سلول‌های CD4D واکنش‌پذیر هسته‌ای در لوپوس اریتماتوز سیستمیک فعال گسترش می‌یابند، سیتوکین‌های موثر تولید می‌کنند و به کلیه‌ها حمله می‌کنند.

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

دیماس ابدیراما و همکاران

Cistanche DHT برای بیماری کلیوی، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

لوپوس سیستمیکاریتماتوزسیستمیک و مزمن استخود ایمنیمرضبا از دست دادن تحمل نسبت به آنتی ژن های هسته ای با خود واکنشی مشخص می شودCD4Dسلول های T در پاتوژنز بیماری نقش دارند. با این حال، از زمان شناسایی اختصاصی اتوآنتی ژن انسانی، اطلاعات کمی در مورد ویژگی گیرنده آنها شناخته شده استCD4Dسلول های T بسیار چالش برانگیز بوده است. در اینجا ما تحلیلی ازCD4Dسلول‌های T با استفاده از دو روش مکمل به آنتی‌ژن‌های هسته‌ای واکنش نشان می‌دهند: کتابخانه‌های سلول T و غنی‌سازی سلول‌های T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن. فرکانس های آنتی ژن اختصاصی هسته ایCD4Dسلول های T با شدت بیماری در ارتباط است. این سلول‌های T خودواکنشی، سیتوکین‌های مؤثری مانند اینترفرون-g، اینترلوکین-17 و اینترلوکین-10 تولید می‌کنند. در مقایسه با خون، این سلول‌ها در ادرار بیماران مبتلا به نفریت لوپوس فعال غنی شده بودند که نشان‌دهنده انفیلتراسیون التهابی است.کلیه ها. بنابراین، این ویژگی‌های قبلاً ناشناخته از نقش سلول‌های CD4D T اختصاصی آنتی ژن هسته‌ای در لوپوس اریتماتوز سیستمیک پشتیبانی می‌کنند.

لوپوس سیستمیکاریتماتوز(SLE) یک بیماری خودایمنی سیستمیک و مزمن است که با از دست دادن تحمل نسبت به آنتی ژن های هسته ای به دلیل دفع معیوب زباله های بیولوژیکی مانند مواد آپوپتوز حاوی ریبونوکلئوپروتئین ها و نوکلئوزوم ها مشخص می شود.1 اتوآنتی بادی علیه آنتی ژن های هسته ای مشخصه SLE است و معمولاً قبل از آشکار شدن رخ می دهد. مرض.²علاوه بر این، سلول‌های CD4þ T خود واکنشی با ترویج تولید اتوآنتی‌بادی توسط سلول‌های B و انتشار مستقیم آسیب عضوی در اندام‌های هدف ملتهب، در پاتوژنز SLE نقش دارند.³اگرچه شناسایی سلول‌های T واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن هسته‌ای قبلاً گزارش شده است، شواهد وجود آن‌ها تا کنون پیرامونی باقی مانده است و در حال حاضر مشخص نیست که چگونه آنها در پاتوژنز نقش متقابل دارند.^4–9درک اینکه چگونه این سلول ها در خودایمنی شرکت می کنند برای طراحی درمان موثر بسیار مهم است.

تشخیص سلول‌های T اختصاصی اتوآنتی‌ژن به دلیل فرکانس‌های فوق‌العاده پایین آن‌ها در خون در گردش مانع می‌شود.10 مطالعات قبلی روی مجموعه‌های سلول‌های T ساده CD4þ انسان از فناوری مبتنی بر تترامر برای ارائه مؤثر اطلاعات دقیق در مورد پاسخ‌های سلول T به اپی توپ‌های آنتی‌ژن خاص استفاده کرده‌اند. ; با این حال، این روش نیاز به دانش قبلی از انواع آنتی ژن لکوسیت انسانی اهداکننده دارد.^11–13تکنیک‌های جایگزین برای شناسایی و شمارش همزمان جمعیت‌های سلول T نادر با واکنش‌پذیری به آنتی‌ژن‌های مختلف بدون آگاهی قبلی از انواع آنتی‌ژن لکوسیت انسانی با استفاده از کتابخانه‌های سلول‌های T پلی کلونال تقویت‌شده توسعه داده شد.¹⁴و با غنی‌سازی سلول‌های T بیان‌کننده CD پس از تحریک با آنتی‌ژنی به نام ARTE (غنی‌سازی سلول‌های T واکنشی آنتی‌ژن).¹⁵

سلول های CD4þ T عمدتاً از طریق ترشح سیتوکین ها بر اثر فعال شدن آنتی ژنی، عملکرد خود را انجام می دهند¹⁶و با انتشار التهاب بافتی مانند نفریت لوپوس (LN) که یکی از جدی ترین عوارض SLE است.^17,18

تجزیه و تحلیل مجموعه سلول های T موجود در بیوپسی کلیه از بیماران مبتلا به LN، اولیگوکلونالیته را نشان داد.کلیه- نفوذ سلول های CD4þ T، نشان دهنده تجمع سلول های T اختصاصی آنتی ژن در ملتهبکلیه ها.¹⁹مطالعه قبلی ما سلول‌های T ادراری را در بیماران مبتلا به LN فعال به‌عنوان یک نشانگر زیستی دقیق نشان داد که شبیه فنوتیپ سلول‌های داخل کلیوی است.^20,21اگرچه این سلول ها برای گیرنده کموکاین CXC 3 و گیرنده کموکاین CC 5 سلول های T بیان کننده سلول های T کمک کننده 1 (Th1) غنی شده اند و حاوی سلول های CD154þ T هستند که نشان دهنده برخورد اخیر با آنتی ژن است.^22,23ویژگی آنتی ژنی آنها نسبت به آنتی ژن های هسته ای نامشخص است. در این مطالعه، ما تجزیه و تحلیل سلول های CD4þ T واکنش پذیر به آنتی ژن های هسته ای را در مجموع 17 فرد سالم ارائه می کنیم.¹² افراد مبتلا به SLE غیر فعال، و 20 فرد مبتلا به SLE فعال با استفاده از کتابخانه های سلول T و تکنیک های ARTE برای تجزیه و تحلیل فراوانی سلول های CD4þ T خود واکنشی در خون محیطی و ادرار بیماران مبتلا به LN و همچنین تولید سیتوکین.

نتایج

سلول‌های CD4D واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن هسته‌ای با استفاده از کتابخانه سلول T و ARTE، SLE غیرفعال منبسط می‌شوند.

با توجه به حساسیت نظری بالا برای شناسایی سلول‌های T اختصاصی آنتی ژن کمیاب، کتابخانه‌هایی از سلول‌های CD4þ T تقویت‌شده تولید و برای واکنش‌پذیری در برابر آنتی‌ژن‌های هسته‌ای مورد بازجویی قرار گرفتند. کتابخانه های گسترش یافته سلول T از 12 بیمار مبتلا به SLE و 6 فرد سالم با آنتی ژن های هسته ای متعارف SmD1، RNP7{29}}، هیستون، Ro و La در حضور سلول های ارائه دهنده آنتی ژن و سپس اندازه گیری سلول تحریک شدند. تکثیر در پاسخ به تحریک آنتی ژنی (شکل تکمیلی S1A). از آنجایی که بلاست‌های سلول T تقویت‌شده به آنتی‌ژن‌ها پاسخ متفاوتی دادند، از نمره z اختصاصی دهنده به عنوان آستانه تکثیر و درجه شاخص تحریک (پاسخ سلول‌های تحریک‌شده نسبت به سلول‌های تحریک‌نشده) به سوپرآنتی ژن استافیلوکوکوس انتروتوکسین B (SEB) استفاده شد. (شکل تکمیلی S1B–D). علاوه بر آنتی ژن‌های هسته‌ای، ما ترانس تیرتین را به‌عنوان یک اتوآنتی‌ژن کنترل نامربوط (n ¼ 8 بیمار مبتلا به SLE؛ n ¼ 5 کنترل سالم) قرار دادیم (شکل 1a). تشخیص سلول های اختصاصی آنتی ژن با به چالش کشیدن یک سری ریزکشت های دارای امتیاز مثبت با آنتی ژن مربوطه و تجزیه و تحلیل بیان نشانگرهای فعال سازی سلول T اختصاصی آنتی ژن CD154 و اینترفرون (IFN)-g با استفاده از سیتومتری24 تایید شد (شکل تکمیلی). S1E). با استفاده از توزیع پواسون، فرکانس سلول های T اختصاصی آنتی ژن شمارش شد. به طور قابل‌توجهی، فرکانس‌های میانه برخی از سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر آنتی ژن هسته‌ای در بیماران مبتلا به SLE فعال در مقایسه با افراد سالم افزایش یافته است (SmD1: P ¼ 1؛ RNP7{31}}: P¼ 0. 35}}4؛ هیستون: P ¼ 0.35؛ Ro: P ¼ 0.02؛ La: P ¼ 0.04 ) و بیماران مبتلا به SLE غیر فعال (SmD1: P ¼ 0.79؛ RNP70: P ¼ 0.04؛ هیستون: P ¼ 0.23؛ Ro: P ¼ 0.04؛ La: P ¼ 0.006) (شکل 1b). تعداد کل سلول‌های CD4þ T خودواکنشی مرتبط با SLE در بین افراد در محدوده 0 تا 185.5 سلول در هر 1 میلیون سلول متفاوت بود، که بیشترین فراوانی را در بیماران مبتلا به SLE فعال داشت (شکل 1c). سلول های CD4þ T واکنش دهنده آنتی ژن هسته ای در تمام بیماران مبتلا به SLE فعال قابل تشخیص بودند. این سلول‌ها همچنین در 5 بیمار از 6 بیمار مبتلا به SLE غیرفعال قابل تشخیص بودند، در حالی که تنها 3 نفر از 6 کنترل سالم سلول‌های T خود واکنشی در گردش را ارائه کردند. جالب توجه است، بیماران مبتلا به SLE فعال نیز تنوع گسترده‌تری از پاسخ‌های خودواکنشی سلول T را نشان دادند، به طوری که هر بیمار دارای سلول‌های T واکنشی در برابر حداقل 3 آنتی ژن هسته‌ای بود. در مقایسه، نمونه کارها در بیماران مبتلا به SLE غیرفعال و افراد سالم کمتر متغیر بود. در مجموع، سلول‌های T واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن هسته‌ای در گردش برای SLE انحصاری نیستند، اما SLE غیرفعال هستند، تعداد آنها بیشتر است و ساختارهای هدف آنها متغیرتر است.

از آنجایی که سلول‌های T خودواکنشی در انتشار پاسخ‌های خودایمنی نقش دارند، ما تعداد سلول‌های T خودواکنشی را با شدت بیماری مقایسه کردیم که توسط شاخص فعالیت بیماری SLE (SLEDAI) ارزیابی شد. فقط فرکانس‌های سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر به RNP70، Ro، و La با SLEDAI همبستگی مثبت دارند (RNP70: P¼ 0.04, r¼ { {11}}.4865؛ Ro: P ¼ 0.005، r ¼ 0.6299؛ La: P ¼ 0.01، r ¼ 0.5651) (شکل 1d). در مقابل، فراوانی سلول‌های T واکنش‌پذیر به ترانس تیرتین در سطح تقریباً مشابهی در هر 3 گروه یافت شد (شکل 1e)، بنابراین یک سوگیری تجربی احتمالی به دلیل SLE غیرفعال بیش‌فعالیت سلول T غیر اختصاصی عمومی را رد کرد.

کتابخانه های سلول T مجموعه ای از مزیت ها از جمله حساسیت بالا برای شناسایی سلول های بسیار نادر در تعداد کم سلول های ورودی را ارائه می دهند. با این حال، این تکنیک بر گسترش سلول‌ها متکی است، که ممکن است ترکیب سلولی را تغییر دهد و تنها امکان محدودی را برای شناسایی فنوتیپی سلول‌های واکنش‌پذیر فراهم می‌کند. بنابراین، ما مشاهدات خود را با روش ARTE تأیید کردیم. پروتکل ARTE به مقادیر بیشتری از سلول های ورودی نیاز دارد، که به ویژه در بیماران مبتلا به SLE که اغلب خود را با لنفوپنی و کم خونی نشان می دهند، چالش برانگیز است. به دلیل این محدودیت و همچنین برای افزایش بازخوانی مورد انتظار سلول های واکنشی، ما تمام 5 آنتی ژن هسته ای متعارف را با هم ترکیب کردیم و از این استخر برای تحریک سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) قبل از غنی سازی سلول های بیان کننده CD (15 ¼ n) استفاده کردیم. بیماران مبتلا به SLE؛ n ¼ 6 فرد سالم). با استفاده از ترکیبی از نشانگرهای سطحی CD154 و CD69، سلول های T واکنش پذیر به آنتی ژن های هسته ای مرتبط با SLE را می توان در یک جمعیت پس زمینه شناسایی کرد (شکل 1f). اگرچه بیان پس‌زمینه CD154 و CD69 در همه افراد به‌وفور مشاهده شد، بیماران مبتلا به SLE فعال به‌طور قابل‌توجهی فرکانس سلول‌های T CD154þCD69þ را هنگام تحریک با آنتی‌ژن‌های هسته‌ای در مقایسه با تحریک پس‌زمینه افزایش دادند (P ¼ 0). {18}}8)، در حالی که افراد سالم و بیماران مبتلا به SLE غیر فعال، فرکانس‌های مشابهی بین سلول‌های تحریک‌شده با آنتی‌ژن و سلول‌های غیرتحریکی داشتند (افراد سالم: P ¼ 0.44؛ بیماران مبتلا به SLE غیر فعال: P ¼ {{23} }.56) (شکل 1g). علاوه بر این، با کم کردن فرکانس‌های پس‌زمینه، فرکانس سلول‌های T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن هسته‌ای در بیماران مبتلا به بیماری فعال بیشتر از افراد سالم و بیماران مبتلا به بیماری غیرفعال بود (P ¼ 0).{29}}2 و P. ¼ 0.11، به ترتیب) (شکل 1h). فراوانی سلول‌های T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن هسته‌ای کم‌شده با پس‌زمینه با فعالیت بیماری همبستگی مثبت داشت (0.004 ¼ P، 0.5978 ¼ r، که نقش بالقوه آنها را در پاتوژنز SLE نشان می‌دهد (شکل 1i). علاوه بر این، سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر به آنتی‌ژن فراخوان کاندیدا آلبیکنس MP65، فرکانس‌های مشابهی را در بین اهداکنندگان نشان دادند (شکل 1j)، که احتمال سوگیری عمومی نسبت به فرکانس‌های بالاتر سلول‌های T واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن را در بیماران مبتلا به SLE فعال حذف می‌کند.

در مجموع، داده‌های ما با استفاده از کتابخانه سلول T و روش‌های ARTE، گسترش سلول‌های CD4þ T اختصاصی اتوآنتی ژن را در بیماران مبتلا به SLE فعال نشان می‌دهد. هر دو تکنیک با مقادیر شاخص تحریک متوسط ​​مشابه بین پاسخ‌های سلول T تحریک‌شده و غیرتحریک‌شده قابل مقایسه هستند (شاخص تحریک متوسط-کتابخانه سلول T: 1.857؛ ARTE: 1.614؛ P ¼ 0.33)، اگرچه روش ARTE فرکانس‌های بالاتری از سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر به آنتی‌ژن هسته‌ای را نسبت به روش کتابخانه سلول T نشان داد (شکل 1k).

سلول‌های T واکنش‌پذیر به آنتی‌ژن هسته‌ای در افراد سالم، سلول‌های T خودواکنشی CD4D هستند.

هر دو روش کتابخانه سلول T و تکنیک ARTE تشخیص سلول‌های T خودواکنشی را در افراد سالم نشان دادند که نشان‌دهنده منشأ احتمالی برای توسعه خودایمنی انسانی است.²⁵با این حال، تعداد آنها تفاوت قابل‌توجهی با فرکانس‌های پس‌زمینه نداشت، و مشخص نیست که آیا افراد سالم واقعاً باید سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر آنتی ژن هسته‌ای را به گردش درآورند. برای کشف ویژگی آنتی ژن سلول‌های T خودواکنشی در افراد سالم، کلون‌های تک سلولی T را از پیش‌سازهای سلول T CD154þCD69þ جدا شده از افراد سالم پس از تحریک PBMCs با آنتی ژن‌های هسته‌ای منفرد و یک آنتی ژن کنترل مشتق شده از لیز Aspergillus fumigatus تولید کردیم. تعداد قابل‌توجهی از کلون‌های سلول T خودآنتی‌ژن خاص مرتبط با SLE به آنتی‌ژن‌های مربوطه پس از تحریک مجدد آنتی‌ژن پاسخ دادند، همانطور که با بیان همزمان IFN-g با CD154 مشخص شد (تعداد کلون‌های خاص - Aspergillus fumigatus: 5 از 5؛ SmD1: 4 از 8؛ RNP70: 3 از 11؛ هیستون: 5 از 5؛ Ro: 4 از 9؛ La: 5 از 7) (شکل تکمیلی S2A و B). علاوه بر این، پاسخ آنتی ژن (که برای SmD1 نشان داده شده است) وابسته به دوز بود، و تأکید می کند که سلول های T واکنش دهنده به آنتی ژن هسته ای در افراد سالم سلول های CD4þ T خودواکنشی مناسب هستند (شکل تکمیلی S2C). بنابراین، ما وجود سلول‌های T واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن هسته‌ای را در افراد سالم در سیگنال پس‌زمینه روش‌های تشخیص کاربردی تأیید کردیم.

تولید سیتوکین سلول‌های CD4D واکنش‌پذیر آنتی ژن هسته‌ای

ما در مرحله بعد تولید سیتوکین سلول های CD4þ T واکنش دهنده آنتی ژن هسته ای را بررسی کردیم. سلول‌های بیان‌کننده CD به‌صورت داخل سلولی برای سیتوکین‌های مؤثر مانند IFN-g، اینترلوکین (IL)-17، IL{4}} و IL-10 پس از تحریک با مخزن رنگ‌آمیزی شدند. آنتی ژن های هسته ای مرتبط با SLE (شکل 2a). فرکانس سلول های T CD154þCD4þ تولید کننده IFN-g-، IL-17- و IL{{{1{0}} به طور قابل توجهی در بیماران مبتلا به SLE فعال افزایش یافت (همه سیتوکین ها: P ¼ {{16} }.004)، در حالی که فرکانس سلول‌های T خودواکنشی تولید کننده IL{15}} از فرکانس پس‌زمینه غیرقابل تشخیص باقی ماند (P ¼ 0.125) (شکل 2b) ). علاوه بر این، تعداد مطلق سلول‌های T خودواکنشی تولیدکننده IFN-g و IL{2{37}}} در بیماران مبتلا به SLE فعال بیشتر از افراد سالم و بیماران مبتلا به SLE غیرفعال بود (شکل 2b). با کم کردن فرکانس‌های پس‌زمینه، بیماران مبتلا به SLE فعال به طور قابل‌توجهی فرکانس‌های بالاتری از سلول‌های T خودواکنشی تولیدکننده IFN-g و IL{23}} نسبت به افراد سالم داشتند (IFN-g: P ¼ {{4{49}} }}.003؛ IL-10: P ¼ 0.004) و همچنین IFN-g– ، IL-17– و IL-10–تولید سلول‌های T خودواکنشی نسبت به بیماران مبتلا به SLE غیرفعال (IFN-g: P ¼ 0).002؛ IL{{ 36}}: P ¼ 0.002؛ IL{39}}: P ¼ 0.005) (شکل 2c). علاوه بر این، فراوانی IFN-g– و IL{44}}– اما نه IL‏-17– و IL{46}}–تولیدکننده آنتی‌ژن هسته‌ای سلول‌های T واکنش‌پذیر با فعالیت بیماری مرتبط است. با این حال، فقط فراوانی سلول‌های تولیدکننده IL، همبستگی کمتری با فعالیت بیماری نشان داد (IFN-g: P <0.0001، r="" 0.7574="" ¼؛="" il{53}}:="" 0.005="" ¼="" p،="" 0.5889="" ¼="" r،="" il="" -4:="" p="" ¼="" 0.14،="" r="" ¼="" 0.3717؛="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0.0004،="" r="" ¼="" 0.6977)="" (شکل="" 2d).="" با="" توجه="" به="" فرکانس="" تولیدکنندگان="" ifn-g،="" سلول‌های="" cd4þ="" t="" واکنش‌پذیر="" به="" آنتی‌ژن="" عمدتاً="" از="" دودمان="" th1="" بودند.="" در="" مقابل،="" il-17،="" و="" همچنین="" تولیدکنندگان="" il{-10،="" فقط="" در="" فرکانس‌های="" پایین‌تر="" شناسایی="" شدند.26="" در="" مقایسه="" با="" سطوح="" اتوآنتی‌بادی،="" فرکانس="" سلول‌های="" cd4þ="" t="" مولد="" سیتوکین="" با="" غلظت="" آن‌ها="" ارتباطی="" نداشت.="" ضد="" dna="" دو="" رشته="" ای="" و="" با="" تیتر="" سرمی="" آنتی="" بادی="" های="" ضد="" هسته="" ای="" (شکل="" تکمیلی="" s3a="" و="" b).="" هیچ="" ارتباط="" دیگری="" بین="" سلول="" های="" cd4þ="" t="" واکنش="" دهنده="" به="" آنتی="" ژن="" هسته="" ای="" و="" اتوآنتی="" بادی="" ها="" به="" جز="" سلول="" های="" cd4þ="" t="" واکنش="" پذیر="" la="" نسبت="" به="" اتوآنتی="" بادی="" های="" la="" مشاهده="" نشد="" (شکل="" تکمیلی="">

Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 مورد برای شمارش سلول‌های CD4þ T ادراری مختص آنتی ژن هسته‌ای منفرد قرار گرفتند. به موازات سلول های CD4þ T ادراری، فراوانی سلول های CD4þ T واکنش دهنده به آنتی ژن هسته ای در خون محیطی تعیین شد که امکان مقایسه مستقیم فرکانس های مربوطه را در همان افراد فراهم می کند (شکل 3b). ما دریافتیم که LN غیرفعال، فراوانی سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر آنتی ژن هسته‌ای ادراری بیشتر از خون محیطی است. برای تأیید این مشاهدات، ما سلول‌های ادراری جدا شده از 4 اهداکننده فعال LN را با کربوکسی فلورسئین سوکسینیمیدیل استر برچسب‌گذاری کردیم و سلول‌های نشان‌دار شده را با PBMC‌های همسان با دهنده مخلوط کردیم تا امکان مقایسه مستقیم سلول‌های واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن را در 1 روش با استفاده از تکنیک ARTE فراهم کنیم. فراوانی سلول‌های T CD154þCD69þ در نمونه‌های تحریک‌شده و غیرتحریک‌شده از سلول‌های ادراری و خون محیطی همسان با اهداکننده برای ارزیابی اینکه آیا سلول‌های T واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن هسته‌ای در ادرار غنی شده‌اند یا نه، استفاده شد.کلیهبا محاسبه شاخص تحریک (شکل 3ج). اگرچه روش‌های کتابخانه سلول T ادراری و روش‌های ARTE در شاخص تحریک میانه نسبت به آنتی‌ژن‌های هسته‌ای متفاوت بودند (شاخص تحریک - کتابخانه سلول T ادرار: 17؛ ARTE: 2.79؛ P ¼ 0.4) (شکل 3d) تجزیه و تحلیل خود واکنش در سلول‌های CD4þ T محیطی و ادراری از هر دو روش (در مجموع n ¼ 7) افزایش شاخص تحریک آنتی ژن اختصاصی هسته‌ای در ادرار را نشان داد (0156.0 ¼ 0) (شکل 3e). این مشاهدات نشان می دهد که سلول های CD4þ T واکنش دهنده آنتی ژن هسته ای به سلول های ملتهب حمله کرده و در آنها تجمع می کنند.کلیه ها. بنابراین، التهاب بافت موضعی در SLE ممکن است یک پدیده خاص آنتی ژن باشد و مستقیماً توسط سلول‌های T خودواکنشی نفوذی تعدیل شود.

بحث

شکست تحمل در برابر آنتی ژن های هسته ای مشخصه SLE است، و علاوه بر سلول های B، سلول های T خودواکنشی نقش اصلی را در پاتوژنز آن ایفا می کنند. با این حال، از آنجایی که تشخیص سلول‌های T (خودکار) آنتی‌ژن خاص، همچنان چالش بزرگی در تحقیقات خودایمنی محسوب می‌شود، تا به امروز، اطلاعات کمی در مورد سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر به آنتی‌ژن هسته‌ای در SLE وجود دارد.

اخیراً روش‌های جدیدی برای تشخیص و شمارش سلول‌های CD4þ T اختصاصی آنتی‌ژن ایجاد شده است. رویکرد کتابخانه سلول T از گسترش پلی کلونال قبلی سلول‌های T برای شناسایی کلون‌های نادر سلول T اختصاصی آنتی ژن استفاده می‌کند. با استفاده از این تکنیک، ما توانستیم سلول های T واکنش پذیر را در برابر 5 آنتی ژن هسته ای متعارف در بیماران مبتلا به SLE فعال نشان دهیم. معایب تشخیص مبتنی بر کتابخانه، علاوه بر کار فشرده بودن، این است که رشد یا از دست دادن برخی از کلون ها در طول مرحله گسترش نمی تواند مستثنی باشد و گزینه های محدود برای تجزیه و تحلیل فنوتیپی سلول ها وجود دارد.

هم‌سیتومتری استاندارد با تعداد رویدادهای قابل تشخیص محدود می‌شود، که معمولاً تجزیه و تحلیل نمونه‌ها را به جمعیتی با فرکانس‌های بالاتر از {{0}}.01 درصد محدود می‌کند. مشاهدات ما با استفاده از کتابخانه سلول T نشان داد که فرکانس سلول‌های CD4þ T خودواکنشی در گردش برای یک اتوآنتی ژن خاص در بیماران مبتلا به شعله‌ور شدن بیماری، سلول‌های w20 در یک میلیون سلول بود که نشان‌دهنده فرکانس 0.002 درصد است. بنابراین، تشخیص سلول‌های CD4þ T اختصاصی اتوآنتی ژن با استفاده از سیتومتری استاندارد و دستکاری نشده تقریباً غیرممکن است. باچر و همکاران پیش غنی سازی سلول های CD4þ T را معرفی کرد که قبل از اکتساب در سیتومتری به آنتی ژن های خاص واکنش نشان می دهند، که به عنوان روش ARTE شناخته می شود. گسترش سلول های CD4þ T واکنش دهنده آنتی ژن هسته ای را در SLE فعال نشان می دهد. به طور قابل‌توجهی، فراوانی سلول‌های T واکنش‌پذیر با ترانس تیرتین و C. Albicans بین افراد سالم و بیماران مبتلا به SLE با فعالیت بیماری متفاوت بی‌تفاوت بود. بنابراین، گسترش مشاهده‌شده سلول‌های T خودواکنشی احتمالاً نتیجه SLE غیرفعال بیش واکنشی عمومی نیست، بلکه ناشی از گسترش سلول‌های T اختصاصی آنتی‌ژن است.

گزارش‌های قبلی قبلاً وجود سلول‌های T خودواکنشی را در SLE نشان داده‌اند که عمدتاً با استفاده از تکثیر، تولید سیتوکین، یا تنظیم مثبت نشانگرهای فعال‌سازی، البته بدون اینکه بتوان جمعیت واضحی از این سلول‌ها را تعیین کرد. 4-6،8 بهترین شواهد در مورد فراوانی سلول‌های T اختصاصی آنتی‌ژن هسته‌ای برای واکنش‌پذیری در برابر ریبونوکلئوپروتئین کوچک U1، یک هدف اتوآنتی‌ژن مشخص در بیماری بافت همبند مختلط و تنها در کسری از بیماران مبتلا به SLE وجود دارد. سلول‌های ریبونوکلئوپروتئین هسته‌ای کوچک U1 واکنش‌پذیر CD4þ T با استفاده از رقت محدود و سنجش نقطه‌ای ایمنی پیوندی با آنزیم (ELISPOT) تعیین شدند و گزارش شد که در فرکانس (40 تا 250) - 106 سلول T و (۲۰ تا ۶۰) رخ می‌دهند. ) 106 PBMC، به ترتیب، 7،9 که از نظر اندازه مشابه فرکانس سلول های خود واکنشی در مطالعه ما است. در کار خود، ما واکنش‌پذیری را در برابر چندین آنتی ژن هسته‌ای مشخصه مرتبط با SLE بررسی کردیم. جالب توجه است، اگرچه همه بیماران با LN فعال، فرکانس‌های سلول‌های CD4þ ضد آنتی‌ژن واکنش‌دهنده T ضد هسته‌ای را افزایش دادند، بیماران در مجموعه هدفشان متفاوت بودند، و واکنش‌پذیری در برابر مجموعه وسیع‌تری از آنتی‌ژن‌ها در مقایسه با بیماران مبتلا به SLE غیرفعال انجام شد. اهمیت بیولوژیکی این در حال حاضر ناشناخته است. واکنش های متفاوت سلول های CD4þ T ممکن است با تظاهرات بالینی خاصی از واکنش های مختلف مرتبط باشد که ممکن است برای پاتوژنز بیماری زائد باشد.

مشابه سایر بیماری‌های خودایمنی، ما همچنین توانستیم وجود سلول‌های CD4þ T خود واکنشی را در افراد سالم نشان دهیم، البته در فرکانس‌های بسیار پایین‌تری در مقایسه با بیماران مبتلا به SLE فعال. این سلول‌ها با مقایسه تعداد سلول‌های فعال شده با یا بدون تحریک آنتی‌ژن، حتی با تکنیک‌های بسیار حساسی مانند کتابخانه‌های سلول T یا روش‌های ARTE غیرقابل شناسایی بودند. با این حال، با شبیه‌سازی تک سلولی، ما توانستیم نشان دهیم که سیگنال «پس‌زمینه» در واقع حاوی سلول‌های CD4þ T اختصاصی آنتی‌ژن است. اینکه کدام رویدادهای خاص منجر به شکست تحمل و افزایش فرکانس سلول‌های T خودواکنشی می‌شود، حدس و گمان باقی می‌ماند. با این وجود، داده‌های ما نشان می‌دهد که گسترش کلون‌های خود واکنش‌گر نقشی در پاتوژنز SLE بازی می‌کند.

سلول‌های CD4þ واکنش‌گر به آنتی‌ژن هسته‌ای در گردش عمدتاً IFN-g و تا حدی کمتر IL-17 و IL{3}} تولید می‌کنند. این مشخصات سیتوکین همراه با همبستگی ضعیف/بدون همبستگی با تولید اتوآنتی بادی نشان می‌دهد که نقش سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن هسته‌ای ممکن است ارائه‌دهنده انحصاری کمک سلول‌های B نباشد. نشان داده شده است که IFN-g در پاتوژنز LN ضروری است. سلول های Th1 30،31 نشان داده شده است که در بافت ملتهب کلیه در SLE به کار گرفته می شوند، 20،32 سلول های T واکنش دهنده به آنتی ژن هسته ای را کاندیدهای اولیه برای تهاجم می کنند.کلیه ها، جایی که آنها با اتوآنتی ژن همزاد خود در همه جا مواجه می شوند. سلول‌های T ادراری قبلاً برای بازتاب فعالیت بیماری و بازتاب فنوتیپ سلول‌های داخل کلیوی در LN20,33 توصیف شده‌اند. بنابراین، ما از سلول‌های T ادراری به عنوان یک پروکسی برای سلول‌های T کلیه استفاده کردیم. سلول های T ادراری تنوع TCR محدودی را نشان دادند که مطابق با مشاهدات در استکلیهبیوپسی، 19،34 که نشان دهنده غنی سازی کلون های خاص سلول T در بافت ملتهب کلیه است. در میان سلول‌های T ادراری، ما توانستیم سلول‌های T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن هسته‌ای را شناسایی کنیم و فرکانس آنها در مقایسه با سلول‌های T گردش خون غنی‌تر شد. در نتیجه، به نظر می‌رسد که سلول‌های واکنش‌گر آنتی‌ژن هسته‌ای به‌طور مستقیم در انتشار آسیب‌های اندام موضعی شرکت می‌کنند.

به طور خلاصه، ما در اینجا نشان می‌دهیم که سلول‌های CD4þ T واکنش‌پذیر آنتی‌ژن هسته‌ای SLE غیرفعال گسترش یافته‌اند. آنها از نظر فنوتیپی عمدتاً سلول های Th1 T تولید کننده IFN-g هستند و به اندام های هدف ملتهب مانند کلیه حمله می کنند.

مواد و روش ها

روش های تفصیلی در مواد تکمیلی آورده شده است.

افراد و نمونه خون و ادرار

نمونه خون از 17 فرد سالم، 12 بیمار مبتلا به SLE غیر فعال (نمره SLEDAI) گرفته شد.<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). علاوه بر این، نمونه ادرار از 12 بیمار مبتلا به SLE و LN فعال گرفته شد. همه آزمودنی ها رضایت آگاهانه خود را بر اساس تأییدیه اخلاقی به دست آمده توسط هیئت بازبینی سازمانی و مقامات اخلاقی در Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12، EA 1/098/07، و 1/036/16) داده بودند. PBMCs و سلول های ادراری با استفاده از گرادیان تراکم Ficoll-Hypaque تهیه شدند.

آنتی بادی ها و فلو سیتومتری

بسته به آزمایش‌ها، چندین مولکول سطحی روی سلول‌های تحریک‌شده با آنتی‌ژن در ترکیب‌های مختلف آنتی‌بادی‌های مونوکلونال زیر رنگ‌آمیزی شدند: anti-CD3، -CD4، -CD8، -CD14، -CD20، -CD69 و -CD154. برای تشخیص سلول‌های زنده و مرده، از کیت LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd., Paisley, UK) استفاده شد. برای رنگ آمیزی محفظه سلولی داخل سلولی، سلول ها با 2 درصد (v/v) پارافورمالدئید به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند و با BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA) نفوذپذیر شدند. آنتی ژن های زیر با استفاده از پروتکل استاندارد به صورت داخل سلولی رنگ آمیزی شدند: CD154، IFN-g، IL{20}}، IL{21}}، IL{22}} و IL{23}}. با استفاده از نرم افزار BDFACSDiva (BD Biosciences)، نمونه ها بر روی سیتومترهای BD FASCanto II و BD LSRFortessa (BD Biosciences) در مرکز اصلی فلوسیتومتری Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin به دست آمد. داده های فلوسایتومتری با استفاده از نرم افزار FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

آماده سازی آنتی ژن و استخر آنتی ژن

ما از آنتی ژن‌های زیر برای تحریک سلول‌های CD4þ T در سنجش کتابخانه سلول T استفاده کردیم: 0.5 mg/ml پروتئین نوترکیب انسانی SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 5{{9 }} نانوگرم در میلی لیتر پروتئین نوترکیب انسانیSNRP70 (RNP70) (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0.5 mg/ml پروتئین هیستون طبیعی انسانی (Abcam Plc) .)، 0.5 میلی گرم در میلی لیتر پروتئین نوترکیب SS-A/Ro انسانی (با مهربانی توسط Euroimmun AG، لوبک، آلمان ارائه می شود)، 0.5 میلی گرم در میلی لیتر پروتئین SS-B/Larecombinant انسانی (با مهربانی توسط Orgentec DiagnostikaGmbH، ماینتس، آلمان ارائه شده است) 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich ChemieGmbH، Steinheim، آلمان)، 1 mg/ml PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH، Bergisch Gladbach، آلمان) و 0.5 mg/ml پروتئین نوترکیب ترانس تیرتین انسانی (ATG) سئونگنام، کره جنوبی).

کتابخانه سلول های T محیطی و ادراری

The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >برای نمونه های خون محیطی و ادرار به ترتیب 99 درصد و 70 تا 75 درصد. به موازات آن، سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن با جمع‌آوری سلول‌های CD3 از PBMC‌ها پس از تخلیه با میکروبیدهای ضد انسان CD3 (Miltenyi Biotec GmbH) تهیه و به صورت انجماد نگهداری شدند. پس از 1 تا 2 هفته کشت، بخش‌هایی از سلول‌های CD4þ T تقویت‌شده، بسته به تعداد آنتی‌ژن‌هایی که باید آنالیز شوند، در صفحات چاهی توزیع شدند. قبل از تحریک با آنتی ژن، سلول ها حداقل به مدت 4 روز استراحت داده شدند. در روز تحریک، سلول های ارائه دهنده آنتی ژن ذوب شده و به نسبت حداقل 1 سلول ارائه دهنده آنتی ژن به 100 سلول CD4þ T در کشت سلول T توزیع شدند. کتابخانه های سلول T CD4þ برای کنترل منفی (سلول های تحریک نشده) و کنترل مثبت (سلول های تحریک شده با SEB) همیشه در آزمایش ها گنجانده شدند. سلول های CD4þ T با آنتی ژن به مدت 4 روز تحریک شدند و تکثیر با استفاده از پروتکل استاندارد [3H]- تیمیدین تعیین شد.

انفجارهای سلول T تقویت شده به آنتی ژن های نمایش داده شده توسط CPM سوسوزن بسیار ناهمگن پاسخ متفاوتی دادند. بنابراین، عادی سازی آستانه تکثیر تعیین شده به عنوان نمره z اختصاصی دهنده ضروری بود. امتیاز z به عنوان 5 تفاوت صدک 75 و 25 بالاتر از CPM میانه ریزکشت های تحریک نشده محاسبه شد. سلول‌ها در ریزکشت‌های تحریک‌شده با SEB به‌عنوان یک کنترل مثبت عمل کردند. نکته قابل توجه، ریزکشت ها با شاخص تحریک SEB از<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">

روش های ARTE محیطی و ادراری

ما از پروتکلی پیروی کردیم که از کیت میکروبید CD154 (Mil-tenyi Biotec GmbH) استفاده می‌کند. 35 به طور خلاصه، سلول‌ها به مدت 7 ساعت با آنتی‌ژن‌ها تحریک شدند و سپس با آنتی‌بادی‌های ضد بیوتین CD و میکروبیدهای ضد بیوتین برچسب‌گذاری شدند. به دستورالعمل سازنده سلول‌های نشان‌دار روی ستون‌های MS کالیبره‌شده (Miltenyi Biotec GmbH) برای غنی‌سازی سلول‌های بیان‌کننده CD بارگذاری شدند. برچسب‌گذاری سلول‌ها با کربوکسی فلورسین دی استات N-succinimidyl استر (Sigma Aldrich Chemie GmbH) طبق یک پروتکل استاندارد انجام شد.

تولید کلون های تک سلولی

کلون‌های تک سلولی از سلول‌های واکنش‌دهنده به آنتی‌ژن تولید شدند که با بیان CD154 به دنبال پروتکل ARTE غنی شدند. سلول‌های بیان‌کننده CD با فیلتر آماده‌سازی 30- میلی‌متری (Miltenyi Biotec GmbH) فیلتر شدند و مجدداً معلق شدند. در 1 میلی لیتر 2{8}} درصد (v/v) سالین بافر فسفات سرد، 0.5 درصد آلبومین سرم گاوی و 2 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید. سلول ها تک سلولی بودند که برای فنوتیپ CD154þCD69þ طبقه بندی شده بودند، و سلول های منفرد طبقه بندی شده در حفره های تکی از صفحات چاهک در حضور سلول های تغذیه کننده کشت شدند. کشت های سلولی به مدت 3 تا 4 روز تا زمانی که چندین کلون قابل مشاهده باشند حفظ شدند. یک روز قبل از تحریک مجدد، سلول های ارائه دهنده آنتی ژن ذوب شده و به نسبت حداقل 1 سلول ارائه دهنده آنتی ژن به 100 سلول CD4þ T در کشت سلول T توزیع شدند. سلول ها با 1 میلی گرم در میلی لیتر آنتی ژن تحریک شدند و کلون های تحریک نشده به عنوان یک کنترل منفی خدمت کردند.

تجزیه و تحلیل رپرتوار TCR مبتنی بر توالی یابی نسل بعدی

DNA ژنومی از سلول‌های CD4þ T محیطی و سلول‌های ادراری با استفاده از کیت میکرو کیت AllPrep DNA/RNA (Qiagen، Venlo، هلند) جدا شد. منبع TCR-b نوترکیب طبق پروتکل همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تقویت شد. 36 خوانده شده با استفاده از IMSEQ،37 پردازش شد و کلونوتیپ های مساوی خوشه بندی شدند و بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

آمار

آزمون های آماری با نرم افزار GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) انجام شد. تنظیم Bonferroni برای مقایسه های چندگانه اعمال شد. در آزمایش‌ها با مجموعه داده‌های مستقل و وابسته، از آزمون من ویتنی U و آزمون رتبه‌بندی علامت‌دار Wil-Coxon استفاده شد. پس از تعدیل بونفرونی برای مقایسه های چندگانه، محاسبه مقادیر P بحرانی تصحیح شد زیرا بر اساس تعداد مقایسه های برنامه ریزی شده است. مقادیر P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">

قدردانی

ما از Toralf Kaiser و Jenny Kirsch (مرکز فلوسیتومتری و مرتب‌سازی سلولی، Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) برای کمک به فلوسیتومتری و مرتب‌سازی سلولی تشکر می‌کنیم. حمایت از این مطالعات توسط کمک های مالی DeutscheForschungsgemeinschaft در Sonderforschungsbereich 650 toGR و کمک های مالی از Deutsche Gesellschaft für Nephrologie و برنامه دانشمندان بالینی Charité - Universitätsmedizin برلین و موسسه بهداشت برلین به PE ارائه شد.