اهمیت آماری بین قلب و مغز هر دو در mRNA نشان داده شد. و سطوح پروتئین (شکل های تکمیلی 2A, E, I). این یافته نشان می دهد که ویروس فعال است

تکثیر در خون، طحال، و کلیه موش Nlrc3 - / - پس از عفونت HTNV رخ داده است. در نهایت، ما از ایمونوفلورسانس برای تشخیص سطوح بیان HTNV NP در طحال و کلیه استفاده کردیم. شدت فلورسانس HTNV NP FL در کلیه بیشتر بودکلیهلوله‌ها (شکل 2E) و پالپ قرمز طحال (شکل 2F) موش‌های Nlrc3-/- نسبت به موش‌های WT روی 6dpi و 9dpi. با هم، این نتایج نشان می‌دهد که موش‌های Nlrc3-/- نسبت به عفونت داخل صفاقی HTNV حساس‌تر هستند.

آزمایشات معمول خون موش های Nlrc3-/- پس از عفونت HTNV

به طور گسترده پذیرفته شده است که آسیب شناسی HFRS تا حد زیادی با واسطه ایمنی است، از جمله کمپلکس های ایمنی، فعال سازی مکمل، پاسخ سلول های T (24-26)، و تولید سیتوکین ناشی از HTNV (26، 27)، که باعث آسیب به اندام های متعدد می شود. علاوه بر این، ترومبوسیتوپنی یک ویژگی بالینی رایج در افراد آلوده به ویروس های تب خونریزی دهنده ویروسی (VHF) است. بنابراین، ما ابتدا یک آزمایش هماتولوژی را با استفاده از خون کامل جمع‌آوری‌شده از موش‌های Nlrc3-/- و WT در 3، 6، 9 و 12 dpi انجام دادیم. نتایج نشان داد که تعداد PLT در موش‌های WT در 3dpi کاهش یافته و سپس به تدریج بهبود یافتند، اما در موش‌های Nlrc3-/- تا رسیدن به کمترین مقدار در 9dpi، به طور قابل‌توجهی کمتر از WT در 9dpi، به کاهش ادامه دادند (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

به طور قابل توجهی در موش های Nlrc3-/- در 6 نقطه در اینچ افزایش یافت اما در موش های WT نه (شکل 3C). نوتروفیل ها در هر دو نوع موش اندکی کاهش یافتند اما به سطح متوسط ​​در 6 dpi بهبود یافتند (شکل 3D). تعداد لنفوسیت ها به طور قابل توجهی در dpi 3 کاهش یافت، در حالی که آنها در موش های WT با 6 dpi شروع به افزایش کردند، تعداد لنفوسیت ها در موش Nlrc3-/- در 6 dpi در سطح پایین باقی ماند (شکل 3E). نسبت سلول های CD3 به علاوه CD4 به علاوه T در مقابل سلول های CD3 به علاوه CD8 به علاوه T در خون محیطی با سیتومتری همتا تعیین شد و مشخص شد که در 3dpi افزایش یافته و سپس به سرعت در 6dpi معکوس می شود، مطابق با تغییراتی که اغلب در بیماران HFRS مشاهده می شود (شکل 3F)، که در آن سلول‌های CD4 به علاوه T به طور چشمگیری کاهش یافتند، و سلول‌های CD8 به علاوه T بدون تغییر باقی می‌مانند یا به طور جبرانی منبسط شده‌اند تا منجر به نسبت معکوس CD4/CD8 شود. این یافته‌ها نشان می‌دهد که تلقیح داخل صفاقی HTNV در موش‌های Nlrc3-/-، تا حدی، ویژگی‌های بالینی اصلی بیماران آلوده به HTNV، مانند ترومبوسیتوپنی و نسبت سلول‌های T CD4/CD8 معکوس را القا می‌کند.

تغییرات پاتولوژیک در کلیه Nlrc3-/- آلوده موش ها خونریزی بینابینی کلیوی و اتساع لوله های کلیوی را نشان می دهند.سپس، تغییرات پاتولوژیک موش‌های آلوده به HTNV با رنگ‌آمیزی H&E مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که در کلیه موش‌های آلوده Nlrc3-/- وجود دارد که به صورت ادم ظاهر می‌شود.کلیهسلول های اپیتلیال لوله ای در 6 نقطه در اینچ، ضایعات هموراژیک در آن مشاهده شدکلیهمدولا (شکل 4A).توبول کلیهاتساع در اوایل 3dpi مشاهده شد، شدت آن در 9dpi به اوج رسید و تا 12dpi ادامه داشت، و در موش های Nlrc3-/- بیشتر از موش های WT مشخص است (شکل 4B, C). این یافته ها نشان داد

که نفروپاتی حاد با مشخصهلوله های کلیویاتساع وخونریزی بینابینی کلیویدر موش Nlrc3-/- آلوده به HTNV القا شد. در مورد سایر تغییرات پاتولوژیک در کبد، طحال، ریه، این دو گروه موش نتایج مشابهی نشان دادند. اینها عمدتاً شامل خونسازی خارج مدولاری در طحال، ضخیم شدن دیواره آلوئول در ریه و انحطاط کبد بود (شکل های تکمیلی 3A-F). بر اساس موارد فوق، ویژگی های پاتولوژیک مشاهده شده در کلیه موش های Nlrc3-/- در طول فاز حاد عفونت HTNV شباهت زیادی به تغییرات بالینی-پاتولوژیک در موارد HFRS انسانی دارد.

بر این اساس، شاخص‌های مرتبط خون و ادرار در موش‌ها را برای اختلالات عملکردی کلیه بررسی کردیم. سرم موش برای ارزیابی آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، کسر کراتین کیناز MB (CK-MB)، اوره، و همچنین اسید اوریک (UA) جمع آوری شد. همانطور که در شکل 4D نشان داده شده است، در مقایسه با موش های کنترل WT، سطح UA سرم به طور قابل توجهی در 3 dpi در موش Nlrc3-/- بالا بود، CK-MB سرم به طور قابل توجهی در 9 dpi در موش Nlrc3-/- بالا بود، اما سطح سرمی ALT، UREA و CREA هیچ ارتفاعی را نشان ندادند (جدول تکمیلی 1).

کلیویدرگیری در HFRS آلوده به PUUV شامل پروتئینوری گذرا، هماچوری میکروسکوپی اما به ندرت قابل مشاهده و AKI اولیگوریک و به دنبال آن پلی اوری و بهبودی است. ویژگی بارز پروتئینوری در این بیماری کاهش سریع آن پس از مرحله حاد بیماری بود (6). در گروه بزرگی از بیماران مبتلا به نفریت توبولو اینترستیشیال حاد ناشی از علل مختلف، پروتئینوری تنها در یک چهارم بیماران مشاهده شد، در حالی که تنها 2 درصد از کل بیماران، پروتئینوری با دامنه نفروتیک یافت شد (28). ما ادرار را در 0، 3، 6 dpi جمع آوری کردیم و متوجه شدیم که سطح پروتئین ادرار در dpi 3 افزایش یافته است، مرحله حاد عفونت. غلظت پروتئین ادرار به طور قابل توجهی افزایش یافت و مقدار متوسط ​​نزدیک به 0.3 گرم در لیتر در dpi 3 در موش Nlrc3-/- و موش WT آلوده بود (شکل 4E).

برای بررسی سلول های التهابی نفوذ شده بهکلیهبینابینی پس از عفونت HTNV، ما رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) با CD3، F4/80 و CD11b انجام دادیم. نتایج نشان داد که گروهی از سلول های ایمنی مثبت برای CD3 به داخل بدن نفوذ کرده اندکلیهبینابینی پس از عفونت HTNV (شکل 5A)، و سلولهای میلوئیدی مثبت برای CD11b در توبولو بینابینی قشری ظاهر شدند (شکل 5B). نسبت نفوذ سلول های CD3 به علاوه T و CD11b به علاوه سلول های میلوئیدی در موش های آلوده Nlrc{5}}/- به طور قابل توجهی بیشتر از موش های WT است، اما ماکروفاژها برای F4/80 مثبت در سراسر قشر کلیه و مدولا توزیع شده و معنی دار نبودند. تفاوت بین این دو نوع ماوس (شکل 5C).

عفونت HTNV باعث ایجاد پاسخ سیتوکین قوی در موش Nlrc3-/- شد

تولید بیش از حد سیتوکین های التهابی معمولاً در افراد مبتلا به HFRS گزارش می شود و این فرضیه را ایجاد می کند که اختلال در تنظیم سیتوکین ممکن است نقشی محوری در پاتوژنز بیماری داشته باشد. واهری و همکاران (8) دریافتند که سیتوکین های متعدد توسط سلول های مختلف مانند ماکروفاژها، مونوسیت ها و لنفوسیت ها در پاسخ به سیگنال های التهابی مانند عفونت ویروسی تولید می شوند. وانگ و همکاران گزارش داد که غلظت سرمی TNF-a، IL{3}}، IFN-g، IL{5}}، IP-10 و RANTES (اما نه IL-4) بسیار بالا بود. در بیماران HFRS (29)، در مقایسه با گروه شاهد. و اینکه بیشترین غلظت ها معمولاً در مراحل تب، افت فشار خون و اولیگوریک، به ویژه در موارد شدید و بحرانی نوع HFRS مشاهده می شود. سطوح بالای IL پلاسما با شدید همراه بودکلیهشکست و ترومبوسیتوپنی در HFRS ناشی از PUUV و می تواند به عنوان نشانگر شدت بیماری استفاده شود.

نتایج ما نشان داد که عفونت HTNV منجر به افزایش تولید سیتوکین از جمله CXCL-1، CCL-5، IL-6، IL-12، TNF-a و IFN-g در Nlrc3-/- موش، و سطح این سیتوکین ها در 6 یا 9 نقطه در اینچ به اوج خود رسید. در مقایسه، موش‌های WT پاسخ‌های سیتوکین ضعیف‌تری در طول فرآیند عفونت داشتند (شکل 6).

در نتیجه، ما در این مطالعه دریافتیم که پس از تلقیح داخل صفاقی HTNV، موش های Nlrc3-/- کاهش وزن پیدا می کنند.خونریزی کلیه، و گشاد شدن لوله ها. این ویژگی‌ها بیشتر از هر مدل حیوانی منتشر شده قبلی شبیه علائم بالینی HFRS است. علاوه بر این، موش‌های Nlrc3-/- بار ویروسی بالاتری را در سرم، طحال و کلیه نسبت به موش‌های WT و Nlrc3-/- نشان دادند که اختلال خونی و تغییرات پاتولوژیک قابل‌توجهی در اندام‌های متعدد ایجاد کردند، بنابراین عفونت HTNV Nlrc3-/ ایجاد شد. - موش ها به عنوان یک مدل جدید برای مطالعه HFRS.

بحث

مدل موش HFRS که در اینجا توضیح داده شد نشان می‌دهد که موش‌های Nlrc3-/- آلوده به HTNV یک مدل حیوانی کوچک مناسب را نشان می‌دهند که ممکن است برای ارزیابی واکسن‌ها و درمان‌های HFRS استفاده شود. مدل موش Nlrc3-/- شبیه آسیب سیستماتیک مشاهده شده در انسان است که با ترومبوسیتوپنی، لنفوسیتوپنی، افزایش سطح سرمی AST (اختلال عملکرد کبد)، LDH، کسر کراتین کیناز MB و UA مشخص می شود.(اختلال عملکرد کلیه). علاوه بر این، موش های Nlrc3-/- کاهش وزن و ظاهری داشتندخونریزی کلیه. تکثیر ویروسی و تغییرات هیستوپاتولوژیک در اندام های هدف در ریه، طحال، کبد و کلیه تشخیص داده شد. علاوه بر این، سطح نسبتاً بالاتری از بارهای RNA ویروسی در خون، طحال و کلیه موش‌های Nlrc3-/- یافت شد. در مقایسه، موش‌های WT علیرغم تشخیص RNA ویروسی در خون، طحال و کلیه، تغییرات بافت‌شناسی خفیفی ایجاد کردند.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 درصد) (30). به عنوان مثال، همسترهای آلوده به HTNV از طریق بینی منجر به عفونت بدون علامت مداوم شد که با ویرمی پراکنده مشخص می شود اما سطوح بالایی از نسخه های ژنوم ویروسی در ریه ها، مغز و کلیه ها مشخص می شود. موش‌های آلوده به HTNV با دوز بالا از طریق تزریق عضلانی کاهش تدریجی وزن بدن را نشان دادند ({2}} درصد در طول زمان) اما دست نخوردهعملکردهای کلیویعدم وجود ویرمی و عدم انتقال ویروس به اندام ها. در مارموست‌ها، تزریق عضلانی HTNV منجر به درجه بالایی از تبدیل سرمی و تولید آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده شد. به طور مداوم، این حیوانات هیچ آسیب کلیوی، ویرمی، یا انتقال ویروس به اندام ها نداشتند (13).

در مورد مشاهده اینکه تغییرات خونی فقط در یک نقطه زمانی مشاهده می شود و تغییرات سیتوکین قابل توجه نیست، ما فکر می کنیم که می توان آنها را با ماهیت عفونت HTNV توضیح داد، که مشابه بسیاری از عفونت های ویروسی دیگر است که اندام های متعدد را مبتلا می کند، و بنابراین اغلب اوقات یافتن تغییرات پایدار در یک پارامتر مشکل است. به طور کلی، یافته های ما به طور کلی با دانش موجود در این زمینه مطابقت دارد. علاوه بر این، کشف موش‌های Nlrc3-/- که حساسیت بیشتری به عفونت HTNV دارند و تغییرات زیادی مشابه تغییرات پاتولوژیک HFRS نشان می‌دهند، سهم جدیدی در این زمینه است. به طور کلی پذیرفته شده است که سلول‌های اندوتلیال عروقی انسان، اهداف اولیه برای هانتاویروس هستند. که منجر به درجات متغیری از اتساع و ادم عمومی مویرگی می شود (31).

آنتی ژن‌های ویروسی را می‌توان در اندوتلیوم مویرگی بافت‌های مختلف یافت (هانتا ویروس‌ها با حساس کردن سلول‌ها به فاکتور نفوذپذیری عروقی VEGF، نفوذپذیری سلول‌های اندوتلیال را هدایت می‌کنند، در حالی که آنژیوپویتین 1 و اسفنگوزین {{1}فسفات نفوذپذیری هدایت‌شده توسط هانتاویروس را مهار می‌کنند). تجزیه و تحلیل بافت شناسی نشان داد که کلیه Nlrc3 - / - موش مشاهده شدلوله های کلیویاتساع در 9 dpi، Nlrc3-/- موش با تغییرات پاتولوژیک شدیدتر از موش WT و در 12 نقطه در اینچ ادامه داشت. در موش های Nlrc3-/-، ادم سلول های اپیتلیال توبولار کلیوی و خونریزی بینابینی کلیوی قابل توجه در کلیه مشاهده شد. علاوه بر این، خونسازی خارج مدولاری برجسته در پالپ قرمز طحال در 6، 9، و 12 dpi، و اتساع مرکز ژرمینال و افزایش تعداد سلول های غول پیکر چند هسته ای در 12 dpi مشاهده شد. کبدها همچنین دژنراسیون شدید کبدی و نکروز پراکنده را در روزهای 3، 6، 9 و 12 dpi نشان دادند. التهاب ریه و ضخیم شدن دیواره آلوئول در dpi 6 مشاهده شد. این یافته نشان می دهد که عفونت HTNV تأثیر قابل توجه و طولانی مدتی بر کبد و کلیه در موش های Nlrc3-/- آلوده به HTNV داشته است. علاوه بر این، موش های Nlrc{17}}/- برجسته نشان دادندگشاد شدن توبول کلیه، خونریزی بینابینی و اختلال عملکرد کلیه پس از عفونت HTNV. سطح UA سرم به طور قابل توجهی در 3 dpi بالا بود، که نشانه واضحی از اختلال عملکرد کلیه است. غلظت پروتئین ادرار به طور قابل توجهی افزایش یافت و مقدار متوسط ​​نزدیک به 0.3 گرم در لیتر در dpi 3 در موش Nlrc{4}}/- آلوده بود. همان روند افزایش UA در موش WT مشاهده نشد. این نتایج نشان می‌دهد که مدل ما ویژگی‌های پاتولوژیک بیشتری عفونت HTNV انسانی را مرور می‌کند.

پروتئین N (NP) به وفور در سلول های آلوده به ویروس هانتا تولید می شود و می توان آن را در اوایل 4 ساعت پس از عفونت تشخیص داد (32). این ویژگی‌ها دلیل اصلی این است که چرا نقطه پایانی ELISA تشخیص پروتئین هانتاویروس N و سنجش‌های ایمونوفلورسانس برای ارزیابی تعداد ذرات ویروسی و پیشرفت عفونت ویروسی است. روش‌های مختلف ممکن است بر نتایج به‌دست‌آمده و نتایج حاصله تأثیر بگذارد. پروتئین ویروسی و ویرمی دو پارامتر مختلف عفونت ویروسی هستند و ممکن است همیشه به طور همزمان تغییر نکنند. نتایج کمی PCR زمان واقعی نشان داد که افزایش گذرا سطح NP در 6 dpi در طحال، جایی که ویروس ممکن است تحت یک تکثیر گذرا قرار گرفته باشد، و سپس پاکسازی آن پس از آن رخ داده است. همانطور که انتظار می رفت، تجمع پروتئین ویروسی پس از اوج ویرمی مشاهده شد که در dpi 3 ظاهر شد. در واقع، تکثیر ویروس در طحال و کلیه در سطح متوسط ​​در 9 و 12 dpi حفظ شد، همراه با سنتز پروتئین N (طحال در 9 dpi: موش WT: 192 ± 128 کپی در هر میلی گرم؛ موش Nlrc3-/-: 431 ± 431 dpi 229 کپی در هر میلی گرم؛ طحال در 12 نقطه در اینچ: موش WT: 160 ± 85 کپی در هر میلی گرم؛ موش Nlrc3-/-: 226 ± 118 کپی در هر میلی گرم). با این حال، مقدار HTNV NP در سطح پروتئین در روز 6 پی به حداکثر رسید و در طول 9 و 12 dpi بالا باقی می ماند. تفاوت در سینتیک نسخه های RNA ویروسی و مقدار پروتئین ممکن است منعکس کننده فروپاشی افتراقی آنها در اندام های مختلف باشد.

نقش سیتوکین ها معمولا در مدل های بیماری پیچیده تر است. در HFRS ناشی از PUUV، شدیدنارسایی کلیهو ترومبوسیتوپنی با سطوح بالای IL{0}} پلاسما همراه است (33). تجزیه و تحلیل ما نشان داد که عفونت HTNV منجر به افزایش تولید سیتوکین، از جمله CXCL-1، CCL-5، IL{4}}، IL-12، TNF-a و IFN-g در موش های Nlrc3-/-، اما در موش های WT نه به اندازه. شایان ذکر است که در 9 dpi، موش های Nlrc3-/- تغییرات پاتولوژیک قابل توجهی را در طحال و کلیه خود نشان دادند که در این زمان با یک پاسخ سیتوکین قوی همراه بود. این یافته ها نشان می دهد که سطح بالایی از سیتوکین ها ممکن است با پاتوژنز بیماری مرتبط باشد.

به طور خلاصه، نتایجی که در اینجا گزارش می کنیم نشان می دهد که پس از تلقیح با HTNV از طریق مسیر داخل صفاقی، موش های Nlrc3-/- دچار کاهش وزن، ترومبوسیتوپنی، rاختلال عملکرد مجرای دهان، و خونریزی.اینها بیشتر از هر مدل حیوانی منتشر شده قبلی به علائم بالینی HFRS شباهت دارند. این مدل می تواند برای ارزیابی واکسن ها و درمان های بالقوه و مطالعه عمیق پاتوژنز HFRS در داخل بدن مورد استفاده قرار گیرد.