مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

I-Fang Wang،1،2 Yihan Wang،2 Yi-Hua Yang،1،3،4 Guo-Jen Huang،5،6 Kuen-Jer Tsai،3،4،* و Che-Kun James Shen1،2،7 ،*

1 موسسه فارغ التحصیل پزشکی احیا کننده عصبی، کالج علوم و فناوری پزشکی، دانشگاه پزشکی تایپه، تایپه 11031، تایوان

2 موسسه زیست شناسی مولکولی، آکادمی سینیکا، تایپه 11529، تایوان

3 موسسه پزشکی بالینی، کالج پزشکی، دانشگاه ملی چنگ کونگ، تاینان 70403، تایوان

4 مرکز تحقیقات پزشکی بالینی، بیمارستان ملی دانشگاه چنگ کونگ، کالج پزشکی، دانشگاه ملی چنگ کونگ، تاینان 70403، تایوان

5 گروه و موسسه فارغ التحصیل علوم زیست پزشکی، کالج پزشکی، دانشگاه چانگ گونگ، تائویوان 33302، تایوان

6 مرکز تحقیقات علوم اعصاب، بیمارستان یادبود چانگ گونگ، لینکو 33302، تایوان

7 مخاطب اصلی

*مطابقات: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT)، ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

سیستانچ می تواند حافظه را بهبود بخشد

خلاصه

تنوع فنوتیپی یک پیش نیاز اساسی برای تکامل سلول و ارگانیسم توسط انتخاب طبیعی است. در حالی که نقش بیان ژن تصادفی در تنوع فنوتیپی سلول های ژنتیکی یکسان به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است، در مورد رابطه بین بیان ژن تصادفی و تغییرات رفتاری فردی در حیوانات اطلاعات زیادی در دست نیست. ما نشان می‌دهیم که یک miRNA خاص (miR{0}}f-3p) در هیپوکامپ بخشی از موش‌های همخون منفرد در یک کار ماز آبی موریس تنظیم مثبت می‌شود. به طور قابل توجهی، miR- 466f-3p به طور مثبت مورفولوژی، عملکرد و یادگیری فضایی نورون را تنظیم می‌کند وحافظهتوانایی موش ها از نظر مکانیکی، miR-466f-3p ترجمه MEF2A، یک تنظیم کننده منفی یادگیری را سرکوب می‌کند.حافظه. در نهایت، ما نشان می‌دهیم که تنظیم دگرگونی miR-466f-3 هیپوکامپ ناشی از فسفوریلاسیون تصادفی AMP حلقوی هیپوکامپ (cAMP) -واکنش عنصری اتصال (CREB) در افراد است. این یافته از تعدیل یادگیری فضایی وحافظهاز طریق یک محور سیگنال دهی تصادفی هیپوکامپ بر روی تحریک عصبی، نشان دهنده این است که چگونه تنوع در بیان ژن بافت منجر به رفتار حیوانات متنوع می شود.

مقدمه

تنوع فنوتیپی در بین افراد یک مزیت تکاملی ایجاد می کند زیرا تنوع جمعیتی را که انتخاب طبیعی بر اساس آن عمل می کند فراهم می کند (پاولیچف و همکاران، 2011). پس زمینه های ژنتیکی و عوامل محیطی به ایجاد چنین تنوع طبیعی کمک می کنند (بندسکی و بارگمن، 2011). به طور تجربی، موش‌های همخون اغلب برای مطالعه پایه‌های مولکولی و سلولی فنوتیپ‌ها و رفتارهای متوسط ​​مورد استفاده قرار گرفته‌اند تا اثرات تفاوت‌های ژنتیکی بین افراد مورد آزمایش به حداقل برسد (Casellas, 2011). با این حال، تنوع فراوانی رونوشت بافتی بین موش‌های ایزوژنیک منفرد نشان داده شده است. ژن هایی که سطوح بیان بسیار متغیر را نشان می دهند اغلب با عملکرد ایمنی، پاسخ های استرس و تنظیم هورمونی، یعنی فرآیندهای حساس به نشانه های محیطی مرتبط هستند (Vedell et al., 2011). برخی از این مطالعات همچنین نشان داده‌اند که تفاوت‌ها در بیان ژن یا سیگنال‌دهی سلولی، با یا بدون تأثیر عوامل محیطی مانند لیسیدن مادر، تأمین مواد مغذی در رحم، یا انعطاف‌پذیری ناشی از استرس در مقابل حساسیت (Bale, 2015؛ Danchin et al. .، 2011؛ ​​لورش

و همکاران، 2019; پدرسن و همکاران، 2011)، می توانند منجر به تفاوت در فنوتیپ ها و رفتارها شوند (کاسلاس، 2011؛ ​​لاک و همکاران، 2015؛ لوس و همکاران، 2015؛ اوی و همکاران، 2015).

یادگیری فضایی وحافظهشکل گیری کنترل شده توسط مغز را می توان به دو سیستم تقسیم کرد: (1) ناوبری خود محور با استفاده از حرکت خود و نشانه های درونی و (2) ناوبری آلوسنتریک که عمدتاً شامل هیپوکامپ و ساختارهای مغزی نزدیک است که توسط نشانه های دیستال خارج از ارگانیسم ها تحریک می شود (اکستروم). و همکاران، 2014). قابلیت یادگیری فضایی وحافظهبه اکثر گونه های جانوری اجازه می دهد تا به تدریج رفتارهای خود را برای سازگاری در محیط های متغیر مکانی و زمانی تنظیم کنند، که برای بقای آنها حیاتی است. این را می توان در حیوانات آزمایشگاهی با استفاده از الگوهای رفتاری مانند ماز آبی موریس (MWM) ارزیابی کرد (ورهیز و ویلیامز، 2014). به طور مشخص، نشان داده شده است که جوندگان همخون از نظر ژنتیکی تنوع فنوتیپی را در یادگیری فضایی وحافظه(تسای و همکاران، 2002)، اما مکانیسم های اساسی این تنوع رفتاری ناشناخته باقی ماند.

تشکیل خاطرات جدید یک فرآیند پیچیده است که نیازمند رونویسی ژن وابسته به فعالیت، سنتز پروتئین جدید و

شکل 1. همبستگی بین تنوع یادگیری فضایی وحافظهقابلیت و القای miR{0}}f-3

(الف) وظیفه MWM موش های نوع وحشی C57BL/6J. پانل سمت چپ: اجرای MWM موش های GLN (نقطه) و موش های PLN (مربع). از مجموع 289 موش مورد آزمایش، 180 موش GLN و 109asPLN دسته‌بندی شدند. پنل راست:probetestoftheMWMtask(n=47و 30 هر گروه). P، محل سکوی گم شده؛ T، منطقه هدف بدون P; R، ناحیه سمت راست؛ O، ناحیه مقابل؛ L، منطقه سمت چپ. (B) تجزیه و تحلیل RT-qPCR بیان miRNA. سطوح بیان نسبی شش miRNA واقع در خوشه miR{9}} و miR{10}}p، به عنوان یک کنترل مثبت غنی شده از مغز، با کنترل داخلی U6 snRNA از هیپوکامپ موش GLN و PLN آنالیز و نرمال شد. (n=9–18 در هر گروه). I, miR-466f- 3p; II، miR-466g; III، miR-466i-3p; IV، miR-467b-3p; V, miR-467f; VI، miR-669f; VII، miR{25}}ص.

شبکه های عصبی خاص به طور دقیق تنظیم شده استحافظهانگرام برای ایجاد اتصالات عصبی جدید و انعطاف پذیری پایدار (Asok et al., 2019). انگرام‌های هیپوکامپ، که جمعیت‌های کمیاب از نورون‌ها در شکنج دندانه‌دار (DG) هستند، مجموعه‌ای از نورون‌ها را نشان می‌دهند که پس از افزایش فعالیت خود را نشان می‌دهند.حافظهتشکیل. در حالی که نورون‌های انگرام DG یک ​​الگوی بسیار متمایز از بیان ژن را نشان می‌دهند (Rao-Ruiz et al., 2019)، مکانیسم‌های مولکولی خاص انگرام زیربنای آن هستند.حافظهادغام تا حد زیادی ناشناخته باقی مانده است. عوامل مختلف و مسیرهای سیگنالینگ برای تنظیم مثبت یا منفی یادگیری وحافظهفرآیندها شناسایی شده اند (آبراهام و همکاران، 2019؛ Humeau and Choquet، 2019). در میان آنها، شکل فعال شده پروتئین متصل شونده به عنصر پاسخ به AMP حلقوی (CREB) رونویسی ژن را در پاسخ به افزایش وابسته به فعالیت Ca2 داخل سلولی در نورون ها تحریک می کند (کاندل، 2012). از سوی دیگر، کمپ/PKApathway با جلوگیری از صادرات هسته‌ای سرکوبگر کمکی آن، HDAC5 و واردات هسته‌ای NFAT کمک‌کننده، فعالیت رونویسی فاکتور 2 افزایش دهنده میوسیت (MEF2) را سرکوب می‌کند (Belfield et al., 2006). علاوه بر این، بر خلاف CREB، MEF2A محدودیت فعالیت داردحافظهشکل گیری (کول و همکاران، 2012). جدا از فاکتورهای پروتئینی، microRNA ها (miRNAs) نیز در تنظیم عملکردهای عصبی از جمله یادگیری و حافظه نقش دارند (مک نیل و ون وکتور، 2012). miRNA‌ها RNA‌های کوچک (22 nt) غیر کدکننده هستند که عمدتاً تنظیم‌کننده‌های پس از رونویسی بیان ژن از طریق جفت‌سازی پایه‌های خاص توالی با مکان‌های شناسایی آن‌ها در 30 ناحیه ترجمه‌نشده (30 UTR) mRNA‌های اختصاصی ga2ard17D (Hansenau) هستند. miRNAها در طیف وسیعی از مسیرهای سیگنالینگ در نورون‌های پس از میتوزی شرکت می‌کنند و فرآیندهای سلولی وابسته به فعالیت از جمله رشد و انشعاب دندریتیک، تشکیل سیناپس و بلوغ را واسطه می‌کنند. با تنظیم بیان ژن، آنها همچنین نقش مهمی در شکل های طولانی مدت شکل پذیری سیناپسی ایفا می کنند که زمینه ساز آن است.حافظهتشکیل، بازیابی و تثبیت (چن و شن، 2013؛ وانگ و همکاران، 2012 ب).

در ادامه، شواهدی را برای ارتباط علت بین بیان ژن بافت تصادفی و تغییرات رفتاری فردی در حیوانات ارائه می‌کنیم. به طور خاص، ما نشان می‌دهیم که فعال‌سازی تصادفی یک محور هیپوکامپ CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A، تغییرات فردی یادگیری فضایی را تعدیل می‌کند.حافظهقابلیت در موش های همخون

نتایج

تنوع فردی یادگیری فضایی وحافظهقابلیت با القای miR{0}}f-3p از یک خوشه miRNA خاص در ارتباط است

شناسایی miRNA های دخیل در تنظیم یادگیری وحافظهشکل گیری، ما از وظیفه MWM برای تشخیص موش های نوع وحشی C57BL/6J با قابلیت یادگیری و حافظه خوب یا ضعیف استفاده کردیم (شکل 1A). ما موش‌هایی را که در جلسه آخر (۶) در عرض ۳۰ ثانیه تکمیل کردند، به‌عنوان «یادگیرنده خوب» (GLN) تعریف کردیم، در حالی که موش‌هایی که نتوانستند پلتفرم را در عرض ۳۰ ثانیه در جلسه آخر پیدا کنند، «یادگیرندگان ضعیف» در نظر گرفته شدند. (PLN). همانطور که در شکل 1A نشان داده شده است (پانل سمت چپ)، 62 درصد از موش ها متعلق به گروه GLN (180 موش از 289 موش) بودند که کاهش قابل توجهی در تأخیر فرار از 98.1 ثانیه (جلسه اول) به 21.8 ثانیه (جلسه ششم) نشان دادند. در مقابل، تأخیر فرار 38 درصد باقی‌مانده موش‌ها، گروه PLN (109 موش از 289 موش)، تنها بین جلسات اول و ششم به طور متوسط ​​کاهش یافت (از 111.8 ثانیه در جلسه اول به 82.1 ثانیه در جلسه ششم). . آزمایش کاوشگر، که نشان می‌دهد موش‌ها واقعاً این کار را طی شش جلسه یاد گرفته‌اند، همچنین نشان داد که موش‌های GLN نسبت به موش‌های PLN طولانی‌تر در ناحیه پلتفرم ماندند (شکل 1A، جفت میله‌های سمت چپ در پانل سمت راست).

در مرحله بعد، ما RNA های هیپوکامپ موش های GLN و PLN را با هیبریداسیون ریزآرایه miRNA (n=4 هر گروه) تجزیه و تحلیل کردیم. به طور کلی، ما تفاوت های نسبتاً جزئی را در نمایه های بیان miRNA های هیپوکامپ از موش های GLN و PLN مشاهده کردیم. با این حال، ما متوجه شدیم که 10 miRNA برتر که سطح بیان آنها در موش‌های GLN بیشتر از موش‌های PLN بود (داده‌ها نشان داده نشده است) همه از همان خوشه miRNA مخصوص جوندگان، miR{3}}، واقع در اینترون 10 مشتق شده‌اند. ژن mSfmbt2 (به زیر مراجعه کنید). بر اساس تجزیه و تحلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی-رونویسی معکوس (RT-qPCR) سطوح بیان miRNA های انتخاب شده در خوشه، ما miR-466f-3p را برای بررسی بیشتر انتخاب کردیم (شکل 1B). میانگین بیان این miRNA 1.{12}}برابر در هیپوکامپ موش‌های GLN نسبت به موش‌های PLN بیشتر بود. به طور قابل‌توجهی، میانگین سطح miR هیپوکامپ-466f-3p در بین گروه PLN، گروه کنترل قفس خانگی (HC) و گروه کنترل شنا (شکل 1C) مشابه بود، بنابراین اثرات مربوط به ورزش در طول دوره حذف شد. شنا و حمایت بیشتر از این ایده که miR{17}}f-3p در طول یادگیری فضایی وحافظهتشکیل.

در شکل 1C، داده‌ها نشان می‌دهند که سطح بیان miR-466f-3p هیپوکامپ در بیش از 42 درصد از موش‌های GLN حداقل 1.{5}}برابر بالاتر از میانگین سطح بیان بود. موش‌های کنترل HC، در حالی که سطح آن در 15 درصد از موش‌های PLN نصف موش‌های HC بود. تقریباً 25 درصد از موش‌های GLN و 55 درصد از موش‌های PLN سطوح مشابهی از miR{{1{11}}}}p (0.8- تا 1) داشتند.2- نسبت به HC برابر شود). نمودار پراکندگی همبستگی پیرسون که یک همبستگی مثبت بین سطوح miR-466f{-3p و درصد مدت زمان روی پلت فرم در طول آزمایش کاوشگر را نشان می‌دهد، در شکل 1D ارائه شده است. ما همچنین miR{18}}f{19}}p و U6 RNA هسته‌ای کوچک (snRNA) هیبریداسیون درجا (ISH) برش‌های مغز را در موش‌های GLN و PLN انجام دادیم (شکل 1E). تجزیه و تحلیل آماری سیگنال‌های miR{22}}f-3p از طریق ISH تأیید کرد که القای miR-466f{25}} در واقع در DG موش‌های GLN نسبت به

موش های PLN، در حالی که هیچ تفاوتی هنگام مقایسه سیگنال های U6 snRNA یافت نشد (هیستوگرام سمت راست، شکل 1E). اگرچه سیگنال‌های miR{2}p در بین سلول‌های گرانول منفرد در DG برابر نبود، اما همچنان در هیپوکامپ موش‌های GLN در مقایسه با موش‌های PLN به طور قابل‌توجهی و در همه جا افزایش یافت. بنابراین، القای miR{4}}f-3 فقط در بخش کوچکی از سلول‌ها، به عنوان مثال، نورون‌های انگرام اتفاق نمی‌افتد. این داده‌ها نشان می‌دهند که تنظیم مثبت miR-466f-3p در طول کار MWM ارتباط نزدیکی با یادگیری فضایی و فضایی بهتر دارد.حافظهقابلیت در میان نسبت قابل توجهی از موش های GLN.

ما همچنین میانگین سطوح بیان چندین miRNAهای خاص مغز را با RT-qPCR تجزیه و تحلیل کردیم. در میان آنها، miR{2}} در هیپوکامپ موش پس از کار MWM تنظیم مثبت شد، اما ما تفاوت های قابل توجهی بین گروه های GLN و PLN مشاهده نکردیم (جفت نوار VII، شکل 1B). سطوح بیان miR-335-5p و miR-22 در بین گروه‌های GLN، PLN و HC مشابه بود (شکل S1A). بنابراین، برخلاف miR-466f-3p، بیان هیپوکامپ این miRNA ها در طول آموزش MWM با یادگیری فضایی وحافظهتوانایی موش ها

تنظیم مثبت miR-466f-3p باعث رشد نوریت و تشکیل ستون فقرات دندریتیک می شود

برای تأیید اینکه miR{0}}f-3 واقعاً در نورون‌ها بیان می‌شود، ما miRNA ISH را همراه با رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس (IF) NeuN و MAP2 در نورون‌های هیپوکامپ اولیه انجام دادیم. نتایج نشان داد که مشابه miRNA های دیگر (کوهن و همکاران، 2011؛ ​​توماس و همکاران، 2017)، miR{5}}f-3p عمدتاً در ناحیه سومای عصبی، با برخی سیگنال های اضافی بیان می شود. در دندریت ها (شکل S2A). برای درک اساس مولکولی و سلولی ارتباط miR-466f-3p تنظیم شده با یادگیری وحافظهشکل‌گیری، ابتدا miR-466f-3p را با یک پلی‌پپتید همجوشی dsRed تحت کنترل پروموتر یوبی‌کوئیتین از pFUGW-miR-466f-3p- به طور گذرا بیان کردیم. پلاسمید dsRed به نورون های هیپوکامپ اولیه DIV10 (شکل S2B). از طریق miRNA ISH، ما تأیید کردیم که سیگنال miR-466f-3p در گروه بیان بیش از حد miR{10}}f{11}}p نسبت به کنترل ناقل یا miR جهش یافته قوی‌تر است. 12}}f-3گروه p (فلش‌ها، شکل S2B). به موازات آن، ما همچنین پلتفرمی را برای بررسی تأثیر miR-466f-3از دست دادن عملکرد توسط مهار miR-466}f-3p با استفاده از اسفنج miR واقع در 30 UTR mRNA ژن EGFP بیان شده از پلاسمید pFUGW-miR-sponge- EGFP (شکل S2C). گزارشگر EGFP در پلاسمید اسفنجی هم به عنوان نشانگر کارایی ترانسفکشن و هم به عنوان حسگر فعالیت miRNA سلولی عمل می کند (کلایور و همکاران، 2012). در بخش قابل توجهی از سلول‌های HEK293T ترانسفکت‌شده، سیگنال EGFP پس از بیان همزمان با miR-466f{30}}p نوع وحشی کاهش یافت، اما با miR جهش یافته-466f{32 کاهش یافت. }}p، به دلیل مهار ترجمه mRNA EGFP با اتصال miR-466f{34}}p به اسفنج miR- در 30 UTR (چهار تصویر سمت چپ و دو برنامه خود را مقایسه کنید، شکل S2C) . در مقابل، ما کاهش سیگنال EGFP را با بیان همزمان اسفنج کنترلی که هشت نسخه از یک توالی درهم از پلاسمید pFUGW-SCR- sponge-EGFP را با miR-466f-3p یا هم رمزگذاری می‌کند، مشاهده نکردیم. جهش یافته آن (چهار تصویر سمت راست و دو هیستوگرام را مقایسه کنید).

همانطور که در شکل 2A نشان داده شده است، بیان نابجا miR-466f-3p منجر به تغییرات مورفولوژیکی نورون‌ها می‌شود که مهم‌ترین آن افزایش رشد نوریت نسبت به نورون‌های کنترل ترانسفکت شده با ناقل بیانگر dsRed pFUGW- است. dsRed یا miR جهش یافته-466f-3پلاسمید بیانگر pFUGW-mut-miR{11}}f-3p-dsRed. داده های کمی نشان داد که میانگین تعداد شاخه های دندریتی در هر نورون تفاوت معنی داری بین گروه miR{14}}f{15}}بیان بیش از حد p (نوار II) و کنترل ناقل یا جهش یافته (نوار I و III) (سمت راست) ندارد. هیستوگرام فوقانی، شکل 2A). با این حال، میانگین طول کل دندریت و میانگین طول دندریت های اولیه با بیان بیش از حد miR-466f{19}}p افزایش یافت (نوار II را با میله های I و III، هیستوگرام پایین سمت راست شکل 2A مقایسه کنید). به موازات، ما miR-466f-3 درون‌زا را با استفاده از اسفنج miR مهار کردیم. همانطور که مشاهده شد، تفاوت معنی‌داری در تعداد شاخه دندریتی بین گروه‌های بازدارنده miR-466f-3p و کنترل وجود نداشت (نوار IV را با میله‌های I و V، هیستوگرام بالا سمت راست، شکل 2A مقایسه کنید) ، اما گروه بازدارندگی miR{29}}f{30}} کاهش قابل توجهی را در میانگین طول کل دندریت و همچنین میانگین طول دندریت‌های اولیه و ثانویه نسبت به گروه‌های دیگر نشان داد (نوار IV را با میله‌های I و مقایسه کنید. V، هیستوگرام پایین سمت راست شکل 2A). علاوه بر این، رنگ‌آمیزی IF نشان داد که بیان بیش از حد miR{33}}f{34}}، اما نه مهار، تراکم خارهای دندریتیک را نیز افزایش می‌دهد (شکل 2B، پانل‌های بالایی و هیستوگرام سمت چپ پایین). ما همچنین رنگ آمیزی همزمان برای پروتئین با چگالی پس سیناپسی 95 (PSD{38}}) انجام دادیم و تراکم خارهای دندریتی کلکلوکالیزه را شمارش کردیم تا تعداد دقیق سیناپس های تحریکی را تعیین کنیم (شکل 2B، هیستوگرام سمت راست پایین)، که نشان داد miR{40 }}f{41}}بیان بیش از حد p تراکم خارهای PSD{42} مثبت را در مقایسه با سایر گروه‌های کنترل افزایش داد. با این حال، مهار miR{44}}f{45}}به طور قابل توجهی چگالی خارهای PSD{46} مثبت را نسبت به گروه‌های کنترل تغییر نداد (شکل 2B، هیستوگرام پایین سمت راست). با هم، این داده‌ها نشان می‌دهند که در غیاب تحریک عصبی، مهار miR{48}}f{49}}به تنهایی بر تراکم سیناپس‌های تحریکی یا کل خارهای دندریتیک تأثیر نمی‌گذارد.