بخش 1: قطبش میکروگلیا M1 سرکوب شده آکتئوزیدی از طریق مسیر سیگنالینگ مهار شده NF-kB و بازیابی عملکرد میتوکندری با واسطه AMPK

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

خلاصه:

زمینه:بیماری آلزایمر (AD)شایع ترین نوع زوال عقل است. در حالی کهاکتئوزید از گیاه سیستانچ(ACT)، یک ترکیب جدا شده از سیستانچتوبولوزا، دارای خواص محافظت کننده عصبی است. با این حال، مکانیسم اساسی در تنظیم پلاریزاسیون میکروگلیا نادرست است.مواد و روش ها:در اینجا، مدل AD القایی{0}}AlCl در لاروهای گورخر برای کشف اثر درمانی ACT استفاده شد. سلول‌های BV{1}} برای نشان دادن نقش ACT در پلاریزاسیون میکروگلیا مورد استفاده قرار گرفتند. توالی RNA، HPLC-Q-TOF-MS، وسترن بلات و داکینگ مولکولی برای تایید مکانیسم آن ترکیب شدند.نتایج:ACT به طور قابل توجهی دیسکینزی تجربی و اختلالات سیستم عصبی را در گورخر بهبود بخشید. پس از آن، قطبش M1 را سرکوب کرد و به فنوتیپ M2 در سلول‌های BV{3}} القا شده با LPS ارتقا یافت. ما برای اولین بار نشان دادیم که ACT تأثیر ترانویسی عمیقی را اعمال می کند، که شامل تنظیم مسیرهای سیگنالینگ کلیدی در حشرات، بیوسنتز آرژنین، و همچنین بیوسنتز پانتوتنات و CoA است که با عملکرد میتوکندری مرتبط است. ACT(اکتئوزید از گیاه سیستانچ) درمان با مهار مسیر سیگنالینگ NF-kB، قطبش میکروگلیا M1 را کاهش داد. و مسیرهای متابولیک بیشتر توسط HPLC-Q-TOF-MS تایید شد. علاوه بر این، ACT ROS بیش از حد را اصلاح کرد تا عملکرد میتوکندری را از طریق PGC{6}} و UCP{7}} با واسطه AMPK بازیابی کند، مطابق با تغییرات متابولیک. به طور جالبی، ACT ممکن است به طور مستقیم به NF-κB و AMPK متصل شود، همانطور که توسط اتصال مولکولی مشهود است.نتیجه گیری:این تحقیق یک مکانیسم تزریقی از ACT ارائه کرد و دیدگاه جدیدی را بر اساس اختلال عملکرد میتوکندری برای آشکار کردن ارتباط بین متابولیسم و ​​قطبش میکروگلیا نشان داد.

زمینه:

آلزایمربیماری(AD) یک بیماری نورودژنراتیو شایع است که با اختلالات شناختی و دیسکینزی همراه است[1]. این بیماری با از دست دادن شدید نورون ها، پلاک های پیری و درهم تنیدگی های نورونی[2] مشخص می شود. پاتوژنز AD چند بعدی است و با نورون‌آمماسیون مرتبط است. عصب‌آماتاسیون توسط فعال‌سازی سلول‌های گلیال، که ارتباط نزدیکی با ایجاد AD دارد، هدایت می‌شود[3، 4]. در طول پیشرفت و تشدید عصب عصبی، میکروگلیا عامل کلیدی در نظر گرفته می شود. میکروگلیا سلول های ایمنی اولیه در سیستم عصبی مرکزی هستند. ارتباط نزدیکی با مجموعه ای از فرآیندها دارد که شامل رشد مغز، حفظ یک محیط خنثی، و همچنین پاسخ به آسیب و ترمیم است[1]. علاوه بر این، میکروگلیا را می توان به فنوتیپ M1 تحریک کرد و بیان سیتوکین های طرفدار آمیختگی در هنگام بروز بیماری های مرتبط با نورون آمیشن مانند AD افزایش می یابد [5]. مطالعات همچنین نشان می دهد که قطبش به فنوتیپ M1 اغلب با اختلالات متابولیک همراه است [6]، که باعث عدم تعادل متابولیسم انرژی و اختلال در عملکرد میتوکندری می شود [7]. این تغییرات نامطلوب ناشی از تخریب عصبی، حتی AD است.

اکتئوزید از گیاه سیستانچ(ACT)، یک گلیکوزید فنیل اتانوئید، در درجه اول از آن مشتق شده است سیستانچتوبولوزا. شواهد فزاینده ای نشان می دهد که ACT دارای فعالیت های دارویی متعددی از جمله اثرات محافظت کننده عصبی [8]، ضد عفونی [9] و آنتی اکسیدانی [10] است. به ویژه، گزارش شده است که ACT باعث بهبود اختلال یادگیری و حافظه و همچنین تنظیم مثبت متابولیسم انرژی در موش های صحرایی القا شده با استرپتوزوتوسین می شود[11]. همچنین پیشنهاد شده است که از مرگ سلولی آپوپتوز نورونی و آسیب میتوکندری در موش های آزمایشگاهی آنسفالومیلیت خودایمنی جلوگیری کند [12]. با این حال، مطالعات کمتری بر روی تأثیر ACT بر قطبش میکروگلیا M1/M2 متمرکز شده است. به خصوص مکانیسم های مختلفی مانند ترمیم عملکرد میتوکندری و تنظیم متابولیسم سلولی انجام نشده است. علاوه بر این، مکانیسم ACT در قطبش میکروگلیا M1/M2 ناشناخته باقی مانده است.

هدف گزارش حاضر بررسی اثر درمانی ACT و همچنین مکانیسم مولکولی زیربنایی ACT در AD بود. در اینجا، ACT یک اثر محافظت عصبی قابل توجه در لاروهای AD گورخری القا شده با AlCl3- نشان داد. علاوه بر این، ACT به طور موثر قطبش M1 را مهار کرد و فنوتیپ M2 را در سلول‌های BV{4}} القا شده با LPS ارتقا داد. توالی یابی RNA (RNA-Seq) با روش متابولومیکس ادغام شده است تا مکانیسم اساسی ACT در تنظیم پلاریزاسیون میکروگلیا را بهتر درک کند. تداخل بین متابولیسم و ​​قطبش میکروگلیا از نظر عملکرد میتوکندری مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه احترام جدیدی را برای بررسی بیشتر ACT به عنوان یک عامل درمانی بالقوه برای درمان AD فراهم می کند.

مواد و روش ها:

حیوانات و گروه بندی مدل:

گورخرهای نوع وحشی (سویه AB، 4 ماهه) در این مطالعه انتخاب شدند (شرکت بیوتکنولوژی نانجینگ چی وو، آموزشی ویبولیتین). آنها تحت یک چرخه نور/تاریکی 14/10 ساعت در دمای 28 درجه نگهداری شدند، به دنبال روش قبلی [13]. کود طبیعی و جنین های به طور معمول توسعه یافته تولید و تا 3 روز پس از لقاح (dpf) در یک انکوباتور روشنایی کشت داده شدند. تمام آزمایشات گورخر تحت نظارت کمیته اخلاق حیوانات دانشگاه داروسازی چین انجام شد.

لاروهای Zebra¦sh به شش گروه تقسیم شدند و از 3 dpf تا 7 dpf تیمار شدند: گروه شاهد، گروه مدل، گروه مدل به همراه دونپزیل هیدروکلراید (DPZ)، گروه مدل به همراه ACT. گروه کنترل در محیط با 2/2 درصد DMSO و گروه مدل با 150 میکرومولار AlCl3 (pH 8/5) تیمار شدند. مدل به علاوه گروه DPZ با AlCl3 و 8 میکرومولار DPZ تحت درمان قرار گرفت. مدل به علاوه گروه های ACT با AlCl3 و غلظت های مختلف ACT (200، 100، 50 میکرومولار) تحت درمان قرار گرفتند. ACT(اکتئوزید از گیاه سیستانچ)(خلوص HPLC بیشتر یا مساوی 98 درصد) از شرکت Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (بائوجی، چین) به دست آمد. AlCl3·6H2O و DPZ از Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD خریداری شدند. (شانگهای، چین).

تحلیل رفتاری

حرکات لارو Zebra¦sh با یک تحلیلگر رفتاری ViewPoint (Zebralab 2018، ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) در 28 درجه ثبت شد. خلاصه، پارامترهای رفتاری و پردازش نتیجه با روشی که قبلاً ایجاد کردیم مطابقت داشت [13]. در اینجا، میانگین سرعت (AS)، تغییر سرعت (ΔS)، نرخ بازیابی دیسکینزی (DRR)، و سرعت پاسخ (RE، درصد) برای ارزیابی بهبود دیسکینزی در گورخر انتخاب شدند.

پس از تیمار از 3 dpf تا 7 dpf، لاروهای گورخر برای اندازه گیری فعالیت AChE و ChAT جمع آوری شدند. بر اساس پروتکل سازنده، فعالیت توسط کیت های سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China) شناسایی شد. و غلظت پروتئین نمونه های مختلف با روش BCA تعیین شد.

سلول‌های BV{0}} در یک 6-بشقاب به طور جداگانه (n=6/گروه) کاشته شدند. پس از تیمار، محیط خارج شد و سلول ها سه بار با PBS سرد شستشو داده شدند. سپس بلافاصله در معرض نیتروژن مایع قرار می گیرد تا متابولیسم سلول ها را سرکوب کند. سلول ها با متانول سرد 80 درصد (1 میلی لیتر در چاه) برداشت و سوسپانسیون به یک لوله اپندورف 2 میلی لیتری منتقل شد. برای تسهیل رسوب پروتئین، به مدت 1 دقیقه به شدت ورتکس شده و با سرعت 13،{8}} دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ می شود. سوسپانسیون سلولی به یک لوله جدید اپندورف 2 میلی لیتری منتقل شد و در زیر جریان نیتروژن خشک شد و تا زمان تجزیه و تحلیل در درجه -80 نگهداری شد. باقیمانده خشک شده در 150 میکرولیتر استونیتریل 25 درصدی از قبل سرد شده بازسازی شد. به منظور اطمینان از ثبات و دقت تجزیه و تحلیل توالی، حجم مساوی (10 میکرولیتر) از هر نمونه سلول به عنوان نمونه کنترل کیفیت (QC) ترکیب شد. در طی تشخیص متابولیت، این نمونه‌ها پس از هر شش نمونه سلول تزریق می‌شوند تا پایداری آنها تایید شود. مقدار 1 میکرولیتر برای HPLC-Q-TOF-MS تزریق شد.

تجزیه و تحلیل HPLC-Q-TOF-MS روی سیستم HPLC Agilent 129 انجام شد که با طیف‌سنج جرمی زمان پرواز چهار قطبی Agilent 6530 (Q-TOF) (Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) متصل است. جداسازی بر روی ستون ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 میلی متر، 1.7 میکرومتر) انجام شد. فاز متحرک از 0.1 درصد اسید فرمیک آب (v/v؛ A) و استونیتریل (B) تشکیل شده بود.

نرخ §ow در {{0}}.4 میلی‌لیتر در دقیقه با شرایط شستشوی گرادیان بهینه زیر تنظیم شد: 0 تا 2 دقیقه، 5 درصد B. 2 تا 20 دقیقه، 5 درصد تا 95 درصد B (حالت یون مثبت). 0 تا 2 دقیقه، 5 درصد B; 2 تا 20 دقیقه، 5 درصد تا 95 درصد B (حالت یون منفی). پارامترهای عملکرد طیف سنج جرمی به شرح زیر تنظیم شد: دمای گاز، 320 درجه. گاز خشک کن 10 لیتر در دقیقه. نبولایزر 35 psi; VCap، 4000 V; قطعه، 120 ولت.

داده های خام تحت نرم افزار MassHunter Workstation نسخه B.07.{1}} (Agilent Technologies، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) استفاده شد. داده های خام توسط پلتفرم XCMS از پیش پردازش شده بودند. تجزیه و تحلیل مؤلفه های اصلی (PCA) و تجزیه و تحلیل تفکیک حداقل مربعات جزئی (PLS-DA) داده های نرمال شده با MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca) انجام شد. همراه با ادبیات، متابولیت های افتراقی (VIP > 1، آزمون تی P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">