تجزیه و تحلیل متابولومیک مبتنی بر NMR برای اثرات مکمل -کتوگلوتارات بر روی میوبلاست های C2C12 در کشورهای مختلف انرژی

برای دریافت مکمل های ضد پیری و رفع خستگی سیستانچ اینجا را کلیک کنید

1. معرفی

عضله اسکلتی بزرگترین عضو بدن انسان است و فعالیت های عادی زندگی را حفظ می کند.تمرین ورزشی طولانی مدتیا پاتولوژیکفرآیندهای بیماری ها باعث آسیب عضلانی می شودیاتامین ناکافی انرژی عضلانیدر این زمان، بازیابی قدرت و عملکرد عضلانی اهمیت ویژه ای دارد. مکمل های غذایی مختلفی برای ترویج هیپرتروفی عضلات اسکلتی و افزایش عملکرد ورزشی استفاده شده است [1]. به عنوان محل تلاقی متابولیسم کربن آلی و نیتروژن و به طور همزمان یک واسطه حیاتی در چرخه TCA، -Ketoglutarate (AKG) اثرات پلیوتروپیک را برای بهبود عملکرد عضلانی در آزمایش‌های بالینی و حیوانی نشان داده است [2-9]. به عنوان مثال، AKG می تواند آسیب مخاط روده را کاهش دهد [8] و التهاب [9] را کاهش دهد.توسعه سرطان کولورکتال[4] و فیبروز کبدی [5]، باعث رشد [6] و کاهش عوارض وبه تاخیر انداختن پیری[7]. کارهای قبلی نشان داده اند که مکمل AKG می تواند از دست دادن عضله را با تجویز تزریقی در مدل ترومایی بیماران تحت تعویض کامل لگن [2] کاهش دهد و هیپرتروفی عضلانی و سنتز پروتئین را از طریق مسیرهای سیگنالینگ Akt/mTOR تقویت کند [10،11]. در مورد دیستروفی عضلانی دوشن، مکمل AKG می تواند از آتروفی و ​​اختلال عملکرد عضلانی از طریق مسیر واسطه ای PHD3/ADRB جلوگیری کند [12]. کار قبلی ما همچنین نشان داد که مکمل AKG می تواند عمیقاً تکثیر میوبلاست های C2C12 را تسهیل کند و آتروفی میوتوب های C2C12 را که در یک محیط بدون گلوکز کشت شده اند را کاهش دهد [13]. با توجه به اینکه گلوکز منبع اصلی انرژی برای حفظ عملکردهای فیزیولوژیکی طبیعی عضلات اسکلتی است، اثرات مکمل AKG برای بهبود عملکرد عضلانی تا حد زیادی به سطح گلوکز در عضله اسکلتی بستگی دارد. تفاوت اثرات ناشی از AKG در عضله اسکلتی بین حالات مختلف انرژی نامشخص است.

AKG در سنتز اسیدهای آمینه، ویتامین ها واسیدهای آلیومتابولیسم انرژیدر بدن، که شامل تبدیل AKG به گلوتامات توسط گلوتامات دهیدروژناز، و آمیداسیون بعدی گلوتامات با آمونیاک توسط گلوتامین سنتتاز است. AKG انرژی رشد سلولی را از طریق چرخه TCA و فسفوریلاسیون اکسیداتیو فراهم می کند و متابولیسم سلولی و سیگنال دهی را با تعامل با گیرنده OXGR (گیرنده جفت شده با پروتئین G) روی غشای سلولی ارتقا می دهد [14،15]. علاوه بر این، AKG می‌تواند متابولیسم اکسیداتیو میتوکندریایی را تنظیم کند و با واسطه‌گری در انتقال اولیه حالت سلولی جنینی و رشد سلول‌های زاینده، حالت اپی ژنتیکی مجاز را ارتقا دهد [16]. علاوه بر این، AKG ناشی از ورزش می تواند گیرنده OXGR1 خود را در غدد فوق کلیوی برای کنترل گرمازایی و تجزیه تری گلیسیرید در بافت چربی تحریک کرده و اثرات مفیدی بر متابولیسم ایجاد کند [17].

با این حال، مطالعات کمی برای نشان دادن تغییرات متابولیکی ناشی از AKG در عضلات اسکلتی در حالت‌های مختلف انرژی و مکانیسم‌های متابولیک زیربنایی انجام شده است. اخیراً، تجزیه و تحلیل متابولومیک برای روشن شدن سیستماتیک مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی اثرات مفید مکمل‌های غذایی مورد استفاده قرار گرفته است. تغییرات متابولیت هایی که به عنوان محصولات پایین دست رونویسی ژن عمل می کنند ممکن است تغییرات کلی متابولیک را به طور مستقیم منعکس کند. به‌عنوان تکنیک‌های مخصوصاً مناسب برای تشخیص کمی تغییرات سطوح متابولیت‌ها در سیالات زیستی، بافت‌ها و سلول‌ها، طیف‌سنجی تشدید مغناطیسی هسته‌ای 1H (NMR) با وضوح بالا به طور گسترده در آنالیزهای متابولومیک استفاده شده است. به طور قابل توجهی، پروفایل متابولومیک مبتنی بر NMR دارای چندین مزیت مانند تکرارپذیری بالا، اندازه گیری کمی بدون تعصب، و آماده سازی نمونه راحت است [18،19]. پیش از این، ما آنالیزهای متابولومیک مبتنی بر NMR را برای روشن کردن اثرات مکمل کراتین بر میوبلاست‌های C2C12 [20] و اثرات مکمل آلانیل-گلوتامین بر میوبلاست‌های آسیب‌دیده در اثر محرومیت از انرژی [21] انجام دادیم.

2. نتایج

2.1. تکثیر و تمایز میوبلاست های C2C12 با مکمل AKG

سلول های میوبلاست C2C12 کشت شده در محیط رشد طبیعی با و بدون مکمل AKG به عنوان Nor-A و Nor گروه بندی شدند، در حالی که آنهایی که در محیط رشد کم گلوکز با یا بدون مکمل AKG به عنوان Low-A و Low گروه بندی شدند. مطابق با مطالعه قبلی [10]، سلول‌های Nor-A با مکمل AKG در غلظت 2 میلی‌متر، زنده‌مانی سلولی به‌طور قابل‌توجهی نسبت به سلول‌های نور افزایش یافته است (شکل S1).

بنابراین، غلظت AKG 2 میلی متر در آزمایش ها برای ارزیابی تغییرات ناشی از AKG در تکثیر و تمایز میوبلاست ها استفاده شد. در مقایسه با سلول‌های نور، سلول‌های Low به دلیل کمبود انرژی نرخ تکثیر عمیقی کاهش یافته‌اند (شکل 1A). حتی اگر مکمل AKG باعث مورفولوژی متفاوت قابل توجهی از میوبلاست ها در دو حالت انرژی نشد، اما نه تنها نرخ تکثیر سلول های Low را که در محیطی با گلوکز پایین کشت می شوند، افزایش داد، بلکه باعث افزایش نرخ تکثیر سلول های نور در یک محیط طبیعی مطابق با مطالعات قبلی [1{13}}،12]. تعداد سلول ها در هر ناحیه معین برای چهار گروه میوبلاست (n=4 برای گروه) شمارش شد: نه، 1 ± 563.80.4. Nor-A، 10.8 ± 624.0; کم، 14.5 ± 493.8; A پایین، 11.7 ± 547.0 (شکل 1B). شایان ذکر است که سلول‌های Low-A تعداد سلول‌های آماری متفاوتی را با سلول‌های نور نشان نمی‌دهند، که نشان می‌دهد مکمل AKG می‌تواند تعداد سلول‌ها را برای میوبلاست‌ها در شرایط کشت کم گلوکز بازیابی کند (شکل 1B).

شکل 1، توانایی های تکثیر و تمایز میوبلاست های C2C12 در شرایط کشت نرمال و کم. کشت گلوکز (الف) مورفولوژی میوبلاست. (B) شماره سلول مربوط به پانل A (n=4). (C) زنده ماندن سلولی نسبت به سلول‌های نور که با روش تکثیر سلولی MTS تجزیه و تحلیل شد (n=5). (د) عبارات MyoD1 در میوبلاست ها با وسترن بلات تجزیه و تحلیل شد. آنتی بادی ضد GAPDH برای استاندارد کردن مقدار پروتئین در هر خط استفاده شد. (E) تجزیه و تحلیل آماری مربوط به پانل های (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5،** p < 0.01، *** p <0.001، **** p <0.0001.

علاوه بر این، سنجش MTS برای مقایسه کمی میزان تکثیر چهار گروه سلولی انجام شد (شکل 1C). سلول‌های کم سرعت تکثیر مشخصی در مقایسه با سلول‌های Nor داشتند که نشان می‌دهد محیط کم گلوکز از تکثیر سلول‌ها مضر است. به طور قابل توجهی، مکمل AKG نرخ تکثیر سلول های Nor-A و Low-A را به ترتیب نسبت به سلول های Nor و Low افزایش داد. توجه داشته باشید که سلول‌های Low-A توانایی تکثیر کمتری نسبت به سلول‌های نور نشان دادند، به این معنی که مکمل AKG تنها تا حدی تکثیر سلول‌های کشت‌شده در محیط با گلوکز پایین را بازسازی کرد.

بیان پروتئین تمایز میوژنیک 1 (MyoD1) معمولاً برای مشخص کردن توانایی تمایز سلول ها استفاده می شود. بنابراین، ما به طور کمی بیان MyoD1 را بین چهار گروه سلول مقایسه کردیم (شکل 1D). سلول های کم توانایی تمایز عمیقاً کاهش یافته را در مقایسه با سلول های نور نشان دادند. به طور قابل توجهی، مکمل AKG توانایی تمایز سلول‌های کشت‌شده را هم در محیط طبیعی و هم در محیط با گلوکز پایین تنظیم می‌کند، همانطور که با افزایش حدود 30 درصدی بیان MyoD1 در سلول‌های Nor-A و Low-A نشان می‌دهد. شایان ذکر است، سلول‌های Low-A بیان MyoD1 را از نظر آماری متفاوت از سلول‌های Nor نشان نمی‌دهند، که دلالت بر کارایی بالای مکمل AKG برای بازیابی توانایی تمایز سلول‌های کشت‌شده در محیط کم گلوکز دارد.

علاوه بر این، ما توانایی های تمایز myotube را برای چهار گروه از میوبلاست های C2C12 تجزیه و تحلیل کردیم. میوتوب ها از طریق ادغام میوبلاست های کشت شده در محیط های تمایز طبیعی و کم گلوکز با یا بدون مکمل AKG تشکیل شدند. شکل S3). مورفولوژی میوتوب‌های C2C12 نشان داد که کشت کم گلوکز توانایی تمایز میوتوب سلول‌ها را مختل می‌کند و مکمل AKG می‌تواند تمایز میوتوبلاست‌هایی را که هم در یک محیط طبیعی و هم در محیط گلوکز ow-گلوکز کشت داده شده‌اند، افزایش دهد.

2.2. طیف NMR از عصاره های آبی مایوبلاست های C2C12

طیف‌های معمولی 850 مگاهرتز 1H NMR روی عصاره‌های آبی مشتق‌شده از گروه‌های Nor، Nor-A، Low و Low-A میوبلاست‌های C2C12 ثبت شد (شکل 2A). در مجموع 34 متابولیت اختصاص داده شد و در جدول S1 خلاصه شد. انتساب رزونانس متابولیت‌ها با استفاده از طیف‌های 2D 1H-13C HSOC و 1H-H TOCSY تأیید شد (شکل‌های S4 و S5). بازرسی بصری طیف های NMR نشان داد که کشت میوبلاست ها با مکمل AKG منجر به تجمع قابل توجهی از AKG درون سلولی در سلول های Nor-A و Low-A شد (شکل 2B).

شکل 2، طیف رزونانس مغناطیسی هسته ای متوسط ​​850 مگاهرتز lH (NMR) ثبت شده بر روی عصاره های آبی مشتق شده از گروه های Nor، Nor-A، Low و Low-A میوبلاست های C2C12. (الف) مقایسه میانگین طیف NMR چهار گروه. مقیاس های عمودی در تمام طیف های lH NMR ثابت نگه داشته شدند. منطقه آب (4.{7}}.2 ppm) حذف شد (B) مناطق تقویت شده محلی قله های a-Ketoglutarate (AKG). خط آبی/سبز/زرد/قرمز: مناطق طیفی از گروه های Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG، a-ketoglutarate; PC، O-phosphocholine. GPC، sn-glycero-3-phosphocholineUDP-glucose، Uridine diphosphate glucose: CTP، sn-glycero-3-phosphocholine. NAD پلاس، نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید AXP آدنین مونو/دی/تری فسفات.

2.3. تجزیه و تحلیل داده های چند متغیره برای بررسی پروفایل های متابولیک سلولی

ما بیشتر تجزیه و تحلیل داده‌های چند متغیره را روی داده‌های طیفی NMR برای پروفایل متابولیک چهار گروه از میوبلاست‌های C2C12 انجام دادیم. ما ابتدا سه مدل PCA بدون نظارت را با دو جزء اول (PC1، PC2) ایجاد کردیم تا روند گروه‌بندی را مرور کنیم و تفاوت‌های متابولیکی بین گروه‌های میوبلاست را آشکار کنیم. نمودارهای امتیاز ThePCA نشان می دهد که مشخصات متابولیکی سلول های کشت شده در محیط با گلوکز پایین به طور مشخص از سلول های کشت شده در محیط طبیعی متمایز می شود (شکل 3A) و مکمل AKC به طور قابل توجهی الگوهای متابولیک سلول های کشت شده را در یک محیط طبیعی و هم در محیط طبیعی و هم تغییر می دهد. در محیط با گلوکز پایین (شکل 3B,C). با این حال، تفاوت متابولیک بین گروه‌های Nor-A و Nor بزرگتر از بین گروه‌های Low-A و Low بود، که نشان می‌دهد اثرات مکمل‌سازی AKG بر پروفایل متابولیک میوبلاست‌ها تا حد زیادی به وضعیت انرژی سلول‌ها وابسته است.

شکل 3. آنالیزهای چند متغیره برای طیف های HNMR روی عصاره های آبی مشتق شده از میوبلاست های C2C12 گروه های Nor، Nor-A، Low و Low-A ثبت شد. (AC) PCA نمودارهای گروه‌های Low و Nor، گروه‌های Low-A و Low گروه‌های Nor-A و Nor را امتیاز می‌دهد. (DF) OPIS-DA نمودارهای گروه های Low و Nor (R2: 0.999، 02: 0.996)، گروه های Low-Aand Low (R2: 0.918: 02: 0.761)، گروه‌های Nor-A و Nor (R2: 0.927: 02: 0.838). بیضی ها حد اطمینان 95 درصد را نشان می دهند.

علاوه بر این، ما سه مدل OPLS-DA تحت نظارت را برای نشان دادن جداسازی متابولیک بین چهار گروه میوبلاست ایجاد کردیم (شکل 3D-F). همانطور که انتظار می‌رفت، مدل‌های OPLSDA با ذخیره اطلاعات متغیر متعامد همبسته و فیلتر کردن اطلاعات متغیر متعامد غیرهمبسته، تمایزات متابولیک بین چهار گروه را به حداکثر رساندند. علاوه بر این، ما آزمایش‌های جایگشت تصادفی (n=200) را برای ارزیابی قابلیت اطمینان مدل‌های OPLS-DA (شکل S6) انجام دادیم، که اعتبار مدل‌های OPLS-DA ایجاد شده را نشان می‌دهد.

2.4. شناسایی متابولیت های متمایز و مهم

برای مقایسه کمی سطوح متابولیت ها بین چهار گروه از میوبلاست های C2C12، ما سطوح نسبی متابولیت های شناسایی شده را بر اساس انتگرال های نسبی آنها محاسبه کردیم (جدول S2). مکمل AKG به طور چشمگیری سطوح AKG داخل سلولی را در گروه های Nor-A و Low-A افزایش داد اما در گروه Nor و Low به طور قابل توجهی تغییری نکرد. ما آزمون t Student را برای شناسایی متابولیت های افتراقی با معیار p <0.05 انجام دادیم (شکل 4). مقایسه 29 متابولیت دیفرانسیل شناسایی Nor در مقابل Low (شکل 4A)، از جمله 18 متابولیت تقویت شده (لوسین، ایزولوسین، والین، استات، گلوتامات، گلوتامین، متیونین، آسپارتات، لیزین، کراتین، PC (O-phosphocholine)روزین، ، فنیل آلانین، هیستیدین، NAD پلاس، فرمت، AXP) و 11 متابو را کاهش دادند. لایت ها (گلوتاتیون، پیروگلوتامات، فسفوکراتین، بتا آلانین، GPC، گلوکز، گلیسین، استات، ترئونین، GTP، UDP-گلوکز). مقایسه متابولیت های دیفرانسیل Low-A در مقابل کم شناسایی شده (شکل 4B)، شامل 7 متابولیت افزایش یافته (اتانول، AKGbeta-آلانین، PC، تورین، گلیسین و GTP) و 3 متابولیت کاهش یافته (گلوتامین، لیزین و میوینوزیتول). مقایسه Nor-A در مقابل Nor شناسایی 18 متابولیت متمایز (شکل 4C)، شامل 6 متابولیت با تنظیم بالا (AKG، پیروگلوتامات، گلوتامین، لیزین، گلوکز، لاکتات)، و 12 متابولیت با تنظیم پایین (آلانین، استات، گلوتاتیون). متیونین، فسفوکراتین، PC، میئوینوزیتول، گلیسین، ترئونین، GTP، UDP-گلوکز و AXP).

شکل 4. شدت نسبی متابولیت های دیفرانسیل از مقایسه های زوجی بین چهار گروه از میوبلاست های C2C12 شناسایی شد. (الف) کم در مقابل نه. (ب) کم A در مقابل کم; (C) Nor-A در مقابل Nor. * p < 0.05، ** p < 0.01، *** p <0.001، **** p <0.0001.n { {13}} برای هر گروه.

علاوه بر این، ما از مدل‌های OPLS-DA برای شناسایی متابولیت‌های مهم با معیار VIP> 1 استفاده کردیم (شکل 5). در مجموع، 12، 10، و 10 متابولیت مهم از مدل های OPLS-DA Nor-A در مقابل Nor، Nor در مقابل Low، Low-A در مقابل Low شناسایی شدند.

شکل 5. نمرات VIP متابولیت های مهم از مقایسه های زوجی بین چهار گروه از C2C12myoblasts شناسایی شد. (الف) کم در مقابل نه. (ب) کم A در مقابل کم; (C) Nor-A در مقابل Nor. فونت قرمز/آبی نشان دهنده افزایش/کاهش سطح متابولیت است.

ترکیب متابولیت‌های مهم شناسایی‌شده و متابولیت‌های متفاوت متابولیت‌های مشخصه‌ای را به دست می‌دهد (جدول 1). مقایسه زوجی Low در مقابل Nor، Low-A در مقابل Low، و Nor-A در مقابل Nor به ترتیب 10، 6 و 10 متابولیت مشخصه را شناسایی کرد، که نشان می دهد اثرات مکمل AKG بر میوبلاست ها ارتباط نزدیکی با انرژی دارد. وضعیت سلول ها

2.5. شناسایی متابولیک به طور قابل توجهی تغییر یافته است

مسیرها ما تجزیه و تحلیل مسیر متابولیک را برای شناسایی مسیرهای متابولیکی تغییر یافته قابل توجه (مسیرهای مهم) بر اساس سطوح متابولیت های شناسایی شده از مقایسه های زوجی بین چهار گروه از میوبلاست های C1C12 انجام دادیم (شکل S7؛ جدول 2 و جدول S3). تجزیه و تحلیل Nor در مقابل Low 11 مسیر مهم را شناسایی کرد: (1) متابولیسم آلانین، آسپارتات و گلوتامات. (2) متابولیسم گلیسین، سرین و ترئونین. (3) متابولیسم گلوتاتیون. (4) متابولیسم D-گلوتامین و D-گلوتامات. (5) متابولیسم نشاسته و ساکارز. (6) متابولیسم بتا آلانین. (7) متابولیسم تورین و هیپوتورین. (8) متابولیسم فنیل آلانین. (9) بیوسنتز فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان. (10) متابولیسم نیکوتینات و نیکوتین آمید. (11) متابولیسم هیستیدین. این مسیر مهم با متابولیسم انرژی، استرس اکسیداتیو، و چرخه آناپلروتیک چرخه TCA همراه بود.

تجزیه و تحلیل Nor-A در مقابل نه تنها پنج مسیر مهم اول 1-5 را به استثنای شش مسیر دیگر 6-11 شناسایی کرد. به طور متفاوت، تجزیه و تحلیل Low-A در مقابل Low تنها شش مسیر مهم را شناسایی کرد: چهار مسیر اول 1-4 با مقایسه Low-A در مقابل Nor، Nor-A در مقابل Nor به اشتراک گذاشته شد. دو مسیر 6-7 به اشتراک گذاشته شده توسط مقایسه کم در مقابل نور. توجه داشته باشید که مکمل AKG به طور قابل توجهی مسیر 5 (متابولیسم نشاسته و ساکارز) را در سلول های کشت شده در محیطی با گلوکز پایین تغییر نداد، اما با دو مسیر دیگر (متابولیسم بتا آلانین و متابولیسم تورین و هیپوتورین) تداخل داشت. برای تجسم تغییرات ناشی از AKG در متابولیت های مشخصه، ما این متابولیت ها را بر روی یک نقشه متابولیک بر اساس پایگاه داده کیوتو دایره المعارف ژن ها و ژنوم ها (KEGG) پیش بینی کردیم (شکل 6). KEGG به طور گسترده به عنوان یکی از منابع داده اصلی برای بازسازی شبکه های متابولیک و برجسته کردن مسیرهای متابولیکی مهم استفاده شده است. هم متابولیت های مشخصه تغییر یافته و هم مسیرهای متابولیکی تغییر یافته به طور قابل توجهی بینش جدیدی را در مورد مکانیسم های مولکولی نهفته در تأثیرات مکمل AKG بر میوبلاست های C2C12 ارائه می دهند.