انگل ها، عفونت ها و تلقیح در سلول های حداقل مصنوعی

خلاصه: سلول های حداقل مصنوعی یک مدل قابل کنترل و مهندسی برای فرآیندهای بیولوژیکی ارائه می کنند. در حالی که بسیار ساده تر از هر سلول طبیعی زنده است، سلول های مصنوعی شاسی را برای بررسی پایه های شیمیایی فرآیندهای بیولوژیکی کلیدی ارائه می دهند. در اینجا، ما یک سیستم سلولی مصنوعی با سلول‌های میزبان را نشان می‌دهیم که با انگل‌ها در تعامل است و دچار عفونت‌هایی با شدت متفاوت می‌شوند. ما نشان می‌دهیم که چگونه میزبان می‌تواند برای مقاومت در برابر عفونت مهندسی شود، هزینه متابولیک حمل مقاومت را بررسی می‌کنیم، و مایه‌زنی را نشان می‌دهیم که میزبان را در برابر عوامل بیماری‌زا ایمن می‌کند. کار ما جعبه ابزار مهندسی سلول مصنوعی را با نشان دادن فعل و انفعالات پاتوژن میزبان و مکانیسم‌هایی برای به دست آوردن ایمنی گسترش می‌دهد. این سیستم های سلولی مصنوعی را یک قدم به ارائه یک مدل جامع از حیات طبیعی پیچیده نزدیک تر می کند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

معرفی

در چند دهه گذشته، زمینه زیست شناسی مصنوعی منفجر شده است و امکان ساخت سلول های مصنوعی را فراهم می کند که شبیه و مدل سازی جنبه های حیات بیولوژیکی طبیعی هستند. مدل‌سازی مسیرها و رفتارهای سلولی در سلول‌های مصنوعی مزایای زیادی نسبت به سلول‌های زنده دارد، مانند محیط واکنش ساده‌تر و تعریف‌شده‌تر، کنترل کامل بر ساختار پروتئومی و شیمیایی سلول، توانایی تقسیم‌بندی مسیرها و فرآیندهای بیولوژیکی مداخله‌گر و همچنین حفظ. سیستم‌های بیولوژیکی مهمی که در سیستم‌های واکنش in vitro وجود ندارند. 1،2 این دارایی‌های منحصربه‌فرد فناوری‌های سلول مصنوعی قبلاً امکان شبیه‌سازی شرایط و مسیرهای بیولوژیکی را در یک بیوراکتور in vitro شبیه حیات (سلول مصنوعی) فراهم کرده‌اند و درک بهتری را به ارمغان آورده‌اند. بسیاری از زمینه های مطالعاتی، از جمله تراکم مولکولی، دینامیک لیپید-پروتئین، 4 حداقل متابولیسم، 5 و بسیاری دیگر از جنبه های حیاتی زندگی بیولوژیکی. عملکردهای اسرارآمیز درونی زندگی سلولی. فعل و انفعالات مهندسی بین جمعیت های لیپوزوم نیز یک فناوری قدرتمند را به اثبات رسانده است. برای مثال، طراحی یک سیستم سلولی مصنوعی که رابطه شکارچی-شکار را تقلید می‌کند، با استفاده از نور به‌عنوان سیگنال بین این جمعیت‌های سلولی مصنوعی توسعه داده شده است. اجازه می دهد فلورسانس به شیوه ای فضایی در بین جمعیت پخش شود. علاوه بر برهم کنش های سلول مصنوعی- سلول مصنوعی، پیشرفت های اخیر در رابط های سلولی زنده- سلول مصنوعی نیز وجود داشته است. به عنوان مثال، نشان داده شده است که یک سلول مصنوعی طراحی شده برای ارتباط با یک سلول بنیادی عصبی، قادر است تمایز عصبی را القا کند و همچنین به عنوان یک شاسی تعمیم یافته که قادر است با انواع سلول های دیگر ارتباط برقرار کند.10 پیشرفت های بی شماری در توسعه وجود داشته است. انتشار سیگنال و سلول‌های مصنوعی که به‌عنوان رابط عمل می‌کنند، که بیشتر آن‌ها در بررسی‌های زیر بررسی می‌شوند. به طور خلاصه، زمینه‌های تحقیقاتی کاملی وجود دارد که به تقلید از تعاملات جمعیت‌های سلولی در سیستم مدل سلول‌های مصنوعی مربوط می‌شوند. با وجود این، مطالعه‌ای وجود نداشته است که از سلول‌های مصنوعی برای مدل‌سازی عفونت، انگلی یا تلقیح استفاده کند. همانطور که سلول های مصنوعی معمولاً برای مدل سازی فرآیندهای بیولوژیکی پیچیده به روشی ساده و کنترل شده استفاده می شوند، پتانسیل مدل سازی این تعاملات بین ارگانیسمی پیچیده نیز وجود دارد. اهمیت این موضوع را می توان در مطالعه پیشگامانه ای مشاهده کرد که با موفقیت ذرات فاژ فعال را در یک پلت فرم بیان پروتئین بدون سلول تولید کرد. هدف ما این است که با طراحی جمعیت های سلولی مصنوعی که می توانند به طور فعال یکدیگر را آلوده و ربوده کنند، این مفهوم را به سطح کلان برسانیم. ژنوم سلول میزبان، درست مانند ویروس‌ها و انگل‌های زنده. توانایی به کارگیری و مهندسی سلول های مصنوعی برای مدل سازی این رفتارهای بیماری، ابزار ارزشمندی را در اختیار جامعه علمی قرار می دهد.

در این کار، ما سیستم خود را برای مدل‌سازی بیماری سلولی مصنوعی به نمایش می‌گذاریم. ما یک سلول میزبان را مهندسی کردیم که می‌توانست از دومین جمعیت سلول‌های مصنوعی انگلی آلوده شود و رقابت منابع، ربودن ژنوم و تغییر هدف متابولیک را که در طول چنین عفونتی رخ می‌دهد، بررسی کردیم. ما همچنین روشی را مدل‌سازی می‌کنیم که امکان نجات میزبان پس از عفونت و همچنین وسیله‌ای برای تلقیح را فراهم می‌کند که به میزبان اجازه می‌دهد در برابر عفونت سلول‌های مصنوعی بیماری‌زا مقاومت کند. به طور خلاصه، ما یک شاسی مدل بیماری و عفونت جدید برای سلول های مصنوعی ارائه می دهیم. با این فناوری، سلول های مصنوعی می توانند به عنوان مدل های ابتدایی برای بیماری، عفونت و تلقیح استفاده شوند (شکل 1).

شکل 1. انگل، عفونت و سیستم تلقیح در سلول های حداقل مصنوعی. (الف) "میزبان" یک سلول مصنوعی است که پروتئین فلورسنت سبز (GFP) را بیان می کند. در سطح غشای خارجی، میزبان برچسب های ssDNA را حمل می کند. تنها پروتئین هایی که به یک میزبان سالم ترجمه می شوند، پروتئین های خود میزبان از پلاسمیدهایی هستند که میزبان با آنها ساخته شده است. (ب) "انگل" یک لیپوزوم پر شده با DNA پلاسمید است که ژن پروتئین فلورسنت mCherry را کد می کند، و سطح لیپوزوم انگل با برچسب ssDNA (مکمل برچسب روی سطح میزبان) تزئین شده است. "عفونت" با ادغام لیپوزوم های میزبان و انگل آغاز می شود که با واسطه برچسب های DNA مکمل روی سطح آنها انجام می شود. پس از عفونت، میزبان هم ژن میزبان اصلی (GFP) و هم ژن انگل (mCherry) را بیان می کند. (ج) "عفونت" با لیپوزوم های "پاتوژن" آغاز می شود که حامل ژنی برای آنزیم محدود کننده MunI با لیپوزوم های میزبان ترکیب می شود. ژن پاتوژن MunI توسط میزبان بیان می شود و آنزیم محدود کننده MunI DNA میزبان را هضم می کند. این منجر به هضم ژنوم میزبان بومی می شود و بیشتر بیان پروتئین میزبان را از GFP به پروتئین رمزگذاری شده پاتوژن، MunI تبدیل می کند. (د) "عفونت کشنده" ادغام لیپوزوم میزبان (با ژنوم GFP) با لیپوزوم پاتوژن حاوی ژن کد کننده aHL، یک پروتئین غشایی است. پس از عفونت، میزبان aHL را بیان می کند که منافذ غشایی را ایجاد می کند و باعث نشت مواد مغذی میزبان و به طور موثر متابولیسم میزبان می شود. (ه) "ایمن سازی" انکوباسیون میزبان با ssDNA حاوی یک توالی سازگار با برچسب های همجوشی روی سطح لیپوزوم میزبان است. DNA ایمن ساز با تگ های DNA میزبان یک دوبلکس ایجاد می کند و از هیبریداسیون دیگر الیگوهای DNA با این برچسب ها جلوگیری می کند. این امر از ادغام هر لیپوزوم بیماری زا به میزبان جلوگیری می کند. این یک شکل اثبات مفهوم است و نمودارها برای اهداف توضیحی هستند و مقادیر نسبی پروتئین بیان شده از میزبان و پاتوژن های مختلف را نشان می دهند. داده های واقعی برای هر سیستم در شکل های بعدی ارائه شده است.

نتایج و بحث

در این کار، ما از کلمات: میزبان، انگل، عفونت، کشنده، واکسن، و تلقیح همه در زمینه سیستم های سلولی غیر زنده و مصنوعی استفاده می کنیم. منظور ما از عفونت "کشنده" کاهش قابل توجه در ترجمه در جمعیت سلول های مصنوعی است. تمام آزمایش‌ها در این کار بر روی سلول‌های مصنوعی انجام شد که زنده نیستند، خود تکثیر نمی‌شوند و تکامل نمی‌یابند. این یک سیستم مدل برای خواص و فرآیندهای بیولوژیکی طبیعی است.

مزایای مکمل سیستانچ - افزایش ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

عفونت یک سلول مصنوعی با یک سلول مصنوعی انگلی منابع میزبان را ربوده است.

برای آزمایش مفهوم یک سیستم سلولی مصنوعی تقلید کننده عفونت، ما با ساختن یک سیستم مدل برای یک انگل شروع کردیم. ما از ساده‌ترین مفهوم انگل ممکن برای بازسازی در این سیستم بیوشیمیایی غیرزنده استفاده کردیم: انگلی که برخی از منابع میزبان را ربوده است. در این مورد، متابولیسم میزبان با بیان پروتئین GFP، و انگل با بیان پروتئین mCherry نشان داده می شود. برای این سیستم، از پدیده نشان داده شده قبلی از بازده بیان خطی پروتئین وابسته به غلظت الگوی DNA در TxTl استفاده کردیم. 15،16 ابتدا، ما شروع به یافتن غلظت کل پلاسمید بهینه کردیم که در آن نسبت GFP و mCherry DNA مطابقت دارد. نسبت فلورسانس مشاهده شده از این پروتئین ها. ما خودسرانه ژن GFP را به عنوان "میزبان" و ژن mCherry را به عنوان "انگل" اختصاص دادیم. این نام‌ها در این آزمایش خاص هیچ چیز خاصی را نشان نمی‌دهند، اما میزبان و انگل را در آزمایش‌های سلول مصنوعی بعدی نشان می‌دهند. در اینجا، ما از این نام‌ها استفاده می‌کنیم تا ارتباط این آزمایش‌های اثبات مفهوم را با آزمایش‌های بعدی عفونت سلولی مصنوعی با استفاده از همان پلاسمیدها آسان‌تر کنیم. ما پلاسمیدهای GFP و mCherry را با هر دو ژن تحت کنترل پروموتر T7 در نسبت‌های پلاسمید متفاوت و غلظت کل پلاسمید در نمونه‌های 1، 5، 10، یا 15 نانومولار مخلوط کردیم (شکل 2b). نتایج به دنبال رابطه خطی مورد انتظار بین غلظت پلاسمید و شدت فلورسانس ثبت‌شده بود، با بهترین تطابق بین نسبت غلظت فلورسانس و پلاسمید در مجموع پلاسمید 10 نانومولار مشاهده شد. رابطه مشاهده‌شده نشان می‌دهد که پلاسمیدها، با پروتئین‌هایی که از نظر اندازه و ترکیب اسید آمینه مشابه هستند (شکل S1)، برای بیان همان منابع TxTl رقابت می‌کنند. تغییر غلظت نسبی دو پلاسمید منجر به تغییراتی در بازده بیان تقریباً متناسب با نسبت پلاسمیدها می شود. این نشان می دهد که مدل خوبی برای تقلید عفونت انگل خواهد بود: ژنوم انگل (پلاسمید mCherry) با ژنوم میزبان (پلاسمید GFP) رقابت خواهد کرد. در مرحله بعد، ما تصمیم گرفتیم موردی را آزمایش کنیم که در آن هر یک از پلاسمیدها تحت کنترل یک پروموتر قوی‌تر بود، بنابراین یک سناریوی تخصیص منابع مغرضانه را تقلید کرد. برای حفظ جنبه رقابت منابع در آزمایش‌های آینده عفونت «انگل»، هر دو ژن را تحت یک پروموتور RNA پلیمراز (T7 RNA پلیمراز، T7 RNAP) نگه داشتیم، اما قدرت آن را تغییر دادیم. ما از یک پروموتر قوی T7 RNAP T7Max استفاده کردیم که بازده رونویسی به طور قابل توجهی بالاتر را نشان می‌دهد که منجر به بازده ترجمه به نسبت بالاتر می‌شود. غلظت پلاسمید یکی از پلاسمیدها تحت کنترل پروموتر قوی T7Max بود، در حالی که دیگری تحت پروموتر T7 متعارف بود. در هر دو مورد آزمایش، بیان پلاسمید T7Max به اندازه کافی قوی بود که فلورسانس پروتئین از یک ژن تحت T7Max به طور قابل توجهی با افزایش غلظت کل پلاسمید افزایش پیدا نکرد (شکل 2c,2d). به نظر می رسد مهم نیست که T7Max GFP یا mCherry را هدایت می کند، هر دو پروتئین با افزایش نسبی مشابه به پروموتر قوی تر پاسخ دادند. این یک مدل امیدوارکننده برای عفونت با یک انگل "قوی تر" (یک انگل حامل ژن تحت T7Max به میزبان تحت T7) و میزبان معکوس و قوی تر در برابر انگل ضعیف تر (میزبان با ژنوم تحت T7Max و انگل حامل ژن T7) ارائه کرد. با تشویق این آزمایش‌های اثبات اصل، به آزمایش‌های سلول مصنوعی رفتیم.

"عفونت" در همه موارد، ادغام سلول مصنوعی میزبان و انگل است. همجوشی توسط برچسب‌های DNA روی سطح لیپوزوم‌ها، با استفاده از سیستم همجوشی القایی DNA که قبلاً توضیح داده شد، تسهیل می‌شود. با DNA تک رشته ای که با اصلاح کلسترول به غشاء متصل شده است. اگر یک جفت لیپوزوم با برچسب‌های مکمل به هم برسند، تگ‌های DNA هیبرید می‌شوند و غشاها را به هم می‌رسانند و همجوشی غشا را آغاز می‌کنند که با اختلاط لومن دنبال می‌شود. در آزمایشات ما، سلول مصنوعی میزبان، لیپوزوم حاوی TxTl با T7 RNAP علاوه بر ژنوم یک GFP رمزگذاری شده با پلاسمید است. نظارت بر فلورسانس GFP به عنوان نماینده ای برای "سلامت" متابولیسم میزبان عمل می کند. انگل ورودی حاوی ژنومی به شکل پلاسمید کدکننده mCherry، سیستم ترجمه کامل است، اما فاقد RNA پلیمراز T7 است. این تضمین می کند که هرگونه تغییر مشاهده شده در متابولیسم میزبان ناشی از ژن های وارد شده توسط انگل است و نه از ادغام انگل و لیپوزوم میزبان، که سیتوپلاسم میزبان را رقیق می کند. آزمایش‌های عفونت انگل با غشای میزبان نشاندار شده با Marina Blue DHPE، یک رنگ لیپیدی غشای آبی انجام شد. این به ما اجازه داد تا فلورسانس مشاهده شده میزبان و ژن انگل را به فلورسانس آبی نرمال کنیم و نتایج را به مقدار کل فلورسانس غشای میزبان موجود در نمونه نرمال کنیم. این رقت های حجم کل نمونه پس از افزودن لیپوزوم های انگل را به حساب می آورد. غشاهای انگل به صورت فلورسنت نشاندار نشدند. همه آزمایش‌ها با یک نمونه کنترل همراه بودند، که در آن تنها یک جمعیت میزبان بود، اما با پلاسمید mCherry، برای نشان دادن حداکثر نظری سطح ممکن بیان mCherry در صورتی که تنها ژن در جمعیت بود. در اولین مجموعه آزمایش‌ها، میزبان و انگل را با ژن‌هایی که هر دو تحت کنترل پروموتر معمولی T7 بودند مخلوط کردیم.بنابراین هر دو ژن میزبان و انگل به یک اندازه "قوی" بودند. ما میزبان را با انگل مخلوط کردیم تا انگل در 25، 50 یا 75 درصد از کل جمعیت لیپوزوم باشد. در تمام موارد، فلورسانس GFP میزبان در حضور انگل، با افزایش متناظر فلورسانس mCherry انگل کاهش یافت (شکل 2e). همانطور که انتظار می‌رفت، نمونه‌هایی که فقط انگل داشتند و میزبان نداشتند، هیچ فلورسانس هیچ رنگی را تولید نکردند. در همه موارد، همجوشی لیپوزوم با واسطه DNA 100٪ کارآمد نیست؛ بنابراین، کاهش نسبی در فلورسانس میزبان و افزایش فلورسانس انگل به اندازه مقدار نظری مورد انتظار بر اساس نسبت میزبان به انگل نبود. به عبارت دیگر، عفونت 100٪ کارآمد نبود. این کیفیت بی‌نظیر سیستم همجوشی ناشی از DNA، در این مورد، یکی از ویژگی‌های مفید این سیستم بود. همانطور که در مورد عفونت طبیعی، عفونت با واسطه همجوشی سلولی مصنوعی بر همه میزبان‌ها تأثیر نمی‌گذارد و همه انگل‌ها میزبانی پیدا نمی‌کنند. در مرحله بعد، ما دو مورد را بررسی کردیم که در آن میزبان و انگل از نظر قدرت ژنوم به طور یکنواخت مطابقت نداشتند. در یک مورد، ژنوم میزبان تحت کنترل پروموتر T7 بود در حالی که ژنوم انگل تحت پروموتر T7Max بود (شکل 2f)، و در سناریوی مخالف، ژنوم میزبان تحت T7Max و ژنوم انگل تحت پروموتر T7 قرار داشت. (شکل 2g). در مورد میزبان ضعیف‌تر مورد حمله یک انگل قوی‌تر، افزایش نسبی در فلورسانس mCherry انگلی و کاهش متناظر در فلورسانس GFP میزبان بسیار قوی‌تر از مورد قبلی میزبان و انگل مشابه بود. همانطور که انتظار می‌رفت، وقتی میزبان قوی‌تر از انگل بود، برعکس بود: سطوح فلورسانس mCherry کمتر و کاهش نسبی در فلورسانس GFP کمتر از موارد مشابه بود. این به بهترین وجه با مقایسه یک نقطه داده منفرد تحت شرایط عفونت یکسان نشان داده می شود: در نسبت انگل 75٪. جمعیت میزبان و انگل که به طور مساوی مطابقت دارند منجر به فلورسانس انگل کمی بزرگتر از میزبان می شود. هنگامی که انگل قوی تر است، فلورسانس انگل به طور قابل توجهی بالاتر از میزبان است. و هنگامی که میزبان قوی تر است، فلورسانس انگل کمی کمتر از میزبان است. این نقاط داده برجسته با یک ستاره زرد در شکل 2e-g مشخص شده اند. ما آزمایش کنترل یک میزبان آلوده به یک انگل "بدون علامت" را انجام دادیم، یک انگل حامل پلاسمید با پروموتر T7 اما بدون توالی کد کننده پروتئین (کاست mCherry را از پلاسمید حذف کردیم) (شکل 2h). فلورسانس GFP میزبان در سطوح بالاتر انگل حداقل کاهش می یابد، که نشان می دهد مقدار کمی از منابع میزبان به رونویسی RNA کوتاه غیرکدکننده از پلاسمید انگل اختصاص داده شده است. این داده ها همچنین تأیید می کند که بار اصلی متابولیک عفونت انگل بر روی میزبان در استفاده از منابع ترجمه ای نه رونویسی نهفته است. این مشاهدات با مشاهدات قبلی ترجمه که منبع متغیرتر و محدودکننده‌تر در سیستم‌های بدون سلول است مطابقت دارد. 20 به طور کلی، این آزمایش‌ها مدلی را برای عفونت با انگلی که منابع متابولیک میزبان را می‌رباید، با تقلید از رفتارهای سلولی مصنوعی ارائه می‌کند. جنبه های یک رابطه طبیعی میزبان-انگل

شکل 2. عفونت انگل منابع میزبان را ربوده است. (الف) لیپوزوم سلول مصنوعی میزبان شامل یک سیستم ترجمه بدون سلول و یک پلاسمید کد کننده GFP است. سطح میزبان با تگ های ssDNA تزئین شده است. لیپوزوم انگل حاوی پلاسمید کدکننده mCherry، با سیستم ترجمه اما بدون RNA پلیمراز است (بنابراین انگل نمی تواند mCherry را بیان کند). سطح انگل با تگ های ssDNA مکمل تگ های روی سطح میزبان تزئین شده است. برچسب های DNA ادغام لیپوزوم های میزبان و انگل را تسهیل می کنند و میزبان هم GFP ژنومی خود و هم ژنوم انگلی حاوی mCherry را بیان می کند. (b-d) اثبات اصل برای ژنوم میزبان (GFP) و انگل (mCherry) که برای منابع سلول مصنوعی یکسان رقابت می کنند. این آزمایش ها در محلول TxTl انجام می شود، نه در لیپوزوم. دو پلاسمید، کدکننده‌ی GFP و mCherry، با نسبت نشان‌داده‌شده توسط نمادهای پلاسمید در سمت چپ نقشه حرارتی، با غلظت کل DNA نمونه در ردیف بالای نقشه حرارتی، مخلوط شدند. فلورسانس در کانال های سبز (GFP) و قرمز (mCherry) اندازه گیری شد. هر پلاسمید در دو نوع با پروموترهای قدرت های مختلف آزمایش شد: با T7 و با پروموتر قوی تر T7Max. داده های فردی برای همه نقشه های حرارتی در شکل های S2-S4 ارائه شده است. دوره های زمانی فردی برای بیان پروتئین میزبان و انگل T7 در شکل های S5-S7 و برای انگل T7Max در شکل های S8-S10 ارائه شده است. (e-g) عفونت میزبان با انگل. در هر آزمایش، لیپوزوم های میزبان با لیپوزوم های انگل مخلوط می شوند. ادغام انگل به میزبان DNA mCherry انگلی را تحویل می دهد که در کنار DNA GFP میزبان بیان می شود. نسبت های مختلف میزبان به انگل مورد آزمایش قرار گرفت، همانطور که توسط نمادهای زیر نمودار میله ای نشان داده شده است. ژنوم میزبان تحت پروموتر T7 با یک انگل با ژنوم آن در زیر پانل پروموتر T7 (e) و با یک انگل با ژنوم خود در زیر پانل پروموتر T7Max (f) آلوده شد، میزبان نیز با ژنوم T7Max ساخته شد و آلوده شد. با انگل با پانل ژنوم T7 (g). دوره های زمانی فردی برای بیان پروتئین در شکل S11 ارائه شده است. آزمایش‌های مشابه در غلظت‌های بالاتر و پایین‌تر کل لیپید در شکل S12 ارائه شده است. ردپای خالص سازی حذف اندازه که نشان دهنده پس فیوژن پایداری وزیکول است در شکل S13 ارائه شده است. (ح) عفونت با انگل ناسازگار: انگل حامل پروموتر T7 اما غیر کد کننده DNA است. نوارهای خطا نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس در پانل ها (e-h) به فلورسانس آبی رنگ غشایی نرمال می شود تا نتایج را به غلظت سلول های میزبان عادی کند. تمام سری‌های نمونه با برچسب "میزبان آلوده به GFP" آزمایش‌هایی هستند که میزبان و انگل دارای برچسب‌های DNA مکمل روی سطح بودند که امکان ادغام لیپوزوم‌ها را فراهم می‌کردند که عفونت نامیده می‌شد. نمونه‌هایی با برچسب سری «میزبان GFP سالم» نشان می‌دهد، جایی که میزبان و انگل در نسبت‌های نشان‌داده‌شده با هم مخلوط شده بودند، اما حاوی برچسب‌های همجوشی مکمل نبودند و عفونت را غیرممکن می‌کردند. الماس در پانل ها (e-h) یک وضعیت عفونت خاص را نشان می دهد که به بهترین وجه تفاوت در قدرت بیان میزبان و انگل در پانل ها (e-g) و مزایای ایمنی میزبان در پانل (h) را نشان می دهد. مقایسه مستقیم مقادیر میزبان و انگل مشخص شده توسط ستاره در شکل S14 آورده شده است. اطلاعات مربوط به عفونت با انگل بدون هیچ پلاسمید در شکل S15 نشان داده شده است.

عفونت یک سلول مصنوعی می تواند ژنوم میزبان را از بین ببرد.

انگلی که در بالا توضیح داده شد با استفاده از منابع میزبان، mCherry کدکننده ژنوم را بیان می کرد، اما میزبان مقداری از متابولیسم خود را حفظ کرد و علیرغم عفونت به بیان GFP ادامه داد. در مرحله بعد، ما تصمیم گرفتیم سیستمی را بررسی کنیم که در آن عفونت منجر به تسخیر کامل متابولیسم میزبان توسط انگل از طریق تخریب ژنوم میزبان می شود (شکل 3a). برای مهندسی چنین سناریویی، ما یک هضم آنزیم محدود کننده یک پلاسمید در TxTl را بررسی کردیم. در آزمایش‌های اثبات اصل، یک آنزیم محدودکننده MunI در TxTl بدون لیپوزوم بیان شد. پلاسمید MunI با پلاسمید GFP در نسبت های مختلف مخلوط شد. اگر پلاسمید GFP حاوی هیچ سایت محدودیت MunI نباشد، کاهش نسبتاً اندک در فلورسانس GFP مشاهده شده را می توان با رقابتی که قبلاً بین دو پلاسمید برای منابع TxTl شرح داده شد، توضیح داد. اگر پلاسمید GFP دارای یک مکان محدود MunI باشد، فلورسانس GFP به طور قابل توجهی کاهش می یابد، و کاهش متناسب با مقدار افزایشی از پلاسمید رمزکننده MunI مقیاس می شود (شکل 3b). بیان MunI از طریق وسترن بلات نظارت شد و متناسب با غلظت پلاسمید مقیاس شد (شکل 3c).

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

با تشویق این نتایج، آزمایش عفونت را با سلول های مصنوعی راه اندازی کردیم. میزبان پلاسمید GFP و پاتوژن حامل پلاسمید MunI بود. غلظت پلاسمیدهای GFP و MunI روی 2 میلی مولار تنظیم شد که بسیار کمتر از غلظت اشباع پلاسمید برای TxTl.21 ما در نظر داشتیم که در غلظت کل پلاسمید باقی بمانیم که در آن بیان میزبان و انگل به اندازه کافی بالا باشد تا مستقیماً برای منابع محدود رقابت کند. مانند موردی که در بالا در مورد یک انگل ساده توضیح داده شد)، در عوض بیشتر قصد دارد اثر آنزیم انگل را که به طور فعال ژنوم میزبان را نابود می کند، اندازه گیری کند. مانند آزمایش‌های انگل توصیف‌شده قبلی، میزبان حاوی TxTl و T7 RNA پلیمراز باکتریایی بود، پاتوژن تنها عصاره سلولی را بدون RNA پلیمراز T7 حمل می‌کرد و میزبان و پاتوژن هر دو با برچسب‌های همجوشی DNA مکمل نشان‌دار شدند. غشاء میزبان با Marina Blue DHPE برای عادی سازی نتایج فلورسانس به غلظت لیپوزوم های میزبان برچسب گذاری شد. میزبان و پاتوژن در نسبت‌های متفاوتی با هم مخلوط شدند و پاتوژن 25، 5{15}} یا 75 درصد از کل جمعیت بود. فلورسانس میزبان "آلوده"، که در آن میزبان و پاتوژن حاوی برچسب های همجوشی مکمل بودند، با افزایش مقدار پاتوژن کاهش یافت. فلورسانس GFP از میزبان "سالم"، که در آن پاتوژن حاوی برچسب های همجوشی مکمل نیست، در حضور هیچ مقدار پاتوژن کاهش نمی یابد. نمونه هایی که فقط پاتوژن داشتند، فلورسانس قابل اندازه گیری نداشتند (شکل 3d). بیان پروتئین بیماریزا MunI با استفاده از تجزیه و تحلیل Western Blot با داده های نشان داده شده برای سری نمونه میزبان آلوده اندازه گیری شد (شکل 3e). در مرحله بعد، ما عفونت را در مورد میزبانی که نسبت به پاتوژن ایمن بود، بررسی کردیم: پلاسمید GFP میزبان محل محدودیت MunI نداشت (شکل 3f). فلورسانس میزبان پس از عفونت کاهش یافت، اما به اندازه مورد قبلی میزبان با یک سایت MunI در ژنوم، به هیچ وجه قابل توجه نبود. پروتئین پاتوژن MunI در سطوحی قابل مقایسه با آزمایش های قبلی عفونت بیان شد (شکل 3g)، بنابراین بار متابولیک روی میزبان مشابه بود. کاهش فلورسانس میزبان آلوده در این آزمایش‌ها ناشی از ربوده شدن برخی از منابع میزبان توسط پاتوژن بیان‌کننده MunI است، اما از آنجایی که غلظت کل پلاسمید بسیار کمتر از آزمایش‌های پاتوژن ساده قبلی است، کاهش فلورسانس میزبان کمتر قابل توجه است. این آزمایش همچنین تأیید می کند که کاهش فلورسانس میزبان با یک سایت MunI (شکل 3d) توسط دوره های زمانی بیان پروتئین ارائه شده در شکل S22 ایجاد شده است. (ز) بیان MunI از طریق تجزیه و تحلیل وسترن بلات از طریق آزمایش برای نمونه های نشان داده شده در سری "GFP آلوده" در پانل (f) ردیابی شد. نوارهای خطا در همه پانل ها نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس در پانل‌های (d، f) به فلورسانس آبی رنگ غشایی که برای نرمال کردن نتایج به غلظت سلول‌های میزبان استفاده می‌شود، نرمال می‌شوند. فلورسانس در پانل (b) به پلاسمید MunI 0 میلی مولار برای هر سری نمونه نرمال می شود. نمادهای الماس در پانل‌های (d, f) یک شرایط خاص را برجسته می‌کنند که به بهترین وجه تفاوت در پاسخ به عفونت میزبان حساس به پانل پاتوژن (d) و مصون از پانل پاتوژن (f) را نشان می‌دهد. تمام سری‌های نمونه با برچسب «آلوده‌شده با GFP» آزمایش‌هایی هستند که میزبان و پاتوژن دارای برچسب‌های DNA مکمل روی سطح بودند که امکان ادغام لیپوزوم‌ها را فراهم می‌کردند که عفونت نامیده می‌شد. سری با برچسب "GFP سالم" نمونه‌هایی را نشان می‌دهد که میزبان و پاتوژن در نسبت‌های نشان‌داده‌شده با هم مخلوط شده‌اند، اما حاوی برچسب‌های همجوشی مکمل نیستند و عفونت را غیرممکن می‌کند.

شکل 3. عفونت ژنوم میزبان را از بین می برد و منابع میزبان را می رباید. (الف) سلول‌های میزبان حاوی پلاسمید کدکننده GFP، با دو مکان محدود MunI هستند. پاتوژن حاوی پلاسمید است که آنزیم محدود کننده MunI را کد می کند. پس از ادغام میزبان و پاتوژن، TxTl میزبان آنزیم محدود کننده MunI را بیان می کند که سپس ژنوم میزبان را هضم می کند. (ب) آزمایش های اثبات اصل برای عفونت: پلاسمید GFP با و بدون سایت های محدودیت MunI تهیه شد. پلاسمید GFP با پلاسمید MunI مخلوط شد و بیان GFP ثبت شد. این آزمایش ها در محلول TxTl بدون لیپوزوم انجام شد. اثبات اصل برای آزمایش عفونت، با آنزیم MunI که به جای بیان در TxTl به صورت خارجی اضافه شده است، در شکل های S16 و S17 نشان داده شده است. دوره های زمانی بیان پروتئین نماینده در شکل S18 ارائه شده است. (ج) بیان MunI با تجزیه و تحلیل وسترن بلات نظارت شد. شدت باند MunI در همان نمونه‌ها به‌عنوان نتایج فلورسانس نشان‌داده‌شده در پانل (ب) برای سری «محل MunI وجود ندارد» اندازه‌گیری شد. یک وسترن بلات نماینده آنزیم محدود کننده MunI در شکل S19 ارائه شده است. (د) فلورسانس GFP میزبان با لیپوزوم های پاتوژن به نسبت نشان داده شده در نمودار داده مخلوط شده است. پلاسمید میزبان GFP دارای دو مکان محدود MunI است. دوره های زمانی بیان پروتئین نماینده در شکل S2 ارائه شده است{13}}. داده های آزمایش های عفونت با برچسب های همجوشی ناسازگار در شکل S21 ارائه شده است. (ه) بیان MunI از طریق آنالیز وسترن بلات از طریق آزمایش برای نمونه‌های نشان داده شده در سری «آلوده‌شده GFP» در پانل (d) ردیابی شد. (f) فلورسانس GFP میزبان با لیپوزوم های پاتوژن با نسبت نشان داده شده در نمودار داده مخلوط شده است. میزبان GFP هیچ مکان محدودیت MunI ندارد و به پروتئین پاتوژن ایمنی می دهد. دوره های زمانی بیان پروتئین نماینده در شکل S22 ارائه شده است. (ز) بیان MunI از طریق تجزیه و تحلیل وسترن بلات از طریق آزمایش برای نمونه های نشان داده شده در سری "GFP آلوده" در پانل (f) ردیابی شد. نوارهای خطا در همه پانل ها نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس در پانل‌های (d، f) به فلورسانس آبی رنگ غشایی که برای نرمال کردن نتایج به غلظت سلول‌های میزبان استفاده می‌شود، نرمال می‌شوند. فلورسانس در پانل (b) به پلاسمید MunI 0 میلی مولار برای هر سری نمونه نرمال می شود. نمادهای الماس در پانل‌های (d, f) یک شرایط خاص را برجسته می‌کنند که به بهترین وجه تفاوت در پاسخ به عفونت میزبان حساس به پانل پاتوژن (d) و مصون از پانل پاتوژن (f) را نشان می‌دهد. تمام سری‌های نمونه با برچسب «آلوده‌شده با GFP» آزمایش‌هایی هستند که میزبان و پاتوژن دارای برچسب‌های DNA مکمل روی سطح بودند که امکان ادغام لیپوزوم‌ها را فراهم می‌کردند که عفونت نامیده می‌شد. سری با برچسب "GFP سالم" نمونه‌هایی را نشان می‌دهد که میزبان و پاتوژن در نسبت‌های نشان‌داده‌شده با هم مخلوط شده‌اند، اما حاوی برچسب‌های همجوشی مکمل نیستند و عفونت را غیرممکن می‌کند.

عفونت یک سلول مصنوعی می تواند "کشنده" باشد، منابع سلول میزبان را تحلیل می برد، و چنین عفونت هایی را می توان برای عملکرد نجات "درمان" کرد.

آزمایش‌های انگل و پاتوژن بالا نشان داد که سلول‌های مصنوعی می‌توانند به عنوان مدلی برای عفونت استفاده شوند، جایی که یک پاتوژن منابع میزبان را ربوده است. در مرحله بعد، ما تصمیم گرفتیم سناریویی را بررسی کنیم که در آن عفونت باعث می‌شود متابولیسم میزبان پس از بیان پروتئین بیماری‌زا از کار بیفتد. در این مورد، پاتوژن قابل مقایسه با عفونت با یک باکتری است که یک سم کشنده را منهای جنبه تکثیر میزبان یا انگل بیان می کند، زیرا این سلول های مصنوعی تکثیر نمی شوند (شکل 4a). برای مهندسی این سیستم، همولیزین (aHL)، یک سم طبیعی و پروتئین غشایی را انتخاب کردیم که به طور گسترده در مهندسی سلول های مصنوعی برای ایجاد منافذ غشایی غیر اختصاصی استفاده می شود. توکسین، و پروتئین بعداً برای مهندسی حمل و نقل غشایی و طولانی‌تر کردن متابولیسم سلولی مصنوعی به کار گرفته شد. در اینجا، ما به استفاده از aHL برای نقش طبیعی آن به عنوان یک سم مضر تولید شده توسط عفونت برمی‌گردیم. یکی دیگر از نمونه‌های قابل‌توجه مرتبط با مهندسی سلول‌های مصنوعی از استفاده از سمیت aHL برای ایجاد مرگ طبیعی سلولی ناشی از استفاده از سلول‌های مصنوعی به عنوان فناوری درمان سرطان است. منجر به نشت محتوای سلول و کاهش قابل توجهی در بیان GFP در داخل سلول می شود. این اثر می تواند معکوس شود اگر قسمت بیرونی لیپوزوم ها حاوی تمام مولکول های کوچک لازم برای TxTl باشد (شکل 4b). در سیستم مدل میزبان – پاتوژن ما، میزبان حاوی یک پلاسمید کدکننده GFP و پاتوژن حاوی یک پلاسمید کدکننده aHL است. طراحی تمام آزمایش‌های عفونت شبیه به سناریوهای انگل و پاتوژن است که در بالا توضیح داده شد، با پاتوژن بدون T7 RNAP و میزبان و پاتوژن هر دو با برچسب‌های همجوشی DNA تزئین شده‌اند. جالب توجه است، ما مشاهده کردیم که در غلظت های پاتوژن کمتر (پاتوژن 25 یا 50٪ از کل جمعیت است)، فلورسانس میزبان فقط اندکی کاهش می یابد. با این حال، افزایش غلظت پاتوژن به 75٪ منجر به کاهش قابل توجهی در فلورسانس GFP میزبان می شود (شکل 4c). ما حدس می زنیم که این نتیجه ممکن است ناشی از نشت نسبتا آهسته مواد مغذی از سلول های مصنوعی در غلظت aHL کمتر باشد. فلورسانس GFP تنها پس از 12 ساعت انکوباسیون اندازه گیری شد و GFP یک پروتئین بسیار پایدار است. بنابراین، ممکن است در مورد غلظت‌های کمتر aHL (مقدار پاتوژن کمتر)، نشت مواد مغذی ناشی از aHL به اندازه‌ای آهسته باشد که سلول‌های میزبان مقادیر قابل‌توجهی از GFP را قبل از اینکه اثرات نشت ناشی از aHL فلج‌کننده شود، جمع‌آوری کنند. متابولیسم برای جدا کردن نتایج رقابت ساده برای منابع بین ژنوم میزبان و انگل، آزمایش‌های «عفونت با نجات» را انجام دادیم که در آن بافر بیرونی حاوی تمام مولکول‌های کوچکی بود که انرژی TxTl، اسید آمینه و مخلوط‌های نمک را تشکیل می‌دهند. این به طور مشابه با شرایط "مواد مغذی خارج" آزمایش شده در شکل 4b تنظیم شد. کاهش فلورسانس میزبان در این آزمایش‌ها مشابه نمونه‌های قبلی «عفونت بدون نجات» با سطوح 25 و 50 درصدی پاتوژن بود. کاهش فلورسانس میزبان در 75٪ از پاتوژن به طور قابل توجهی کمتر از کاهش مشاهده شده در نمونه های بدون نجات بود (شکل 4d). به نظر می رسد تفاوت بزرگ در نتایج آزمایش با 75 درصد انگل، با نقاط داده در پانل های شکل 4 (c, d) که با ستاره مشخص شده اند، از فرضیه ما حمایت می کند که غلظت های بالاتر aHL باعث آسیب در اوایل واکنش می شود. در غلظت پاتوژن کمتر، نشت به اندازه‌ای آهسته است که GFP میزبان تجمع می‌یابد (همانطور که هم با مواد مغذی نجات و هم بدون آن دیده می‌شود)، بنابراین فلورسانس GFP مشاهده‌شده پس از آلودگی بیشتر به دلیل رقابت برای منابع کاهش می‌یابد. در غلظت‌های بالاتر پاتوژن، فلورسانس GFP در نمونه‌های دارای مواد مغذی خارجی عمدتاً به دلیل رقابت در منابع کاهش می‌یابد. این آزمایش‌ها نشان می‌دهند که ما می‌توانیم سلول‌های مصنوعی را برای مدل‌سازی عفونت مهندسی کنیم، که منجر به دو نتیجه متفاوت می‌شود: جریمه متابولیکی خود عفونت (کاهش GFP به دلیل رقابت در منابع) و عفونت «کشنده‌تر» ناشی از لغو بیان پروتئین میزبان. با تشویق این مشاهدات، تصمیم گرفتیم سیستمی را بررسی کنیم که در آن سلول های مصنوعی می توانند به طور فعال در برابر عفونت بیماری زا مقاومت کنند و جریمه متابولیک چنین پاسخی را بررسی کنیم.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

سلول های مصنوعی می توانند با استفاده از یک استراتژی الهام گرفته از باکتری در برابر عفونت دفاع کنند.

با الهام از عملکرد شناخته شده اندونوکلئازهای محدود کننده برای محافظت از باکتری ها در برابر DNA خارجی، ما به دنبال استفاده از این استراتژی در سلول های مصنوعی بودیم. ما سیستم انگل ارائه شده در شکل 2 را گسترش دادیم: علاوه بر GFP، پلاسمید حاوی MunI را به میزبان اضافه کردیم. این انگل مانند آزمایش های قبلی حاوی mCherry بود. پلاسمید mCherry حاوی یک مکان محدود MunI است (شکل 5a). ابتدا، آزمایش‌های اثبات اصل را برای ارزیابی بار متابولیک بیان MunI روی میزبان انجام دادیم. در این آزمایش‌های TxTl بدون کپسول، بیان GFP و بیان mCherry را که هر کدام با مقدار فزاینده‌ای از پلاسمید MunI یا EcorI مخلوط می‌شد، نظارت کردیم. همه ژن ها تحت کنترل پروموتر T7 یکسان بودند. ژن GFP دارای یک EcorI بود اما یک سایت محدودیت MunI نداشت و ژن mCherry دارای یک MunI بود اما یک مکان محدود EcorI نداشت. هنگامی که پلاسمید آنزیم محدود کننده با یک پلاسمید پروتئین فلورسنت بدون مکان شناسایی برای آن آنزیم محدود کننده مخلوط شد، بیان پروتئین فلورسنت متناسب با افزایش پلاسمید آنزیم محدود کاهش یافت، که نشان دهنده رقابت بین دو پلاسمید برای منابع TxTl است، همانطور که قبلا برای GFP نشان داده شد. و mCherry در شکل 2. این جفت های غیر برش GFP با MunI (شکل 5b) و mCherry با EcorI (شکل 5e) بودند. هنگامی که یک پروتئین فلورسنت با یک آنزیم محدود کننده که قادر به برش ژن آن پروتئین فلورسنت است جفت شد، فلورسانس به طور قابل توجهی به سطوح تقریباً پس زمینه در غلظت های پلاسمید آنزیم محدودکننده بالاتر کاهش یافت. این جفت های برش GFP با EcorI (شکل 5c) و mCherry با MunI (شکل 5d) بودند. این نشان دهنده کاهش قابل توجهی در فلورسانس فراتر از رقابت ساده برای منابع و مشابه سناریوی عفونت نشان داده شده در شکل 3 است. بیان MunI در حضور GFP بیان GFP را کاهش می دهد. اگر از GFP به عنوان پروکسی برای متابولیسم "پایه" میزبان استفاده کنیم، آنگاه MunI را می توان به عنوان یک بار متابولیک روی میزبان مشاهده کرد.

شکل 4. میزبان مستعد ابتلا به عفونت "کشنده" است، اما میزبان را می توان نجات داد. (الف) میزبان حاوی پلاسمید GFP است و پاتوژن حاوی پلاسمید است که کانال غشایی همولیزین (aHL) را کد می کند. پس از عفونت، میزبان aHL را بیان می کند که منافذی در غشاء ایجاد می کند و باعث نشت مواد مغذی و در نتیجه کاهش فعالیت متابولیک میزبان می شود. (ب) اثبات اصل برای aHL بیان کننده میزبان (بدون عفونت، میزبان با هر دو nM GFP و مقدار مشخص شده پلاسمید aHL ایجاد شد). میزبان در یک بافر با یا بدون مواد مغذی انکوبه شد (همه اجزای ترکیب انرژی، نمک و اسید آمینه برای تهیه سیستم ترجمه بدون سلول میزبان استفاده می‌شود). داده‌ها در شکل S23 نشان داده شده‌اند، غلظت بهینه ماده مغذی نجات به‌صورت تجربی ایجاد شد. (ج) عفونت میزبان با پاتوژن، با مقادیر مختلف پاتوژن در هر سلول میزبان. نشت مولکول های کوچک از سلول های "سالم" و "آلوده" به طور مستقیم با استفاده از رنگ مولکولی کوچک اندازه گیری شد، داده ها در شکل های S24 و S25 نشان داده شده است. (د) آزمایش‌های مشابه اینها در پانل (ج) نشان داده شده‌اند، اما بافر بیرونی حاوی مواد مغذی مولکولی کوچک شبیه به شرایط آزمایشی «مواد مغذی خارج» است که در پانل (ب) نشان داده شده است. نوارهای خطا در همه پانل ها نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس در پانل ها (b-d) به فلورسانس آبی رنگ غشایی که برای عادی سازی سیگنال به غلظت سلول های میزبان استفاده می شود، نرمال می شوند. نمادهای الماس در پانل‌های (c, d) یک شرایط خاص را برجسته می‌کنند که به بهترین وجه تفاوت‌ها را در پاسخ به عفونت از میزبان بدون پانل مواد مغذی خارجی (c) و مصون بودن از پاتوژن به دلیل وجود پانل مواد مغذی خارجی (d) نشان می‌دهد. برای پانل های (c, d)، سری "GFP infected" میزبانی است که با پاتوژن حامل پروتئین aHL ذوب شده است و "GFP سالم" میزبانی است که با پاتوژنی که پلاسمید ندارد ذوب شده است.

ما به آزمایش های عفونت ادامه می دهیم، میزبان (با پلاسمیدهای GFP و MunI) را با یک انگل (با پلاسمید mCherry) مخلوط می کنیم. همانطور که قبلاً، سناریوهایی را با افزایش مقدار انگل در جمعیت بررسی کردیم (شکل 5f). کنترل مثبت فقط mCherry بیان کننده میزبان (با EcorI به جای MunI برای متعادل کردن بار متابولیک) معیاری را برای حداکثر مقدار نظری پروتئین پاتوژن که می تواند در میزبان بیان شود ایجاد کرد (شکل 5f). با افزایش مقدار انگل، فلورسانس GFP میزبان کاهش یافت، اما کاهش در فلورسانس میزبان آلوده به طور قابل توجهی کمتر از کاهش بیان GFP بود که در آزمایش‌های قبلی با همان انگل مشاهده شد. فلورسانس GFP و انگل mCherry این MunI بیانگر میزبان آلوده (نقطه داده نشان‌گذاری شده با ستاره در شکل 5f) می‌تواند مستقیماً با میزبان‌های عفونت مشابه بدون MunI مقایسه شود (نقطه داده با ستاره در شکل 2e نشان‌گذاری شده است). در میزبانی که MunI را بیان می‌کند، GFP میزبان با سطح کاملاً پایین‌تری شروع شد در حالی که سالم بود (زیرا برخی منابع به بیان MunI منحرف می‌شوند) اما پس از عفونت، کاهش فلورسانس میزبان بسیار کمتر است و میزبان پروتئین mCherry انگل بسیار کمتری تولید می‌کند. در مقایسه با میزبانی که MunI را بیان نمی کند. این آزمایش سود میزبانی را که برخی از منابع را برای دفاع در برابر انگل ها صرف می کند، نشان می دهد. این سیستم را می توان به عنوان یک مدل بیوشیمیایی بسیار ساده برای ارگانیسم های بیان کننده پروتئین برای دفاع در برابر عفونت های آینده یا حتی عوامل محیطی مضر در نظر گرفت. میزبان در اصل از استحکام کمتری برخوردار است (اگر بیان GFP را به عنوان معیاری برای سلامت میزبان در نظر بگیریم)، ​​اما در صورت عفونت، منابع اضافی که میزبان برای بیان پروتئین‌های دفاعی صرف می‌کند، جواب می‌دهد و محافظت در برابر انگل آلوده کننده را فراهم می‌کند. بنابراین، در این سلول مصنوعی غیرزنده ساده، نمونه‌ای از یک مسابقه تسلیحاتی بیولوژیکی اساسی را بازسازی کردیم.

شکل 5. سلول های میزبان در برابر عفونت دفاع می کنند. (الف) سلول های میزبان شامل دو پلاسمید هستند: یکی کدکننده GFP (بدون مکان محدود MunI) و دیگری کد کننده آنزیم محدود کننده MunI (ژن "مقاومت انگل"). این انگل حاوی پلاسمید mCherry است، در سیستمی شبیه به آزمایشات نشان داده شده در شکل 2. عفونت با همجوشی از طریق برچسب های DNA روی سطح میزبان و انگل انجام می شود. پس از عفونت، پلاسمید mCherry معرفی شده توسط انگل توسط آنزیم محدود کننده MunI میزبان هضم می شود. (ب-ه) اندازه گیری هزینه متابولیک بیان مقاومت انگل. آزمایش‌ها در یک سیستم TxTl حجیم هستند، نه در وزیکول‌ها. در هر آزمایش، پلاسمید پروتئین فلورسنت (GFP یا mCherry) با پلاسمید آنزیم محدودکننده (MunI یا EcorI) در نسبت نشان داده شده در محور x برای غلظت کل پلاسمید 10 میلی مولار مخلوط شد. GFP یک سایت محدودیت EcorI دارد اما یک سایت MunI ندارد و mCherry یک MunI دارد اما یک سایت محدودیت EcorI ندارد. خط روند یک راهنمای بصری است اما مناسب داده نیست. نوارهای خطا نشان دهنده SEM، n=3 است. آزمایش‌های کنترل با آنزیم‌های محدودکننده خالص شده، به جای بیان آنها از یک پلاسمید، در شکل S26 ارائه شده‌اند. پایداری لیپوزوم ها با مقدار افزایش یافته پلاسمید انگل نیز اندازه گیری شد، داده ها در شکل S27 نشان داده شده است. (و) آلودگی میزبان با مقدار فزاینده انگل. "میزبان GFP سالم" بیان GFP از سلول های میزبان است که با انگل بدون هیچ پلاسمید ترکیب شده اند. "Host GFP infected" میزبانی است که با انگل حامل mCherry ترکیب شده است. فلورسانس قرمز فلورسانس mCherry از انگل ترکیب شده با میزبان است (فقط داده های میزبان آلوده در دسترس است. نمونه های میزبان سالم حامل پلاسمید mCherry نبودند). نوارهای خطا در همه پانل ها نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس به فلورسانس آبی رنگ غشایی که برای نرمال کردن نتایج به غلظت سلول‌های میزبان استفاده می‌شود، نرمال می‌شوند. نماد الماس بیان پروتئین انگل را در شرایط عفونت خاص نشان می دهد، که مستقیماً قابل مقایسه با نقطه داده ای است که با یک ستاره در شکل 2e آزمایشی در شرایط مشابه، اما با میزبان فاقد ژن مقاومت MunI مشخص شده است.

شکل 6. تلقیح دفاع در برابر عفونت ها را فراهم می کند. (الف) میزبان حاوی پلاسمید GFP است. پاتوژن در این آزمایشات یکی از سه طرح عفونت نشان داده شده در این مقاله است: یک انگل (همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است)، یک پاتوژن با آنزیم محدود کننده MunI که ژنوم GFP میزبان را هضم می کند (همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است)، یا یک پاتوژن. حامل کانال غشایی aHL که باعث نشت مواد مغذی از میزبان می شود (همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است). در هر مورد، میزبان و پاتوژن حاوی برچسب های همجوشی DNA مکمل هستند. قبل از معرفی پاتوژن، میزبان "تلقیح" می شود: با الیگوس های ssDNA اضافی مکمل تگ های DNA همجوشی روی سطح میزبان انکوبه می شود (برچسب های یکسان با آنها روی پاتوژن منهای قسمت کلسترول مورد استفاده برای لنگر انداختن برچسب به غشاء پاتوژن). تلقیح باعث می شود که تگ های همجوشی روی سطح میزبان دو رشته ای شوند و در نتیجه ادغام با پاتوژن غیرممکن می شود. (ب) اثبات اصل برای طرح تلقیح. جمعیت لیپوزوم های حامل GFP تحت کنترل پروموتر RNA T7، اما بدون RNA پلیمراز T7، با لیپوزوم های حاوی RNA پلیمراز T7 ذوب می شوند. پروتئین GFP تنها در صورت ترکیب شدن دو جمعیت قابل بیان است. یک یا هر دو شرکای اختلاط با انکوباسیون با یک برچسب DNA سازگار با تگ های همجوشی روی سطح لیپوزوم "تلقیح" شدند، که باعث می شود تگ های همجوشی دو رشته ای و در نتیجه با همجوشی ناسازگار باشند. یک دوره زمانی نماینده برای بیان پروتئین در شکل S28 نشان داده شده است. آزمایش‌های کنترلی بدون هیچ گونه تگ فیوژن در شکل S29 و کنترل‌هایی با برچسب‌های همجوشی ناسازگار در شکل S30 ارائه شده‌اند. غلظت اولیگو تلقیح به صورت تجربی تعیین شد، داده ها در شکل S31 نشان داده شده است. (ج) آزمایشات عفونت انگل. یک میزبان حامل GFP با یک انگل حامل mCherry، همانطور که در شکل 2 توضیح داده شده است، ترکیب شد. میزبان و انگل با نسبت متفاوتی از میزبان به انگل مخلوط شدند. سلول‌های میزبان یا تلقیح شدند (با برچسب‌های همجوشی DNA دو رشته‌ای که با همجوشی سازگار نیستند) یا تلقیح نشدند (در نتیجه مستعد ادغام با انگل بودند). فلورسانس mCherry فقط برای نمونه هایی با میزبان تلقیح نشده گزارش می شود زیرا فلورسانس mCherry قابل اندازه گیری در نمونه های میزبان تلقیح شده وجود نداشت. تلقیح معکوس با تلقیح انگل به جای میزبان آزمایش شد، داده هایی که در شکل S32 نشان داده شده است. (د) آزمایش‌های عفونت با ژنوم میزبان حساس به پاتوژن حامل آنزیم محدودکننده MunI، همانطور که در شکل 3 توضیح داده شده است. بنابراین حساس به همجوشی با پاتوژن نیست. (ه) آزمایش‌های عفونت با پاتوژن حامل ژن aHL، منجر به نشت مواد مغذی از طریق کانال‌های aHL از سلول‌های میزبان پس از عفونت می‌شود، همانطور که در شکل 4 توضیح داده شده است. میزبان انکوبه شده با الیگوس تلقیح شده، بنابراین مستعد ادغام با پاتوژن نیست. نوارهای خطا در همه پانل ها نشان دهنده SEM، n=3 است. مقادیر فلورسانس در پانل‌ها (c-e) به فلورسانس آبی رنگ غشایی که برای نرمال کردن نتایج به غلظت سلول‌های میزبان استفاده می‌شود، نرمال می‌شوند. برخی از داده‌های نشان‌داده‌شده در این شکل، آزمایش‌هایی با تنظیمات مشابه با آزمایش‌های نشان‌داده‌شده در شکل‌های قبلی هستند (همانطور که در هر عنوان نشان داده شده است). این آزمایش‌ها برای این رقم تکرار شد تا داده‌هایی با استفاده از همان دسته TxTl برای مقایسه مستقیم نتایج، حذف تنوع دسته به دسته آماده‌سازی TxTl تولید شود.

تلقیح سلول های مصنوعی از عفونت جلوگیری می کند.

در مثال فوق، ما نشان دادیم که میزبان با بیان یک پروتئین اضافی در برابر تأثیر ژنوم یک پاتوژن دفاع می کند. در مرحله بعد، ما پرسیدیم که آیا می‌توان سناریویی را مدل‌سازی کرد، که در آن برخی مداخلات میزبانی را که قبلاً مستعد ابتلا به عفونت است، در وهله اول مصون می‌سازد. ما آن را مدل تلقیح نامیدیم. در حالی که تشخیص این امر دور از یک قیاس کامل است، جنبه ای که ما روی آن تمرکز کردیم این است که سلول مصنوعی میزبان هیچ منبعی را برای ایجاد مصونیت مصرف نمی کند. در مدل ایمن سازی خود، ما درمانی طراحی کردیم که سلول مصنوعی میزبان را که مستعد عفونت است به سلول هایی تبدیل می کند که نمی توانند با یک پاتوژن ترکیب شوند. سیستم همجوشی سلولی مصنوعی مورد استفاده در این مقاله بر برچسب‌های DNA تک رشته‌ای برای القای همجوشی غشای لیپوزوم متکی است. برای تلقیح در برابر همجوشی با یک پاتوژن، سلول ها را با الیگونوکلئوتید DNA مکمل الیگوی همجوشی در سطح سلول ها انکوبه کردیم (شکل 6a). اول، ما باید تأیید کنیم که تلقیح از طریق جوجه کشی با الیگوی مکمل باعث از بین بردن همجوشی می شود. در آزمایش‌های اثبات اصل، دو جمعیت لیپوزوم تهیه شد: یک جمعیت دارای TxTl با پلاسمید کدکننده GFP تحت کنترل پروموتر T7 و جمعیت دیگر دارای TxTl و RNA پلیمراز T7 بود اما پلاسمید نداشت. پس از ادغام این دو جمعیت، پلاسمید GFP با RNA پلیمراز T7 مخلوط شد و بیان GFP را القا کرد. اگر دو جمعیت تگ های همجوشی تک رشته ای و مکمل داشتند، همجوشی رخ می دهد و فلورسانس GFP تشخیص داده می شود. اگر یک یا هر دو جمعیت با یک الیگونوکلئوتید مکمل برچسب فیوژن انکوبه شوند، همجوشی لیپوزوم رخ نمی دهد و GFP بیان نمی شود (شکل 6b). پس از ایجاد سیستم تلقیح، ما اقدام به معرفی تلقیح برای محافظت از سلول های مصنوعی میزبان در سه مورد از سناریوهای عفونت که قبلا در این کار توضیح داده شد، کردیم. ابتدا، ما از سناریوی انگل تشریح شده در شکل 2 استفاده کردیم. سلول های میزبان، حاوی ژنوم GFP، با یک الیگو مکمل تگ همجوشی روی سطح میزبان تلقیح شدند و میزبان با انگل mCherry مخلوط شد. ما میزبان را با انگل در نسبت های مختلف مخلوط کردیم. تحت همه شرایط عفونت، فلورسانس mCherry انگل غیرقابل تشخیص بود اگر میزبان تلقیح شده بود و فلورسانس GFP میزبان تلقیح شده کاهش نمی یافت. آزمایش‌های کنترلی با میزبان بدون تلقیح کاهش بیان GFP میزبان و افزایش سیگنال انگل mCherry را، همانطور که انتظار می‌رفت، نشان داد (شکل 6c). در مرحله بعد، سیستم تلقیح را در مورد میزبان آلوده به یک پاتوژن حامل یک آنزیم محدود کننده MunI کد کننده ژنوم که قادر به هضم ژنوم GFP میزبان است، مانند آزمایش های نشان داده شده در شکل 3 اعمال کردیم. میزبان تلقیح شده کاهشی نشان نداد. در فلورسانس GFP پس از اختلاط با مقادیر فزاینده پاتوژن، در حالی که میزبان تلقیح نشده آلوده بود و فلورسانس GFP میزبان متناسب با افزایش مقدار پاتوژن کاهش یافت (شکل 6d). تلقیح همچنین در برابر پاتوژن aHL موثر بود. میزبان های تلقیح شده با اختلاط با پاتوژن هیچ کاهشی در فلورسانس نشان ندادند، در حالی که فلورسانس GFP میزبان تلقیح نشده با عفونت به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 6e). در همه موارد، این روش تلقیح ساده، جوجه کشی میزبان با یک اولیگو DNA مکمل الیگوی همجوشی در سطح میزبان، برای از بین بردن توانایی سلول های مصنوعی بیماری زا برای آلوده کردن سلول های میزبان کافی بود. بنابراین، ما یک مدل فیزیکوشیمیایی ساده از مداخله را نشان دادیم که از سلول‌های میزبان در برابر عفونت محافظت می‌کند.

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

نتیجه گیری

در این مقاله، روش‌هایی را برای استفاده از حداقل سلول‌های مصنوعی برای مدل‌سازی عفونت‌های انگل و بیماری‌زا نشان می‌دهیم. انگیزه پشت کار ما دوگانه بود. ما می‌خواستیم رفتار پیچیده و شبیه زندگی را در سلول‌های مصنوعی مهندسی کنیم تا هدف مهندسی سلول‌های مصنوعی را که بیشتر شبیه سلول‌های زنده طبیعی هستند، تسهیل کنیم. ما همچنین می‌خواستیم از سیستم سلول مصنوعی ساده و قابل کنترل برای مدل‌سازی ویژگی‌های اساسی عفونت، تلقیح و فرآیندهای مقاومت استفاده کنیم. در حالی که سلول‌های مصنوعی تکامل نمی‌یابند یا خود تکثیر می‌شوند، این سیستم امکان مطالعه دینامیک عفونت را در یک مدل ساده و آسان برای آنالیز فراهم می‌کند. ما امیدواریم که اصول عفونت که در اینجا توضیح داده شده است به ایجاد مدل های عملی و کاربردی برای پاتوژن های مختلف و کاهش عفونت کمک کند. مطالعه این سیستم سلولی مصنوعی ساده شده، تعاملات اساسی بین انگل و پاتوژن را برجسته کرد. در حالی که سلول‌های مصنوعی (هنوز) زنده نیستند و توانایی انجام تکامل داروینی را ندارند، این سیستم به ما اجازه می‌دهد تا تعاملات پاتوژن و میزبان را بدون توانایی ایجاد ایمنی طبیعی یا تغییر قدرت بیماری‌زا مشاهده کنیم. در حالی که دینامیک عفونت میزبان ارائه شده در اینجا از سلول های مصنوعی مبتنی بر باکتری استفاده می کند، این سیستم ذاتاً محدود به TxTl باکتریایی نیست. حتی می‌توان تصور کرد از سیستم ارائه‌شده در اینجا برای مدل‌سازی پویایی عفونت در جمعیت‌هایی شبیه اکوسیستم‌های طبیعی، استفاده از سادگی ذاتی سلول‌های مصنوعی برای کنترل و مطالعه کامل تعاملات بین اعضای مختلف جمعیت‌های بزرگ، استفاده شود.

منابع

(1) برنامه های کاربردی. ماتر امروز 2016، 19، 516–532.

(2) Gaut، NJ; آدامالا، KP بازسازی عناصر سلولی طبیعی در سلول های مصنوعی. Adv. Biol. 2021، 5، شماره 2000188.

(3) تان، سی. ساوراب، س. بروچز، نماینده مجلس؛ شوارتز، آر. Leduc، P. بیان ژن اشکال ازدحام مولکولی در نانو سیستم‌های سلولی مصنوعی. نات. فناوری نانو 2013، 8، 602-608.

(4) Glantz، ST; برلو، EE; Chow، توسط رابط‌های غشایی سلول‌مانند مصنوعی برای بررسی برهم‌کنش‌های دینامیک پروتئین-لیپید، چاپ اول. Elsevier Inc، 2019؛ جلد 622.

(5) ژائو، جی. ژانگ، ی. ژانگ، ایکس. لی، سی. دو، اچ. Sønderskov، SM; مو، دبلیو. دونگ، ام. هان، ایکس. تقلید متابولیسم سلولی در سلول های مصنوعی: انتقال جهانی مولکول از طریق غشاء از طریق همجوشی وزیکول. مقعدی شیمی. 2022، 94، 3811-3818.

(6) دامیانو، ال. Stano، P. در مورد "شبیه زندگی" سلول های مصنوعی. جلو. Bioeng. بیوتکنول. 2020، 8، شماره 953.

(۷) صالحی ریحانی، ع. سس، او. Elani، Y. تقلید سلول مصنوعی به عنوان مدل های ساده شده برای مطالعه زیست شناسی سلولی. انقضا Biol. پزشکی 2017, 242, 1309−1317.

(8) چاکرابورتی، تی. Wegner، SV سلول به سلول سیگنالینگ از طریق نور در جوامع سلولی مصنوعی: شکارچی درخشان طعمه را فریب می دهد. ACS Nano 2021، 15، 9434-9444.

(9) دوپین، ا. Simmel، FC سیگنالینگ و تمایز در مدارهای ژنی چند بخش بندی شده مبتنی بر امولسیون. نات. شیمی. 2019، 11، 32-39.

(10) Toparlak, OD; زاسو، جی. بریدی، س. سرا، MD; ماچی، پ. کونتی، ال. Baudet، M.-L. مانسی، سلول های مصنوعی SS تمایز عصبی را هدایت می کنند. علمی Adv. 2020، 6، شماره eabb4920.

(11) رابینسون، AO; Venero، OM؛ آدامالا، KP به سوی زندگی مصنوعی: ارتباطات سلولی مصنوعی بیومیمتیک. Curr. نظر. شیمی. Biol. 2021، 64، 165-173.

(12) اسمیت، JM; چودری، ر. غرفه، MJ کنترل ارتباطات سلول-سلول مصنوعی. جلو. مول. Biosci. 2022، 8، شماره 1321.

(13) Elani، Y. تلاقی سلول های زنده و مصنوعی به عنوان مرزی در حال ظهور در زیست شناسی مصنوعی. آنژو. Chem., Int. اد. 2021، 60، 5602- 5611.

(۱۴) روستاد، م. ایستلوند، ا. ژاردین، پی. Noireaux، V. سنتز TXTL بدون سلول از باکتریوفاژ عفونی T4 در یک واکنش لوله آزمایش. مصنوعی. Biol. 2018، 3، شماره ysy002.

(15) مارشال، آر. Noireaux، V. مدلسازی کمی رونویسی و ترجمه یک All-E. coli سیستم بدون سلول علمی Rep. 2019, 9, No. 11980.

(16) گاراملا، ج. مارشال، آر. روستاد، م. Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: بستری برای زیست شناسی مصنوعی بدون سلول. ACS Synth. Biol. 2016، 5، 344-355.

(17) دیچ، سی. نقدی، بی. ساتو، دبلیو. شارون، جی. آفدمبرینک، ال. گوت، نیوجرسی؛ هایلی، ج. استوکس، ک. انگلهارت، AE; آدامالا، سیستم رونویسی KP T7Max. 2021، 1-28.

(18) Gaut، NJ; گومز-گارسیا، جی. هیلی، جی.ام. نقدی، بی. هان، س. انگلهارت، AE; آدامالا، همجوشی قابل برنامه ریزی KP و تمایز سلول های حداقل مصنوعی. ACS Synth. Biol. 2022، 11، 855- 866.

(19) استنگل، جی. زان، ر. Höok, F. همجوشی قابل برنامه ریزی وزیکول های فسفولیپید ناشی از DNA. مربا. شیمی. Soc. 2007، 129، 9584- 9585.

(20) چیزولینی، اف. فورلین، ام. یه مارتین، ن. برلوفا، جی. سیچی، دی. مانسی، ترجمه بدون سلول اس اس نسبت به رونویسی متغیرتر است. ACS Synth. Biol. 2017، 6، 638-647.

(21) شین، ج. Noireaux, V. An E. coli جعبه ابزار بیان بدون سلول: کاربرد در مدارهای ژن مصنوعی و سلول های مصنوعی. ACS Synth. Biol. 2012، 1، 29-41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber، A. یک بیوراکتور وزیکولی به عنوان گامی به سوی یک مونتاژ سلولی مصنوعی. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 2004، 101، 17669-17674.

(23) آدامالا، KP; Martin-Alarcon، DA; Guthrie-Honea، KR; بویدن، برهمکنش‌های مدار ژنتیکی مهندسی ES در داخل و بین سلول‌های حداقل مصنوعی. نات. شیمی. 2017، 9، 431-439.

(24) Noireaux, V.; بارزیو، ر. گادفروی، جی. سلمان، ح. Libchaber، A. به سوی یک سلول مصنوعی بر اساس بیان ژن در وزیکول ها. فیزیک Biol. 2005، 2، P1-P8.

(25) کرینسکی، ن. کدوری، م. زینگر، ا. شاینسکی-رویتمن، جی. گلدفدر، م. بنهار، آی. هرشکوویتز، دی. شرودر، A. سلول های مصنوعی پروتئین های درمانی را در داخل تومورها سنتز می کنند. Adv. بهداشت و درمان. 2018، 7، شماره 1701163.

(26) Kwon، YC; Jewett، MC روش‌های آماده‌سازی عصاره خام با توان عملیاتی بالا برای سنتز پروتئین بدون سلول قوی. علمی Rep. 2015, 5, No. 8663.

(27) Sun، ZZ; هیز، کالیفرنیا؛ شین، جی. کاسکرا، اف. موری، آر.ام. پروتکل های Noireaux، V. برای پیاده سازی یک سیستم بیان بدون سلول TXTL مبتنی بر اشریشیا کولی برای زیست شناسی مصنوعی. J. Vis. انقضا 2013، 79، 1-15.

(28) فوجی، اس. ماتسورا، تی. سونامی، تی. نیشیکاوا، تی. کازوتا، ی. Yomo، T. Liposome Display برای انتخاب در شرایط آزمایشگاهی و تکامل پروتئین های غشایی. نات. پروتکل 2014، 9، 1578-1591.

(29) لوفلر، PMG; ریس، او. رابه، ا. اوکلم، ق. تامسن، آر.پی. کجمز، جی. Vogel، S. یک آبشار فیوژن لیپوزوم برنامه ریزی شده با DNA. آنژو. Chem., Int. اد. 2017, 56, 13228−13231.