قسمت 1: آکتئوزید با اینترلوکین مقابله می کند-1 -از طریق مدولاسیون پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن و مسیر سیگنالینگ سلولی NFκB با فرآیندهای کاتابولیک القا شده

Acteoside با اینترلوکین مقابله می کند-1 -از طریق مدولاسیون پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن و مسیر سیگنالینگ سلولی NFκB با فرآیندهای کاتابولیک القا شده

هیانگ آی لیم، 1 دو کیونگ کیم، 1 ته هیئون کیم، 1 کیونگ-روک کانگ، 1 جونگ یئون سو، 1،2 سونگ سیک چو، 3 یونگهی یون، 4،5 یه یونگ چوی، 4،5 جونگتای لیم ,4,5 هیون وو کیم ,6 گئون اونگ جو ,6

چان جین اوه، 6 دیوک سیل اوه، 6 هونگ سونگ چون، 2 و جائه سونگ کیم 1

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com

1 موسسه علوم دندانپزشکی، دانشگاه چوسان، گوانگجو 61452، جمهوری کره

2 گروه علوم زیست پزشکی، دانشگاه چوسان، گوانگجو 61452، جمهوری کره

3 گروه زیست پزشکی، علوم همگرایی بهداشت و زندگی، BK21 Four، کالج داروسازی، دانشگاه ملی موکپو،

Jeonnam 58554، جمهوری کره

موسسه پزشکی 4Chung-Yeon، گوانگجو 61949، جمهوری کره

5 موسسه تحقیق و توسعه، شرکت CY Pharma، سئول 06224، جمهوری کره

6 موسسه منابع جنگلی Jeollanamdo، ناجو، Jeollanamdo، 58213، جمهوری کره

مکاتبات باید به جائه سونگ کیم ارسال شود. js_kim@chosun.ac.kr

دریافت شده در 2 ژوئیه 2020؛ بازبینی شده در 15 فوریه 2021؛ پذیرش در 6 مارس 2021؛ منتشر شده در 25 مارس 2021

ویراستار آکادمیک: Joël R. Drevet

حق چاپ © 2021 HyangI Lim et al. این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت CreativeCommonsAttributionLicense توزیع شده است،

که اجازه استفاده نامحدود، توزیع،و تکثیر در هر رسانه، به شرطی که اصل اثر به درستی ذکر شده باشد.

سیستانچ می تواند بیماری کلیوی را درمان کند و عملکرد کلیه را بهبود بخشد

استئوآرتریت (OA) شایع ترین بیماری دژنراتیو مفصلی با درد مزمن مفصلی است که در اثر تخریب پیشرونده غضروف مفصلی در مفاصل سینوویال ایجاد می شود.اکتئوزیدیک گلیکوزید کافئوئیل فنیل اتانوئیدی، دارای فعالیت های بیولوژیکی مختلفی مانند ضد میکروبی، ضد التهابی، ضد سرطانی، آنتی اکسیدانی، محافظ سلولی و محافظت عصبی است. علاوه بر این، تجویز خوراکیاکتئوزیددر دوز بالا باعث ایجاد سمیت ژنی نمی شود. بنابراین، هدف مطالعه حاضر بررسی اثرات آنتی کاتابولیک استاکتئوزیددر برابر استئوآرتریت و مسیر سیگنالینگ آنتی کاتابولیک آن.اکتئوزیدقابلیت زنده ماندن سلول های L929 فیبروبلاست موش مورد استفاده به عنوان سلول های طبیعی و سلول های غضروفی اولیه موش را کاهش نداد.اکتئوزیدبا سرکوب بیان و فعال شدن آنزیم‌های تخریب‌کننده غضروف مانند ماتریکس متالوپروتئیناز (MMP-) 13، MMP{5} و MMP-1 -از دست دادن پروتئوگلیکان ناشی از IL در سلول‌های غضروفی و ​​غضروف مفصلی مقابله کرد. 6}}. علاوه بر این،اکتئوزیدبیان واسطه‌های التهابی مانند نیتریک اکسید سنتاز، سیکلواکسیژناز{0}}، اکسید نیتریک و پروستاگلاندین E2 را در سلول‌های غضروفی اولیه موش تحت درمان با IL{2}} سرکوب کرد. متعاقبا، بیان سیتوکین های پیش التهابی کاهش یافتاکتئوزیددر سلولهای غضروفی اولیه موش تحت درمان با IL-1. علاوه بر این، آکتئوزید نه تنها فسفوریلاسیون پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن را در سلولهای غضروفی موش اولیه تیمار شده با IL-1 بلکه همچنین انتقال NFκB از سیتوزول به هسته را از طریق سرکوب فسفوریلاسیون آن سرکوب کرد. تجویز خوراکی آکتئوزید 5 و 10 میلی گرم بر کیلوگرم، انحطاط پیشرونده غضروف مفصلی در مدل موش مبتلا به استئوآرتریت ایجاد شده توسط بی ثباتی منیسک داخلی را کاهش داد. یافته های ما نشان می دهد که اکتئوزید یک عامل یا مکمل بالقوه آنتی کاتابولیک برای تضعیف یا جلوگیری از انحطاط پیشرونده غضروف مفصلی است.

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

استئوآرتریت (OA) شایع ترین بیماری دژنراتیو مفصلی با درد مزمن مفصلی است که در اثر تخریب پیشرونده غضروف مفصلی در مفاصل سینوویال ایجاد می شود [1].

با توجه به افزایش امید به زندگی، شیوع OA با از دست دادن تحرک و درد مزمن مفاصل ناشی از دژنراسیون پیشرونده غضروف مفصلی در مفاصل سینوویال در زنان پس از یائسگی و در مردان به ترتیب 18 درصد و 9.6 درصد برآورد شده است [2]. ]. اگرچه شیوع OA در سراسر جهان سالانه افزایش می یابد، اما علت پاتوفیزیولوژیک OA هنوز ناشناخته است. ممکن است در اثر عوامل خطر بسیار پیچیده و چندعاملی مانند افزایش سن، جنسیت، وراثت ژنتیکی، آسیب مفصلی و بار مکانیکی شدید مفصل ایجاد شود. علاوه بر این، روابط عصبی - آسیب شناختی بین دژنراسیون پیشرونده غضروف مفصلی و ایجاد درد مزمن مفصل ناشناخته است [3]. از این رو، هدف مدیریت بالینی برای بیماران مبتلا به OA، حفظ تحرک بدن و عملکرد مکانیکی مفصل از طریق تسکین درد مزمن مفصل، با استفاده از رویکردهای دارویی و غیر دارویی و جراحی تعویض مفصل است. تقاضا برای توسعه مداخله یا مکمل موثر، با ایمنی بیولوژیکی طولانی مدت، برای جلوگیری یا کاهش OA برای حفظ کیفیت زندگی از طریق حفظ عملکرد مفصل مکانیکی در جمعیت سالمند در حال افزایش است.

همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است،اکتئوزید(شماره CAS 61276-17-3؛ C29H36O15) یک گلیکوزید کافئوئیل فنیل اتانوئیدی است که از چندین گیاه گیاهی مانند کلرید ورباسکوم [4]، بودلجا گلوبوزا [5] و پلانتاگو استرالیا [6] جدا شده است. Acteoid دارای فعالیت های بیولوژیکی مختلفی مانند ضد میکروبی [5]، ضد التهابی [7]، ضد سرطانی [8]، آنتی اکسیدانی [9]، محافظ سلولی [9] و اثر محافظتی عصبی [10] است. علاوه بر این، تجویز خوراکیاکتئوزیددر دوز بالا باعث ایجاد سمیت ژنتیکی نمی شود[11].

از این رو، ما فرض کردیم که اکتئوزید با ایمنی بیولوژیکی ضد التهابی دارای اثرات ضد کاتابولیک مرتبط با محافظت از غضروف مفصلی در برابر انحطاط پیشرونده غضروف مفصلی از طریق سرکوب عوامل کاتابولیک مانند سیتوکین های پیش التهابی، التهاب غضروف مفصلی و التهاب مفصلی است. . بنابراین، هدف از این مطالعه، بررسیاکتئوزید-اثرات ضد کاتابولیک القا شده و مسیر سیگنال دهی سلولی آن هم در شرایط آزمایشگاهی، با استفاده از غضروف های اولیه جدا شده از غضروف مفصلی مفصل زانوی موش صحرایی، و هم در داخل بدن، با استفاده از یک مدل حیوانی OA ایجاد شده توسط بی ثباتی جراحی منیسک داخلی در مفصل زانوی موش.

اکتئوزیدکه درسیستانچمی توانبهتر کردنمصونیت

2. روش ها

2.1. کشت سلولی

سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی از غضروف مفصلی مفاصل زانو ({0}}روزه؛ Sprague–Dawley) مطابق با پروتکل (CIA-CUC2019-A0027) تایید شده توسط موسسه جدا شد. کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه چوسان، گوانگجو، جمهوری کره. سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی در مخلوط مدیوم/مغذی دولبکو اصلاح شده عقاب F{6} (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rock-ford, IL, USA) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) نگهداری شدند. ، گرند آیلند، نیویورک، ایالات متحده آمریکا)، آنتی بیوتیک ها (50U/mL پنی سیلین و 50ug/mL استرپتومایسین)، و 50ug/mL اسید اسکوربیک. رده سلولی طبیعی فیبروبلاست L-929 موش از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC) خریداری شد. طبق دستورالعمل‌های ارائه‌شده از ATCC، سلول‌های L{14} در محیط حداقل ضروری Eagle، حاوی 10 درصد FBS، کشت شدند و در انکوباتور مرطوب‌شده در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 رشد کردند.

2.2. سنجش زنده ماندن سلولی

سنجش نمک دی‌متیل تیازولیل دی فنیل تترازولیوم (MTT) برای ارزیابی قابلیت حیات سلول‌های رده سلولی فیبروبلاست موش L929 که به‌عنوان سلول طبیعی و کندروسیت‌های اولیه موش تیمار شده با آکتئوزید استفاده می‌شوند، انجام شد. به طور خلاصه، سلول‌های L929 و سلول‌های غضروفی اولیه موش با تراکم سلولی 105×8 سلول در میلی‌لیتر در پلیت‌های کشت به مدت 24 ساعت کشت داده شدند و سپس با 2.5، 5، 10، 25، 50 و 100 میکرومولار تیمار شدند.اکتئوزیدبه مدت 24 ساعت پس از درمان با محلول MTT، سلول‌های L929 و سلول‌های غضروفی به مدت 4 ساعت بیشتر کشت داده شدند. پس از انکوباسیون، کریستال های MTT تشکیل شده به طور کامل در دی متیل سولفوکسید معلق شدند و برای ارزیابی قابلیت زنده ماندن سلول ها با استفاده از یک طیف سنج (طیف سنج میکروپلیت Epoch، BioTek®، Winooski، VT، USA) جذب در 570 نانومتر اندازه گیری شدند.

2.3. آزمایش سلول زنده/مرده.

بقای سلولی با استفاده از کیت سنجش سلول زنده/مرده (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) انجام شد که از calcein-AM سبز برای برچسب زدن سلول های زنده (با فلورسانس سبز) و همودایمر اتیدیوم{1} برای برچسب زدن مرده تشکیل شده است. سلول ها (با فلورسانس قرمز). به طور خلاصه، هم سلول های L929 و هم سلول های غضروفی اولیه موش با تراکم سلولی 105×8 سلول در میلی لیتر بر روی لام های محفظه ای (سیستم Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™؛ Sigma- Aldrich؛ Merck KGaA) به مدت 24 ساعت کشت داده شدند و سپس تحت درمان قرار گرفتند. 50 و 100 میکرومولار اکتئوزید برای 24 ساعت. پس از کشت، سنجش بقای سلولی طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. پس از آن، سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (Eclipse TE200؛ Nikon Instruments، Melville، NY) تصویربرداری شدند.

2.4. سنجش دی متیل متیلن آبی (DMMB).

سنجش DMMB برای ارزیابی تغییر محتوای پروتئوگلیکان در سلول‌های غضروفی اولیه موش‌های صحرایی تحت درمان با آکتئوزید به مدت 21 روز در حضور یا عدم حضور IL{1}} انجام شد. برای حفظ ویژگی‌های کندروسیت‌های اولیه موش صحرایی به مدت 21 روز، سلول‌های غضروفی موش اولیه (2×106 سلول) در 1 میلی‌لیتر آلژینات 1.2 درصد تعلیق شدند و سپس با چکاندن سوسپانسیون سلول/آلژینات به محلولی از 105 میلی‌مولار CaCl2 کپسوله شدند. سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی محصور شده در آلژینات به مدت 24 ساعت در DMEM/F12 (حاوی 10 درصد FBS، 50 U/mL پنی سیلین، 50 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین و 50 میکروگرم در میلی لیتر اسید اسکوربیک) کشت داده شدند و سپس به مدت 24 ساعت در DM112 درصد DM/F سازگار شدند. مینی انسولین-ترانسفرین-سلنیوم (mini-ITS) و 50 گرم در میلی لیتر اسید اسکوربیک. متعاقبا، سلولهای غضروفی با 50 یا 100 میکرومولار تحت درمان قرار گرفتنداکتئوزیددر حضور یا عدم حضور 1ng/ml IL-1 به مدت 21 روز. در روز 21، سلول‌های غضروفی اولیه موش برای ارزیابی محتوای پروتئوگلیکان با استفاده از روش DMMB، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، جمع‌آوری شدند [12]. علاوه بر این، برای تعیین کمیت محتوای پروتئوگلیکان در هر سلول و ارزیابی تکثیر سلول‌های غضروفی اولیه موش، تعداد سلول‌ها با روش DNA با استفاده از PicoGreen (Molecular Probes، Carlsbad، CA)، مطابق دستورالعمل‌های سازنده اندازه‌گیری شد. وجود یا عدم وجود 10ng/mL IL{6}} به مدت 7 روز. در پایان دوره کشت، نمونه‌ها جمع‌آوری و در پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 72 ساعت برای تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی تثبیت شدند.

2.6. تجزیه و تحلیل بافت شناسی.

تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی با استفاده از سافرانین-O و رنگ‌آمیزی سبز سریع برای تأیید از دست دادن پروتئوگلیکان در غضروف مفصلی تحت درمان با 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{3}} به مدت 7 روز انجام شد. به طور خلاصه، نمونه های ثابت غضروف مفصلی در اتیلن دی آمین تتراستیک اسید کلسیفیه شدند و سپس در پارافین جاسازی شدند. پس از آن، بلوک های پارافین آماده شده حاوی غضروف مفصلی به صورت متوالی به ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند و روی اسلایدها قرار گرفتند. سافرانین-O و رنگ آمیزی سریع سبز متعاقبا برای ارزیابی از دست دادن پروتئوگلیکان در ماده زمین غضروف مفصلی انجام شد. علاوه بر این، رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین برای مشاهده مورفولوژی کلی غضروف مفصلی انجام شد.

2.7. وسترن بلاتینگ.

وسترن بلات برای بررسی بیان عوامل کاتابولیک شامل MMP{0}}، MMP{1}}، MMP-3، نیتریک اکسید سنتاز القایی (iNOS) و سیکلواکسیژناز-2 (COX) انجام شد. -2) و تغییر مولکول های سیگنال دهی سلولی مانند پروتئین کینازهای فعال شده با میتوژن و فاکتور هسته ای کاپا B (NFκB). به طور خلاصه، سلول‌های غضروفی اولیه موش با 50 یا 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{10}} به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، سلولهای غضروفی اولیه موش توسط سانتریفیوژ برداشت شدند و با استفاده از بافر لیز (Cell Signaling Technology، Danvers، MA، USA) مطابق دستورالعمل سازنده لیز شدند. علاوه بر این، برای تأیید جابه‌جایی هسته‌ای NFκB، سلول‌های غضروفی اولیه موش با 50 یا 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{15}} به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، بخش‌های سیتوزولی و هسته‌ای با استفاده از معرف‌های استخراج هسته‌ای و سیتوپلاسمی NE-PER™ (Thermo Sci-entific، Rockford، IL، USA) مطابق دستورالعمل سازنده استخراج شدند. غلظت کل پروتئین استخراج شده از سلول های غضروفی اولیه موش با استفاده از کیت سنجش پروتئین اسید بیسینکونیک (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد. علاوه بر این، محیط شرطی شده برای شناسایی سطوح آنزیم های تجزیه کننده غضروف ترشح شده از سلول های غضروفی جمع آوری شد. مقادیر مساوی از پروتئین و محیط مطبوع بر روی الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) الکتروفورز و سپس بر روی غشاهای نیتروسلولزی منتقل شدند. پس از آن، وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اولیه هدفمند علیه MMP-13، MMP{24}}، MMP{25}}، iNOS، COX-2، فسفو-ERK1/2، کل انجام شد. -ERK1/2، phospho-p38، total-p38، phospho-JNK، total JNK، phospho-NFκB، NFκB کل، - اکتین و لامین B. نوارهای Immunoreactive با استفاده از یک سیستم نورتابی شیمیایی تقویت شده (Thermo Sci- entic, Rockford, , IL, USA) طبق دستورالعمل سازنده و سپس توسط دستگاه Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel) تصویربرداری شده است.

2.8. واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (qPCR) و کمی PCR در زمان واقعی (qRT-PCR).

سلولهای غضروفی موش اولیه با 50 یا 100μM تحت درمان قرار گرفتنداکتئوزیددر حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{1}} به مدت 24 ساعت. پس از آن، RNA کل از سلولهای غضروفی اولیه موش با استفاده از معرف TRIZol (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده جدا شد. غلظت RNA کل با استفاده از NanoDrop 2000 (Thermo Scientic, Rockford, IL, USA) اندازه‌گیری شد. برای سنتز cDNA، RNA 1 ug با استفاده از سیستم رونویسی معکوس-PCR ThermoScript (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده رونویسی معکوس شد. qPCR cDNA با استفاده از 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics، سئول، جمهوری کره) و پرایمرهای خاص روی دستگاه چرخه حرارتی TaKaRa PCR (TaKaRa Bio Inc.، Shiga، ژاپن) انجام شد. پس از آن، محصولات PCR بر روی ژل آگارز الکتروفورز شدند تا سطح بیان ژن‌های هدف تعیین شود. گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان یک کنترل درون زا استفاده شد. علاوه بر این، برای qRT-PCR، cDNA با استفاده از یک سیستم Eco™ Real-Time PCR (illumine Inc., San Diego, CA, USA) تقویت شد. اکتین به عنوان کنترل درون زا استفاده شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در qPCR و qRT-PCR به ترتیب در جداول 1 و 2 خلاصه شده است.

2.9. زیموگرافی ژلاتینی.

زیموگرافی ژلاتینی برای ارزیابی فعال شدن MMPs در سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی انجام شد. به طور خلاصه، کندروسیت‌های اولیه موش با 50 یا 10{21}}μM اکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL-1 به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، حجم مساوی از محیط مطبوع بر روی ژل پلی آکریل آمید 10 درصد کوپلیمر شده با 2/0 درصد (1 میلی گرم بر میلی لیتر) ژلاتین پوست خوک الکتروفورز شد. پس از الکتروفورز، ژل در بافر احیاکننده زیموگرام (50 میلی‌مولار تریس– HCl (pH7.6)، 10 میلی‌مولار CaCl2، 50 میلی‌مولار NaCl و 0.05 درصد Brij{18}}) در دمای 37 درجه به مدت 72 ساعت انکوبه شد. پس از بازسازی مجدد MMP ها، ژل با 0.1 درصد Coomassie Brilliant Blue R250 رنگ آمیزی شد. نوارهای ژلاتینولیتیک به صورت نوارهای شفاف بر روی پس‌زمینه‌ای که به طور یکنواخت به رنگ آبی روشن رنگ‌آمیزی شده بود، آشکار شد و سپس با استفاده از دوربین دیجیتال تصویربرداری شد.

2.10. اندازه گیری اکسید نیتریک (NO).

سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی با 50 یا 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{3}} به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. سپس 50 میکرولیتر از محیط مطبوع با 50 میکرولیتر سولفانیل آمید و N{7}}نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید واکنش داده شد. سپس جذب در طول موج 540 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (اسپکتروفتومتر Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA) اندازه‌گیری شد.

2.11. سنجش پروستاگلاندین E2 (PGE2).

سلولهای غضروفی موش اولیه با 50 یا 100μM تحت درمان قرار گرفتنداکتئوزیددر حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{1}} به مدت 24 ساعت. پس از آن، غلظت PGE2 با استفاده از کیت سنجش پارامتر PGE2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) طبق دستورالعمل سازنده اندازه‌گیری شد.

2.12. آرایه سیتوکین.

سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی با 50 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{2}} به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، پروتئین کل استخراج و اندازه گیری شد همانطور که قبلاً توضیح داده شد [13]. سپس، یک آرایه سیتوکین برای بررسی تغییر در تولید سیتوکین، طبق دستورالعمل سازنده (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) انجام شد.

2.13. سنجش انتقال هسته ای

سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی با دوزهای 50 و 100 گرم در میلی لیتر تیمار شدنداکتئوزیددر حضور 10ng/mL IL-1. پس از 30 دقیقه، کندروسیت‌های اولیه موش صحرایی با 1 درصد پارافورمالدئید تثبیت شدند، در 2/0 درصد تریتون X نفوذپذیر شدند و به طور گسترده با سالین بافر فسفات شسته شدند. سیگنال های غیر اختصاصی با استفاده از سرم طبیعی بز مسدود شدند. پس از چندین شستشو، غضروف‌ها با آنتی‌بادی‌های ضد NFκB خرگوش و سپس با IgG ضد خرگوش بز کونژوگه با FITC (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) در یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شدند. پس از آن، سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از یک سیستم میکروسکوپ اسکن کانفوکال لیزری (Leica Microsystems، Wetzlar، آلمان) در شعبه Gwangju موسسه علوم پایه کره (Gwangju، جمهوری کره) تصویربرداری شدند.

2.14. نسل حیوانات آرتروز.

برای تولید حیوانات مبتلا به استئوآرتریت، منیسک داخلی (DMM) در مفاصل زانو موش‌های BALB/c (متوسط ​​وزن بدن 19:3±{2}}:5 گرم) مطابق با دستورالعمل‌های IACUC (CIACUC{4}) از طریق جراحی بی‌ثبات شد. }A0029). حیوانات ناشی از OA به صورت خوراکی با 5 و 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم آکتئوزید حل‌شده در 5 درصد اتانول (گروه آزمایش؛ n =5) یا وسیله نقلیه (5 درصد اتانول) (گروه DMM; n =5) هر بار تحت درمان قرار گرفتند. یک روز دیگر به مدت 8 هفته در پایان دوره کشت، مفاصل زانو تشریح و با استفاده از پارافورمالدئید 5 درصد به مدت 7 روز برای انجام ارزیابی‌های بافت‌شناسی ثابت شدند. پس از سافرانین-O و رنگ‌آمیزی سبز سریع، بافت‌های تصویربرداری شده از غضروف مفصلی مطابق با درجه Mankin مورد بررسی قرار گرفتند [14، 15].

2.15. تحلیل آماری.

داده های تجربی به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده و با استفاده از تحلیل واریانس مقایسه شدند و سپس با مقایسه چندگانه تعقیبی (آزمون توکی) با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 25 (IBM Corp.) همه داده ها به جز مطالعه حیوانی به دست آمد. از سه آزمایش مستقل

اکتئوزیدکه درسیستانچ

3. نتایج

3.1. Acteoside بر زنده ماندن سلول L929 و سلول های غضروفی موش اولیه تأثیر نمی گذارد.

رده سلولی فیبروبلاست موش L929 مورد استفاده به عنوان سلول های طبیعی با 2.5، 5، 10، 25، 50، و 100μM اکتئوزید به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفت. پس از آن، سنجش MTT برای ارزیابی سمیت سلولی اکتئوزید بر روی سلول های L929 انجام شد. همانطور که در شکل 2 (الف) نشان داده شده است، زنده ماندن نسبی سلول های L929 8±94:8 درصد، 7±93:6 درصد، 5±100 درصد، 5±103:9 درصد، 8±126:1 درصد تعیین شد. و 4±122:7 درصد در 2.5، 5، 10، 25، 50 و 100μM اکتئوزید، در مقایسه با شاهد (3 ± 100:02 درصد). علاوه بر این، برای تأیید سمیت سلولی اکتئوزید بر غضروف‌های اولیه موش صحرایی، سنجش MTT همانطور که در شکل 2 (b) نشان داده شده است، انجام شد. قابلیت زنده ماندن سلول های غضروفی اولیه موش صحرایی تیمار شده با 2.5، 5، 10، 25، 50 و 100 میکرومولار آکتئوزید به صورت 4 ± 114 درصد، 6 ± 117: 8 درصد، 5 ± 123: 9 درصد، 4 ± 132: 6 درصد تعیین شد. به ترتیب 7±153:1 درصد و 6±142:1 درصد در مقایسه با شاهد (5±100:4 درصد). علاوه بر این، برای تأیید اثر اکتئوزید بر روی زنده ماندن سلول‌های L929 و سلول‌های غضروفی اولیه موش، آزمایش سلول زنده/مرده همانطور که در شکل 2 (c) نشان داده شده است، انجام شد. تعداد سلول‌های مرده رنگ‌آمیزی شده به‌عنوان فلورسانس قرمز برای سلول‌های L929 و سلول‌های غضروفی اولیه موش‌های صحرایی تحت تیمار با 50 و 100 میکرومولار آکتئوزید به مدت 24 ساعت افزایش پیدا نکرد. این داده ها به طور مداوم نشان می دهد که دوز تعیین شده ازاکتئوزیدبر زنده ماندن سلول های L929 و سلول های غضروفی اولیه موش تاثیری نداشت. بنابراین، آکتئوزید 50 میکرومولار و اکتئوزید 100 میکرومولار، که دوزهای غیرسمی هم در سلول‌های L929 و هم در سلول‌های غضروفی موش اولیه هستند، برای تأیید اثرات ضد کاتابولیک آن در مطالعات آزمایشگاهی با استفاده از سلول‌های غضروفی اولیه موش مورد استفاده قرار گرفتند.

3.2. Acteoside با از دست دادن پروتئوگلیکان ناشی از IL در سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی مقابله می کند.

سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی جاسازی شده در دانه های آلژینات با 50 و 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 1 نانوگرم در میلی لیتر IL{3}} به مدت 21 روز تیمار شدند. پس از آن، یک سنجش DMMB برای ارزیابی تغییر در محتوای پروتئوگلیکان همانطور که در شکل 3 (a) نشان داده شده است، انجام شد. محتوای پروتئوگلیکان نسبی 18:1±88:3 درصد و 86:8±16:3 درصد در سلول‌های غضروفی اولیه موش‌های صحرایی تحت تیمار با 50 و 100 میکرومولار آکتئوزید، در مقایسه با شاهد (103:8±8) تعیین شد. 32:3 درصد). اگرچه محتویات نسبی پروتئوگلیکان توسط اکتئوزید کاهش یافت، اما این نتایج معنی دار نبودند. با این حال، محتوای نسبی پروتئوگلیکان به طور قابل توجهی 14:7 ± 37:1 درصد در سلول های غضروفی موش اولیه تیمار شده با 1ng/ml IL کاهش یافت، اما 50 و 100μM اکتئوزید به طور قابل توجهی محتوای پروتئوگلیکان را به میزان 127±127 کاهش داد: درصد و به ترتیب 64 ± 14:5 درصد در حضور 1ng/mL IL{35}}. متعاقباً، برای بررسی اینکه آیا اکتئوزید از دست دادن پروتئوگلیکان ناشی از IL را سرکوب می‌کند، غضروف مفصلی جدا شده از مفاصل زانوی موش صحرایی با 100μM اکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/mL IL{39}} به مدت 7 روز درمان شد. پس از آن، ارزیابی‌های بافت‌شناسی با استفاده از رنگ‌آمیزی H&E و سافرانین-O و رنگ‌آمیزی سبز سریع همانطور که در شکل 3 (b) نشان داده شده است، انجام شد. تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ‌آمیزی H&E مشاهده نشد. با این حال، سافرانین-O و رنگ‌آمیزی سبز سریع نشان داد که پروتئوگلیکان رنگ‌آمیزی شده به‌عنوان رنگ قرمز در غضروف‌های مفصلی تحت درمان با اکتئوزید 100 میکرومولار در مقایسه با گروه شاهد تغییری نمی‌کند. با این حال، از دست دادن شدید پروتئوگلیکان توسط 10ng/mLIL{46}} در غضروف مفصلی القا شد و 100μM اکتئوزید به طور قابل توجهی از دست دادن پروتئوگلیکان را در غضروف مفصلی تحت درمان با 10ng/ml IL سرکوب کرد. در مجموع، این داده ها به طور مداوم نشان می دهند که اکتئوزید دارای اثر ضد کاتابولیک است که از طریق خنثی کردن از دست دادن پروتئوگلیکان ناشی از IL، انحطاط غضروف مفصلی را به تاخیر می اندازد.

اکتئوزیدکه درسیستانچاثرات خوبی بر رویآنتی اکسیدان

3.3. Acteoside دارای اثر آنتی کاتابولیک است که بیان و فعال شدن MMP را در سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی تحت درمان با IL -1 سرکوب می کند.

برای بررسی اینکه آیا اثر ضد کاتابولیک ناشی از آکتئوزید با سرکوب بیان و فعال‌سازی MMP مرتبط است، غضروف‌های اولیه موش با 50 و 100 میکرومولار آکتئوزید در حضور یا عدم حضور 10ng/ml IL{4}} به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از آن، تغییرات در MMP ها مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 4 (الف) نشان داده شده است، اگرچه بیان آنزیم های تجزیه کننده غضروف مانند MMP{8}}، MMP-1 و MMP{10}} به طور قابل توجهی در محیط های شرطی شده موش اولیه افزایش یافته است. سلولهای غضروفی تحت درمان با 10ng/mL IL{12}}، کاهش یافتاکتئوزیدبه صورت وابسته به دوز علاوه بر این، نتایج هر دو qPCR (شکل 4(b)) و qRT-PCR (شکل 4(c)) نشان داد که IL{4}} به طور قابل توجهی سطوح mRNA MMP ها مانند MMP-13، MMP{ را افزایش داد. {6}} و MMP-3 در سلولهای غضروفی اولیه موش صحرایی. با این حال، آنها وابسته به دوز در سلول های غضروفی موش اولیه تحت درمان با 50 و 100μM اکتئوزید کاهش یافته است. علاوه بر این، آکتئوزید 50 و 100 میکرومولار به طور موثری فعال شدن MMP ها را در سلول های غضروفی اولیه موش تحت درمان با 10ng/mL IL{14}} سرکوب کردند (شکل 4(d)). در مجموع، این داده ها به طور مداوم نشان می دهد که اکتئوزید دارای اثر ضد کاتابولیک است که بیان و فعال شدن آنزیم های تجزیه کننده غضروف را سرکوب می کند.