کل گلیکوزیدهای گیاه سیستانش دسرتیکولا با القای بازسازی عصبی عروقی از طریق مسیر Nrf- 2/Keap-1 در موش‌های صحرایی MCAO/R باعث بهبود عملکرد عصبی می‌شوند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

فوجیانگ وانگ، رویان لی، پنگفی تو، جیان پینگ چن، کوو زنگ و یونگ جیانگ

زمینه:طب سنتی چینی Cistanche deserticola برای بیماری های قلبی عروقی و عروق مغزی معتبر گزارش شده است. با این حال، اجزای فعال آن برای محافظت از سکته مغزی ایسکمیک مشخص نیست. هدف ما بررسی اجزای فعال بودC. deserticolaدر برابر سکته مغزی ایسکمیک و همچنین مکانیسم های بالقوه آن.مواد و روش ها:ما اثرات محافظتی مغز عصاره‌ها را بررسی کردیمC. deserticola، گلیکوزیدهای کل (TGs)، پلی ساکاریدها (PSs) و الیگوساکاریدها (OSs) در مدل موش انسداد عروق مغزی میانی (MCAO/R). 2، 3، 5-رنگ‌آمیزی تری فنیل تترازولیوم کلرید (TTC) برای ارزیابی حجم انفارکتوس مغزی استفاده شد و از روش آبی ایوانز برای ارزیابی نفوذپذیری سد خونی مغزی (BBB) ​​استفاده شد. سپس عبارات CD31، a-SMA، PDGFRb، SYN، PSD95، MAP{8}}، ZO-1، claudin-5، occludin، Keap{11}}، و Nrf{{ 12}} با استفاده از وسترن بلات یا ایمونوفلورسانس آنالیز شدند و فعالیت‌های MDA، SOD، CAT و GSH-Px با استفاده از کیت‌ها آنالیز شدند.نتایج:درمان TGs به طور قابل توجهی نمرات نقص عصبی و حجم انفارکتوس را کاهش داد، رگ زایی و بازسازی عصبی را ارتقا داد و به طور موثر یکپارچگی سد خونی-مغزی را در مقایسه با گروه مدل حفظ کرد. علاوه بر این، TGs به طور قابل توجهی سطوح MDA را کاهش داد و فعالیت های آنتی اکسیدانی (SOD، CAT و GSH-Px) را در مغز افزایش داد. در همین حال، TGها به طرز قابل توجهی بیان Keap{3}} را کاهش دادند و انتقال هسته‌ای Nrf-2 را تسهیل کردند. در مقابل، هیچ اثر محافظتی برای گروه های PS و OSs مشاهده نشد.نتیجه:TGها اجزای اصلی فعال هستندC. deserticolaدر برابر آسیب مغزی ناشی از MCAO/R، و محافظت عمدتاً از طریق مسیر Nrf-2/Keap-1 است.

کلمات کلیدی: سیستانش کویر، آسیب مغزی، گلیکوزیدهای کل، پلی ساکاریدها، الیگوساکاریدها، مسیر Nrf-2/Keap- 1

مقدمه

سکته مغزی به عنوان یک عامل اصلی مرگ و ناتوانی در جهان در نظر گرفته می شود (دانان و همکاران، 2008). تقریباً 87 درصد از تمام موارد سکته مغزی توسط سکته مغزی ایسکمیک ایجاد می شود (Ovbiagele و Nguyen-Huynh، 2011). در حال حاضر، موثرترین عامل و تنها داروی مورد تایید FDA که برای درمان سکته مغزی ایسکمیک استفاده می شود، فعال کننده پلاسمینوژن بافت نوترکیب است. با این حال، تعداد زیادی از بیماران سکته مغزی به دلیل بازه زمانی درمانی باریک آن و خطر جدی عوارض هموراژیک، به این دارو پاسخ نمی‌دهند (لی و همکاران، 2012؛ شلینگر و کورمان، 2014). چالش اصلی درمان ترومبولیتیک آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن (I/R) است که علت اصلی آسیب مغزی و تخریب عملکرد در نظر گرفته می‌شود. خونرسانی مجدد پس از ایسکمی مغزی خطر خونریزی مغزی را افزایش می دهد در حالی که منجر به آسیب عصبی عروقی و تولید گونه های اکسیژن فعال بیش از حد (ROS) می شود که به سد خونی مغزی آسیب می رساند (Alluri et al., 2015). چندین مطالعه تایید کرده اند که اختلال BBB یکی از دلایل اصلی پاتوژنز سکته مغزی ایسکمیک است (Cao et al., 2016b).

BBB عمدتاً از سلول های اندوتلیال، پری سیت ها، آستروسیت ها، نورون ها و غشای پایه تشکیل شده است. اجزای اصلی BBB سلول‌های اندوتلیال ریز عروقی مغز هستند که توسط اتصالات محکم به هم متصل می‌شوند، بنابراین مولکول‌های برون‌زا را به داخل مغز محدود می‌کنند. تغییرات پاتولوژیک اتصالات سفت - به ویژه اکلودین، کلودین-5 و زونولا انسداد-1 (ZO-1) - به طور قابل توجهی بر عملکرد BBB در طول سکته مغزی ایسکمیک، به ویژه نفوذپذیری سد تأثیر می‌گذارد (Liu et al. همکاران، 2014؛ هو و همکاران، 2018؛ لیو و همکاران، 2019). در طول دوره های I/R، ROS بیش از حد یکی از عوامل اصلی است که منجر به آسیب مستقیم نورون های مغز می شود (دینگ و همکاران، 2014). تولید بیش از حد ROS منجر به تخریب اتصالات خاص و اختلال BBB می شود که منجر به ورود مولکول های اگزوژن به مغز از طریق BBB می شود که منجر به تشدید آسیب مغزی می شود (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). بنابراین، محافظت از BBB توسط آنتی اکسیدان ها به عنوان یک راه بالقوه برای جلوگیری از آسیب خونرسانی مجدد در نظر گرفته شده است.

علاوه بر تجزیه BBB، I/R می تواند منجر به آسیب عصبی عروقی و مرگ نورون شود (یونگ و همکاران، 2010). در طول سکته مغزی، افزایش مرگ سلول های عصبی ممکن است ناشی از استرس اکسیداتیو باشد (چی و همکاران، 2018)، و مطالعات متعدد نشان داده اند که ROS شدت سکته مغزی و آسیب عصبی را تشدید می کند (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; کراک و همکاران، 2006). اگرچه کارآزمایی‌های بالینی نتایج رضایت‌بخشی به دست نیاورده‌اند، محافظت عصبی هنوز یک استراتژی امیدوارکننده برای درمان سکته مغزی ایسکمیک حاد است (مورتی و همکاران، 2015). بنابراین، یافتن داروهای محافظت کننده عصبی موثر برای درمان سکته مغزی برای بیماران سکته مغزی مفید است.

طب سنتی چینی (TCM) اقداماتی را برای مداخله در برابر عدم تعادل داخلی بدن انجام می دهد (Gaire, 2018). با توجه به پاتوژنز پیچیده سکته های مغزی ایسکمیک، اثر چند عاملی TCM و اجزای فعال آن نقش مهمی در درمان سکته های مغزی ایفا می کند. Cistanche deserticola YC Ma که در مناطق خشک یا نیمه خشک در سراسر مغولستان و شمال غربی چین گسترده شده است، بیش از 1،{3}} سال است که در چین به طور گسترده ای از گیاهان دارویی TCM برای درمان بیماری های مختلف مانند فراموشی و افسردگی استفاده می شود. . نوینمطالعات فارماکولوژیک نشان داد که عصاره خام ازC. deserticolaفعالیت های دارویی متعددی مانند افزایش عملکرد یادگیری و حافظه، محافظت عصبی، افزایش ایمنی، آنتی اکسیدان، ضد پیری و اثرات ضد خستگی را نشان داد (کو و لیونگ، 2007؛ وانگ و همکاران، 2012؛ لی و همکاران، 2015). تجزیه و تحلیل شیمیایی C. deserticola نشان داد که ترکیبات اصلی آن شامل گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید، گلیکوزیدهای ایریدوئید، پلی ساکاریدها و الیگوساکاریدها می باشد (جیانگ و تو، 2009). با این حال، اجزای فعال C. deserticola برای محافظت از مغز خیلی واضح نیست.خاصیت محافظت عصبی C. deserticola به پتانسیل درمانی آن در بیماری های مرتبط با شناختی مانند سکته مغزی و افسردگی و همچنین بیماری آلزایمر اشاره دارد (Wang et al., 2017). با این حال، تحقیق در مورد تأثیرC. deserticolaدر سکته مغزی، از جمله اجزای فعال آن و مکانیسم های عمل، بسیار محدود است. در کار فعلی، ما اثر محافظتی سه عصاره از C. deserticola، گلیکوزیدهای کل (TGs، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی، و سایر گلیکوزیدها)، پلی ساکاریدها (PSs)، و الیگوساکاریدها (OSs) را بر آسیب‌های I/R مغزی بررسی کردیم. یافته های ما ممکن است به کاربرد بالینی دقیق کمک کندC. deserticolaو یک عامل کاندید برای درمان سکته مغزی ایسکمیک فراهم کنید.

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

ساقه Cistanche deserticola از آلاشان، مغولستان داخلی خریداری شد و توسط یکی از نویسندگان (P.-F. Tu) شناسایی شد. TGs، PSs و OSs طبق روش گزارش شده قبلی ما تهیه شده اند (Gao et al., 2015). تجزیه و تحلیل کمی TGs با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) همانطور که قبلا توضیح داده شد (Li et al, 2019) انجام شد و کروماتوگرام آن در شکل 1 نشان داده شده است. اکتئوزید، و 2'-acetylakteoside. محتوای آنها به ترتیب 163.05 mg/g، 4.125 mg/g، 41.66 mg/g، 22.655 mg/g و 12.045 mg/g است. محتوای PS و OS به ترتیب 69.42 درصد و 65.24 درصد است که توسط HPLC و تجزیه و تحلیل فنل-سولفوریک اسید تعیین شده است (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).

مراجع استاندارد اکیناکوزید (A0282)، توبولوزید A (A0942)، اکتئوزید (A0280)، ایزو-اکتئوزید (A0281) و 2'- استیللاکتئوزید (A0943) از Chengdu Must Biotechnology (سیچوان، چین) خریداری شد. خلوص تمام استانداردها بیش از 98 درصد است. کیت های رنگ آمیزی Nissl H&E از Boster (ووهان، چین) خریداری شد. Edaravone (T0407-1) از Target Mol (شانگهای، چین) خریداری شد. Rabbit anti-rat MAP{11}} (ab32454)، Nrf{13}} (ab31163)، PDGFRb (ab32570)، Keap{16}} (ab66620) و CD31 ضد موش موش (ab24590) خریداری شد از Abcam Inc (کمبریج، MA، ایالات متحده). خرگوش ضد موش Claudin5 (BS1069)، ZO{24}} (BS9802M) و Occludin (BS72035) از Bioworld Technology (نانجینگ، چین) خریداری شد. Cell Signaling Technology Inc. (بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) منبع سیناپسین-1 ضد موش خرگوش (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T) بود. GAPDH (HRP{35}}) از Proteintech Group, Inc. (شیکاگو، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. آنتی بادی های ثانویه توسط Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (پکن، چین) عرضه شد. Hoechst 33258 از Beyotime (جیانگسو، چین) به دست آمد.

حیوانات

موش های Sprague-Dawley (نر، با وزن 250-300 گرم) از فناوری حیوانات آزمایشگاهی Vital River (پکن، چین) به دست آمدند و در یک اتاق تهویه مطبوع قرار گرفتند که در چرخه نور/تاریکی 12 ساعت نگهداری می شد. تمام آزمایش‌های حیوانی توسط دستورالعمل‌های ARRIVE تحقیقات حیوانی انجام شد (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) و توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی مرکز علوم بهداشتی دانشگاه پکن (LA2019123) تأیید شد.

پروتکل های آزمایشی حیوانات

همانطور که قبلاً توضیح داده شد، موش‌ها در معرض MCAO/R قرار گرفتند (وانگ و همکاران، 2{5}}18). به طور خلاصه، شریان کاروتید مشترک چپ (CCA)، شریان کاروتید خارجی (ECA) و شریان کاروتید داخلی (ICA) در معرض دید قرار گرفتند و یک نخ نایلونی مونوفیلامنت 3-0 تا رسیدن به وسط از ECA به داخل ICA قرار داده شد. شریان مغزی (MCA). پس از 1.5 ساعت انسداد MCA، خونرسانی مجدد با برداشتن رشته شبیه سازی شد. در طول عمل جراحی، دمای بدن تمام موش ها در 37.0 درجه حفظ شد.

اداره دارو

موش ها با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 22 به طور تصادفی به شش گروه تقسیم شدند. گروه مدل (MOD)؛ گروه edaravone (دارو مثبت، 6 میلی لیتر / کیلوگرم، EDI)؛ گروه TGs (280 mg/kg، TGs)؛ گروه PSs (280 mg/kg، PS)، و گروه OSs (280 mg/kg، OSs). TGs، PSs و OSs یک بار در روز پس از MCAO/R به مدت 14 روز تجویز شدند. گروه های NOR و MOD با نرمال سالین تحت درمان قرار گرفتند. شماره حیوانات در جدول 1 نشان داده شده است.

اندازه گیری وزن و نمرات اصلاح شده نقص عصبی (mNSS)

وزن بدن در روز چهاردهم با استفاده از مقیاس دیجیتال ADVENTURE™ (OHAUS، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) کنترل شد. mNSS با توجه به روشی که توسط FJ Wang (وانگ و همکاران، 2018) توصیف شده است، با تجدید نظرهای جزئی ارزیابی شد.

2، 3، 5-رنگ‌آمیزی تری فنیل تترازولیوم کلرید (TTC)

حجم انفارکتوس همانطور که قبلا توضیح داده شد اندازه گیری شد (وانگ و همکاران، 2015). به طور خلاصه، مغزها به هفت بلوک کرونی با فاصله مساوی (2 میلی متر) تقسیم شدند. این مقاطع با 2 درصد TTC (کولابر، پکن، چین) در دمای 37 درجه به مدت 15 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. حجم انفارکتوس (درصد)=(حجم نیمکره ایسکمیک همان طرف - حجم نیمکره ایسکمیک مقابل)/حجم نیمکره ایسکمیک طرف مقابل × 100.

رنگ آمیزی Nissl و H&E

موش ها عمیقاً بیهوش شدند و سپس کل مغز به سرعت از جمجمه خارج شد و با استفاده از 4 درصد پارافورمالدئید ثابت شد و در موم پارافین جاسازی شد و به برش هایی به ضخامت 7 میکرومتر تقسیم شد. مقاطع با Nissl و H&E رنگ آمیزی شدند. در این مطالعه، شش میدان تصادفی 200×200 میکرومتر در هر نمونه بافت با میکروسکوپ نوری ثبت شد. تعداد بدنه های نیسل با نرم افزار IPP نسخه 6.0 (Media Cybernetics، Bethesda، ایالات متحده آمریکا) شمارش شد.

سنجش آبی ایوانز

پس از MCAO/R، 2 درصد EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) به موش ها تزریق شد. دو ساعت بعد، موش‌ها بیهوش شدند و کل مغز به سرعت خارج شد و در استون همگن شد. مواد رویی در طول موج 620 نانومتر توسط یک خواننده جذب 800 TS (BioTek، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شدند.

اندازه گیری فعالیت های کاتالاز (CAT)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، مالون دی آلدئید (MDA) و گلوتاتیون پراکسیداز (GSH-Px)

تمام نمونه‌های سرم با سرعت 4،{1}} × دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند و سپس برای شناسایی فعالیت‌های MDA، CAT، SOD و GSH-Px طبق دستورالعمل‌های سازنده (شرکت صنعتی جیانگ سو می‌میان، با مسئولیت محدود، چین).

تجزیه و تحلیل وسترن بلاتینگ

بافت‌های مغز (100 میلی‌گرم) جمع‌آوری‌شده از هر موش، همگن شده و در بافر لیز RIPA لیز شدند، و سپس برای تشخیص غلظت پروتئین با استفاده از کیت BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.) تجزیه و تحلیل شدند. پروتئین کل بافت بر روی ژل های 10 درصد SDS-PAGE بارگذاری شده و روی غشای نیتروسلولزی منتقل شد. غشا با استفاده از شیر بدون چربی 5 درصد مسدود شد، سپس یک شبه با آنتی بادی های اولیه در دمای 4 درجه انکوبه شد. غشاء سپس با یک آنتی بادی ثانویه انکوبه شد. تجزیه و تحلیل وسترن بلات با استفاده از سیستم تصویربرداری دیجیتال کداک (5200 Multi، Tanon، چین) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

آنالیز ایمونوفلورسانس

رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس برای CD31، a-SMA، ZO{2}}، claudin5، ocludin، PDGFRb، SYN، PSD95، MAP{5}}، Nrf-2 و Keap-1 انجام شد. آنتی بادی های اولیه علیه Nrf-2، CD31، a-SMA، ZO{11}}، claudin5، ocludin، PDGFRb، SYN، PSD95، MAP{14}} و Keap{15}} رقیق شدند تا 1:200 و 1:100، به ترتیب. آنتی بادی ثانویه الکسا فلور 488 موش ضد خرگوش IgG و رودامین (TRITC) بز ضد خرگوش IgG هر دو به 1:200 رقیق شدند. هسته ها توسط Hoechst 33258 رنگ آمیزی شدند. تصاویر با استفاده از سیستم تصویربرداری کمی آسیب شناسی خودکار Vectra® Polaris (PerkinElmer، USA) گرفته شد. بیان پروتئین با استفاده از نرم افزار IPP نسخه 6.0 تجزیه و تحلیل شد.

تحلیل آماری

تمام داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار توصیف شدند. نرم افزار SPSS نسخه 22.{1}} برای تجزیه و تحلیل آماری انجام شد. هنگام مقایسه گروه های مختلف از آنالیز واریانس یک طرفه استفاده شد. P < 0.05="" به="" عنوان="" تفاوت="" آماری="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

TG ها وزن بدن را افزایش می دهند و آسیب های مغزی را در موش های MCAO/R کاهش می دهند

پس از 14 روز درمان با TGs، PSs، Oss، و EDI، وزن بدن، نقایص عصبی، و حجم انفارکتوس موش I/R بررسی شد. نتایج نشان داد که وزن بدن در گروه MOD بسیار کاهش یافته است، در حالی که وزن کاهش یافته در گروه های TGs، PSs و EDI افزایش یافته است (شکل 2A). نمرات نقص عصبی به طور قابل توجهی توسط EDI و TGs کاهش یافت (شکل 2B). برش های مغز در موش های گروه NOR قرمز تیره بود و انفارکتوس وجود نداشت، در حالی که موش های گروه MOD انفارکتوس مغزی بزرگ همان طرف را نشان دادند. پس از درمان TGs، حجم انفارکتوس به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 2C، D). تیمار PS و OSs هیچ اثر آشکاری بر شاخص های فوق نشان نداد. داده های بالا نشان داد که TG ها می توانند به طور قابل توجهی آسیب مغزی ناشی از I/R را کاهش دهند، اما PS ها و OS ها نمی توانند.

TG ها آسیب هیستوپاتولوژیک را در موش های صحرایی MCAO/R بهبود می بخشد

برای تعیین برخی از اثرات درمان TGs، PSs و OSs بر آسیب های هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی H&E برای آشکارسازی آسیب پاتولوژیک انجام شد. ساختارهای هیستومورفولوژیکی مغز در گروه NOR به طور منظم مرتب شد. تغییرات مورفولوژی در گروه های TGs جزئی تر از گروه MOD بود. با این حال، گروه های تیمار PSs و OSs هیچ بهبود قابل توجهی در تغییرات مورفولوژی نشان ندادند (شکل 3).

TG ها آسیب عصبی را پس از موش های القا شده با I/R کاهش می دهند

رنگ آمیزی Nissl تغییرات هیستوپاتولوژیک نورون ها را در نیم سایه ناحیه ایسکمیک نشان داد. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، نورون های طبیعی دارای یک هسته واضح و ساختار دست نخورده بودند. در گروه MOD، نورون ها فضاهای بین سلولی بزرگ شده داشتند. اجساد نیسل ناپدید، منقبض و عمیقاً لکه‌دار شدند. با این حال، این تغییرات به ندرت در گروه های EDI، TGs و PSs مشاهده شد. این نتایج نشان داد که TGs و PSs می توانند به طور قابل توجهی آسیب عصبی ناشی از ایسکمی/پرفیوژن مجدد را کاهش دهند.

TG ها اختلال BBB را پس از موش های تحت درمان I/R کاهش می دهند

روش ایوانز آبی روشی کلاسیک برای تحقیق در مورد تغییر نفوذپذیری BBB است. نتایج آزمایش نشان داد که افزایش آبی ایوانز در گروه MOD مشاهده شد، در حالی که آبی ایوانز به طور قابل توجهی در موش های تحت درمان با TG و EDI کاهش یافت. علاوه بر این، بین گروه های درمانی PS و OSs تفاوت معنی داری وجود نداشت (شکل 5). این نتایج نشان داد که TG ها می توانند به طور قابل توجهی اختلال BBB را کاهش دهند.

TG ها رگزایی را در موش های صحرایی آسیب دیده I/R ترویج می کنند

مطالعات جدیدتر نشان می دهد که رگ زایی نقش مهمی در بهبود عملکرد عصبی و پیامد پیش آگهی پس از سکته مغزی ایسکمیک حاد ایفا می کند (Yuen et al., 2015). برای ارزیابی اثرات TGs، PSs و OSs بر روی رگزایی، CD31 و a-SMA برای تعیین کمیت تعداد مویرگی استفاده شد. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که گروه MOD باعث کاهش قابل توجه بیان CD31 (شکل 6A, B) و a-SMA (شکل 6C, D) در نیم سایه نواحی ایسکمیک موش I/R در مقایسه با موش های نرمال شد. . این نتیجه نشان داد که I/R می‌تواند باعث آسیب عروقی در نیم‌کره‌های قشر ایسکمیک شود. با این حال، درمان TGs و EDI به طور قابل توجهی باعث افزایش تراکم مویرگی، رگزایی، و شریان زایی شد که با افزایش بیان CD31 و a-SMA نشان داد. این نتایج نشان می دهد که TG ها می توانند رگزایی را در نیم سایه ایسکمیک موش های I/R ترویج کنند، اما PS ها و OS ها نتوانستند.

TG ها بیان پروتئین های اتصال محکم را در موش های آسیب دیده I/R افزایش می دهند

اختلال BBB می تواند محتوای آب مغز و تورم بافت را افزایش دهد و منجر به آسیب مغزی شود. پروتئین های اتصال محکم اجزای ساختاری مهم BBB هستند (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). برای آزمایش اینکه آیا درمان TGs، PSs و OSs بعد از سکته مغزی ممکن است بر یکپارچگی BBB تأثیر بگذارد یا خیر، بیان ZO-1، claudin-5، و اکلودین با تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس انجام شد. نتایج نشان داد که عبارات کلودین-5، اکلودین و ZO-1 در گروه MOD به طور مشهود کاهش یافته است. با این حال، آنها به طور قابل توجهی پس از 14 روز از تجویز TGs افزایش یافته است. گروه های PS و OSs هیچ تغییر قابل توجهی در بیان این پروتئین نشان ندادند (شکل 7). این داده ها نشان داد که TG ها می توانند بیان پروتئین اتصال محکم را تنظیم کنند و احتمالاً یکپارچگی BBB را پس از آسیب I / R حفظ کنند. TG ها پوشش پری سیتی روی مویرگ ها را در موش های آسیب دیده I/R افزایش می دهند پوشش پری سیتی روی مویرگ ها نقش مهمی در حفظ یکپارچگی BBB ایفا می کند (Armulik و همکاران، 2010؛ Daneman و همکاران، 2010). بنابراین، ما آزمایش کردیم که آیا پوشش پری سیتی را می توان با درمان TGs، PSs و OSs افزایش داد یا خیر. نتایج آنالیز شدت ایمونوفلورسانس نشان داد که هر دو عبارات PDGFRb و CD31 به طور چشمگیری در گروه MOD کاهش یافتند. تجویز TGs به موش‌های I/R شدت بیان PDGFRb و CD31 را به‌طور قابل‌توجهی بهبود یا حتی افزایش داد، اما هیچ تفاوتی در گروه‌های درمان PSs و OSs مشاهده نشد (شکل 8). بنابراین، درمان TGs می تواند به طور قابل توجهی پوشش پری سیتی را افزایش دهد. این یافته ها بیشتر تایید کرد که TG ها می توانند یکپارچگی BBB را پس از I/R حفظ کنند.

TG ها بازسازی عصبی را در موش های آسیب دیده I/R ترویج می کنند

طبق مطالعات متعدد، نوروژنز پس از سکته مغزی می تواند به طور قابل توجهی بهبود عملکردی را بهبود بخشد (گرفکس و وارد، 2014؛ ژانگ و همکاران، 2019). پروتئین های سیناپتوفیزین (SYN)، تراکم پس سیناپسی 95 (PSD{3}}) و پروتئین مرتبط با میکروتوبول 2 (MAP{6}}) به عنوان نشانگر برای بررسی انعطاف پذیری عصبی در نیم سایه ایسکمیک قشر مغز مورد استفاده قرار گرفتند. برای ارزیابی اثرات درمان TGs، PSs و OSs بر نوروژنز در موش‌های آسیب دیده I/R، ایمونوفلورسانس و وسترن بلات برای عبارات SYN، PSD95 و MAP{8}} انجام شد. همانطور که در شکل‌های 9 و 10 نشان داده شده است، سطح بیان SYN، PSD95 و MAP{12}} در موش‌های I/R پس از 14 روز خون‌رسانی مجدد در مقایسه با موش‌های NOR کاهش یافت، در حالی که درمان TGs و PSs می‌تواند به طور قابل توجهی افزایش یابد. سطح بیان آنها را تنظیم کنید. گروه OSs در مقایسه با گروه MOD تغییر معنی داری نداشت. داده ها نشان داد که درمان TGs و PSs قادر است به طور چشمگیری بازسازی عصبی را پس از آسیب I/R ارتقا دهد.

عبارات TGs Alter Nrf-2 و Keap-1 در موش‌های I/R آسیب دیده

استرس اکسیداتیو یک مکانیسم اصلی بیماریزا در آسیب I/R است (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). مطالعات تأیید کردند که Nrf{2}} تنظیم کننده اصلی پاسخ های آنتی اکسیدانی است (Thompson et al., 2015). برای بررسی پاسخ‌های اکسیداتیو با واسطه Nrf-2 و Keap-1 پس از آسیب I/R، بیان سیتوپلاسمی و همچنین جابجایی هسته‌ای Keap{6}} را ارزیابی کردیم. در همین حال، بیان Nrf{7}} در بافت‌های مغزی موش‌های آسیب دیده I/R نیز مورد سنجش قرار گرفت (شکل‌های 10 و 11). بر اساس تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس، Nrf{10}} عمدتاً در سیتوپلاسم در گروه NOR قرار دارد. در گروه TGs، بیان Nrf{11}} در محلی سازی سیتوپلاسمی کاهش یافت، اما در هسته تنظیم مثبت شد، و کاهش بیان Keap{12}} نیز مشاهده شد. داده‌ها نشان داد که محافظت از مغز TGs می‌تواند با مدولاسیون Nrf{13}} و Keap{14}} مرتبط باشد.

TG ها استرس اکسیداتیو بافت مغز را در موش های آسیب دیده I/R کاهش می دهند

برای تایید اثرات آنتی اکسیدانی TGs، فعالیت های SOD، CAT، GSH-Px، و MDA در موش های آسیب دیده I/R مورد بررسی قرار گرفت. در شکل 12، محتوای MDA به طور قابل توجهی در گروه MOD افزایش یافت و در همان زمان، فعالیت SOD، CAT و GSH-Px نسبت به موش‌های معمولی کاهش یافت. در مقابل، درمان TGs منجر به کاهش قابل توجهی در محتوای MDA و افزایش فعالیت‌های SOD، CAT و GSH-Px شد. این نتایج بیشتر فعالیت آنتی اکسیدانی TGs را تایید کرد.

بحث

بسیاری از مطالعات نشان می دهد که TCMC. deserticolaفعالیت های بیولوژیکی گسترده ای دارد، به عنوان مثال تقویت توانایی یادگیری، حافظه و ایمنی (دونگ و همکاران، 2007؛ جیانگ و تو، 2009؛ وانگ و همکاران، 2017؛ شیا و همکاران، 2018). با این حال، اجزای فعال C. deserticola برای محافظت عصبی نامشخص است. هدف کار فعلی بررسی اجزای فعال استC. deserticolaدر برابر سکته مغزی ایسکمیک در مدل MCAO/R. سه عصاره از C. deserticola (TGs، PSs، و OSs) برای ارزیابی اثرات آنها بر موش MCAO/R و همچنین مکانیسم‌های ممکن استفاده شد.

سکته مغزی یک بیماری شایع حاد عروق مغزی است. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می دهد که سکته مغزی در مردان شایع تر از زنان است (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). بنابراین، در آزمایش ما، موش‌های صحرایی نر برای آزمایش‌ها پذیرفته شدند. نتایج ما ثابت کرد که القای I/R استرس اکسیداتیو و حجم انفارکتوس را تسریع می‌کند، BBB را می‌شکند و منجر به آسیب عصبی و عروقی مغز می‌شود. پس از غربالگری، TGها حجم انفارکتوس را کاهش داده و بازسازی عصبی و رگ زایی را تقویت می کنند. علاوه بر این، TGs برای حفظ یکپارچگی BBB پس از آسیب I / R مشاهده شد. در مقابل، PS ها و OS ها هیچ کاهش قابل توجهی برای آسیب I/R ایجاد نمی کنند. بنابراین، TG ها جزء اصلی فعال در نظر گرفته می شوندC. deserticolaبرای محافظت عصبی، به طور بالقوه از طریق ارتقاء بازسازی عصبی، رگزایی، و یکپارچگی BBB از طریق فعال کردن مسیر Nrf- 2/Keap-1.

شواهد رو به افزایش نشان می دهد که ایجاد گردش وثیقه موثر برای جلوگیری از ایجاد انفارکتوس و نیم سایه ایسکمیک بسیار مهم است و یک درمان حیاتی در مراحل اولیه سکته مغزی ایسکمیک است (ElAli، 2016؛ Iwasawa et al., 2016). تکثیر سلول های اندوتلیال عروقی و سلول های ماهیچه صاف پس از انفارکتوس ایسکمیک، ایجاد گردش خون جانبی را تعیین می کند. با این حال، مدل‌های ایسکمی یک پدیده مشترک دارند - یعنی استرس اکسیداتیو به طور گسترده در عروق ریز مغز وجود دارد. داده های مطالعه نشان داده است که تعداد زیادی از آنتی اکسیدان ها می توانند عملکرد BBB و خواص رگزایی را مختل کنند (منتور و فیشر، 2017). CD31 و a-SMA به ترتیب نشانگرهای سلول های اندوتلیال عروقی و همچنین سلول های ماهیچه صاف هستند (Saboor et al., 2016). برای بررسی اثر بر تکثیر سلولی فوق الذکر عصاره های ازC. deserticolaما عبارات CD31 و a-SMA را در هموژنه نیم سایه ایسکمیک مغزی بررسی کردیم. داده های ما نشان داد که TG ها به طرز چشمگیری بیان CD31 و a-SMA را افزایش می دهند. با این حال، تفاوت معنی داری برای گروه های PS و OSs وجود نداشت. بنابراین، ما نتیجه گرفتیم که TG ها ممکن است با ترویج رگزایی از طریق افزایش بیان CD31 و a-SMA، آسیب مغزی را کاهش دهند، در حالی که PSs و OSs چنین محافظتی را در برابر آسیب مغزی ارائه نکردند. این نتایج بیشتر تایید کرد که تنها TG ها می توانند از آسیب I/R مغزی جلوگیری کنند.

سکته مغزی ایسکمیک را می توان نتیجه ایسکمی مغزی ناشی از اختلال در انعطاف پذیری عصبی یا بازسازی نواحی مغز دانست. اکثر بیماران سکته مغزی از نقایص عصبی رنج می برند. فعال کردن نوروژنز یک استراتژی امیدوارکننده برای بیماران سکته مغزی برای بهبود عملکردهای عصبی است (کرامر و چوپ، 2000). نوروژنز به طور مستقیم در بازیابی عملکرد عصبی پس از آسیب I/R مغز شرکت می کند (ژانگ و همکاران، 2019). تحقیقات قبلی نشان می‌دهد که TGها می‌توانند میزان بقای سلول‌های هرمی هیپوکامپ را بهبود بخشند و نوروژنز را القا کنند (لیان و همکاران، 2017). استرس اکسیداتیو باعث از بین رفتن نورون ها در طول بسیاری از بیماری ها مانند پارکینسون، سکته مغزی و غیره می شود (دوان و سی، 2019؛ سینگ و همکاران، 2019). Nrf{5}} بسیاری از ژن‌های مربوط به محافظت عصبی را در ناحیه پروموتور خود رونویسی می‌کند، به طور عمده شامل SOD، MDA، CAT، و g گلوتامیل سیستئین لیگازها و غیره (Satoh et al., 2006). پروتئین‌های SYN، PSD-95، و MAP-2 که ارتباط نزدیکی با شکل‌گیری سیناپسی و انتقال عصبی دارند، می‌توانند به‌عنوان نشانگر انعطاف‌پذیری عصبی تحقیقاتی در ناحیه نیم سایه ایسکمیک در نظر گرفته شوند. پس از مطالعه، دریافتیم که درمان با TGs می‌تواند به طور قابل‌توجهی بیان PSD95، SYN، و MAP را افزایش دهد، که نشان می‌دهد محافظت مغزی TGs با افزایش انعطاف‌پذیری عصبی در طول I/R مرتبط است. با این حال، حیف است که هیچ تفاوت آشکاری برای گروه های PS و همچنین OS وجود ندارد. این نتایج نشان داد که TG ها می توانند انعطاف پذیری عصبی را پس از آسیب I/R مغزی افزایش دهند.تحقیقات تصویربرداری در بیماران سکته مغزی نشان داد که اختلال عملکرد BBB را می توان به عنوان یک ویژگی قابل توجه از مغز پری ایسکمیک در نظر گرفت (Bang et al., 2007). TJ ها که از پروتئین های سیتوپلاسمی، پروتئین های گذرنده و مولکول های چسبنده پیوندی بین سلول های اندوتلیال مویرگی تشکیل شده اند، در حفظ یکپارچگی BBB بسیار مهم هستند (Ye et al., 2019). در میان آنها، ZO-1، کلودین-5 و اکلودین مهمترین پروتئین های TJ هستند. شواهد فزاینده نشان می دهد که افزایش نفوذپذیری BBB ناشی از ایسکمی عموماً با تغییرات ZO-1، کلودین-5 و اکلودین مرتبط است (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu. و همکاران، 2017؛ لیو و همکاران، 2018). در این کار، نتایج نشان داد که اگرچه TGها می‌توانند به‌طور قابل‌توجهی بیان پروتئین‌های ZO{10}}، کلودین-5 و اکلودین را در بافت‌های مغزی ناشی از MCAO افزایش دهند، نه PSs و نه OSs. BBB از سلول های اندوتلیال مغزی تشکیل شده است و ارتباط نزدیکی با پری سیت ها دارد (Nyul-Toth et al., 2016). پری سیت ها برای یکپارچگی BBB حیاتی هستند (بل و همکاران، 2010). سکته مغزی ایسکمیک باعث مرگ پری‌سیت‌ها و جدا شدن از سلول‌های اندوتلیال مغز در فاز حاد می‌شود، بنابراین عروق میکروسکوپی را بی‌ثبات می‌کند و خواص BBB را تغییر می‌دهد (Zechariah et al., 2013). داده‌های ما نشان داد که TGها می‌توانند پوشش پری سیتی روی مویرگ‌ها را افزایش دهند و سطح بیان ZO-1، کلودین-5 و اکلودین را افزایش دهند. این پدیده ها ثابت کردند که TG ها می توانند به طور موثری از یکپارچگی BBB پس از آسیب I/R مغزی محافظت کنند. به طور خلاصه، TGs ممکن است آسیب مغزی را به طرق مختلف کاهش دهد، مانند ترویج رگزایی، بهبود انعطاف پذیری عصبی و حفظ یکپارچگی BBB.

سپس ما مسیر سیگنالینگ را برای کشف مکانیسم زیربنایی محافظت از مغز TGها بررسی کردیم. فرآیند آسیب I/R چند عاملی است و بنابراین مکانیسم های متعددی در پاتوژنز دخیل هستند. استرس اکسیداتیو یک عامل خطر اساسی است که به آسیب های مغزی ناشی از I/R کمک می کند (سودا و همکاران، 2013)، مانند آسیب ساختار BBB، اختلال عملکرد اندوتلیال عروقی، و تشدید آسیب عصبی ایسکمیک (Xiong et al., 2015; Caglayan). و همکاران، 2019؛ پریستلی و همکاران، 2019). بنابراین، استرس اکسیداتیو به یک هدف درمانی جذاب در آسیب مغزی ناشی از I/R تبدیل شده است. آنزیم‌های فاز 2 که توسط فاکتور هسته‌ای E2-فاکتور مرتبط-2 (Nrf{9}}) واسطه می‌شوند، به‌عنوان وسیله مهمی برای محافظت نورون‌ها در برابر استرس اکسیداتیو در نظر گرفته شده‌اند (سوزوکی و یاماموتو، 2015؛ یا و همکاران، 2018). شواهد فزاینده نشان می دهد که فعال شدن Nrf{12}} در طول I/R یک هدف درمانی بالقوه برای محافظت عصبی است (دینگ و همکاران، 2015؛ ژانگ آر و همکاران، 2017). Nrf{15}}، به عنوان یک تنظیم کننده مهم دفاع آنتی اکسیدانی درون زا، واسطه سطح هم اکسیژناز 1 (HO{17}}) و سایر آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند NAD(P)H کینون اکسیدوردوکتاز 1 (NQO1) است. SOD، CAT، GSH، و MDA (Siow و همکاران، 2007؛ دینگ و همکاران، 2014). علاوه بر این، Nrf{22}} نقش تنظیم کننده مهمی در رگزایی دارد. مطالعه حاضر نشان می دهد که Nrf{23}} را می توان به طور قابل توجهی در فرآیند رشد عروقی افزایش داد و فعال کرد (وی و همکاران، 2013).

همانطور که قبلاً توضیح داده شد (جیانگ و تو، 2009)، TGها حاوی ترکیبات فعال زیستی زیادی هستند، به عنوان مثال، اکیناکوزید، توبولوزید A، آکتئوزید، ایزو-اکتئوزید و 2'-استیلاکتئوزید، و برخی از آنها عملکردهای محافظت کننده عصبی پس از I/R مغزی نشان دادند. آسیب (پنگ و همکاران، 2016). اکیناکوزید دارای اثرات فارماکولوژیک زیادی است، مانند آنتی اکسیدان، ضد پیری، محافظت عصبی، ضد التهاب، ارتقاء سیکاتریزاسیون، محافظت از کبد، تقویت استخوان سازی و فعالیت های ضد تومور (Yu et al., 2016; Li et al., 2018؛ Zhang Y. و همکاران، 2018؛ جی و همکاران، 2019؛ Xu و همکاران، 2019). اخیرا، اکیناکوزید به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی در سیستم عصبی مرکزی شناسایی شده است (Lu et al., 2016). اکیناکوزید می تواند محتوای MDA را کاهش دهد و فعالیت های SOD و GSH Px را در آسیب ایسکمی مغزی بهبود بخشد، و تجزیه و تحلیل اتصال مولکولی نشان داد که اکیناکوزید ممکن است به Keap{14}} متصل شود و منجر به انتقال هسته ای Nrf-2 شود (Li و همکاران، 2018). مطالعه Xia نشان داد که اکتئوزید می‌تواند حجم انفارکتوس و محتوای آب مغز را برای بهبود نقایص عصبی در موش‌های MCAO/R از طریق کاهش استرس اکسیداتیو کاهش دهد (Xia et al., 2018). مطالعات دیگر نشان داده‌اند که ایزو اکتئوزید می‌تواند فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سلولی، SOD و CAT را در سلول‌های V{21} تیمار شده با H2O افزایش دهد (چای و همکاران، 2005). بر اساس گزارش های فوق از ترکیبات فعال موجود در TG ها، می توان نتیجه گرفت که TG ها می توانند از طریق مسیرهای آنتی اکسیداسیون در برابر سکته مغزی ایسکمیک محافظت کنند.

Li در مورد اثرات محافظت عصبی گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید (PhGs) بر آپوپتوز ناشی از H2O{1} در سلول‌های PC12 از طریق مسیر Nrf2/ARE گزارش داد (Li et al., 2018). این PhGها با تحریک جابجایی هسته‌ای Nrf2 و افزایش بیان‌های HO{6}}، NQO1، زیرواحد کاتالیزوری گلوتامات-سیستئین لیگاز (GCLC) و زیرواحد تعدیل کننده لیگاز گلوتامات-سیستئین (GCLM) به طور قابل‌توجهی سرکوب شدند (Li et al., 2018). ؛ گونگ و همکاران، 2019). بنابراین، این یافته‌ها نشان می‌دهند که مسیر Nrf-2/ARE نقش مهمی در اثرات محافظتی با واسطه PhGs روی سلول‌های عصبی ایفا می‌کند. به طور مشابه، در این مطالعه، ما دریافتیم که TG ها می توانند سطح MDA را کاهش دهند و سطوح SOD، CAT و GSH-Px را در موش های I/R افزایش دهند. در همین حال، TG ها می توانند بیان Nrf2 را در هسته تنظیم کنند، بیان مربوطه را در سیتوپلاسم کاهش دهند، و به طور قابل توجهی بیان Keap{16}} را کاهش دهند. بنابراین، مسیر Nrf-2/Keap-1 ممکن است در اثرات محافظت عصبی با واسطه TGs دخالت داشته باشد. اعتبار سنجی بیشتر این مسیر کشت سلولی در شرایط آزمایشگاهی با مدل‌های آسیب محرومیت از اکسیژن-گلوکز/اکسیژناسیون مجدد در آینده انجام خواهد شد. علاوه بر این،C. deserticolaعصاره در مطالعه ما به مدت 14 روز به طور مداوم تجویز شد. از آنجایی که نوروژنز بزرگسالان بر تفسیر اثرات محافظت کننده عصبی در طول 14 روز خونرسانی مجدد تأثیر می گذارد، نوروژنز را نمی توان در طرح آزمایش فعلی ما در بررسی اثر محافظت عصبی CT ها حذف کرد. این محدودیت تحقیق ماست.

در نتیجه، آن TGs از استC. deserticolaکه می تواند رگ زایی و نوروژنز را افزایش دهد و همچنین یکپارچگی BBB را در موش های آسیب I/R حفظ کند، اما نه PSs و OSs. تأثیرات را می توان با فعال کردن مسیر Nrf-2/Keap-1 واسطه کرد.