پروفایل متابولومیک مبتنی بر NMR برای خواص ضدپیری و مهار رادیکال قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.5. طبقه بندی عصاره های گیاهی بر اساس تجزیه و تحلیل اجزای اصلی

تغییرات متابولیت بین برگ‌های گیاهان مورد آزمایش با استفاده از تجزیه و تحلیل داده‌های چند متغیره (MVDA) بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA)، یک روش تشخیص الگو، یک MVDA بدون نظارت است که درک عمده ای از ارتباط بین نمونه ها ارائه می دهد. نمودارهای امتیاز PCA جداسازی گیاهان را به خوشه‌ها نشان داد، در حالی که نمودارهای بارگذاری متابولیت‌هایی را که جداسازی را فراهم می‌کنند برجسته کرد [85،{1}}]. مدل PCA برازش خوب (R2X=0.997) و قابلیت پیش بینی بالا (Q2=0.993) را نشان داد که در آن تغییرات بین R2X(cum) و Q2 (cum) کمتر از 0 بود. .3، بنابراین نشان می دهد که عصاره هر یک از گیاهان به طور مساوی و یکنواخت در جداسازی گروه مشاهده شده نقش داشته است. این مشاهدات مطابق با Wheelock و همکاران بود. [87].

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

نمودار نمره تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی نشان داد که گیاهان انتخاب شده به دو دسته بدون هیچ گونه پرت قابل توجهی که در شکل 4 الف نشان داده شده است، جدا شدند. جزء اصلی (PC)1 بیشترین تنوع نمونه را نشان داد، سپس PC2 به دنبال آن قرار گرفت. PC1 و PC2 به ترتیب 29.7 درصد و 24.9 درصد در درصد واریانس نقش داشتند. بنابراین، واریانس کل حدود 54.6 درصد توسط این رایانه های شخصی توصیف شد. نتایج حاصل از نمودار ستون بارگذاری متابولیت های مسئول جداسازی گیاهان را به سمت مثبت PC1 (V.negundo و C.longa) و سمت منفی PC1 (P. منهای، P. indica، O.javanica و P. C. caudatus) (شکل 4B).

داده ها از نمودار ستون بارگذاری PC1 کشف کردند که ترکیبات فنلی، عمدتاً گروه فلاونوئید و اسیدهای فنولیک، مسئول جداسازی گیاهان انتخاب شده بودند. کوئرستین (1)، کورستین-3-O-rhamnoside (2)، کورستین-3-O-glucoside (3)، کورستین-3-O-glucuronide (4)، کورستین{11}} O-arabinofuranoside (5)، روتین (6)، مشتقات mvricetin (7)، کاتچین (8)، اپیکاتچین (9)، ایزورامنتین (10)، astragalin (11)، اسید کلروژنیک (12)، اسید گالیک (13)، محتوای اسید کوماریک (14)، اسید اسکوربیک (15)، اسید فرمیک (21)، اسید فوماریک (22)، 3-متیل گزانتین (26) و آپیژنین (28) در P.minus، P.indica بیشتر بود. ، C. caudatus و O.javanica که در سمت منفی طرح قرار گرفتند. در مقابل، V.negundo و C.longa با وجود سروتونین (27) و D-limonene (29) در عصاره‌های خود از سایر گیاهان متمایز شدند.

2.6. همبستگی بین فعالیت های زیستی و متابولیت ها با استفاده از تجزیه و تحلیل حداقل مربعات جزئی (PLS)

به منظور درک ارتباط بین فعالیت‌های زیستی اندازه‌گیری شده و متابولیت‌های موجود در گیاهان آزمایش‌شده، PLS، به عنوان یک روش نظارت‌شده MVDA، برای ارتباط داده‌های متغیرهای مستقل (تغییر شیمیایی NMR متابولیت‌ها) با داده‌های متغیرهای وابسته، اجرا شد. مهار سنجش DPPH، ABTS و ORAC، و همچنین فعالیت های ضد الاستاز و ضد کلاژناز بود. این روش به این دلیل به کار گرفته شد که PLS دستاورد بزرگی در پیوند دادن فعالیت های زیستی آزمایش شده با متابولیت ها دارد، بنابراین می تواند مدلی برای پیش بینی ارائه کند [88]. از طریق تجزیه و تحلیل PLS، ارتباط بین فعالیت‌های زیستی مانند فعالیت‌های مهار رادیکال و خواص ضد پیری با متابولیت‌های موجود در نمونه‌ها می‌توان برقرار کرد. از این رو، متابولیت هایی که به عنوان نشانگرهای فعال زیستی مسئول هستند، می توانند پیشنهاد شوند.

همانطور که Mediani و همکاران گزارش کرده اند، بای پلات ترکیبی از امتیازها و نمودارهای بارگذاری حاصل از تجزیه و تحلیل PLS است. [80]. یک بای پلات جزئی حداقل مربعات برای فعالیت مهار رادیکال (شکل 5A) و خواص ضد پیری (شکل 5B) نشان داد که همه نمونه ها به خوبی از هم جدا شده و بدون نقاط پرت قابل توجه خوشه بندی شدند. PC1 برگ های P. minus، C.caudatus و P. indica را از V. negundo، O.jaoanica و C.longa جدا کرد. بر اساس فعالیت‌های مهار رادیکال و خواص ضد پیری بای پلات‌ها، مدل مقادیر مناسب تناسب (R'Y) به ترتیب 988.988 و 0}}. در همین حال، پیش بینی پذیری (Q4) برای فعالیت های مهار رادیکال و خواص ضد پیری به ترتیب 0.984 و 0.951 بود.

همانطور که از بای پلات PLS فعالیت های مهار رادیکال (شکل 5A) نشان داده شده است، فعالیت های زیستی (DPPH، ABTS، و ORACassay) به سمت مثبت بای پلات هدایت شدند که فعال ترین مناطق و نزدیک ترین به P.minus، P بود. indica و C.caudatus. در مقابل، V. negundo، O.javanica، و C. longa به طرف‌های منفی بای پلات هدایت شدند که کمترین نواحی فعال در نظر گرفته شدند و از سنجش‌های DPPH، ABTS و ORAC دورتر بودند و یک همبستگی منفی نشان دادند. با فعالیت های زیستی در این شرایط، P. mimus، P. indica، و C.caudatus جدا از گیاهان کم‌فعال دسته‌بندی شده‌اند، که نشان می‌دهد این گیاهان دارای اثر مهار رادیکال قوی‌تری هستند، در نتیجه نشان می‌دهد که این عصاره‌های گیاهی ممکن است حاوی سطوح بالاتری از فنولیک باشند. ترکیبات. در میان سه گیاه فعال ترین، P. منهای به شدت با روش DPPH و ABTS، و پس از سنجش ORAC همبستگی پیدا شد.

این یافته با نتایج آزمایشگاهی فعالیت‌های مهار رادیکال که انجام شده بود مطابقت داشت. نتایج نشان داد که P. minus اثر مهار رادیکال آزاد قوی در مقایسه با گیاهان دیگر نشان می‌دهد. بنابراین نتایج نشان داد که P. minus فعال ترین گیاه برای ریشه کن کننده گونه های اکسیژن فعال است. متابولیت های ثانویه قابل توجهی که به فعالیت مهار رادیکال P. minus کمک می کنند به عنوان کوئرستین، کورستین{0}O-rhamnoside، catechin، isorhamnetin، astragalin و apigenin شناسایی شدند.اوتفلاوونوئیدهمه این متابولیت‌ها نزدیک‌تر به P. منهای و همچنین به روش‌های مهار رادیکال DPPHand ABTS قرار گرفتند. مطالعه قبلی توسط Mediani و همکاران.[80] همچنین کشف کرد که نمونه‌ای از گیاهان خشک شده با انجماد، مقدار بیشتری از گلوکز، گلوکز، کاتچین و اسید کلروژنیک را نشان می‌دهد که ممکن است به ظرفیت قوی مهار رادیکال DPPH گیاه کمک کند. با این حال، اثر مهار رادیکال بالای P.minus می تواند توسط متابولیت های ناشناس موجود در عصاره نیز ایجاد شود.

یافته های مشابهی برای خواص ضد پیری نیز یافت شد. شکل 5B، بای پلات به دست آمده از PLS خواص ضد پیری را نشان می دهد. فعالیت‌های زیستی (فعالیت‌های ضد الاستاز و ضد کلاژناز) در سمت مثبت بای پلات، که فعال‌ترین ناحیه بود و به P.minus، P. indica و C.caudatus نزدیک‌تر بود، پیش‌بینی شد. در مقابل، V.negundo، O.javanica و C.longa به سمت منفی بای پلات هدایت شدند که کمترین ناحیه فعال در نظر گرفته شد و از فعالیت های ضد الاستاز و ضد کلاژناز دورتر بود. این یک همبستگی منفی یا ضعیف‌تر را با فعالیت‌های زیستی نشان داد. در این وضعیت، P.mimus، P.indica، و C. caudatus جدا از گیاهان کم‌فعال دسته‌بندی شدند، که نشان می‌دهد این عصاره‌های گیاهی مهار الاستاز و کلاژناز بیشتری را نشان می‌دهند. در بین سه گیاه فعال، P. minus دوباره همبستگی قوی با این خواص ضد پیری در مقایسه با گیاهان دیگر داشت.

این یافته با نتایج آزمایشگاهی خواص ضد پیری که قبلاً انجام شده بود مطابقت داشت. نتایج نشان داد که P.minus فعال ترین گیاه دارویی برای مهار آنزیم های الاستاز و کلاژناز است. متابولیت‌های ثانویه مهمی که به خواص ضد پیری P. minus کمک می‌کنند، به‌عنوان کورستین، کورستین-3-O-rhamnoside، مشتقات میریستین، کاتچین، ایزورامنتین، استراگالین و آپیژنین شناسایی شدند. متابولیت های دیگری مانند گلوکز، گلوکز، اسید فوماریک و اسید چرب نیز ممکن است مسئول فعالیت های زیستی باشند. همه این متابولیت ها نزدیک تر به P. منهای و به فعالیت های ضد الاستاز و ضد کلاژناز قرار داشتند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

تبعیض این گیاهان منتخب به ویژه با نمونه‌های فعالیت مهار رادیکال بالا مطابقت داشت. منهای P.India و C.caudatus، که انتظار می رفت به دلیل غلظت بالای متابولیت های ثانویه، به ویژه فلاونوئیدها، از سایرین متمایز شوند، اعتقاد بر این است که وجود این ترکیبات فنلی به فعالیت های بازدارنده الاستاز و کلاژناز بیشتر کمک می کند. این گیاهان [67-79،89-92].

سهم ترکیبات زیست فعال عصاره های گیاهی در توانایی مهار رادیکال های آزاد و فعالیت ضد پیری توسط مطالعات مختلف ثبت شده است [66،72،75،79،92-101]. علاوه بر این، متابولیت هایی مانند فلاونوئیدها (کوئرستین، کامپفرول، میریستین، اپی کاتچین و کاتچین) و سایر فنل ها مانند رسوراترول و پروسیانیدین B2 ثابت شده است که به طور قابل توجهی الاستاز و کلاژناز را مهار می کنند [{7}}،79].

در مطالعه حاضر، سیگنال‌های متابولیت برای اهمیت متغیر در مقادیر پروجکشن (VIP) شناسایی و بررسی شدند تا مهم‌ترین متابولیت‌هایی را که با فعالیت‌های زیستی آزمایش‌شده مرتبط بودند، به‌دست آوریم. این کار برای افزایش یکپارچگی نتایج ارائه شده در اینجا انجام شد که پتانسیل تمایز متابولیت های شناسایی شده را بررسی می کرد.ویتامین C پوریتانسGenerally, the metabolites signal with VIP>{0}}.5 برای تبعیض مهم در نظر گرفته شد [102]. در این مطالعه، تمام متابولیت‌هایی که به فعالیت‌های مهار رادیکال و خواص ضد پیری کمک می‌کنند، می‌توانند به عنوان متابولیت‌های متمایزکننده قابل‌توجهی طبقه‌بندی شوند، زیرا مقادیر VIP آنها بالاتر از 1.0 بود (جدول 2). دو مدل PLSbiplots با استفاده از 100 جایگشت تصادفی، برای تایید اعتبار (R2) و توانایی های پیش بینی (Q2) مدل اصلی با چندین مدل، در مقایسه با خوبی برازش، اعتبارسنجی شد. R2 نشان داد که برازش مدل معنادار است و درجه متغیرهای Y را در مدل توضیح می‌دهد، در حالی که Q2 کیفیت پیش‌بینی مدل را مشابه آنچه توسط اریکسون و همکاران گزارش شده است ارائه می‌دهد. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). نتایج نشان داد که تمام رهگیری های محور Y R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>سیستانچهمقادیر رهگیری R2 و Q2 به ترتیب در محدوده 0 بودند.0367-0.0872.-0.444 تا-0.492. و اضافه تناسب نشان نداد. بنابراین، این دو مدل PLS را می‌توان به عنوان مدل‌های عملکرد خوب دسته‌بندی کرد و این یافته‌ها قابلیت اطمینان مدل‌ها را افزایش داد.

2.7. کمی سازی نسبی متابولیت های ثانویه

کمیت نسبی برخی از متابولیت های ثانویه که از گیاهان انتخاب شده شناسایی شده بودند در شکل 6 نشان داده شده است. و تقریباً به تمام فعالیت های زیستی آزمایش شده نزدیک تر بودند.سیستانچ چیستاین نتایج نشان داد که متابولیت‌های ثانویه به‌ویژه از گروه ترکیبات فلاونوئیدی که به مقدار زیاد در P. منهای وجود دارند ممکن است در ریشه‌کن‌کننده رادیکال‌های آزاد و خواص ضد پیری این گیاه نقش داشته باشند؟

در مقایسه با ساختارهای مختلف فلاونوئید که می‌توانست در اثربخشی آن‌ها نقش داشته باشد، اشاره شد که الگوی هیدروکسیلاسیون در حلقه B ممکن است یکی از عوامل مهم برای اثر بازدارندگی متابولیت‌ها بر فعالیت آنزیم‌های پیری باشد[80] . سیم و همکاران.[104] همچنین نشان داد که در هر دو سطح پروتئین و mRNA، اثر بازدارندگی این فلاونوئیدها با افزایش تعداد گروه‌ها در حلقه B قدرتمند شد و آنها ارتباط ساختار-فعالیت برخی فلاونوئیدها را در MMP بررسی کردند{5}} بیان ژن در فیبروبلاست های پوستی انسانی تحت تابش اشعه UV

3. مواد و روشها

3.1. مواد شیمیایی و معرف ها

دوتره متانول-d4 (CH3OH-d4)، KH2PO4 غیر دوتره، اکسید دوتریوم سدیم (NaOD)، تری متیل سیلیل پروپیونیک اسید-d4 نمک سدیم (TSP)، اتانول، و متانول توسط Merck Millipore International (Darmstadt، آلمان) عرضه شد. کوئرستین، بافر فسفات، 2،2-دی فنیل{12}}پیکریل هیدرازیل (DPPH)، 2،{14}}آزینوبیس (3-اتیل بنزوتیازولین-6-اسید سولفونیک)[ABTS ]، ترلوکس، پرسولفات پتاسیم، 2،2'-آزوبیس(2-آمیدینوپروپان)[AAPH، اپی گالوکاتچین گالات (EGCG)، بافر HEPES، آنزیم های الاستاز، N-متوکسی سوکسینیل-آلا-آلا-پرو-کلرو، N متوکسی سوسینیل-آلا-آلا-پرو-وال-پی-نیتروآنیلید و اکسید دوتریوم (D2O) توسط سیگما (آلدریچ، آلمان) عرضه شد.

3.2. مواد گیاهی و نمونه برداری

برگهای تازه O.jacanica، P. minus و C.longa از Felda Sungai Koyan Satu، Raub و Pahang جمع آوری شدند. برگ های V.negundo از موسسه علوم زیستی دانشگاه پوترا مالزی تهیه شد. برگ‌های تازه P. indica در پارک کشاورزی دانشگاه، دانشگاه پوترا مالزی و برگ‌های تازه برگ‌های C. caudatus در مؤسسه کشاورزی، سردانگ، سلانگور جمع‌آوری شد. یک نمونه کوپن از این گیاهان در هرباریوم، موسسه علوم زیستی، دانشگاه پوترا مالزی قرار داده شد و هر نمونه توسط گیاه شناس تایید شد.ضد پیری سیستانچهمه برگها به طور مداوم در صبح، در روزهای آفتابی برای اطمینان از قابلیت اطمینان محتوای متابولیت ها برداشت شدند. کرت در زمین باز برای هر گیاه به شش قسمت تفکیک شد و هر نمونه از هر بخش در شش تکرار جمع آوری شد.

3.3. آماده سازی نمونه

پس از برداشت، برگ‌های تازه در زیر آب جاری شسته شدند تا همه باقی‌مانده‌ها حذف شوند، با دستمال کاغذی آزمایشگاهی خشک شدند و فوراً با نیتروژن مایع منجمد شدند تا تمام واکنش‌های آنزیمی متوقف شود و متابولیت‌ها قبل از لیوفیلیزاسیون حفظ شوند. سپس نمونه ها در خشک کن انجمادی LABCONCO (کانزاس سیتی، MO، ایالات متحده) تا زمانی که وزن و رطوبت ثابت به زیر 10 درصد برسد، خشک شدند. تمام نمونه های خشک شده با استفاده از مخلوط کن آزمایشگاهی به پودر ریز تبدیل شدند و با استفاده از غربال آزمایشی آزمایشگاهی (ENDECOTTS LTD. London, England) به اندازه 300 میکرومتر الک شدند تا اندازه یکنواخت بدست آید. نمونه های پودر شده برای محافظت در برابر نور و رطوبت در بسته بندی آلومینیومی در خلاء بسته بندی شدند و قبل از تجزیه و تحلیل در درجه {3}} نگهداری شدند.

3.4. استخراج

روش استخراج شرح داده شده توسط Mediani و همکاران. [105] با برخی تغییرات دنبال شد. به طور خلاصه، 10 گرم از هر نمونه پودری در 100 میلی لیتر اتانول 60 درصد در یک فلاسک مخروطی کهربایی غوطه ور شد و به مدت 1 ساعت با استفاده از دستگاه سونیکاتور حمام اولتراسونیک (WiseClean، مدل WUC-D10H، سئول، کره) تحت دمای کنترل شده (زیر 40 درجه) سونیک شد. . نمونه ها از طریق کاغذ صافی شماره 1 واتمن فیلتر شدند و بقایای دو بار مجدداً استخراج و پس از اتمام اولین استخراج فیلتر شدند. سپس عصاره ها با استفاده از اواپراتور چرخشی در خلاء 40 درجه تغلیظ و تغلیظ شدند. سپس مواد چسبناک به دست آمده با استفاده از خشک کن انجمادی LABCONCO برای اطمینان از حذف کامل آب، انجماد خشک شدند و تا زمان استفاده بعدی در{12}} درجه نگهداری شدند. در نهایت، عصاره های خام خشک شده به غلظت های لازم برای تمام تحقیقات انجام شده رقیق شدند.

3.5. فعالیت پاکسازی رادیکال DPPH

فعالیت مهار رادیکال نمونه ها با پیروی از تکنیک توسعه یافته توسط کنگ و همکاران تعیین شد. [107]با اندکی تغییر. به طور خلاصه، 50 میکرولیتر عصاره نمونه در متانول در غلظت‌های مختلف (0 تا 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر) با محلول 2/0 میلی‌متر متانولیک 2،{10}دی فنیل{11}پیکریل هیدرازیل (DPPH) 195 میکرولیتر تازه تهیه شده اضافه شد و ذخیره شد. تمام نمونه ها در یک بشقاب چاهی 96 تهیه شد. فرآیند رنگ‌زدایی در طول موج 515 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Biotek EL 800 microplate reader, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) پس از 60 دقیقه انکوباسیون در تاریکی و مقایسه با شاهد مثبت و نمونه‌های خالی ثبت شد. درصد فعالیت مهار رادیکال بر اساس رابطه زیر اندازه گیری شد:

که در آن کنترل، جذب کنترل بدون عصاره گیاهی و Simple، جذب عصاره گیاهی است.

عصاره‌های گیاهی یا غلظت‌های کنترل مثبت که 50 درصد DPPH رادیکال آزاد پایدار را از بین می‌بردند به عنوان ICs با استفاده از نمودار خطی درصد فعالیت مهار رادیکال در برابر محاسبه شدند.

عصاره های گیاهی / غلظت کنترل مثبت ICso پایین نشان دهنده فعالیت آنتی اکسیدانی بالاتر است. تمام آزمایش‌ها در شش تکرار با Trolox و quercetin به عنوان شاهد مثبت اجرا شدند.

3.6. سنجش رادیکال ABTS

برای سنجش مهار رادیکال ABTS، تجزیه و تحلیل به دنبال روشی که توسط Arnao و همکارانش توضیح داده شد انجام شد.[1{5}}8] با برخی اصلاحات. محلول های استوک تهیه شده 7 میلی مولار ABTS به علاوه محلول و 2.45 میلی مولار محلول پرسولفات پتاسیم بود. به منظور تهیه محلول کار، دو محلول استوک در مقادیر یکسان مخلوط شده و به مدت 16 ساعت در دمای اتاق در تاریکی واکنش نشان دادند. سپس، محلول کار با آب مقطر رقیق شد تا جذب 0.005±0.700 واحد 0 در 734 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (UV{10}}اسپکتروفتومتر PC، شیمادزو، کیوتو، ژاپن) به دست آورد. راه حل ABTS plus. محلول ABTS پلاس برای هر سنجش تازه تهیه شد. این محلول ABTS پلاس (900 میکرولیتر) اجازه داده شد تا با 100 میکرولیتر عصاره گیاهان دارویی به مدت 2 دقیقه واکنش دهد. سپس جذب با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 734 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد شامل 3.1 میکروگرم بر میلی‌لیتر تا و 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر Trolox ایجاد شد و نتایج به عنوان میلی‌گرم ظرفیت آنتی‌اکسیدانی معادل ترولوکس بر گرم نمونه (mg TEAC/g نمونه) بیان شد.

3.7. سنجش رادیکال اوراک اسکنینگ

یک روش ORAC برای اندازه‌گیری کارایی مهار رادیکال پراکسیل همانطور که توسط Huang و همکاران بیان شد، اجرا شد. [109] با استفاده از فلورسانس خوان میکروپلیتی FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH، Ortenberg، آلمان). عصاره هر گیاه و Trolox (استاندارد) در محلول بافر فسفات 75 میلی مولار (PBS) pH 7.4 تهیه شد. در میکروپلیت سیاه چاهی، مجموعاً 150 میکرولیتر فلوئورسئین (10 نانومولار محلول در PBS) و سپس 25 میکرولیتر Trolox، عصاره‌های گیاهی یا PBS به عنوان خالی اضافه شد. این محلول ها در چاه های سه تکراری پیپت شدند. میکروپلیت به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد و با درب پوشانده شد. فلورسانس با طول موج تحریک در 458 نانومتر و طول موج انتشار در 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. سیگنال پس زمینه با اندازه گیری هر 90 ثانیه تعیین شد.

پس از آن، 25 uL تازه آماده 2،2'-azobis (2-amidinopropane) (AAPH، 240 میلی‌مولار در PBS) توسط انژکتورهای روی برد معرفی شد. سپس فروپاشی فلورسانس تا 90 دقیقه با استفاده از همان طول موج‌های تحریک و انتشار گرفته شد. ارزیابی برای نواحی زیر منحنی برای نمونه‌ها (فلورسانس در مقابل زمان) منهای سطح زیر منحنی برای قسمت خالی و در مقایسه با یک منحنی استاندارد (25-400 μM Trolox) انجام شد. مقادیر ORAC مربوط به Trolox با استفاده از معادله زیر محاسبه شد:

3.8. سنجش مهار الاستاز

فعالیت مهاری الاستاز با توجه به تکنیک توصیف شده توسط Krause و همکاران [110]، با تغییرات جزئی توسط Ndlovu و همکاران تعیین شد. [75]. چاه های نمونه حاوی 25 میکرولیتر بافر HEPES 0.1 مولار (pH7.5)، 25 میکرولیتر عصاره گیاهی (100 میکروگرم بر میلی لیتر) و 25 میکرولیتر آنزیم الاستاز (1 میکروگرم بر میلی لیتر) بود. چاه های خالی فقط حاوی 75 میکرولیتر بافر HEPES و چاهک های کنترل منفی حاوی 50 میکرولیتر بافر HEPES و 25 میکرولیتر آنزیم الاستاز بودند. چاه های کنترل مثبت حاوی 25 میکرولیتر بافر HEPES، 25 میکرولیتر N-متوکسی سوکسینیل-آلا-آلا-پرو-کلرو (10 میکروگرم بر میلی لیتر) و 25 میکرولیتر آنزیم الاستاز بودند. چاه های کنترل حلال حاوی 25 میکرولیتر بافر HEPES، 25 میکرولیتر متانول 10 درصد و 25 میکرولیتر آنزیم الاستاز بودند. کنترل‌های خالی عصاره گیاهی (برای کنترل‌های رنگی هر عصاره آزمایش‌شده) حاوی 150 میکرولیتر بافر HEPES و 25 میکرولیتر عصاره گیاهی بود. سپس صفحه میکرو چاهک به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. به دنبال این، بستر 100μL (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide، 1 میلی مولار) اضافه شد. سپس پلیت ها به مدت 40 دقیقه دیگر در دمای 25 درجه انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، جذب با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (ریدر میکروپلیت EL800 Biotek) در 405 نانومتر قرائت شد. درصد بازدارندگی عصاره های گیاهی با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

که در آن کنترل، جذب بافر با الاستاز و حلال و Atest جذب بافر، الاستاز و عصاره گیاهی یا N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro است.

3.9. سنجش مهار کلاژناز

فعالیت مهار کلاژناز به دنبال روش Van-Wart و Steinbrink [111] (1981) با اصلاحات Madrone و همکاران انجام شد. [92]. آزمایش در بافر TES 5{7}} میلی مولار (pH7.4 با 0}.36 میلی مولار CaCl2) اجرا شد. آنزیم کلاژناز از کلستریدیوم هیستولیتیکوم (ChC-EC.3.4.23.3) در غلظت 0.8 واحد در میلی لیتر (محلول در محلول بافر TES) تهیه شد. سوبسترای مصنوعی N-[{18}}(2-فوریل) آکریلول]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) با غلظت 2 میلی‌مولار در محلول بافر TES تهیه شد. حجم کل 15{33}} میکرولیتر برای مخلوط واکنش نهایی حاوی 46.3 میکرولیتر TESبافر، 60 میکرولیتر FALGPA (غلظت نهایی FALGPA 0.8 میلی‌مولار)، آنزیم کلاژناز 18.7 میکرولیتر (0.1 واحد در میلی لیتر غلظت نهایی) و 2 عصاره 100 میکروگرم در میلی لیتر) عصاره ها و آنزیم های گیاهی در بافر TES قبل از افزودن سوبسترا برای شروع واکنش شیمیایی در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. کنترل های منفی با یک بافر TES انجام شد. پس از افزودن بستر، جذب بلافاصله در 340 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) در پلیت های میکروتیتر 96 چاهی خوانده شد و به طور مداوم برای دیگری اندازه گیری شد. 20 دقیقه کنترل مثبت با استفاده از اپی گالوکاتچین گالات (EGCG) با غلظت 12.5 میکروگرم بر میلی لیتر انجام شد. درصد بازداری نمونه ها با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:

که در آن کنترل، جذب بافر TES و Atest جذب بافر TES، آنزیم کلاژناز و عصاره گیاهی یا FALGPA است.

3.10. پروفایل متابولیت با استفاده از اندازه گیری H-NMR

پروفایل متابولیت با استفاده از H-NMR گیاهان منتخب بر اساس پروتکل توصیف شده توسط کیم و همکاران انجام شد. [47] با تغییرات جزئی. عصاره گیاهان خام (25 میلی گرم) به یک لوله میکروسانتریفیوژ میلی لیتری منتقل شد. مخلوطی از متانول-d4 و بافر KHPO4 در دائو (pH 6.{7}}) حاوی 0.1 درصد نمک سدیم تری متیل سیلی پروپیونیک اسید (TSP) با حجم کل 0 به نمونه‌های گیاهی اضافه شد. {10}}.7 میلی لیتر در نسبت (1:1). سپس لوله های میکروسانتریفیوژ حاوی عصاره گیاهان به مدت 1 دقیقه در دمای اتاق و سپس فراصوت به مدت 15 دقیقه گرداب شدند. سپس مخلوط به مدت 1{33}} دقیقه در 5678 گرم سانتریفیوژ شد تا مایع رویی از مواد غیرقابل حل جدا شود. سپس، 0.6 میلی لیتر مایع رویی شفاف به لوله های NMR وارد شد و تحت آنالیز 'H-NMR قرار گرفت. تجزیه و تحلیل 'H-NMR از طریق یک طیف سنج Varian INOVA NMR با فرکانس 500 مگاهرتز (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) که در فرکانس 499.887 مگاهرتز کار می کرد و طیف ها در 26 درجه ثبت شدند، انجام شد. هر طیف شامل 64 اسکن با 3.53 دقیقه زمان اکتساب و عرض 20 ppm بود. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار Chenomx (v.6.2) (Clhenomx Inc، Edmonton، AB، Canada) برای انجام تصحیح فازی و خط پایه با یک تنظیم سازگار تجزیه و تحلیل شد. تجزیه و تحلیل داده های چند متغیره با استفاده از نرم افزار SIMCA (نسخه 13.0، Umetrics، Umea، سوئد) انجام شد. 3.11. سطل سازی 'H-NMR Spectra

باکتینگ طیف های H-NMR با استفاده از نرم افزار Chenomx (v.6.2, Edmonton, AB, Canada) پیاده سازی شد. همه طیف‌ها از ناحیه 0.5-10.0 pprn با پارامترهای یکسان پیوند شدند. پارامترها شامل عرض طیفی §0.04 بود که در مجموع 245 ناحیه یکپارچه برای هر طیف NMR به دست آورد. تغییر شیمیایی برای آب و باقیمانده متانول-d در δ4. سپس داده‌های یکنواخت شده تحت تجزیه و تحلیل داده‌های چند متغیره (MVDA) قرار گرفتند.

3.12. کمیت نسبی متابولیت ها

متابولیت‌های شناسایی‌شده از نظر کمی‌سازی نسبی مورد بررسی قرار گرفتند که بر اساس میانگین مساحت پیک سیگنال‌ها پس از اتصال طیف‌های LH-NMR محاسبه شد.

3.13. تحلیل آماری

تمام نتایج شش تکرار به عنوان میانگین ± انحراف معیار بیان شد. برای اندازه گیری فعالیت های مهار رادیکال، مهار فعالیت های الاستاز و کلاژناز، و کمی سازی نسبی متابولیت ها، تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از Minitab 16 (نسخه 16، Minitab Inc.، کالج ایالتی، PA، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. از آنالیز واریانس (ANOVA) برای بررسی تفاوت معنی دار بین میانگین ها با p استفاده شد<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. نتیجه گیری

استفاده از آنالیزهای H-NMR همراه با MVDA در بررسی تغییرات متابولیت‌های گیاهان انتخاب‌شده موفق بود. نمودار نمره PCA جداسازی مشخصی از گیاهان را بر اساس خوشه های آنها نشان داد. این مطالعه نشان داد که P. minus دارای بالاترین اثر مهار رادیکال از طریق سنجش DPPH و ABTS بود و بالاترین فعالیت ضد پیری را نشان داد. دو بای پلات از تجزیه و تحلیل PLS بیشتر این نتیجه را تایید کرد، زیرا یک ارتباط قوی بین متابولیت های شناسایی شده در P. منهای و زیست فعالی های آزمایش شده پیدا شد. متابولیت‌های فعالی که اعتقاد بر این است که به فعالیت‌های مهار رادیکال و خواص ضد پیری P.minus کمک می‌کنند شامل کورستین، کورستین{3}O-rhamnoside، مشتقات میریستین، کاتچین، ایزورامنتین، آستراگالین و آپیژنین هستند. بنابراین، می توان فرض کرد که این متابولیت ها مسئول اثر مهار رادیکال قوی و خواص ضد پیری بالای P. minus هستند. این متابولیت ها عمدتاً از گروه فلاونوئیدها، به ویژه فلاونول ها بودند. بنابراین، می‌توان پیشنهاد کرد که متابولیت‌های P. minus می‌توانند یک ریشه‌کن‌کننده رادیکال‌های آزاد امیدوارکننده و مهارکننده آنزیم‌های پیری باشند که می‌توانند برای به تاخیر انداختن علائم پیری و برای درمان بیماری‌های مزمن مرتبط با پیری استفاده شوند. این یافته ها به تعیین قدرت P. minus به عنوان یک منبع طبیعی بالقوه عوامل ضد پیری و به عنوان یک ریشه کن کننده رادیکال آزاد طبیعی کمک می کند.

این مقاله از Molecules 2019, 24, 3208 استخراج شده است. doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules