طی چند دهه گذشته، دانشمندان به پیشرفت های چشمگیری در بهبود سلامت و افزایش طول عمر دست یافته اند.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

مقدمه

سلول‌های اپیتلیال لنز (LECs) یک لایه سلولی را تشکیل می‌دهند که کپسول قدامی عدسی را پوشانده و تا کمان عدسی استوایی گسترش می‌یابد [1، 2]. ساخت و عملکرد طبیعی LEC ها برای حفظ شفافیت و هموستاز متابولیک کل لنز ضروری است [3]. شواهد فزاینده نشان می‌دهد که پیری LECs ممکن است باعث تغییر، دناتوره شدن و تجمع پروتئین‌های عدسی از جمله آنزیم‌ها و کریستالین‌ها شود و در نتیجه در نهایت منجر به کدورت عدسی یا حتی آب مروارید شود [3-5]. آب مروارید وابسته به سن (ARC) علت اصلی اختلال بینایی و نابینایی است که به شدت بر کیفیت زندگی افراد مسن تأثیر می گذارد [6]. در حال حاضر، هیچ استراتژی موثری برای جلوگیری از پیشرفت ARC وجود ندارد. بنابراین، لازم است یک مداخله دارویی ایجاد شود که بتواند شفافیت لنز را بهبود بخشد و پیشرفت ARC را به تاخیر بیندازد.

در طول چند دهه گذشته، دانشمندان با استفاده از چندین مداخله ژنتیکی، غذایی و دارویی به پیشرفت های قابل توجهی در بهبود سلامت و افزایش طول عمر دست یافته اند [7]. متفورمین (MET) یکی از عوامل ضد پیری است که به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است. مطالعات اساسی نشان می دهد که MET می تواند پیری را کاهش داده و طول عمر سالم را در سیستم های مختلف مدل حیوانی افزایش دهد. MET نه تنها می تواند طول عمر Caenorhabditis elegans را افزایش دهد، بلکه سلامت و سرزندگی آن را نیز افزایش می دهد [8]. MET می تواند تجمع آسیب DNA مرتبط با سن و استرس اکسیداتیو را در سلول های بنیادی روده میانی مگس سرکه کاهش دهد تا طول عمر آنها را افزایش دهد [9]. مطالعات قبلی همچنین نشان می دهد که تجویز مزمن با دوز کم MET سلامت و طول عمر موش ها را بهبود می بخشد [10]. علاوه بر این، شواهد در حال ظهور نشان می‌دهد که وقتی بیماران مبتلا به دیابت با MET درمان می‌شوند، مزایای بقای خود را نشان می‌دهند، حتی در مقایسه با گروه کنترل که دیابت ندارند [11].

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

علاوه بر فعالیت افزایش طول عمر MET در ارگانیسم‌های مدل مختلف، MET چندین مسیر سیگنال‌دهی سلولی را برای بهبود بیماری‌های مرتبط با سن هدف قرار می‌دهد. نشان داده شده است که MET اتوفاژی را عمدتاً از طریق فعال شدن پروتئین کیناز فعال شده با آدنوزین مونوفسفات (AMP) تعدیل می کند و از تخریب عصبی و التهاب عصبی برای ایفای نقش محافظت کننده عصبی در بیماری پارکینسون جلوگیری می کند [12]. به طور مشابه، MET تغییرات مربوط به سن را در سلول اندوتلیال سینوسی کبد از طریق مسیرهای AMPK و اکسید نیتریک اندوتلیال بهبود می بخشد [13].دوز cistanche redditعلاوه بر این، فعال‌سازی مزمن AMPK توسط MET از کاردیومیوپاتی با تنظیم کردن اتوفاژی در موش‌های OVE26 مبتلا به دیابت جلوگیری می‌کند [14]. علاوه بر این، MET با افزایش اتوفاژی و محدودیت کالری، زوال قلبی عروقی مرتبط با سن را کاهش می دهد [15]. علاوه بر این، درمان MET می‌تواند آترواسکلروز مرتبط با سن را در موش‌ها و خرگوش‌های ApoE ناشی از رژیم غذایی پرچرب مهار کند، به طور قابل‌توجهی از کلسیفیکاسیون پلاک آترواسکلروتیک، کاهش سطح پروتئین واکنش‌گر C با حساسیت بالا، و سرکوب فعال‌سازی مسیر کاپا B(NF-kB) فاکتور هسته ای در عروق خونی [{10}}].

بر اساس این مشاهدات، مطالعه حاضر تلاش کرد تا بررسی کند که آیا MET می‌تواند پیری ARC و مکانیسم مولکولی زیربنایی را به تاخیر بیندازد. یافته‌های ما به شرح زیر است: (i) درمان مزمن با دوز کم MET پیری LEC‌ها را در موش‌های مسن به‌طور طبیعی به تأخیر انداخت و در نتیجه تیرگی لنز را مهار کرد؛ (i) مسیر AMPK غیرفعال شد و شار اتوفاژیک در LEC‌های پیر مختل شد. درمان مزمن با دوز کم MET با فعال کردن مسیر AMPK و افزایش اتوفاژی، پیری LECها را در موش‌های مسن طبیعی به تاخیر انداخت. یافته‌های ما نقش احتمالی ضد پیری MET را اثبات می‌کند و شواهد کافی ارائه می‌کند که MET ممکن است یک گزینه درمانی احتمالی برای ARC باشد.

نتایج

پیری LECها با ARC در موش‌های مسن طبیعی همراه بود

مکانیسم های بالقوه متعدد ARC، از جمله اثر پیری، به طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است.فواید عصاره سیستانچبا این حال، ارتباط بین پیری LEC و ARC در داخل بدن نامشخص است. ما فرض کردیم که پیری LECها ممکن است منجر به ARC در داخل بدن شود. بنابراین، ما یک مدل موس از ARC ساختیم. نتایج ما نشان داد که شفافیت عدسی در موش‌های مسن‌تر (موش‌های مسن‌تر) به طور قابل‌توجهی در مقایسه با گروه کنترل (موش‌های جوان) کاهش یافته است (شکل 1a). همانطور که در شکل 1b نشان داده شده است، بروز آب مروارید در گروه سنی طبیعی 95.23 درصد بود. سنجش رنگ‌آمیزی H&E نشان داد که LEC‌های گروه کنترل گرد شکل و مرتب چیده شده‌اند، و چگالی LEC‌های معمولی نسبتاً بالا بود، در حالی که LEC‌های موش‌های مسن طبیعی به شکل مسطح و چیده نشده بودند و چگالی LECهای پیر به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 1c). علاوه بر این، رنگ‌آمیزی SA{5}Gal نشان داد که نسبت LECهای پیر در موش‌های مسن طبیعی افزایش یافته است (شکل 1d). علاوه بر این، ما بیان پروتئین نشانگرهای مرتبط با پیری را از طریق رنگ‌آمیزی IHC و آنالیز وسترن بلات آنالیز کردیم. رنگ‌آمیزی IHC نشان داد که بیان p21 و p53 در LEC موش‌های مسن طبیعی در مقایسه با موش‌های جوان افزایش یافته است (شکل 1e, f). به طور مشابه، ما بیشتر کشف کردیم که بیان پروتئین p21 و p53 در کپسول‌های لنز موش‌های مسن طبیعی بیشتر از کپسول‌های لنز موش‌های جوان بود (شکل 1g). این نتایج نشان داد که پیری LECها با ARC در موش‌های مسن طبیعی مرتبط است.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

تجویز مزمن MET با دوز پایین شفافیت لنز را بهبود بخشید و پیری LEC ها را کاهش داد قبل از اینکه اثر متفورمین را بر ARC آزمایش کنیم، مشخص کردیم که آیا تجویز مزمن MET با دوز پایین برای موش ها بی خطر است یا خیر. پس از درمان MET به مدت 10 ماه، 28 موش (18 در گروه مسن طبیعی و 10 در گروه MET) به دلایل طبیعی مردند. ما دریافتیم که موش های زنده در هر دو گروه سالم بودند و تفاوت معنی داری در وزن بدن و وزن اندام بین هر دو گروه وجود نداشت (جدول 1). بنابراین، این نتایج نشان داد که دوز متفورمین مورد استفاده در این مطالعه برای حیوانات بی‌خطر بوده و می‌توان از آن برای آزمایش‌های بعدی استفاده کرد.

متعاقباً، MET مزمن با دوز کم برای ارزیابی اینکه آیا MET می‌تواند کدورت لنز را مهار کند و پیری LECs مربوط به سن را در موش‌های مسن طبیعی کاهش دهد، تجویز شد. همانطور که انتظار می رفت، شفافیت لنز در گروه MET در مقایسه با شفافیت لنز در گروه سالخورده طبیعی بسیار بهبود یافته است (شکل 2a). علاوه بر این، مشاهدات مورفولوژیکی تایید کرد که لنز گروه MET کاهش شفافیت را نشان داد. بروز آب مروارید در گروه مسن طبیعی 95.23 درصد بود، در حالی که در گروه MET 19.{6}} درصد بود (شکل 2b). سنجش رنگ آمیزی H&E نشان داد که تراکم LECs در گروه MET به طور قابل توجهی بالاتر بود. نسبت به موشهای مسن طبیعی (شکل 2c). علاوه بر این، LEC های گروه MET در مقایسه با گروه سن طبیعی نسبتا گرد بودند (شکل 2c). رنگ آمیزی SA{10}}گال نشان داد که نسبت LECهای پیر به طور قابل توجهی در گروه MET در مقایسه با گروه مسن طبیعی کاهش یافته است (شکل 2d). تجزیه و تحلیل IHC نشان داد که بیان p21 و p53 در LECهای گروه MET نسبت به گروه سن طبیعی کاهش یافته است (شکل 2e، f). به طور مشابه، تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که بیان پروتئین p21 و p53 به طور قابل توجهی در کپسول‌های لنز گروه MET در مقایسه با کپسول‌های گروه مسن طبیعی کاهش یافته است (شکل 2 g). این نتایج نشان داد که تجویز مزمن MET با دوز پایین می‌تواند شفافیت لنز را بهبود بخشد و پیری LEC را کاهش دهد.

تجویز مزمن MET با دوز پایین پیری LECها را در موش‌های مسن طبیعی از طریق فعال‌سازی AMPK تضعیف کرد. تعداد زیادی از داده‌ها از این نتیجه حمایت می‌کنند که فعال کردن AMPK برای افزایش طول عمر در موجودات مدل کافی است و جذابیت آن را به عنوان یک هدف طول عمر افزایش می‌دهد [19،20] . با در نظر گرفتن این نظریه، ما بیان مسیر AMPK را در LECهای موش ارزیابی کردیم. سطح نسبی mRNA FAS در گروه مسن طبیعی کاهش یافت و در گروه MET افزایش یافت (شکل 3a). همانطور که در شکل 3b,c نشان داده شده است، بیان AMPKa فسفریله (Thr172) و ACC فسفریله (Ser79) در LECهای موشهای طبیعی در مقایسه با موشهای جوان کاهش یافته است. با این حال، بیان AMPKa فسفریله (Thr172) و ACC فسفریله (Ser79) در LECهای گروه MET در مقایسه با گروه سن طبیعی بالا بود. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که بیان پروتئین AMPKa فسفریله (Thr172) و ACC فسفریله (Ser79) به طور قابل توجهی در کپسول عدسی افراد مسن طبیعی کاهش یافت و سطح بیان پروتئین AMPKa فسفریله (Thr172) و فسفریله (ACC) Ser79) در کپسول لنزهای گروه MET افزایش یافت (شکل 3d). این داده‌ها نشان داد که مسیر AMPK در LEC موش‌های مسن طبیعی غیرفعال شده است. علاوه بر این، تجویز مزمن MET با دوز پایین پیری LECs را در موش‌های مسن طبیعی از طریق فعال‌سازی AMPK کاهش داد.

تجویز مزمن MET با دوز پایین، شار اتوفاژیک را برای کاهش پیری LECها در موش‌های مسن طبیعی بازسازی کرد. برای تجزیه و تحلیل بیشتر تغییرات مولکولی و سلولی در لنز پس از درمان MET، بیان LC3 و p62 را تعیین کردیم زیرا آنها به طور گسترده ای به عنوان نشانگرهای زیستی سطوح اتوفاژی پذیرفته شده اند. همانطور که در شکل. با این حال، سطح بیان mRNA نسبی p62 در گروه MET در مقایسه با گروه مسن طبیعی به میزان قابل توجهی کاهش یافت.سیستانچ چنگیز خانعلاوه بر این، رنگ‌آمیزی IHC نشان داد که سطح پروتئین مرتبط با میکروتوبول 1 زنجیره سبک 3 (LC{3}}II/l) و p62 در LEC موش‌های مسن طبیعی افزایش یافته است. علاوه بر این، نتایج ما نشان داد که سطوح LC3-II/l و p62 به طور قابل ملاحظه‌ای در LECهای گروه MET کاهش یافته است (شکل 4b, c). سطح پروتئین LC{8}}ll و p62 به طور قابل توجهی در کپسول لنزهای گروه مسن طبیعی افزایش یافت (شکل 4d). در مجموع، ما حدس زدیم که شار اتوفاژیک در LECهای موش‌های مسن طبیعی مختل شده است و می‌تواند با تجویز مزمن MET با دوز پایین برای کاهش پیری LEC‌ها در موش‌های مسن طبیعی بازسازی شود.

بحث

آب مروارید درمان نشده یکی از علل اصلی نابینایی در سراسر جهان است که با کدورت عدسی کریستالی مشخص می شود [23]. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان داده است که سن عامل خطر غالب برای آب مروارید است که به نام ARC شناخته می شود و تنها درمان آن برداشتن جراحی است [24]. مطالعات قبلی نشان داده اند که پیری LEC ها علت اصلی ARC است [25]. تا به امروز، هیچ عامل درمانی موثری برای مهار کدر شدن لنز و کاهش پیری LEC ها بدون عوارض جانبی نامطلوب وجود نداشته است. تمرکز مطالعه حاضر ارزیابی مبنای بیولوژیکی مولکولی برای پیری LECها و مکانیسم محافظت از LECهای طبیعی در برابر پیری بود. نتایج ما نشان داد که غیرفعال شدن AMPK و اختلال اتوفاژی با پیری LEC و ARC مرتبط است. علاوه بر این، ما دریافتیم که MET ممکن است از LEC ها در برابر پیری محافظت کند و با فعال کردن AMPK و افزایش اتوفاژی، از تیرگی لنز جلوگیری کند.

پیری یک فرآیند بیولوژیکی اساسی است که با کاهش کلی عملکرد بافت همراه است. با افزایش طول عمر، اختلالات مرتبط با افزایش سن مانند ARC به سلامت جدی تبدیل می شوند

مسائل [26]. گزارش شده است که پیری LEC در بروز و توسعه ARC نقش دارد [5]. نتایج ما نشان داد که LECهای موش‌های مسن طبیعی به شکل مسطح و به‌طور ناموزون چیده شده‌اند، و چگالی LECها به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافته است (شکل 1c، d). علاوه بر این، بیان ژن‌های مرتبط با پیری (p21 و p53) در LECs موش‌های مسن طبیعی افزایش یافت (شکل 1e, f, g). نتایج ما نشان داد که پیری LEC با وقوع و توسعه ARC مرتبط است. بنابراین، درک دقیق مکانیسم‌های مولکولی زیربنای پیری LECs ممکن است برای ارائه منطقی برای استراتژی‌های درمانی جدید مورد نیاز باشد.

MET رایج ترین داروی خوراکی کاهش قند خون برای دیابت نوع 2 در سراسر جهان است. شواهد در حال ظهور نشان می دهد که MET اثرات مفیدی بر سلامتی فراتر از موارد مرتبط با بهبود قند خون دارد [27]. تأیید شده است که مکانیسم های MET برای هدف قرار دادن مسیرهای اساسی در پیری بیولوژیکی، مانند فعال کردن AMPK، افزایش اتوفاژی، مهار التهاب و اعمال اثرات آنتی اکسیدانی مهم هستند [28]. در انسان، MET در عمل بالینی برای بیش از 60 سال استفاده شده است. مشخصات ایمنی بالایی دارد و به طور منحصر به فردی برای مداخله در چندین مسیر حیاتی مسئول پیری و بیماری‌های مرتبط با سن قرار دارد. با این حال، اثرات MET بر روی ARC و مکانیسم نظارتی آن اثرات هرگز گزارش نشده است. در نتیجه، در مطالعه ما، تجویز مزمن MET با دوز پایین در موش‌های مسن طبیعی شفافیت لنز را بهبود بخشید (شکل 2a) و پیری LECs را در داخل بدن کاهش داد (شکل 2).

به طور گسترده ای پذیرفته شده است که MET مسیر AMPK را فعال می کند که مکانیسم بالقوه MET برای اعمال اثر ضد پیری است [29]. AMPK، یک حسگر انرژی سلولی، نقش مهمی در تنظیم تعادل انرژی سلولی دارد [30]. چندین مطالعه نشان داده اند که AMPK به عنوان یکپارچه کننده و واسطه چندین مسیر و فرآیند مرتبط با انرژی با طول عمر عمل می کند. در مطالعه ما متوجه شدیم که غیرفعال شدن AMPK یکی از ویژگی‌های LECهای پیر در موش‌های مسن طبیعی است (شکل 3). متعاقبا نشان داده شد که MET مسیر AMPK را برای جلوگیری از پیری LECها تحریک می کند (شکل 3). به عنوان یک فعال کننده AMPK تاسیس شده، نقش MET در پیشگیری از پیری به طور کلی به اثرات آن در تعدیل مسیرهای سیگنالینگ پایین دست، مانند بازیابی اتوفاژی، فعال سازی Sirt1 و Foxo1 و سرکوب mTOR نسبت داده می شود [31،32]. مطالعه ما یک خط شواهد جدید ارائه کرد که بر اهمیت عملکرد AMPK فعال شده توسط MET در جلوگیری از وقوع ARC تأکید می‌کند.

همانطور که در بالا ذکر شد، AMPK با مسیرها و پروتئین های متعددی برای اعمال یک اثر ضد پیری، از جمله افزایش اتوفاژی، ارتباط برقرار می کند. اتوفاژی، که به عنوان یک فرآیند اصلی برای تضمین طول عمر در حال ظهور است، به عنوان یک هدف درمانی بالقوه برای بیماری های مرتبط با افزایش سن توجه گسترده ای را به خود جلب کرده است. اتوفاژی یک فرآیند بیولوژیکی پیچیده و سیال است. فرآیند کامل اتوفاژی شار اتوفاژیک نامیده می شود که به طور گسترده ای برای انعکاس سطح اتوفاژی استفاده می شود. به عنوان یک شاخص اتوفاژی، LC{3}}Il محکم به غشای اتوفاگوزومی که توسط آنزیم های لیزوزومی تجزیه می شود، متصل است.افزایش عمر cistancheبه طور مشابه، p62، یک بستر خاص اتوفاژی، معمولاً در اتوفاگولیزوزوم تجزیه می شود و بیان آن به طور غیرمستقیم سطح اتوفاژی را منعکس می کند. در مطالعه حاضر، یافته‌های ما حاکی از آن بود که سطح اتوفاژی به طور مشخص در LEC‌های پیر کاهش می‌یابد (شکل 4)، در حالی که MET اختلالات مربوط به سن اتوفاژی را معکوس می‌کند (شکل 4). مکانیسم مولکولی ضد پیری MET به عملکرد اولیه AMPK در سلول ها نسبت داده می شود زیرا به طور کلی اتوفاژی را از طریق فعال سازی AMPK افزایش می دهد [33]. علاوه بر این، نشان داده شده است که MET به طور مستقیم اتوفاژی را تقویت می کند و در نتیجه به جلوگیری از پیری کمک می کند [34]. با این حال، مطالعات دقیق‌تری برای روشن شدن مکانیسم‌های اساسی مورد نیاز است، و ثابت می‌کند که MET از طریق یک مسیر AMPK مستقل یا وابسته، اتوفاژی را افزایش می‌دهد.

نشان داده شده است که شیوع ARC با جنسیت در جمعیت هایی که منشاء آسیایی دارند ارتباطی ندارد [35، 36]. بنابراین، ما جنسیت را به عنوان عاملی که ممکن است ARC را تحت تاثیر قرار دهد در نظر نگرفتیم. مطالعه ما باید با توجه به محدودیت های ذکر شده در بالا تفسیر شود.

نتیجه

به طور خلاصه، ما ثابت کردیم که غیرفعال شدن مسیر AMPK و اختلال اتوفاژی مرتبط با سن ممکن است به پیری LEC و بروز ARC کمک کند. علاوه بر این، داده‌های آزمایش‌های ما نشان داد که MET به طور موثر پیری LECs و تشکیل ARC را از طریق فعال‌سازی مسیر AMPK و افزایش اتوفاژی به تاخیر می‌اندازد. یافته های ما یک خط اساسی برای بررسی بیشتر مکانیسم های مولکولی است که در نقش MET در طول فرآیند پیری ARC مفید هستند و برای مطالعات فشرده تر در مورد توسعه استراتژی های جدید در برابر وقوع و توسعه ARC آموزنده خواهد بود.

مواد و روش ها معرف ها

MET از شرکت Bristol-Myers Squibb (چین) خریداری شد. آنتی‌بادی‌ها علیه p21 (ab188224)، p53 (ab131442)، AMPKa فسفریله (p-AMPK) (Thr172) (ab133448)، AMPKa1 (ab32047) و 2-2. SQSTM1/p62 (3340-1) از Abcam (MA، ایالات متحده آمریکا) به‌دست آمد. آنتی‌بادی‌ها علیه LC3 (12741) و فسفو استیل CoA کربوکسیلاز (p-ACC) (Ser79) (3661) از فناوری سیگنال‌دهی سلولی خریداری شدند. MA، ایالات متحده).

حیوانات و درمان

موش های نر C57BL6J 3 و 8 ماهه از Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (پکن، چین) خریداری شدند. موش ها در شرایط کنترل دما (دما، 20-25 درجه و رطوبت نسبی، 15±55 درصد) با چرخه نور/تاریکی 12 ساعت، با دسترسی آزاد به غذا و آب قرار گرفتند. تمامی روش ها و پروتکل های انجام شده بر روی حیوانات توسط کمیته اخلاق دانشگاه پزشکی هاربین تایید شد.

موش ها به سه گروه زیر تقسیم شدند: (i) گروه کنترل دارای موش های جوان (3 ماهه، وزن بدن=29.72±1.66 گرم، n =40) رژیم غذایی موش خالص شده و آب استاندارد دریافت کردند. آزادانه; زمانی که موش‌ها 10 ماه داشتند، 120 موش به‌طور تصادفی به دو گروه تقسیم شدند: گروه سن طبیعی و گروه MET. (i) گروه مسن‌تر طبیعی (موش‌های مسن‌تر، 20 ماهه، وزن بدن=32.98±1.93 گرم، n=60) یک رژیم غذایی استاندارد موش خالص و آب به صورت آزاد دریافت کردند؛ (ii) گروه MET ( 20 ماهگی، وزن بدن=31.21±2.81 گرم، n=60) تا زمانی که موش‌ها به سن 10 ماهگی برسند، در رژیم غذایی استاندارد موش خالص و آب نگهداری شد. پس از آن، درمان ها آغاز شد. موش های گروه MET به مدت 10 ماه با رژیم غذایی حاوی 0.1 درصد MET (Bristol Myers Squibb، چین) و آب آزادانه تغذیه شدند.

جداسازی لنزها و کپسول های لنز

موش ها از طریق دررفتگی دهانه رحم کشته شدند. کل چشم بلافاصله از تمام حیوانات آزمایش برداشته شد و در سالین استریل قرار داده شد. عصب بینایی به سمت بالا قرار گرفت و با موچین ثابت شد. سپس برشی روی عصب بینایی که وارد چشم می شود ایجاد شد و صلبیه به عقب کشیده شد تا عدسی نمایان شود.cistanche nzپس از آن، ما از موچین برای برداشتن آرام قطعات جسم مژگانی متصل به صفحه استوایی عدسی استفاده کردیم. بلافاصله عکس‌هایی از لنز تازه گرفته شد و لنز به سرعت با 4 درصد پارافورمالدئید در دمای اتاق ثابت شد. کل کپسول های لنز به سرعت از لنز باقی مانده جدا شد، در نیتروژن مایع منجمد شد و برای آزمایش های بعدی در دمای 80 درجه سانتی گراد نگهداری شد.

هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)

لنز تازه بلافاصله با 4 درصد پارافورمالدئید در دمای اتاق ثابت شد و در پارافین جاسازی شد. برای بررسی بافت شناسی، بافت ها به برش های 4- میکرومتر برش داده شدند. پس از پارافین زدایی و آبرسانی مجدد، مقاطع پارافینی تهیه شده با محلول هماتوکسیلین (H) به مدت 8 دقیقه رنگ آمیزی شدند و سپس 5 غوطه ور در اتانول اسیدی 1 درصد (1 درصد HCI در اتانول 70 درصد) انجام شد.

و با آب مقطر شستشو دهید. پس از آن، مقاطع با محلول ائوزین (E) به مدت 3 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند و سپس آب‌گیری با الکل درجه‌بندی شده و پاک‌سازی با زایلن انجام شد. تغییرات مورفولوژیکی زیر میکروسکوپ مشاهده شد (Nikon، Eclipse، ژاپن).

سنجش -گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{2}Gal) فعالیت -گالاکتوزیداز مرتبط با پیری (SA{5}}Gal) با استفاده از کیت رنگ‌آمیزی SA{6}Gal (Sigma, CS{) اندازه‌گیری شد. {12}}030). طبق دستورالعمل سازنده، مقاطع بافتی، پس از یک سری درمان، با سالین بافر فسفات (PBS) به مدت 5 دقیقه (سه بار) شسته شدند و سپس در محلول رنگ‌آمیزی SA{10}gal (pH 6.0) در انکوبه شدند. 37 درجه بدون CO2 به مدت 24 ساعت. تصاویر زیر میکروسکوپ نوری (نیکون، اکلیپس، ژاپن) گرفته شده است. درصد سلول‌های SA{16}}گال مثبت به‌عنوان میانگین تعداد سلول‌های مثبت/میانگین تعداد سلول‌های کل برآورد شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (gRT-PCR) RNA کل از کپسول‌های لنز موش‌ها با استفاده از معرف TRlzol استخراج شد. رونویسی معکوس با کیت معرف ExScript RT (Invitrogen) انجام شد. تجزیه و تحلیل کمی واکنش زنجیره ای رونویسی-پلیمراز معکوس (qRT-PCR) با استفاده از SYBR Green Supermix انجام شد.

کیت (Takara، توکیو، ژاپن)، با اکتین به عنوان یک کنترل درون زا. رونویسی برای چندین ژن هدف، از جمله FAS (به جلو، 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'و معکوس،5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3')، p62 (به جلو،5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{{{ 10}} و معکوس، 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') و -اکتین (به جلو، 5 '-TCGTGGGGCCGCCCTAGGCAC-3'و معکوس،5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGGG The نسبی{20}'. سطح بیان هر ژن بود

روش. نرمال به -اکتین و محاسبه با استفاده از رنگ‌آمیزی 2-△△ct r ایمونوهیستوشیمی (IHC) مجموعاً 5 بخش نماینده از هر یک از 10 لنز انتخاب‌شده در هر گروه برای آنالیز ایمونوهیستوشیمی (IHC) استفاده شد. برای ارزیابی بیان p21، p53، p-AMPK، p-ACC، LC3 و p62. نمونه های تهیه شده پس از انکوبه شدن در دمای 6{17} درجه به مدت 2 ساعت، برای پارافین زدایی از سری زایلن و الکل درجه بندی شده عبور داده شدند. سپس نمونه ها در 0.1 مولار اسید سیتریک (pH 6.1) به مدت 30 دقیقه جوشانده شدند و تا دمای اتاق خنک شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، نمونه ها با 0.3 درصد HO خیسانده شدند تا از فعالیت پراکسیداز درون زا جلوگیری شود. سپس آنتی بادی های اولیه اضافه شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد، یک شبه سرد شدند. آنتی بادی های ثانویه مربوطه به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، نمونه ها در دی آمینو بنزیدین (DAB) انکوبه شدند تا شدت رنگ مورد نظر ایجاد شود. تصاویر سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ نیکون اکلیپس (Nikon، Eclipse، ژاپن) گرفته شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

پروتئین کل از کپسول‌های لنز موش‌ها با استفاده از بافر سنجش رسوب رادیویی (RIPA) با کوکتل بازدارنده پروتئاز (Pierce، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد و یک کیت اسید بیسینکونیک (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) برای تعیین کمیت غلظت پروتئین استفاده شد. . پروتئین کل (40 میکروگرم) با استفاده از الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) تجزیه و تحلیل شد و به صورت الکتروفورزی روی غشاهای فیلتر پلی‌وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) (میلیپور، آلمان) منتقل شد. غشاها یک شبه با یک آنتی بادی اولیه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. روز بعد، غشاها با آنتی بادی های ثانویه مربوطه به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. نوارهای واکنش ایمنی با استفاده از روش سوبسترای نورتابی شیمیایی با سوپر سیگنال وست پیکو مشاهده شدند. کیت (بیوتکنولوژی پیرس، ایالات متحده آمریکا). سه آزمایش مستقل انجام شد.

تحلیل آماری

داده ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان شد. تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 7.{1}} و Microsoft Excel انجام شد. پروتئین با استفاده از نرم افزار Image J اندازه گیری شد. برای محاسبه معنی‌داری آماری داده‌های تجربی از آزمون t-test و آنالیز واریانس (ANOVA) استفاده شد. تفاوت با مقدار P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

در دسترس بودن داده ها

مجموعه داده های مورد استفاده و تجزیه و تحلیل در طول مطالعه حاضر در این مقاله منتشر شده گنجانده شده است.

این مقاله از www.nature.com/cddiscovery استخراج شده است