الیگوساکاریدها آسیب حاد کلیه را با کاهش خوشه تمایز بهبود می‌دهند 44-واکنش‌های ایمنی واسطه‌ای در سلول‌های لوله‌ای کلیوی

چکیده:آسیب حاد کلیه (AKI)یک قسمت ناگهانی ازآسیب کلیهکه معمولا در بیماران بستری در بیمارستان ها رخ می دهد. تا به امروز، هیچ درمان ایده آلی برای کاهش ایجاد نشده استشدت AKI. الیگو-فوکوئیدان(FC) برای جلوگیری از فیبروز بینابینی کلیوی، با خوشه پروتئین سطح سلولی لوله کلیوی تمایز 44 (CD44) تداخل دارد. با این حال، تاثیر الیگوساکاریدها بر AKI ناشناخته باقی مانده است. در این مطالعه، FC، galacto-oligosaccharide (GOS)، و fructo-oligosaccharide (FOS) برای بررسی تاثیر الیگوساکاریدها بر AKI انتخاب شدند. ثابت شده است که هر سه الیگوساکارید تا حدی توسط روده جذب می شوند. ما دریافتیم که الیگوساکاریدها به طور وابسته به دوز آنتی ژنیسیته CD44 را کاهش داده و بیان CD44، فسفو-JNK، MCP{9}}، IL{10}} و TNF- ناشی از هیپوکسی را در NRK{12}}E سرکوب می‌کنند. سلول های لوله ای کلیه در همین حال، ترانسفکشن CD44 siRNA و مهارکننده JNK SP600125 بیان فسفو-JNK و سیتوکین‌ها را کاهش دادند. لیگاند CD44، هیالورونان، با تأثیر الیگوساکاریدها بر CD44 و فسفو-JNK مقابله کرد. در 2 روز پس از جراحی برای آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد، الیگوساکاریدها التهاب کلیه، کراتین سرم، MCP{23}}، IL{24}} و TNF- را در موش‌های AKI کاهش دادند. در 7 روز پس از جراحی، بهبود کلیه ارتقا یافت. این نتایج نشان می‌دهد که FC، GOS، و FOS آبشار CD44/JNK و سیتوکین‌های ناشی از هیپوکسی را در سلول‌های لوله‌ای کلیوی مهار می‌کنند، در نتیجه AKI و التهاب کلیه را در موش‌های AKI بهبود می‌بخشند. بنابراین،مکمل الیگوساکاریدیک استراتژی بالقوه مراقبت های بهداشتی برای بیماران مبتلا به AKI است.

کلمات کلیدی: آسیب حاد کلیه; خوشه تمایز 44; فروکتو-الیگوساکارید؛ گالاکتولیگوساکارید؛ الیگو-فوکوئیدان; التهاب

1. مقدمه

آسیب حاد کلیه(AKI) با کاهش ناگهانی نرخ فیلتراسیون گلومرولی و افزایش متعاقب آن در کراتینین سرم مشخص می شود. این آسیب در بیماران بستری در بیمارستان ها و بخش های مراقبت های ویژه به ویژه افراد مسن شایع است. ایسکمی، سپسیس و سمیت کلیوی علل اصلی AKI هستند که اغلب همزمان وجود دارند و بنابراین تشخیص و درمان را پیچیده می‌کنند [1]. AKI شدید بیماران ترخیص شده را در معرض خطر عوارض جانبی مانند بیماری مزمن کلیوی، حوادث قلبی عروقی، سرطان و عفونت قرار می دهد [2]. AKI رشد سریعی دارد و هیچ درمان موثری برای جلوگیری یا کاهش شدت آن در دسترس نیست. مصرف مواد مغذی خاص می تواند آسیب لوله های کلیوی را در AKI کاهش دهد [3]. بنابراین، مطالعه تاثیر تغذیه خاص بر AKI به بهبود AKI و خطرات همراه بیماران ترخیص شده کمک می کند.

التهاب و جذب لکوسیتمیانجی های کلیدی AKI هستند. کلیه ها، به خصوص سلول های لوله ای کلیه، تولید می کنندسیتوکین های التهابیدر طول AKI، مانند IL-1، IL-6، پروتئین جذب کننده شیمیایی مونوسیت-1 (MCP-1)، و فاکتور نکروز تومور- (TNF-) [4،5] . این سیتوکین ها التهاب سیستمیک و جذب لکوسیت را بیشتر القا می کنند. اگرچه چندین زیر مجموعه لکوسیت اثرات محافظتی بر AKI (مانند سلول های تنظیم کننده T) دارند، بیشتر نوتروفیل ها، مونوسیت ها و سلول های دندریتیک برای بازیابی AKI مضر هستند [6]. التهاب سیستمیک نیز به دلیل سطوح بالای سیتوکین برای بهبودی از AKI مضر است [7]. در میان سیتوکین‌های ترشح شده از کلیه، MCP{11}} عمدتاً مسئول جذب لکوسیت است، به سیتوکین‌های مختلف از جمله IL{12}} و TNF- [8،9] پاسخ می‌دهد و نقش مهمی در پاتوژنز دارد. آسیب های مختلف کلیه [10]. در سلول‌های لوله‌ای پروگزیمال انسانی HK{17}}، بیان MCP{19}} ناشی از هیپوکسی توسط مسیر c-Jun NH{21}} ترمینال کیناز (JNK) واسطه می‌شود [11]. مسیر p38 همچنین در بیان MCP{25}} ناشی از آلبومین در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیه نقش دارد [12]. بنابراین، تنظیم مسیرهای JNK و p38 ممکن است بر التهاب و جذب لکوسیت در AKI تأثیر بگذارد.

الیگوساکاریدها پلیمرهای ساکاریدی حاوی 3 تا 10 مونوساکارید هستند که غیرقابل هضم هستند و جزء اصلی کل پری بیوتیک های موجود به عنوان افزودنی های غذایی را تشکیل می دهند [13]. بیشتر فروکتو الیگوساکاریدها (FOSs) که در بدن انسان خورده می شوند به طور کامل توسط فلور کولون تخمیر می شوند و بخش کوچکی از آن در ادرار بازیابی می شود [14]. گالاکتوالیگوساکاریدها (GOSs) می توانند در خون جذب شده و متعاقباً از طریق ادرار دفع شوند [15]. همین وضعیت در مورد fucoidan در جلبک های دریایی قهوه ای [16] صدق می کند. الیگوساکاریدهای جذب شده می توانند بر واکنش های بیوشیمیایی و شناسایی سلول ها تأثیر بگذارند [17]. مطالعه قبلی ما نشان می‌دهد که الیگو-فوکوئیدان (FC) با تعامل بین پروتئین CD44 سطح سلول لوله‌ای کلیوی و لیگاندهای خارج سلولی آن تداخل می‌کند و در نتیجه از فیبروز بینابینی کلیوی جلوگیری می‌کند [18]. تعامل بین CD44 و لیگاندهای خارج سلولی آن مسیر سیگنالینگ JNK را ارتقا می دهد [19]. بنابراین، مصرف روزانه الیگوساکاریدها ممکن است التهاب کلیه را در بیماران مبتلا به AKI کاهش دهد. با این حال، تاثیر این پلیمرها بر AKI ناشناخته باقی مانده است. این مطالعه اثر FC، FOS و GOS را بر سلول‌های لوله‌ای کلیوی تحت درمان با هیپوکسی و موش‌های AKI با آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد (IRI) بررسی کرد. نتایج نشان داد که سه الیگوساکارید CD{16}}واکنش‌های ایمنی کلیوی را سرکوب می‌کنند و شدت پس از AKI را کاهش می‌دهند. بنابراین، استفاده از این پلیمرها به عنوان یک مکمل غذایی یک استراتژی جدید درمان AKI را ارائه می دهد

2. مواد و روشها

2.1. مواد

FOS (متوسط ​​درجه پلیمریزاسیون <10)، GOS (متوسط ​​درجه پلیمریزاسیون <8)، و FC (متوسط ​​درجه پلیمریزاسیون <5) از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا، Cat. No. F8052)، Carbosynth (Berkshire، UK، Cat. No. OG32134) و Hi-Q Marine Biotech International (تایپه، تایوان). الیگوساکاریدها در H2O دو تقطیر شده حل شده و با استفاده از فیلترهای استریل 0.22 میکرومتر (Merck Millipore، دارمشتات، آلمان) فیلتر شدند. هیالورونان (HA) و سایر مواد شیمیایی با درجه معرف از سیگما به دست آمدند. آنتی بادی علیه JNK (sc-7345), phospho-JNK (sc-6254), MCP{14}} (sc-52701), IL-1 (sc{17} }})، و TNF- (sc-52746) از بیوتکنولوژی سانتا کروز (دالاس، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. آنتی بادی علیه p38 (9212) و فسفو-p38 (9211) از فناوری سیگنالینگ سلولی (Danvers، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. آنتی بادی ها علیه Ly6G (ab25377) و F4/80 (ab100790) از Abcam (کمبریج، انگلستان) خریداری شدند. آنتی بادی علیه HIF{30}} (NB100-105) از Novus Biologicals (Centennial، CO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

2.2. کشت سلولی

سلول‌های لوله‌ای کلیوی پروگزیمال موش (NRK-52E) و خط ماکروفاژ موش RAW264.7 از موسسه تحقیقات و توسعه صنایع غذایی (Hsinchu، تایوان) خریداری شدند. کشت در DMEM مکمل با محلول آنتی بیوتیک/ضد قارچ و 10% سرم جنین گوساله. و در دمای 37 ◦C و رطوبت 95% در انکوباتور CO2 نگهداری می شود. پس از رسیدن به تلاقی 70 درصد، سلول ها در محیطی بدون سرم کشت و قبل از آزمایش یک شبه انکوبه شدند. برای آزمایش هیپوکسی، سلول‌های NRK-52E و بسته Anaero (Mitsubishi Gas Chemical America، نیویورک، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) در شیشه‌های مستطیلی (Mitsubishi Gas Chemical America) قرار گرفتند و کل مجموعه در یک 37 قرار گرفت. ◦ انکوباتور C به مدت 4 ساعت. سپس سلول ها در یک شب تحت شرایط عادی کشت داده شدند.

2.3. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

به طور خلاصه، 15 میکروگرم از لیز پروتئین NRK-52E به هر خط اعمال شد و نتایج با وسترن بلات آنالیز شد. سطوح باند پروتئین نسبی از پنج آزمایش مستقل توسط نرم افزار Quantiscan از Biosoft (کمبریج، انگلستان) اندازه گیری شد.

2.4. انتقال کوتاه تداخلی (si)RNA CD44

siRNA CD44 موش صحرایی (4390771) از Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) خریداری شد. پس از رشد تا 70% تلاقی، سلول ها با استفاده از معرف ترانسفکشن Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) با siRNA به دستور سازنده ترانسفکت شدند.

2.5. سنجش تکثیر سلولی

پس از کشت سلول‌های NRK{0}E هیپوکسیک به مدت 24 ساعت، از همان محیط برای کشت سلول‌های RAW264.7 در یک صفحه 96- چاه (2000 سلول در چاهک) استفاده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون، تکثیر سلول‌های RAW264.7 با استفاده از کیت سنجش SRB (Abcam، Cat. No. ab235935) طبق دستورالعمل‌های سازنده آنالیز شد.

2.6. تست های آنتی ژنی CD44

CD44 موش نوترکیب از R&D Systems (Minneapolis، MN، USA، Cat. No. 6577-CD) به دست آمد و برای ایجاد واکنش اتصال با HA توسط دستورالعمل سازنده استفاده شد. به طور خلاصه، 20 نانوگرم در میلی لیتر CD44 موش نوترکیب با غلظت های مختلف FC، FOS، یا GOS به مدت 10 دقیقه برای بررسی تأثیر الیگوساکاریدها بر آنتی ژنیسیته CD44 مخلوط شد. مخلوط ها با استفاده از کیت CD44 ELISA (Abcam، Cat. No. ab213928) طبق دستورالعمل سازنده آنالیز شدند.

2.7. حیوانات تجربی و IRI کلیه

موش های نر 129S1/SvImJ هشت هفته ای از Lasco Technology (تایپه، تایوان) خریداری شدند. همه آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشی دانشگاه پزشکی تایپه (تأیید شماره LAC-2019-0511) تأیید شد و توسط راهنمای NIH برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی تشکیل شد. برای القای IRI، موش‌ها (با وزن 21-23 گرم) به مدت 30 دقیقه با انجام یک برش پهلو، تحت فشار دو طرفه ساقه کلیه قرار گرفتند [20]. موش ها قبل از عمل با بیهوشی استنشاقی با ایزوفلوران بیهوش شدند. موش‌هایی که تحت عمل شم قرار گرفتند، به جز بستن ساقه‌های کلیوی، تحت عمل مشابهی قرار گرفتند. همه موش ها از 1 روز قبل تا 2 روز پس از عمل IRI از طریق گاواژ خوراکی با الیگوساکارید تغذیه شدند. موش‌های آزمایشی برای نتایج روز سوم و هفتم به پنج گروه زیر با n=8 تقسیم شدند: (1) گروه شم. (2) گروه AKI؛ (3) گروه AKI تغذیه شده با FC (10 میلی گرم / کیلوگرم / روز). (4) گروه AKI تغذیه شده با FOS (10 میلی گرم / کیلوگرم / روز). و (5) گروه AKI تغذیه شده با GOS (10 mg/kg/day). موش‌ها 3 یا 7 روز پس از جراحی قربانی شدند و خون جمع‌آوری و با استفاده از آنالایزر بیوشیمیایی و کیت‌های الایزا آنالیز شد. سطح کراتینین سرم هر موش برای ارزیابی توسعه AKI مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مورفولوژی کلیه با رنگ‌آمیزی اسید پریودیک-شیف (PAS) و رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) در مقاطع پارافین 2 میکرومتری ثابت با فرمالین مورد بررسی قرار گرفت.

2.8. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی

بافت‌های کلیه با پارافورمالدئید بافر 4 درصد تثبیت شدند، در پارافین جاسازی شدند و برای رنگ‌آمیزی با کیت‌های HRP DAB System Quanto Detection UltraVision (Thermo Scientific، Fremont، CA، USA) و هیبریداسیون با آنتی‌بادی اصلی بر اساس دستورالعمل‌های سازنده، به بخش‌های 2 میکرومتری بریده شدند. .

2.9. رنگ آمیزی PAS

مقاطع کلیه با کیت رنگ آمیزی PAS (Abcam، Cat. No. ab150680) مطابق با دستورالعمل سازنده رنگ آمیزی شدند.

2.10. سنجش الایزا

محیط کشت سلول‌های NRK{0}E و نمونه‌های سرم موش‌های آزمایشگاهی با استفاده از کیت MCP{1}} ELISA (Abcam، Cat. No. ab208979) و IL{3}} جمع‌آوری و آنالیز شدند. کیت الایزا (Abcam، Cat. No. ab197742). نمونه‌های سرم نیز با استفاده از کیت TNF- ELISA (R&D Systems، Cat. No. MTA{6}}B) و کیت ELISA لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL) (R&D Systems, Cat. No. MLCN20) توسط دستورالعمل سازنده

2.11. آزمون های آماری

تفاوت معنی داری بین دو گروه با استفاده از آزمون t-test مشخص شد. تفاوت ها برای مقادیر p معنی دار در نظر گرفته شد<0.05

3. نتایج

3.1. الیگوساکاریدها از افزایش CD44 و سیتوکین ها در سلول های NRK{3}}E هیپوکسیک جلوگیری می کنند

بیان CD44 در سلول‌های NRK{1}E تیمار شده با FC، FOS و GOS ابتدا برای ارزیابی تأثیر الیگوساکاریدها بر سلول‌های لوله‌ای کلیوی بررسی شد. بیان CD44 ناشی از هیپوکسی توسط هر سه الیگوساکارید در محدوده 0 مهار شد. بنابراین، دوز الیگوساکارید 0.1 میلی گرم در میلی لیتر در آزمایشات سلولی زیر استفاده شد. در سیستم آماده‌شده، درمان هیپوکسی به طور قابل‌توجهی بیان نشانگر هیپوکسی HIF{11}} را در سلول‌های NRK{12}}E القا کرد، که نشان می‌دهد سلول‌ها در حالت هیپوکسی هستند (شکل 1B). هیپوکسی سطوح فسفریله JNK، MCP{14}}، IL{15}} و TNF- را افزایش داد، اما نه در سلول‌های تیمار شده با الیگوساکاریدها (شکل 1B، C). بیان JNK در سلول های هیپوکسیک افزایش یافته است اما در سلول های تحت درمان با FC یا تحت درمان با FOS افزایش نیافته است. GOS بر بیان JNK در سلول‌های هیپوکسیک تأثیری نداشت، اما تنظیم دخیل JNK فسفریله را سرکوب کرد. بنابراین، الیگوساکاریدها می توانند انتقال سیگنالینگ JNK ناشی از هیپوکسی و بیان سیتوکین را در سلول های توبولار کلیوی مهار کنند. اگرچه FC و GOS فسفر p38 را در سلول‌های هیپوکسیک تنظیم مثبت کردند، بیان این پروتئین در سلول‌های هیپوکسیک افزایش نیافت. این یافته نشان می‌دهد که p38 نقش کلیدی در پاسخ‌های ناشی از هیپوکسی در سلول‌های NRK{24}} ندارد.

3.2. CD44 و JNK نقش مهمی در افزایش سیتوکین در سلولهای NRK{3}}E هیپوکسیک دارند

بیان CD44، JNK فسفریله، و سیتوکین ها در سلول های توبولار کلیوی همگی تحت تأثیر الیگوساکاریدها قرار گرفتند، اما ارتباط آنها هنوز مشخص نشده است. برای بررسی نقش CD44 در انتقال سیگنال دهی JNK و بیان سیتوکین در سلول های هیپوکسیک، سلول های NRK{2}}E با دوزهای مختلف CD44 siRNA ترانسفکت شدند. CD44 siRNA در 50 و 100 بعد از ظهر به طور موثر بیان CD44 افزایش یافته توسط هیپوکسی را مسدود کرد و به طور قابل توجهی از افزایش ناشی از هیپوکسی در سطوح فسفریله JNK، MCP{10}}، IL{11}}، و TNF- جلوگیری کرد (شکل 2A). تأثیر مسدود کردن CD44 بر بیان JNK مربوط به دوزهای siRNA بود. بیان JNK در سلول های هیپوکسیک توسط CD44 siRNA در 50 pM القا شد اما در 100 pM مهار شد. هر دو دوز تنظیم دخیل JNK فسفریله را سرکوب کردند. مهارکننده انتخابی برای JNK، SP600125، بیان MCP{19}}، IL{20}}، و TNF- را در سلول های NRK{22}}E هیپوکسیک به طور قابل توجهی کاهش داد (شکل 2B). این نتایج نشان می دهد که اثر مهاری انتقال CD44 siRNA بر سیتوکین های ناشی از هیپوکسی به کاهش JNK فسفریله نسبت داده می شود.

شکل 1. اثر مهاری الیگوساکاریدها بر انتقال سیگنال CD44 در سلول های NRK{2}}E هیپوکسیک. سلول ها با FC، FOS، یا GOS به مدت 3{7}} دقیقه پیش تیمار شدند و سپس تحت کشت هیپوکسیک قرار گرفتند. بیان پروتئین با وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. (الف) اثرات وابسته به دوز الیگوساکاریدها بر بیان CD44. (ب) تأثیر الیگوساکاریدها بر سیگنال‌های مرتبط با CD. غلظت الیگوساکارید 0.1 میلی گرم در میلی لیتر تعیین شد. افزایش نسبی در نوارهای پروتئینی نیز به شکل نمودار میله ای (C) ارائه شده است. نتایج به صورت میانگین ± SD (n=4) بیان می‌شوند.

شکل 2. نقش CD44 و JNK در پاسخ های التهابی ناشی از هیپوکسی در سلول های NRK{3}}. بیان پروتئین با وسترن بلات آنالیز شد. (الف) اثر مهاری انتقال CD44 siRNA بر JNK فسفریله و سیتوکین ها. (ب) اثر مهاری SP600125 بر روی سیتوکین ها. سلول ها با 20 میکرومولار SP600125 به مدت 30 دقیقه قبل از هیپوکسی تحت تیمار قرار گرفتند. افزایش نسبی در نوارهای پروتئینی نیز به شکل نمودار میله ای ارائه شده است. نتایج به صورت میانگین ± SD (n=4) بیان می‌شوند.

3.3. ترشح سیتوکین ناشی از هیپوکسی در سلول‌های لوله‌ای کلیه، تکثیر ماکروفاژها را تقویت می‌کند.

التهاب واسطه آسیب کلیوی در AKI است. از این رو، تأثیر سواری الیگوساکا بر روی لکوسیت ها مورد بررسی قرار گرفت. شکل 3A نشان می دهد که FC، FOS و GOS بر تکثیر سلول های RAW264.7 ماکروفاژ تأثیری نداشتند. تکثیر سلول‌های RAW264.7 توسط محیط کشت ساعتی برای سلول‌های NRK{6}}E هیپوکسیک (شکل 3B) تقویت شد، اما نه توسط محیط کشت سلول‌های NRK{8}}E هیپوکسیک که با الیگوساکاریدها اولی سطوح MCP-1 و IL-1 بالاتری نسبت به دومی داشت (شکل 3C، D). هر سه الیگوساکارید به طور قابل توجهی MCP{12}} و IL-1 را در محیط کشت سلول های NRK{14}}E هیپوکسیک کاهش دادند. بنابراین، FC، FOS و GOS می‌توانند بیان و ترشح سیتوکین‌ها را در سلول‌های لوله‌های کلیوی هیپوکسیک کاهش دهند و در نتیجه التهاب ناشی از سلول‌های لوله‌ای کلیوی آسیب دیده را کاهش دهند.