مطالعه تطبیقی ​​خواص و مکانیسم ضد پیری: رسوراترول و محدودیت کالری Ⅱ

اثر رسوراترول و CR بر بیان mRNA SIRT1، p53، و Foxo3a در بافت موش های صحرایی پیر

شرایط استرس اکسیداتیواغلب بیان و فعالیت SIRT1 را القا می کنند. SIRT1 عملکرد عوامل کلیدی بقا از جمله p53 و Foxo3a را تعدیل می کند [9]. برای تعیین اثر رسوراترول و CR بر روی سطوح mRNA SIRT1، p53، و Foxo3a در موش‌های پیری ناشی از D-Gal، سنجش‌های کمی RT-PCR انجام شد. در مقایسه با گروه کنترل منفی متناظر، سطوح بیان mRNA SIRT1 و Foxo3a به طور قابل توجهی کاهش یافت، اما سطح p53 در گروه D-Gal به طور قابل توجهی افزایش یافت (P < 0).01؛ شکل 9A و 9B). علاوه بر این، درمان همزمان رسوراترول یا CR با D-gal در موش‌ها باعث افزایش سطح بیان mRNA SIRT1 و Foxo3a شد اما سطح p53 را در مقایسه با گروه کنترل مدل کاهش داد (P <{29}}.05). با این حال، در مقایسه با درمان CR، سطح بیان mRNA SIRT1 در کبد با دوز بالای رسوراترول به اضافه گروه D-gal به طور قابل توجهی افزایش یافت، سطح بیان mRNA p53 به طور قابل توجهی در کبد و مغز با دوز بالای رسوراترول به اضافه D- کاهش یافت. گروه گال (P <0.05).

برای دریافت مکمل های ضد پیری سیستانچ اینجا را کلیک کنید

اثر رسوراترول و CR بر بیان پروتئین اصلی مرتبط با SIRT1- در بافت مغز موش‌های پیر

FOXO3a و p53 که توسط SIRT1 تنظیم می شوند، مولکول های پایین دست SIRT1 هستند. به طور همزمان، فعالیت SIRT1 توسط مولکول های بالادست آن تنظیم می شود، به عنوان مثال، DBC1 (همچنین به عنوان KIAA1967 شناخته می شود)، AROS (همچنین به عنوان RPS19BP1 شناخته می شود) و سرکوب کننده تومور HuR (همچنین به عنوان ELAVL1 شناخته می شود) [9، 1{21}}] . برای تعیین اثر رسوراترول و CR بر روی سطوح پروتئین p53، FOXO3a، HuR، AROS، و DBC1 در موش‌های پیری ناشی از D-Gal، سنجش وسترن بلات انجام شد. در مقایسه با گروه کنترل منفی متناظر، سطوح بیان پروتئین FOXO3a، AROS و HuR به طور معنی‌داری کاهش یافت، اما سطوح p53 و DBC1 در گروه D-gal به‌طور معنی‌داری افزایش یافت (P <{28}}).{32}}1. ؛ شکل 10). علاوه بر این، درمان همزمان رسوراترول یا CR با D-gal در موش‌ها باعث افزایش بیان پروتئین‌های FOXO3a، AROS و HuR شد اما سطوح p53 و DBC1 را در مقایسه با گروه کنترل مدل کاهش داد (05/0 > P). با این حال، در مقایسه با درمان CR، سطح بیان پروتئین HuR به طور قابل توجهی افزایش یافت، اما سطح DBC1 به طور قابل توجهی در مغزهای دارای دوز بالای رسوراترول به همراه گروه D-gal کاهش یافت (05/0 > P). هیچ تفاوتی بین گروه رسوراترول به علاوه D-gal و گروه CR به علاوه D-gal در سطوح بیان پروتئین p53، FOXO3a و AROS وجود نداشت (05/0 > P).

بیان FOXO3a و p53 در بافت مغز و کبد

وضعیت بیان FOXO3a و p53 در بافت مغز و کبد با روش ایمونوهیستوشیمی تعیین شد. تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمیایی FOXO3a و p53 نشان داد که بیان FOXO3a در بافت‌های مغز و کبد به‌طور معنی‌داری کاهش یافته و بیان p53 در گروه D-Gal نسبت به گروه کنترل منفی به‌طور معنی‌داری افزایش یافته است (P <0).{13} }5، شکل 11). علاوه بر این، درمان همزمان رسوراترول یا CR با D-gal در موش‌های صحرایی باعث افزایش بیان FOXO3a شد اما بیان p53 را در مقایسه با گروه کنترل مدل کاهش داد (P <{19}}.05). با این حال، هیچ تفاوتی بین گروه رسوراترول به علاوه D-gal و گروه CR به علاوه D-gal در عبارات p53 و FOXO3a وجود نداشت (05/0 > P).

بحث

فرآیند شیمیایی اساسی زیربنای پیری برای اولین بار توسط سازمان توسعه یافتنظریه رادیکال های آزاد پیری[11]، واسترس اکسیداتیواعتقاد بر این است که عامل اصلی در روند طبیعی پیری است.آغازگر رادیکال آزاد AAPHاستفاده شدهایجاد استرس اکسیداتیوو ایجاد یک مدل اکسیداتیوپیری سلولی ناشی از استرسدر سلول‌های IMR{0}} انسان [12، 13]. از مزایای این روش این است که AAPH به صورت حرارتی تجزیه می شودتولید رادیکالبدون تبدیل زیستی یا آنزیم، و نرخنسل رادیکالمی توان به راحتی با تنظیم غلظت آغازگر [12] کنترل کرد. AAPH پیدا شداز تکثیر انسان جلوگیری می کندسلول های IMR{0}} به روشی وابسته به غلظت و زمان. نتایج نشان داد که انکوباسیون 2 روزه با AAPH (1 میلی‌مولار) به طور قابل‌توجهی درصد نسبت SA -Gal مثبت، جمعیت سلول‌های آپوپتوز را افزایش داد، بیان mRNA SIRT1 را کاهش داد و باعث ایجاد مورفولوژی بزرگ و مسطح شد. اینها نشان دادند که استرس اکسیداتیو ناشی از AAPH سلولهای IMR{6}} را به سمت پیری سوق داد. بر اساس این مدل پیری سلولی، درمان 10 میکرومولار رسوراترول به طور موثرتری پیری و آپوپتوز ناشی از AAPH را نسبت به درمان CR مهار کرد.

مدل حیوانی D-gal یک مدل حیوانی سالخورده شناخته شده بین المللی است و به طور گسترده در زمینه استفاده شده استداروهای ضد پیری. D-gal یک ماده مغذی فیزیولوژیکی است که به طور معمول توسط D-galactokinase و گالاکتوز{2}}فسفات در حیوانات متابولیزه می شود. با این حال، عرضه بیش از حد D-gal، که توسط آنزیم های فوق متابولیزه نمی شود، اما در سلول ها تجمع می یابد، منجر به استرس اکسیداتیو و آسیب سلولی می شود [14]. بنابراین، تجویز طولانی‌مدت D-gal باعث ایجاد تغییراتی می‌شود که شبیه پیری طبیعی در حیوانات است، مانند کوتاه شدن طول عمر، اختلال عملکرد شناختی، تخریب عصبی، استرس اکسیداتیو، کاهش پاسخ‌های ایمنی، و تشکیل محصول نهایی گلیکاسیون پیشرفته (AGE) [15]. مطالعه حاضر نشان‌دهنده استقرار موفقیت‌آمیز مدل پیری تقلیدی است که با اختلال یادگیری و حافظه قابل‌توجه، تولید MDA، تجمع لیپوفوسین، کاهش T-AOC و SOD، و کاهش فعالیت تلومراز در مغز مشهود است. در همین حال، تیمارهای رسوراترول یا CR با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی، کاهش سطح محصولات پراکسیداسیون لیپیدی و حفظ تعادل سیستم‌های اکسیداتیو و آنتی‌اکسیداتیو، از موش‌های ناشی از D-gal در برابر استرس اکسیداتیو محافظت کردند. در آزمایش‌های رفتاری و فعالیت تلومراز، درمان رسوراترول یا CR می‌تواند اختلال شناختی و فعالیت تلومراز ناشی از D-gal را معکوس کند. علاوه بر این، موش‌های مدل پیر تحت درمان با دوزهای بالای رسوراترول، نسبت به موش‌هایی که با CR درمان شده بودند، تأثیر نسبتاً معنی‌داری بر رفتار نشان دادند.

شکل 11: آنالیز ایمونوهیستوشیمی بیان p53 (A, B) و FOXO3a (C, D) در بافت‌های کبد (A, C) و مغز (B, D) موش‌های پیر. بزرگنمایی 20× بود. NG، گروه کنترل منفی. MG، گروه کنترل مدل. RESL، دوز کم گروه رسوراترول؛ RESH، دوز بالای گروه رسوراترول؛ CR، گروه محدودیت کالری

مطالعات نشان داده اند که CR، کاهش 10 تا 40 درصدی در مصرف یک رژیم غذایی مغذی، می تواندتاخیر در پیری و افزایش طول عمربنابراین یکی از سطوح رایج CR (کاهش 40 درصدی در دریافت غذا) در موش های گروه CR در مطالعه حاضر اعمال شد. با این وجود، برخی تحقیقات نشان داد که هیچ اثر مفیدی از CR بر طول عمر در پستانداران سالخورده طبیعی وجود ندارد [16]. به طور مشابه، اگرچه نشان داده شد که درمان با رزوراترول اثرات شبه CR را القا می کندمتابولیسم انرژیو مشخصات متابولیک در انسان‌های چاق [17]، عملکرد متابولیک را در زنان غیر چاق با تحمل گلوکز طبیعی بهبود بخشید [18]. دلیل تفاوت بین این مطالعات مشخص نیست، اما ممکن است این باشد که CR و رسوراترول برای بازگرداندن هموستاز در افراد متابولیکی به خطر افتاده، و کمتر در افراد سالم، کار می کنند، که این احتمال با عملکردهای شناخته شده SIRT1 در مطالعات حیوانی سازگار است [19]. بنابراین، مدل‌های موش پیری ناشی از D-gal برای مقایسه فعالیت‌های ضد پیری رسوراترول یا CR به جای مدل موش‌های مسن طبیعی استفاده شد.

SIRT1، یک دی استیلاز وابسته به (NAD به علاوه)، به دلیل نقش های متعدد آن در افزایش طول عمر، مقاومت در برابر استرس و کاهش آپوپتوز توجه زیادی را به خود جلب کرده است [20، 21]. مطالعات انباشته به شدت حاکی از آن است که SIRT1 یک هدف کلیدی رزوراترول و CR است [22]. تعداد زیادی مولکول پایین دستی SIRT1 از جمله p53، Foxo1، Foxo3، Foxo4 و E2F1 وجود دارد که توسط SIRT1 تنظیم می‌شوند. به طور همزمان، فعالیت SIRT1 توسط مولکول های بالادست آن، به عنوان مثال، p53، HIC1، E2F1، DBC1، HuR و AROS تنظیم می شود. خروج حاد مواد مغذی یک برنامه رونویسی را در پروموتر SIRT1 فعال می کند که توسط فاکتورهای رونویسی Foxo3a و p53 هدایت می شود. از آنجایی که p53 بیان ژن SIRT1 را سرکوب می کند، حذف آن توسط Foxo3a رونویسی SIRT1 را فعال می کند [23]. DBC1 و AROS اخیراً به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های مستقیم منفی و مثبت فعالیت SIRT1 توصیف شدند، HuR اثر کاهش سطح بیان SIRT1 را در سلول‌های پیر نشان می‌دهد [9، 10].

CRپیری را به تاخیر می اندازد و طول عمر متوسط ​​و حداکثر را افزایش می دهددر گونه های مختلف از جمله موش، موش، ماهی، مگس، کرم و مخمر. با این حال، چنین برنامه های غذایی سختگیرانه ای در افراد آزاد، مسائل اخلاقی و روش شناختی را مطرح کرده است [24]. در حال حاضر، افزایش طول عمر ممکن است مهمتر از افزایش طول عمر باشد. بررسی‌های اخیر نشان می‌دهد که رسوراترول یکی از قوی‌ترین محرک‌های فعالیت SIR2 در میان تمام پلی‌فنل‌های گیاهی است [25] و از طریق مکانیسم‌های مشابهی که در محدودیت کالری دیده می‌شود، بر طول عمر تأثیر می‌گذارد. این نتایج نشان داد که CR و رسوراترول فعالیت های مشابهی در بازیابی سطوح بیان mRNA SIRT1، افزایش بیان پروتئین FOXO3a، AROS و HuR و کاهش سطوح p53 و DBC1 داشتند. در همین حال، چندین خط شواهد قانع کننده نشان دهنده اثرات مفید رسوراترول بر سیستم عصبی، کبدی و قلبی عروقی است.

مواد و روش ها

کشت سلولی، استرس و درمان

سویه فیبروبلاست دیپلوئید انسانی IMR-90 از ATCC تهیه شد. سلول ها در محیط حداقل ضروری (MEM) (Gibco، UK) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco) در دمای 37 درجه در 5 درصد CO2 رشد کردند. پس از رسیدن به تلاقی، سلول ها در 6-صفحه های کشت چاه کاشته شدند. یک روز بعد، سلول‌ها به مدت 48 ساعت با 1 میلی‌مولار 2،2'-آزوبیس (2-آمیدینوپروپان) دی هیدروکلراید (AAPH) (سیگما، ایالات متحده آمریکا) رقیق‌شده در MEM به اضافه 10 درصد FBS تیمار شدند. انکوباسیون 48 ساعته با آغازگر رادیکال آزاد AAPH مدلی از پیری سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو را ایجاد می کند [12، 13]. سلول های کنترل تنها در محیط کشت انکوبه شدند. پس از تیمار AAPH، IMR{17}} با سالین بافر فسفات سرد (PBS) pH 7.4 شسته شد و با محیط کشت تازه یا محیط کشت حاوی رسوراترول (گروه رسوراترول) یا MEM مکمل با 3 درصد FBS (گروه CR) برای مدت زمان انکوبه شد. 48 ساعت قبل از برداشت

فعالیت رنگ آمیزی SA-gal

ظاهر بیومارکرهای پیری (کاهش پتانسیل تکثیر و افزایش رنگ آمیزی SA-gal) [26] از روز بعد از درمان بررسی شد. سپس سلول ها با توجه به دستورالعمل سازنده کیت رنگ آمیزی SA-gal (CST، ایالات متحده آمریکا) رنگ آمیزی شدند. پس از رنگ آمیزی، حداقل 300 سلول در چندین میدان مورد بررسی قرار گرفت و سلول های SA-gal مثبت شمارش شد. این آزمایش ها سه بار تکرار شد و نتایج به عنوان مقادیر میانگین با انحراف معیار (SD) ارائه شد. برای جلوگیری از رنگ‌آمیزی غیراختصاصی احتمالاً به دلیل تلاقی سلولی، رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی SA-gal با سلول‌های subconfluent انجام شد.

تجزیه و تحلیل میکروسکوپ الکترونی روبشی

سلول‌ها بر روی ورقه‌های پوششی در 6-صفحه‌های کشت چاهی همانطور که در بالا توضیح داده شد، رشد کردند. پس از تیمار رسوراترول و CR، ورقه‌های پوششی از پلیت‌ها برداشته شد، سپس سلول‌ها در گلوتارآلدئید بافر فسفات 2.5 درصد تثبیت شدند و پس از تثبیت در 1 درصد تتروکسید اسمیم بافر شدند. نمونه های ثابت پس از کم آبی از طریق یک سری درجه بندی اتانول در الکل تی بوتیل غوطه ور شدند. نمونه‌ها از الکل تی بوتیل به صورت انجمادی خشک شدند، سپس با استفاده از پوشش‌دهنده خودکار (JFC{10}}, JEOC, Japan) با طلا پوشش داده شدند و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (JEOL, JSM{11}) مورد بررسی قرار گرفتند. }LV، ژاپن).

تجزیه و تحلیل آپوپتوز

پس از انکوباسیون رسوراترول یا CR، تمام سلول‌ها با تریپسین برداشت شدند و دو بار با PBS شسته شدند و سپس در بافر اتصال 400 میکرولیتری Annexin V مجدداً معلق شدند. سپس سلول ها به دنبال دستورالعمل سازنده کیت تشخیص آپوپتوز سلول Annexin V-FITC (BestBio، چین) رنگ آمیزی شدند. فلوسیتومتر FACSCalibur (Becton-Dickinson، San Jose، CA) برای تشخیص فلورسانس استفاده شد و درصد سلول های آپوپتوز توسط سیستم نرم افزار داخلی FACSCalibur محاسبه شد. تقریباً 104 سلول برای هر دنباله آنالیز شد.

رویه های حیوانی

موش‌های صحرایی نر نژاد ویستار، با وزن تقریبی 10 ± 200 گرم، از مرکز حیوانات تجربی کالج پزشکی Tongji، دانشگاه علم و فناوری Huazhong (SCXK 2010-0009) به دست آمدند. حیوانات به مدت 2 هفته قبل از دوز در مرکز حیوانات آزمایشی دانشگاه پزشکی چینی هوبی سازگار شدند و در این مدت آنها به طور آزاد به غذا و آب دسترسی آزاد داشتند. پس از سازگاری، 50 سر موش صحرایی انتخاب و به پنج گروه ده تایی تقسیم شدند. حیوانات طبق دستورالعمل ها و پروتکل های ملی تایید شده توسط کمیته اخلاقی حیوانات سازمانی (IAEC) نگهداری می شدند.

موش‌های گروه I (گروه کنترل منفی) وسیله نقلیه را به تنهایی (1 میلی‌لیتر/کیلوگرم وزن بدن معادل 9/9 درصد سالین) به مدت 6 هفته دریافت کردند. موش‌های گروه دوم (گروه کنترل مدل) D-gal (200 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، سیگما کمیکال، سنت لوئیس، MO) را به مدت 6 هفته دریافت کردند. موش‌های گروه III (گروه با دوز کم رسوراترول) D-gal و رسوراترول (50 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن) را به مدت 6 هفته در 5 درصد دی متیل سولفوکسید (DMSO) دریافت کردند. گروه IV (گروه با دوز بالای رسوراترول) D-gal و رسوراترول (100 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) را دریافت کردند. موش های گروه V (گروه CR) به مدت 6 هفته D-gal و CR (تغذیه با رژیمی که 40 درصد کالری کمتری نسبت به موش هایی که به طور آزاد تغذیه می کردند [27]) دریافت کردند. D-gal به صورت داخل صفاقی داده شد، در حالی که رسوراترول به صورت خوراکی برای کل مدت آزمایش داده شد. موش‌ها در آخرین روز درمان قربانی شدند، سپس خون، سرم و اندام‌ها بلافاصله برای سنجش زیستی جمع‌آوری شدند یا در دمای 80- درجه برای استفاده بعدی نگهداری شدند.

تست های رفتاری

آزمایش ماز آبی موریس برای ارزیابی ظرفیت یادگیری و حافظه فضایی موش‌ها پس از 6 هفته پس از آسیب طراحی شد [28]. آزمایش ماز آبی موریس شامل 4-آموزش یادگیری و حافظه روزانه و یک آزمایش کاوشگر در روز 5 بود. حیوانات در یک استخر دایره‌ای (قطر 155 سانتی‌متر) با نشانه‌های بصری آموزش داده شدند. یک سکوی فرار (قطر 9.{7}} سانتی متر) به عمق 1.{9}} سانتی متر زیر سطح آب استخر فرو رفت که در دمای 2 ± 25 درجه حفظ شد. مکان سکو در طول دوره آموزشی یک روزه 4-در مرکز ربع شمال غربی باقی ماند. در هر روز، موش‌ها برای یک بلوک صبح و یک بلوک بعد از ظهر آموزش داده شدند. موش آزادانه شنا کرد تا اینکه در عرض 120 ثانیه سکو را پیدا کرد. در صورت عدم موفقیت، به مدت 10 ثانیه روی سکو قرار می گیرد. تأخیر فرار (یافتن سکوی فرار غوطه‌ور) و سرعت شنا ثبت شد. آزمایش کاوشگر با برداشتن سکو و اجازه دادن به هر موش برای شنا آزادانه به مدت 120 ثانیه در داخل استخر انجام شد. تعداد عبور از سکو در ربع آموزش دیده (جایی که سکو برداشته شد) با یک سیستم ویدئویی کامپیوتری ثبت شد. نسخه پلت فرم قابل مشاهده ماز آبی پس از مشاهده تفاوت معنی داری در سرعت شنا بین موش های تحت درمان با D-gal و وسیله نقلیه انجام نشد.

تشخیص شاخص های بیولوژیکی مرتبط با استرس اکسیداتیو

سطوح MDA، SOD و T-AOC در خون و بافت ها به روش فتومتریک مطابق با پروتکل سازنده با استفاده از کیت های سنجش آنزیمی موجود تجاری (موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ، شهر نانجینگ، PR چین) تعیین شد. تمام آزمایشات شرح داده شده در این بخش در سه تکرار برای به دست آوردن میانگین و SD انجام شد.

سطح لیپوفوسین با روش سوهال [29] تعیین شد. به طور خلاصه، 200 میلی‌گرم قشر مغز را وزن کردیم، 2 میلی‌لیتر عصاره کلروفرم متانولی (2:1) اضافه کردیم، همگن و صاف کردیم، سپس باقیمانده را با عصاره شستیم، فیلترها را ترکیب کردیم، عصاره را به 5 اضافه کردیم. میلی لیتر و شدت فلورسانس را روی یک طیف سنج فلورسانس اندازه گیری کرد. طول موج انتشار 435 نانومتر و طول موج تحریک 365 نانومتر بود. اسپکتروفلوئورومتر برای ایجاد انحراف 50 در طول موج های فوق با محلول 1 ug/ml از بی سولفات کینین در 0.1 M H2 SO4 استاندارد شد. نتایج به عنوان واحدهای فلورسنت نسبی / میلی لیتر کلروفرم / گرم وزن بافت مرطوب بیان شد.

تشخیص فعالیت TE

برای استخراج تلومراز تقریباً 3{3}} میلی‌گرم از بافت دو بار در PBS سرد یخ شسته شد و در نهایت در حدود 150 میلی‌لیتر PBS همگن شد. فعالیت TE با استفاده از کیت های TE ELISA مطابق دستورالعمل سازنده (نانجینگ سن بیجیا شرکت فناوری بیولوژیکی، آموزشی ویبولیتین، نانجینگ، چین) اندازه گیری شد. حدود حساسیت سنجش برای TE 0.8 IU/L بود.

تجزیه و تحلیل RT-PCR

سطوح بیان mRNA SIRT1، Foxo3 و p53 در بافت‌های کبد و مغز با استفاده از آنالیز RT PCR مورد بررسی قرار گرفت. RNA کل با استفاده از Trizol استخراج شد و کمیت و خلوص آنها توسط یک میکروسپکتروفتومتر اولترا (Thermo Fisher Scientific, USA) بر اساس اندازه گیری جذب در 260 و 280 نانومتر ارزیابی شد. پس از تعیین کمیت، cDNA با استفاده از کیت FastQuant RT (Tiangen Biotech، پکن، چین) مطابق دستورالعمل سازنده سنتز شد. سطوح بیان mRNA ژن SIRT1، Foxo3، p53 توسط RT-PCR با استفاده از TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech، پکن، چین) با پرایمرهای خاص اندازه گیری شد (جدول 2). PCR کمی با زمان واقعی با یک سیستم PCR 480 درجه LightCycler (روش، بازل، سوئیس) با استفاده از 20 میکرولیتر به عنوان حجم کل هر واکنش انجام شد. تقویت PCR با 15 دقیقه دناتوراسیون در دمای 95 درجه آغاز شد و سپس 40 سیکل 95 درجه برای 10 ثانیه، 59-63 درجه (دمای بازپخت) برای 20 ثانیه و 72 درجه برای 30 ثانیه و انکوباسیون نهایی در 72 ثانیه دنبال شد. درجه به مدت 5 دقیقه تعداد آستانه چرخه به‌دست‌آمده از هر ژن (مقدار Ct) با توجه به معادله 2-∆∆CT [30] در برابر تغییرات نسبی نرمال‌سازی شد.

جدول 2: فهرست آغازگر

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سطح بیان پروتئین p53، FOXO3a، HuR، RPS19BP1، و DBC1 در بافت‌های مغز با استفاده از آنالیز وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پروتئین کل بافت های مغز با استفاده از بافر RIPA Lysis (Beyotime، چین) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. غلظت پروتئین با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (بیوتیم، چین) تعیین شد. 5 میلی‌گرم پروتئین با استفاده از ژل‌های 12 درصدی SDS-پلی‌آکریل‌آمید جدا شد و روی غشای PVDF (45/0 میکرومتر {{8}، میلی‌پور، ایالات متحده آمریکا) منتقل شد. لکه ها با 5 درصد شیر بدون چربی در TBS مسدود شدند، سپس یک شبه در 4 درجه با رقت مناسب آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند: anti-p53 (SC{14}}، Santa Cruz Biotechnology)، anti-FOXO3a (#12829, Cell). فناوری سیگنالینگ)، ضد HuR (#12582، فناوری سیگنال‌دهی سلولی)، ضد AROS (Ab201091، abcam)، ضد DBC1 (#5857، فناوری سیگنال‌دهی سلولی)، عملکرد ضد{25}} (AC004، فناوری ABclonal) . پس از شستشوی غشاها برای حذف آنتی بادی های اولیه اضافی، غشاها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی های ثانویه مناسب در رقت 1:{29}}:5000 (AC004 یا AS003، ABclonal Technology) انکوبه شدند. غشاها 3 بار شسته و سپس با استفاده از بستر وسترن بلاتینگ Pierce ECL (Thermo Scientific) مشاهده شدند. -اقدام به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.

ایمونوهیستوشیمی

نمونه های بافت در فرمالین 10 درصد بافر خنثی ظرف 1 ساعت پس از برداشتن جراحی تثبیت و با استفاده از روش های استاندارد در پارافین جاسازی شدند. سپس نمونه‌های تعبیه‌شده در پارافین ثابت به بخش‌هایی به ضخامت 5- میکرومتر برش داده شدند که در زایلن پارافین‌زدایی شدند، در اتانول هیدراته شدند و برای بازیابی آنتی‌ژن تحت درمان با مایکروویو قرار گرفتند. آنتی بادی اولیه رقیق شده مناسب، anti-p53 (SC{9}}، بیوتکنولوژی سانتا کروز) و ضد FOXO3a (#12829، فناوری سیگنالینگ سلولی)، به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق در یک محفظه رطوبت انکوبه شدند. اسلایدها سپس در PBS شسته شدند و متعاقبا با آنتی بادی ثانویه علیه آنتی بادی ضد خرگوش و تجسم HRP (غلظت 1:300، #{17}}، KPL) انکوبه شدند. سپس لام ها شسته شدند و مقاطع در محلول آنزیم سوبسترا دی آمینو بنزیدین (DAB، Sigma) توسعه یافتند. تصاویری از مقاطع رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی توسط میکروسکوپ دیجیتال Olympus (IX{19}}P1F، Olympus، ژاپن) گرفته شد.

تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار برای حداقل سه آزمایش مستقل بیان شد و با استفاده از نرم افزار SPSS 18 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تفاوت‌های گروهی در تاخیر فرار و سرعت شنا در تمرین ماز آبی موریس با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه (ANOVA) با اندازه‌گیری‌های مکرر، که عوامل درمان و روز تمرین بودند، تجزیه و تحلیل شد. سایر داده ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون توکی تعقیبی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مقدار P کمتر از 05/0 0 معنی دار در نظر گرفته شد.

نتیجه گیری

رسوراترول و CR فعالیت های ضد پیری مشابهی را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن نشان دادند، که با توانایی آنها در مهار پیری و آپوپتوز ناشی از AAPH و بازگرداندن اختلال شناختی مرتبط با سن ناشی از تجویز D-gal مشهود است. مکانیسم های ضد پیری آنها شامل تنظیم فعالیت TE، کاهش آسیب اکسیداتیو و تنظیم مسیر SIRT1 بود. به طور کلی، 10 میکرومولار رسوراترول در شرایط آزمایشگاهی و دوز بالای رسوراترول در داخل بدن فعالیت‌های نسبتاً قوی‌تری در زمینه ضد پیری و تحریک سطوح SIRT1 نشان دادند. این نتایج پتانسیل رسوراترول را به عنوان یک تقلید کننده CR نشان داد.

اختصارات

AAPH، 2،2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride; AMPK، پروتئین کیناز فعال شده با آدنوزین مونوفسفات. ANOVA، تجزیه و تحلیل واریانس. AROS، تنظیم کننده فعال SIRT1. CR، محدودیت کالری؛ DBC1، حذف شده در سرطان پستان 1; D-gal، D-گالاکتوز؛ FBS، سرم جنین گاوی؛ Foxo3a، جعبه چنگال 3a; HuR، آنتی ژن Hu R. MEM، حداقل رسانه ضروری؛ PBS، سالین بافر فسفات؛ PGC{12}}، گیرنده پراکسیزوم فعال شده با تکثیر کننده G coactivator-1 ; RES، رسوراترول؛ SA -gal، گالاکتوزیداز مرتبط با پیری. SD، انحرافات استاندارد؛ SIRT1، تنظیم کننده اطلاعات خاموش. TE، تلومراز.

مشارکت های نویسنده

مفهوم و طراحی تحقیق: Gang Chen; اکتساب، تجزیه و تحلیل و تفسیر داده ها: خوان لی، شیا چون ژانگ، یی-می لیو. به دست آوردن منابع مالی و بازنگری انتقادی نسخه خطی برای محتوای فکری: گانگ چن، کی لی چن. نوشتن نسخه خطی: خوان لی. همه نویسندگان چاپ این نسخه را خوانده و تایید کرده اند. قدردانی و بودجه

این کار توسط بنیاد علوم پسا دکتری چین (2016M601237)، پروژه بنیاد علوم طبیعی (81373704، 30873292) تامین شده است.

تضاد علاقه

بدون تضاد منافع از سوی همه نویسندگان شرکت کننده.

منابع

1. Ramis MR، Esteban S، Miralles A، Tan DX، Reiter RJ. محدودیت کلکوری، رسوراترول و ملاتونین: نقش SIRT1 و پیامدهای آن برای پیری و بیماری‌های مرتبط. Mech Aging Dev. 2015; 146-148:28-41.

2. Colman RJ، Beasley TM، Kemnitz JW، Johnson SC، Weinduch R، Anderson RM. محدودیت کالری، مرگ و میر ناشی از سن و همه علل را در میمون های رزوس کاهش می دهد. Nat Commun. 2014; 5:3557.

3. Sohal RS، Weinduch R. استرس اکسیداتیو، محدودیت کالری، و پیری. علوم پایه. 1996; 273:59-63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. تقلیدهای محدودیت کالری و رژیم غذایی: استراتژی برای بهبود پیری سالم و طول عمر. Curr Pharm Des. 2014; 20:2950-77.

5. Lane MA، Roth GS، Ingram DK. تقلیدهای محدودیت کالری: رویکردی جدید برای بیوجرونتولوژی روش‌ها Mol Biol. 2007; 371:143-9.

6. Baur JA، Pearson KJ، Price NL، Jamieson HA، Lerin C، Kalra A، Prabhu VV، Allard JS، Lopez-Lluch G، Lewis K، Pistell PJ، Poosala S، Becker KG، و همکاران. رسوراترول سلامت و بقای موش ها را در رژیم غذایی پر کالری بهبود می بخشد. طبیعت. 2006; 444:337-42.

7. Lagouge M، Argmann C، Gerhart-Hines Z، Meziane H، Lerin C، Daussin F، Messadeq N، Milne J، Lambert P، Elliott P، Geny B، Laakso M، Puigserver P، و همکاران. رسوراترول با فعال کردن SIRT1 و PGC{3}}آلفا، عملکرد میتوکندری را بهبود می بخشد و از بیماری متابولیک محافظت می کند. سلول. 2006; 127:1109-22.

8. Howitz KT، Bitterman KJ، Cohen HY، Lamming DW، Lavu S، Wood JG، Zipkin RE، Chung P، Kisielewski A، Zhang LL، Scherer B، Sinclair DA. فعال کننده های مولکولی کوچک سیرتوئین ها طول عمر ساکارومایسس سرویزیه را افزایش می دهند. طبیعت. 2003; 425:191-6.

9. Kwon HS، Ott M. فراز و نشیب های SIRT1. Trends Biochem Sci. 2008; 33:517-25.

10. Brooks CL, Gu W. چگونه SIRT1 بر متابولیسم، پیری و سرطان تأثیر می گذارد؟ Nat Rev سرطان. 2009; 9:123-8.

11. هارمن دی. نظریه رادیکال آزاد پیری. موتات ری. 1992; 275:257-66.

12. Mayo JC، Tan DX، Sainz RM، Lopez-Burillo S، Reiter RJ. آسیب اکسیداتیو به کاتالاز ناشی از رادیکال های پراکسیل: محافظت عملکردی توسط ملاتونین و سایر آنتی اکسیدان ها. Free Radic Res. 2003; 37:543-53.

13. Hubackova S، Krejcikova K، Bartek J، Hodny Z. IL1- و سیگنال‌دهی TGF -Nox4، استرس اکسیداتیو و پاسخ آسیب DNA ویژگی‌های مشترک پیری پاراکرین مشابه، ناشی از انکوژن و دارو هستند. '. پیری (آلبانی نیویورک). 2012; 4:932-51. https://doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X، Zuo P، Zhang Q، Li X، Hu Y، Long J، Packer L، Liu J. قرار گرفتن در معرض مزمن سیستمیک D-گالاکتوز باعث از دست دادن حافظه، تخریب عصبی و آسیب اکسیداتیو در موش می شود: اثرات محافظتی R{{ 2}}لیپوئیک اسید. J Neurosci Res. 2006; 84:647-54.

بیشتر بخواهید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950